Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез 2017

21-27 мая 2017 г. в г. Краснодаре прошла III Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» с международным участием. Организаторами конференции выступили Российская Академия Наук, Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН, Научный совет РАН по аналитической химии, МГУ имени М.В.Ломоносова, Кубанский государственный университет, ООО НТЦ «БиАСеп». Конференция прошла при финансовой поддержке РФФИ (проект № 17-03-20002), РАН и 12 фирм — представителей ведущих мировых производителей аналитических приборов. В конференции приняли участие 275 человек из всех субъектов Российской Федерации, а также зарубежных стран — Германии, Польши, Австралии, Австрии, Кореи, Казахстана.

На конференции были заслушаны 10 пленарных, 50 устных докладов, а также представлены 163 стендовых сообщения. Обсуждались вопросы, связанные с состоянием и перспективами развития аналитических возможностей методов хроматографии и капиллярного электрофореза, в том числе: тенденции развития хроматографии и хроматографического приборостроения; тенденции и подходы в методе капиллярного электрофореза; сорбенты и материалы для хроматографии и электрофоретического анализа; применение хроматографии в экологии; новые решения в хромато-масс-спектрометрии; селективность и эффективность разделения хроматографическими методами; автоматизация, хемометрическое и метрологическое обеспечение хроматографических и электрофоретических определений; анализ биологических объектов хроматографическими методами; пробоподготовка в хроматографическом анализе; практическое использование методов хроматографии и капиллярного электрофореза.

Во вступительном слове председатель оргкомитета конференции член-корреспондент РАН О.А. Шпигун и член-корреспондент РАН Б.Я. Спиваков осветили последние достижения хроматографии и электрофореза в нашей стране, остановились на проблемах, стоящих перед этими направлениями аналитической химии. Было отмечено, что российские ученые внесли большой вклад в развитие хроматографической науки, что было ярко продемонстрировано представленными на симпозиуме докладами, которые были посвящены как фундаментальным, так и практическим аспектам этой науки. Заседания собрали большую аудиторию, доклады были выслушаны с вниманием и интересом. Многие из них вызвали вопросы и научную дискуссию. Заказные пленарные доклады были посвящены основным достижениям и современным тенденциям различных направлений хроматографии и электрофореза. Открывающий пленарный доклад председателя оргкомитета конференции члена-корреспондента РАН О.А. Шпигуна (МГУ имени М.В. Ломоносова), посвященный анализу состояния и современных тенденций развития аналитической хроматографии, задал общую высокую тональность конференции. В докладе в основном были рассмотрены современные тенденции и достижения ВЭЖХ в таких областях как двумерная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия и хроматография гидрофильных взаимодействий.

Доктор химических наук, профессор Карцова Л.А. (СПбГУ) в своем пленарном докладе «Полимерные модификаторы с ионогенными группами в процессах электрофоретического разделения и концентрирования» показала, что основная проблема при решении различных медико-биологических задач методом капиллярного электрофореза заключается в высоких пределах обнаружения и необратимой сорбции основных аналитов на внутренней поверхности кварцевого капилляра. Одно из возможных решений этой проблемы – ковалентная или динамическая модификация стенок капилляра мицеллярными, дендритными и фторполимерными соединениями, блокирующая силанольные гидроксильные группы, препятствующая сорбции аналитов, влияющая на процессы внутрикапиллярного концентрирования. Как известно, хромато-масс-спектрометрия является гибридным физико-химическим методом анализа, сочетающим уникальные возможности хроматографии, как метода количественного анализа, и масс-спектрометрии, как метода идентификации соединений. Обсуждению новых решений в хромато-масс-спектрометрии было посвящено два пленарных доклада: д.х.н. Рыбальченко И.В. и д.х.н. Буряка А.К. Пленарный доклад д.х.н., профессора Буряка А.К. (ИФХЭ РАН) «Построение структуры органических молекул на основе хромато-масс-спектрометрических данных» был посвящен сравнению методов и методологическим подходам к сложной задаче – совместному применению информации, полученной из разных источников. В этом случае очень важна информативность различных спектральных данных и надежность получаемых с их помощью структурных характеристик. На примере газовой, жидкостной и тонкослойной хромато-масс-спектрометрии были продемонстрированы возможности этих методов для определения структуры неизвестных молекул. Доклад д.х.н. Рыбальченко И.В. (ФГБУ «27 Научный центр» МО РФ) был посвящен применению хроматомасс-спектрометрических методов анализа в системе контроля за нераспространением химического оружия. В докладе были рассмотрены реализованные исполнителями проекта основные подходы к подготовке проб и проведению их анализа с использованием новых аналитических технологий. В пленарном докладе профессора Грузнова В.М. (Институт нефтегазовой геологии и геофизики СО РАН) «Газохроматографические критерии пробоотбора следовых концентраций взрывчатых веществ в системах автоматизированного контроля объектов» рассмотрены проблемы теоретического и экспериментального определения условий индивидуального отбора следовых концентраций паров взрывчатых веществ от распределённых по пространству объектов, в частности, в ячейках автоматических камер хранения, выявлены условия контроля объектов с автоматизированным отбором паров по протяженным каналам.

Пленарный доклад проф. Пирогова А.В. (МГУ имени М.В. Ломоносова) «Применение микроэмульсий для извлечения, концентрирования и последующего определения биологически активных веществ» был посвящен микроэмульсионной жидкостной хроматографии. В докладе продемонстрированы преимущества микроэмульсий для извлечения различных по природе соединений из объектов со сложной матрицей.

Следует отметить доклад д.х.н. Савельевой Е.И. (ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России) «Аналитические технологии для исследования абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции ксенобиотиков», касающийся использования изотопно-меченых стандартов определяемых веществ, что позволяет разрабатывать унифицированные методики, применимые к анализу мочи, цельной крови и плазмы, эритроцитов, желчи, тканей и других интересующих биообъектов.

В пленарном докладе д.х.н. Яшкина С.Н. (Самарский государственный технический университет) систематизированы данные по структурной селективности применяемых в различных вариантах газовой и жидкостной хроматографии сорбентов, обсуждаются достоинства и ограничения известных классификационных подходов при выборе сорбентов с максимальными показателями структурной селективности в отношении компонентов разделяемой сложной смеси аналитов, рассмотрены пути направленного увеличения структурной селективности сорбентов путем создания смешанных хроматографических фаз из сорбентов с разным типом селективности.

В конференции с пленарными и заказными докладами приняли участие приглашенные иностранные ученые – проф. И.Вайсс (Германия) «Современные тенденции в ионной хроматографии»; проф. Б.Бушевский (Польша) «Является ли капиллярный зонный электрофорез подходящим методом для определения патогенов?»; проф. Нестеренко П.Н. (Австралия) » Варьирование селективности разделения в жидкостной хроматографии путем изменения линейной скорости потока», Окунь В.М. (Австрия) «Новые возможности автоматизации анализа в капиллярном электрофорезе с использованием потенциала течения», которые вызвали большой интерес у участников конференции.

Среди устных докладов следует отметить доклад Курганова А.А. (ИНХС РАН) «Новые неподвижные фазы для газовой хроматографии на основе полимеров с большим свободным объемом». В докладе с привлечением большого иллюстративного материала освещено применение новых неподвижных фаз для газовой хроматографии, полученных на основе производных трициклононена. На конференции были заслушаны устные доклады по применению хроматографии в естественных науках, экологии и др. Так, доклад Родина И.А. (МГУ имени М.В. Ломоносова) был посвящен использованию новых подходов при определении продуктов трансформации отравляющих веществ методом ультра-ВЭЖХ-МС/МС. В работе продемонстрированы новые возможности метода жидкостной хромато-масс-спектрометрии при высоких давлениях (ультраВЭЖХ-МС(-МС)), сочетающего в себе возможность проведения высокоселективного экспрессного разделения полярных, нелетучих продуктов трансформации нервно-паралитических и кожно-нарывных отравляющих веществ и высокую чувствительность обнаружения. В докладе Занозиной И.И. (ПАО «СвНИИНП») были обсуждены задачи и проблемы хроматографического контроля параметров нефтяного сырья, технологических потоков и готовой продукции. Актуальной задачей является совершенствование лабораторного контроля действующих и вновь вводимых в эксплуатацию технологических процессов, входного контроля сырья и оценки качества целевой продукции для оперативного планирования и контроля производства, но в рамках комплекса стандартизованных методов, что является первоочередной задачей аналитических служб предприятий, отраслевых научно-исследовательских центров нефтеперерабатывающей отрасли.

Хроматография благодаря высокой чувствительности и экспрессности определения находит все большее применение в биохимии, биологии, медицине, фармации. В докладе Бессоновой Е.А. (СПбГУ) рассмотрены новые аналитические подходы при концентрировании и определении стероидных гормонов, катехоламинов и белков в биологических матрицах хроматографическими и электрофоретическими методами. В работе исследованы возможности ионных жидкостей на основе имидазолия в качестве модификаторов подвижной и неподвижной фаз в условиях обращенно-фазовой и гидрофильной хроматографии для разделения полярных биологически активных веществ (аминокислоты, витамины, катехоламины и лекарственные препараты).

В последние годы в рамках правительственных программ ведется активная популяризация спорта и здорового образа жизни, связанная с вовлечением населения в разного рода спортивных мероприятиях. Параллельно с этим, растет также и теневой рынок спортивного питания, добавок и препаратов, позволяющих достичь желаемого результата в существенно более сжатые сроки. Важным направлением хроматографии, в связи с этим, является контроль качества спортивного питания и препаратов. Этой актуальной проблеме был посвящен доклад А.З. Темердашева (Кубанский госуниверситет), в котором обсуждались результаты хромато-масс-спектрометрического исследования ряда продуктов спортивного питания и допинг-препаратов, реализовывавшихся в период с 2014 по 2016 гг. Для эффективного противодействия распространению «дизайнерских наркотиков» остро стоит проблема разработки быстрой диагностики. Однако, если вопросам внедрения современных экспертных систем физико-химической идентификации посвящено значительное количество работ, то методы подготовки биопроб для инструментального исследования ограничены жидкостной и твердофазной экстракцией. В докладе д.х.н. В.Н. Бехтерева (Сочинский государственный университет) описывалось газохроматографическое экспресс-определение пировалерона, который можно отнести к часто встречающимся в судебно-химической практике психотропным веществам нелегального рынка, в моче с экстракционным вымораживанием в качестве пробоподготовки.

Важным направлением хроматографии является анализ пищевых продуктов, вин, пива, витаминов и соков. Проблемы, возникающие при анализе этих сложных объектов, рассмотрены в докладе О.Б. Рудакова (Воронежский государственный технический университет) «Хроматография в контроле качества и безопасности пищевой продукции». Было показано, что при определении в пищевой продукции контаминантов, а также различных ингредиентов, характеризующих качество, аутентичность или натуральность продукции наиболее информативны методы хроматографии. Проанализировано три блока задач в аналитическом контроле качества и безопасности пищевой продукции. Это установление экологической безопасности; определение комплекса технологических свойств, гарантирующих высокое качество сырья и готовой продукции; распознавание натуральности, контрафакта и идентификация фирменной продукции.

Следует отметить доклад Покровского О.И. (ИОНХ РАН), посвященного исследованию влияния состава подвижной фазы, прежде всего типа и содержания сорастворителей и модификаторов, на селективность разделения структурно близких соединений в сверхкритической флюидной хроматографии.

Большой вклад в развитие аналитической хроматографии и электрофореза вносят молодые ученые. На конференции присутствовало 125 молодых ученых, которые выступили с интересными устными докладами и стендовыми сообщениями. В рамках конференции была проведена школа по ионной хроматографии.

Плодотворно прошла работа стендовой сессии. Было представлено 163 стендовых сообщения, посвященных важнейшим достижениям и перспективам развития хроматографических и электрофоретических методов. Таким образом, краткий обзор пленарных лекций и докладов показывает высокий научный уровень прошедшей конференции. Устные доклады были представлены как классиками хроматографии, так и молодыми учеными, в том числе и из России.

Тезисы устных и стендовых докладов опубликованы в виде материалов конференции.

Конференцию сопровождала выставка приборов, литературы, реактивов и оборудования для хроматографии и электрофореза, в которой участвовало 12 фирм. Ведущие специалисты фирм «Аджилент Текнолоджис», Абакус, ГК Галахим, ГК Аналит, «Севко и Ко», и др. провели семинары с демонстрацией своего оборудования.

Конференция показала, что в России проводятся важные фундаментальные и практические работы в области хроматографии и электрофореза, одними из разработчиков которых являются сотрудники Кубанского госуниверситета. В работе конференции приняли участие 27 представителей Кубанского госуниверситета, из которых 21 – студенты, аспиранты и молодые ученые.

источник

В процессе проведения биохимического анализа при клинико-лабораторных исследованиях часто возникает необходимость предварительного выделения анализируемых веществ, отделения их от других компонентов, находящихся в исследуемом биологическом материале. Для этих целей чаще всего используются такие физико-химические методы, как электрофорез и хроматография.

Электрофорез. Под электрофорезом понимают процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле. Многие биологически важные молекулы (белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты и др.) имеют в своем составе ионизирующие группы. Поэтому в биологических жидкостях (крови, лимфе и др.) они существуют в виде катионов и анионов. Помимо этого молекулы имеющие примерно одинаковый заряд могут отличаться молекулярными массами и отношением заряда к массе. На этих различиях и основано разделение ионов при движении их в растворе под действием электрического поля.

Скорость перемещения зависит от величины заряда, а также в ряде случаев, от размера и формы молекул. Так как в большинстве случаев молекулы отличаются по своим физическим и химическим свойствам то очень немногие из них имеют одинаковую электрофоретическую подвижность. Скорость движения частиц (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью.

В зависимости от способа проведения электрофореза его делят на свободный или фронтальный, когда электрофоретическое разделение осуществляется в водной фазе и зональный, т.е. электрофорез на поддерживающей среде, когда разделение осуществляется на каком-либо инертном носителе (бумага, асбестовые пластины, целлюлоза, агаровый, крахмальный и полиакриламидный гели и др.).

Суть зонального электрофореза заключается в том, что раствор смеси веществ подлежащих разделению вводят на определенный участок носителя, пропитанного электролитом. Биологический материал, подлежащий электрофоретическому разделению, растворяют или суспензируют в буфере, чтобы обеспечить проведение электрического тока, этим же буфером насыщают и носитель. В растворе между электродами ток обусловлен ионами буфера и образца, в остальной части цепи — электронами. После снятия электрического поля ионы исследуемой смеси распределятся в соответствии с их электрофоретической подвижностью.

В клинико-лабораторных исследованиях чаще используется зональный электрофорез на агаре или полиакриламидном геле. При наложении электрического поля частицы подлежащей разделению смеси придут в состояние направленного движения (будут двигаться к противоположно заряженному полюсу) и распределятся на носителе в виде отчетливых зон, которые легко обнаружить соответствующим аналитическим методом.

Важными характеристиками процесса зонального электрофореза являются градиент потенциала (В/см) и сила тока, приходящаяся на 1 см поперечного сечения полосы (плотность тока — мА/см).

Под градиентом потенциала понимают падение напряжения на 1 см носителя расположенного между электродами. В зависимости от градиента потенциала различают низковольтный электрофорез (5-15 В/см) и высоковольтный (более 50 В/см). Низковольтный электрофорез используется для разделения высокомолекулярных соединений типа белков, липопротеинов, гликопротеинов и др. Высоковольтный электрофорез используется для разделения низкомолекулярных веществ, типа аминокислот, их производных и др. Так как различие в заряде и молекулярной массе у таких веществ невелико, то нужен большой градиент потенциала, чтобы произошло эффективное разделение частиц. Так как при этом происходит значительное разогревание носителя, требуются специальные устройства для его охлаждения.

В зависимости от целей исследования электрофорез делят на аналитический и препаративный. В клинико-биохимических исследованиях используют обычно аналитический электрофорез, который позволяет работать с очень небольшими количествами исследуемого вещества и вести их количественное определение. В тех случаях, когда требуется получить большое количество изучаемого вещества, необходимого для дальнейших исследований используют препаративный вариант электрофореза.

В настоящее время для анализа биологических смесей все шире используется капиллярный электрофорез, при котором электрофоретическое разделение проводится в тонких капиллярах диаметром 25-200 мкм и длинной 10-100 см, заполненных буферным раствором. Под действием электрического поля (электрофорез проводится при напряжении 10000-30000 В) в капилляре создается электроосмотический поток, направленный к отрицательному полюсу, вместе с которым перемешаются и компоненты подлежащие разделению. В зависимости от заряда и массы скорость их движения будет различной, что приводит к фракционированию смеси. В концевой точке капилляра разделенные компоненты количественно определяют, используя различные оптические детекторы Близким к электрофорезу является метод изоэлектрического фокусирования, когда разделение белков и некоторых других анализируемых веществ идет в зависимости от величины их изоэлектрических точек.

Изоэлектрической точкой называют такое состояние белковой молекулы, при котором ее суммарный заряд равен нулю. В методе изоэлектрического фокусирования вначале между электродами устанавливают градиент рН с помощью веществ особой химической природы, получивших название амфолитов-носителей. Заряженные молекулы белков в ходе опыта будут двигаться в направлении противоположно заряженного электрода в соответствии с их действительным зарядом. Так как молекулы белков амфотерны, то при перемещении в градиенте рН их суммарный заряд будет меняться до тех пор, пока он не станет равным 0. Это произойдет в том месте, где величина рН будет равна изоэлектрической точке. Поэтому молекулы с одинаковой изоэлектрической точкой сконцентрируются в одной узкой зоне.

Хроматография. Это метод разделения и анализа многокомпонентных систем, основанный на использовании явлений сорбции и десорбции в динамических условиях. В процессе хроматографии происходит многократное повторение актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. Вещество подвижной фазы непрерывно вступает в контакт с новым участком сорбента и частью сорбируется, а сорбированное вещество контактирует со свежими порциями подвижной фазы и частично десорбируется.

Методы хроматографического анализа различаются: по агрегатному состоянию системы, в которой проводится разделение на газовую и жидкостную: по механизму разделения — на адсорбционную, распределительную, ионообменную, гель-хроматографию, аффинную и др. В ряде случаев разделение оказывается результатом нескольких одновременно протекающих процессов с различными механизмами. Это приводит к образованию хроматограммы смешанного типа, но один из процессов всегда является доминирующим (рис. 9 и 10, см. стр. 20-21).

В газовой хроматографии подвижной фазой является газ. В зависимости от состояния неподвижной фазы газовая хроматография подразделяется на газо-адсорбционную, когда неподвижной фазой является твердый адсорбент и газо-жидкостную, когда неподвижной фазой является жидкость, или точнее пленка жидкости на поверхности частиц твердого адсорбента.

Жидкостная хроматография основана на адсорбции твердым веществом, играющим роль неподвижной фазы, определяемых компонентов, находящихся в растворенном состоянии.

В основе адсорбционной хроматографии лежит различная сорбируемость разделяемых веществ на твердом сорбенте в соответствии с их сродством к адсорбенту. При этом сорбируемость растворителя должна быть незначительной по сравнению с таковой анализируемой смеси. Процесс адсорбции зависит от свойства адсорбента, адсорбируемых соединений, растворителя. В зависимости от этих свойств вещества, подлежащие хроматографическому разделению, образуют адсорбционный ряд выражающий относительное адсорбционное сродство его членов к адсорбенту. Образующееся в колонке адсорбента зональное распределение веществ соответствует их положению в адсорбционном ряду. В качестве адсорбентов в адсорбционно-жидкостной хроматографии применяются органические и неорганические вещества: сахароза, крахмал, оксид алюминия, силикагель, активированный уголь и др.

Ионообменная хроматография основана на способности некоторых твердых веществ (ионитов) обмениваться ионами с подлежащими разделению веществами. Применяемые в ионообменной хроматографии иониты могут быть как органическими, так и неорганическими. Способность к ионному обмену определяется строением ионита, представляющего собой каркас, на котором закреплены активные группы (-СООН, -SO3H, — NH₃Cl, -NH₂Cl и др.). В зависимости от обмена катионов или анионов иониты делят на катиониты, аниониты и амфолиты. На принципах ионообменной хроматографии основано разделение аминокислот в аминокислотных анализаторах.

Распределительная хроматография основана на распределении компонентов разделяемой смеси между несмешивающимися фазами. Образующая неподвижную фазу жидкость находится на поверхности или в порах твердого носителя, на который наносится смесь веществ, подлежащих разделению. Затем создают ток подвижного растворителя. Чем лучше вещество растворимо в жидкости, играющей роль подвижной фазы, тем дальше оно продвинется по направлению тока растворителя. Вещества, плохо растворимые в подвижной фазе, расположатся ближе к точке нанесения. В зависимости от техники выполнения распределительная хроматография выполняется как колоночная, бумажная или тонкослойная. Методика распределительной хроматографии в колонках аналогична адсорбционной или ионообменной: вначале в колонку с носителем и закрепленным на нем неподвижной фазой вводят небольшой объем раствора смеси компонентов и затем промывают колонку подвижным растворителем.

При бумажной хроматографии разделение проводят на полосах бумаги, где роль неподвижной фазы играет вода, удерживаемая гидрофильными целлюлозными волокнами бумаги, а подвижной фазой является какой-либо органический растворитель. В каждый момент имеет место определенное перераспределение разделяемых компонентов между слоем органического растворителя и водой. В результате одни вещества движутся быстрее вслед за фронтом органического растворителя, другие в той или иной степени отстают, а некоторые вообще остаются на стартовой линии.

При тонкослойном варианте разделение идет в тонком слое носителя. Чаще всего для этих целей используются пластинки из силикагеля (например, Silufol) широко используемые для фракционирования липидов, аминокислот и других биосубстратов.

Гель-хроматография основана на различии в размерах и молекулярных массах белков и других макромолекул, являющихся важнейшей характеристикой молекулы. В качестве материала-носителя в гель- хроматографии используется сшитый декстран (сефадекс), сшитый полиакриламид (биогель Р) и агароза. Они получили широкое распространение как в аналитической, так и в препаративной лабораторной работе, а также в производстве, в химической и биологической промышленности.

Колонка с сефадексом действует по принципу «молекулярного сита». Молекулы большие, чем самые крупные поры разбухшего сефадекса не могут проникать в гранулы и сравнительно быстро проходят в жидкой фазе вне частиц геля, поэтому элюируются первыми. В настоящее время имеется большое число сефадексов, позволяющих разделить белки и полипептиды в диапазоне молекулярных масс от 700 до 800000 Да.

Были разработаны также хроматографические материалы для разделения белков, путем связывания некоторых ионообменных групп с сефадексами. Полученные производные-ДЭАЭ-сефадекс, КМ-сефадекс и другие широко используются при хроматографии.

Аффинная хроматография или (биоспецифическая по сродству хроматография), основана на принципе специфического взаимодействия с особыми веществами (лигандами), закрепленными на носителе. Биологические макромолекулы обладают способностью обратимо связывать многие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами, антитела взаимодействуют с антигенами, мРНК с комплементарной ДНК и т. д. Все эти взаимодействия строго специфичны. Образование специфических комплексов биологических макромолекул, способных в определенных условиях к диссоциации лежит в основе метода разделения получившего название аффинной хроматографии. Если закрепить один из компонентов этого комплекса на матрице, иммобилизовать его, то получится специфический сорбент для второго компонента (аффинат). Нерастворимые аффинаты готовят обычно путем ковалентного присоединения лиганда к нерастворимому носителю. Если смесь белков пропустить через колонку, заполненную таким аффинатом, то все молекулы, которые не обладают сродством к лиганду, закрепленному на носителе пройдут не задерживаясь, а белок имеющий сродство к аффинному лиганду будет адсорбироваться на колонке. Вымыть адсорбированный белок с колонки можно буферными смесями с измененной величиной рН, ионной силой, а также введением в состав элюента веществ, ослабляющих связи между белками и лигандами.

Одними из первых биоспецифических сорбентов, были антигены ковалентно связанные с нерастворимым носителем. Они были использованы для получения моноспецифических антител. Затем аналогичным путем были получены иммобилизованные ферменты. Стало возможным создание ферментных реакторов для получения различных веществ с использованием иммобилизованных ферментов.

источник

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
НАУЧНЫЙ СОВЕТ РАН ПО АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ МГУ имени М.В.Ломоносова
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ЗАО НТЦ «БиАСеп»

Всероссийская конференция
«Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез»

26 сентября — 01 октября 2010 г.
Краснодар

Уважаемые коллеги!
Приглашаем Вас принять участие в работе Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез».

Организационный комитет

Шпигун О.А., член-корр. РАН – председатель
Темердашев З.А., д.х.н. – зам. председателя
Яшин Я.И., д.х.н. – зам. председателя
Татаурова О.Г., к.х.н. – ученый секретарь
Бродский Е.С., д.х.н.
Варламов В.П., д.х.н.
Грузнов В.М., д.т.н.
Карцова Л.А., д.х.н.
Киселева Н.В., д.х.н.
Красиков В.Д., д.х.н.
Лобачев А.Л., д.х.н.
Рыбальченко И.В., д.х.н.
Пирогов А.В., д.х.н.
Селеменев В.Ф., д.х.н.
Смоленков А.Д., к.х.н.
Спиваков Б.Я., член.-корр. РАН

Секретариат:

Татаурова Ольга Геннадьевна
Свидрицкий Егор, Пашкова Елена

Тематика конференции

На конференции планируется обсудить вопросы, связанные с улучшением аналитических возможностей всех видов хроматографии, в том числе:

1. новые средства и подходы в хроматографии и капиллярном электрофорезе;
2. селективность и эффективность хроматогра-фиических и форетических разделений;
3. хемометрическое и метрологическое обеспече-ние хроматографических и форетических определений;
4. практическое использование хроматографии и капиллярного электрофореза.

Место и сроки проведения конференции

26 сентября – 01 октября 2010 г.,
ОАО «санаторий «Автотранспортник России»», расположенный на живописном побережье Черного моря в 9 км от г. Туапсе Краснодарского края. Расстояние от г. Краснодара – 150 км.

В рамках конференции планируются пленарные и устные доклады, стендовые сообщения. Залы заседаний оснащены мультимедиа-проекторами. Демонстрационные файлы могут быть представлены на компакт-дисках и флэш-накопителях.

Планируется издание отдельного сборника материалов конференции.
Тезисы объемом 1 страница размером А4 в формате Microsoft Word, шрифт Times New Roman, размер 12, поля 25 мм со всех сторон, интервал одинарный, выравнивание по ширине, допускается использование встроенной графики.
Название доклада прописными буквами — центрировано.
Авторы: фамилия и инициалы (выделяется курсивом) – центрировано. Фамилию докладчика дополнительно подчеркнуть.
Полное название организации с указанием почтового и электронного адресов.
Текст отделен от шапки доклада одной пустой строкой.
Тезисы докладов в электронном виде направлять по адресу info@biasep.ru

Адреса и телефоны для контактов:

119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.3
Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, химический факультет
E-mail: info@biasep.ru

Тел.: (495)922-98-26; (495)939-25-36
Факс: (495)939-32-41

Ключевые даты

01.06.2010 – окончание регистрации участников и последний срок предоставления тезисов докладов;
10.09.2010 – последний срок приема оргвзносов;
26.09.2010 – дата заезда участников конференции;
27.09.2010 – дата начала конференции;
01.10.2010 – отъезд участников конференции.

Выставки

Конференции

Семинары

Курсы, школы

Даты

Защиты

источник

Содержимое (Table of Contents)

Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Капиллярный ОФС.1.2.1.0022.15

электрофорез Вводится впервые

Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.

Скорость миграции частиц определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью буферного раствора.

Электрофоретическая подвижность вещества (μ_эф) зависит от его характеристик (электрического заряда, размеров и формы) и от характеристик буферной среды, в которой происходит разделение (типа и ионной силы электролита, рН, вязкости и добавок):

где q – эффективный заряд частицы;

η – вязкость раствора электролита;

r – стоксовский радиус частицы.

Электрофоретическую скорость (ν_эф) для вещества сферической формы определяют по формуле:

где E – сила электрического поля;

V – приложенное напряжение;

Когда к капилляру, заполненному буферным раствором, приложено электрическое поле, внутри капилляра образуется поток растворителя, называемый электроосмотическим потоком. Скорость и направление электроосмотического потока зависят от электроосмотической подвижности (μ_эо), определяемой знаком и плотностью заряда на внутренней стенке капилляра, а также характеристиками буфера:

где ε – диэлектрическая константа буфера;

ζ – дзета-потенциал поверхности капилляра.

Электроосмотическую скорость (ν_эо) рассчитывают по формуле:

Электрофоретическая и электроосмотическая подвижность ионов могут быть направлены в одну и ту же или в противоположные стороны в зависимости от заряда частиц; таким образом, скорость движения растворенного вещества будет определяться уравнением:

Если электроосмотическая скорость выше электрофоретической, можно одновременно разделить как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. Время, затраченное ионом для миграции от конца, в котором вводится образец, до места детекции (l – эффективная длина капилляра), определяют по формуле:

Как правило, капилляры из плавленого кварца без покрытия при pH выше 3 несут на внутренней поверхности отрицательный заряд из-за диссоциации силанольных групп. При этом электроосмотический поток направлен от анода к катоду.

В некоторых случаях необходимо уменьшить или изменить направление электроосмотического потока. Для этого различным образом модифицируют внутреннюю стенку капилляра или изменяют рН буферного раствора.

После введения образца в капилляр каждый анализируемый ион движется внутри фонового электролита в виде отдельной зоны в соответствии со своей электрофоретической подвижностью. Степень размывания каждой зоны растворенного соединения определяется совокупностью различных причин. В идеальном случае единственной причиной размывания зон является продольная молекулярная диффузия растворенного вещества вдоль капилляра. В этом, идеальном, случае эффективность разделения полосы, характеризуемая числом теоретических тарелок (N), выражается формулой:

где D – молекулярный коэффициент диффузии растворенного вещества в буферном растворе.

На практике на размывание полос значительное влияние оказывают тепловое рассеяние, адсорбция образца на стенке капилляра, различная проводимость между образцом и буфером, длительность ввода пробы, размеры детектирующей ячейки и различия уровней жидкости в емкостях с буферными растворами.

Разделение между двумя полосами, называемое разрешением (R_s), определяют по формуле (8):

где μ_эфб и μ_эфа – электрофоретические подвижности каждого из двух разделенных ионов;

– их средняя электрофоретическая подвижность.

Среднюю электрофоретическую подвижность определяют по формуле:

Система для капиллярного электрофореза состоит из высоковольтного источника напряжения; двух флаконов с буферными растворами и погруженными в них электродами; капилляра, заполненного соответствующим раствором и погруженного обоими концами во флаконы с буферными растворами; системы ввода образца; детектора, способного в режиме реального времени регистрировать вещества, проходящие мимо оптического окна капилляра; системы термостатирования; регистрирующего прибора или подключенного компьютера.

Для введения пробы могут использоваться три способа: гидростатический – за счет разного уровня буферных растворов, гидродинамический – с помощью прилагаемого давления или вакуума и электрокинетический – благодаря прилагаемому напряжению. В последнем случае степень ввода в капилляр каждого компонента пробы зависит от соответствующей электрофоретической подвижности. Электрокинетическая система ввода для многокомпонентной смеси с разной электрофоретической подвижностью ведет к изменению соотношения концентраций ее составляющих и в данном случае может адекватно применяться лишь для качественного анализа. При условии определения в многокомпонентной смеси одного или двух соединений этот метод может использоваться и для количественного анализа. Кроме того, такой способ введения может позволить увеличить чувствительность анализа.

Детектирование осуществляется с помощью абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях, флуориметрии, кондуктометрии, амперометрии или масс-спектрометрии.

Для обнаружения не поглощающих в ультрафиолетовой области и не флуоресцирующих соединений используется непрямое детектирование. В этом случае в ведущий электролит вводится вещество, поглощающее ультрафиолетовое излучение и образующее выраженное фоновое поглощение. При этом зона определяемого вещества визуализируется в виде обратного пика. С использованием специального программного обеспечения электрофореграмме придают стандартный вид.

Применяемый раствор электролита фильтруют для того, чтобы удалить крупные частицы (размером более 0,45 мкм), и дегазируют для предотвращения образования пузырьков воздуха, которые могут быть помехой для детектирующей системы или могут нарушить электропроводность в капилляре во время проведения анализа. Для хорошей воспроизводимости времени миграции анализируемых компонентов проб для каждого определения должна быть разработана определенная процедура промывки капилляра.

Основными формами проведения капиллярного электрофореза являются: капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярный гель-электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование и капиллярный изотахофорез.

Аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор. Разделение происходит за счет того, что различные компоненты образца движутся с разными скоростями, образуя так называемые зоны. Скорость движения каждой зоны зависит от электрофоретической подвижности растворенного вещества и от электроосмотического потока в капилляре. Для уменьшения адсорбции веществ на поверхности плавленого кварца могут использоваться капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.

Использование капиллярного зонного электрофореза позволяет выполнить разделение как малых (молекулярная масса Мицеллярная электрокинетическая хроматография

В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение осуществляется в растворе электролита, содержащего поверхностно-активное вещество в концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы растворенного вещества распределяются между буферным раствором и псевдостационарной фазой, состоящей из мицелл. Этот метод может использоваться для разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве анионного поверхностно-активного вещества наиболее часто используется додецилсульфат натрия, в качестве катионного – соли цетилтриметиламмония.

При нейтральных и щелочных значениях рН возникает сильный электроосмотический поток, который движет ионы разделяющего буфера в сторону катода. При использовании в качестве поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия электрофоретическое движение анионных мицелл направлено в противоположную сторону – к аноду. В результате суммарная скорость движения мицелл снижена по сравнению с основным потоком раствора электролита. В случае нейтральных веществ скорость движения компонента, не имеющего электрофоретической подвижности, зависит только от его коэффициента распределения между мицеллой и водной средой. На электрофореграмме сначала появляется пик маркера электроосмотического потока, затем пики аналитов, и в конце – пик маркера мицелл. Время между первым и последним пиком называется окном разделения. На движение заряженных веществ влияют как их коэффициенты распределения между мицеллой и водным буферным раствором, так и их собственная электрофоретическая подвижность.

Движение аналитов и разрешение может быть описано термином «фактор удерживания (k)», представляющим собой отношение молярных долей аналита в мицелле и в подвижной фазе. Для нейтрального вещества k вычисляют по формуле:

где t_R – время миграции аналита;

t – время миграции неудерживаемого вещества;

t_mc – время миграции мицеллы;

K – коэффициент распределения аналита;

V_S – объем мицеллярной фазы;

Разрешение для двух близко движущихся аналитов (R_S) рассчитывают по формуле:

где N – число теоретических тарелок для одного из аналитов;

α – селективность разделения;

Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако следует учитывать, что увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и вязкости буферного раствора. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения.

Как и в капиллярном зонном электрофорезе, при мицеллярной электрокинетической хроматографии длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа и эффективность разделения. Увеличение длины капилляра уменьшает электрическое поле, увеличивает время миграции и повышает эффективность разделения. Уменьшение внутреннего диаметра повышает рассеяние тепла и увеличивает разрешение.

Величина рН среды влияет на электроосмотический поток в немодифицированных капиллярах. Уменьшение рН снижает электроосмотический поток и вследствие этого увеличивает разрешение нейтральных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии за счет увеличения времени анализа.

Для улучшения разделения гидрофобных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии используют органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). При этом необходимо учитывать, что добавление органического модификатора влияет на критическую концентрацию мицеллообразования.

Для разделения с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии энантиомеров в мицеллярную систему включают хиральные селекторы: ковалентно связанные с поверхностно-активным веществом (соли N-додеканоил-L-аминокислот, соли желчных кислот и др.) или вводимые в состав электролита (циклодекстрины).

Для улучшения селективности разделения в мицеллярной электрокинетической хроматографии применяют также вещества, способные изменить взаимодействие аналита с мицеллой путем адсорбции на последней. Этими добавками могут быть второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное), ведущее к образованию смешанных мицелл, катионы металлов, которые распределяются в мицелле и образуют координационные комплексы с аналитом, а также ион-парные соединения, которые взаимодействуют с заряженными компонентами пробы и задерживают их, например, тетрабутиламмония бромид.

В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, действующим в качестве молекулярного сита. При равном отношении заряда к массе более мелкие компоненты движутся в капилляре быстрее, чем более крупные. Капиллярный гель-электрофорез может быть использован для разделения биологических макромолекул по их молекулярной массе. Электроосмотический поток при этом полностью устраняется путем модификации внутренней стенки капилляра.

В капиллярном гель-электрофорезе используются два типа гелей: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически модифицированные гели, как, например, поперечно-сшитый полиакриламид, поливинилпирролидон, готовятся внутри капилляра посредством полимеризации мономеров. Они обычно связаны с кварцевой стенкой капилляра и не могут быть удалены без его разрушения. При использовании таких гелей для анализа белков в редуцирующих условиях буферный раствор содержит обычно додецилсульфат натрия и образцы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси додецилсульфата натрия с 2-меркаптоэтанолом или дитиотрейтолом. При анализе в нередуцирующих условиях 2-меркаптоэтанол и дитиотрейтол не используют. Разделение в поперечно сшитых гелях оптимизируют модификацией буферного раствора (как указано в разделе «Капиллярный зонный электрофорез») и контролем пористости геля во время его приготовления. Пористость этих гелей регулируют изменением концентрации акриламида, а также его соотношения со сшивающим реагентом. Уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности аналитов. Из-за неподвижности таких гелей допустимо только электрокинетическое введение пробы.

Динамически модифицированные гели являются гидрофильными полимерами, как, например, линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и т. п., которые могут быть растворены в водных разделительных буферных растворах с образованием разделяющей среды, действующей как молекулярное сито. После приготовления они могут быть введены в капилляр под давлением. Замена геля перед каждой инжекцией улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей увеличивается при использовании полимеров с большей молекулярной массой или уменьшении концентрации полимера. Для выбранного буферного раствора уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности компонентов раствора. Так как растворение этих полимеров в буферном растворе дает растворы с низкой вязкостью, может быть использован гидродинамический или электрокинетический ввод пробы.

В изоэлектрическом фокусировании заряженные молекулы движутся под воздействием электрического поля в рН-градиенте, созданном амфолитами с широким диапазоном значений рI, растворенными в буфере разделения.

Тремя основными этапами изоэлектрического фокусирования являются введение пробы, фокусирование и мобилизация.

Этап введения пробы осуществляют в один прием, когда образец смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или под вакуумом, или в несколько приемов, когда в капилляр последовательно вводится ведущий буферный раствор, амфолиты, образец, смешанный с амфолитами, снова амфолиты и, наконец, заключающий буферный раствор. Объем образца должен быть достаточно малым, чтобы не изменять рН-градиент.

На этапе фокусирования амфолиты движутся после приложения напряжения к катоду или аноду согласно их суммарному заряду, создавая, таким образом, рН-градиент от более низкого рН (у анода) к более высокому рН (у катода). Движение каждого аналита продолжается до тех пор, пока он не достигнет рН, соответствующего его изоэлектрической точке (pI).

На этапе мобилизации полосы разделенных компонентов приводятся в движение в сторону детектора благодаря электроосмотическому потоку путем приложения давления после стадии фокусирования или с помощью добавления солей к флакону у катода или анода.

Достигнутое разделение, выражаемое как , зависит от градиента , количества амфолитов, имеющих различные значения pI, молекулярного коэффициента диффузии (D), интенсивности электрического поля (E) и вариации электрофоретической подвижности аналита в зависимости от :

Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке разделения, являются:

– Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании используется очень высокое электрическое поле – от 300 до 1000 В/см на этапе фокусирования.

– Капилляр. Электроосмотический поток должен быть уменьшен или полностью подавлен. Для уменьшения электроосмотического потока используют капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.

– Растворы. Анодный флакон заполняется буферным раствором с рН ниже, чем pI наиболее кислого амфолита, а катодный флакон заполняется раствором с рН выше, чем pI наиболее щелочного амфолита. Обычно для анода используется фосфорная кислота, а для катода – натрия гидроксид.

Добавление в раствор амфолита полимера, такого как метилцеллюлоза, ведет к подавлению конвекции и электроосмотического потока при увеличении вязкости. Широкие диапазоны рН используются для оценки изоэлектрической точки, в то время как более узкие диапазоны применяются для улучшения точности.

Осаждение белков в их изоэлектрической точке во время этапа фокусирования предотвращают в случае необходимости с помощью таких буферных добавок, как глицерин, поверхностно-активные вещества, мочевина или цвиттерионные буферные соли.

Изотахофорез – это метод разделения, который проводится в режиме поддержания постоянства тока (все разделенные зоны движутся с одной скоростью). При этом должно обеспечиваться постоянное отношение между концентрацией и подвижностью ионов в каждой зоне.

В капиллярном изотахофорезе применяются два буферных раствора, между которыми находятся зоны аналита. Например, для анализа анионов буфер должен быть выбран таким образом, чтобы ведущий электролит содержал анион с фактической подвижностью, превышающей характерную для разделяемых веществ. Аналогично ион завершающего электролита должен иметь меньшую подвижность, чем подвижность разделяемых веществ. В результате разделения ведущий анион движется первым, за ним движется анион с очередной высокой подвижностью и т. д. В капиллярном изотахофорезе индивидуальные анионы мигрируют в дискретных зонах, но все движутся с той же скоростью, что и ведущий анион. Концентрации анализируемых веществ одинаковы в каждой зоне; таким образом, длина каждой зоны пропорциональна количеству отдельного компонента. Зоны менее сконцентрированные, чем ведущий электролит, сужаются, зоны более сконцентрированные – расширяются. Принцип изотахофореза используется для предварительного концентрирования образца перед разделением его компонентов с помощью других методик капиллярного электрофореза.

Качественный анализ. К качественным результатам относится определение идентичности компонента пробы внутреннему или внешнему стандартному веществу по времени появления соответствующего пика.

Полуколичественный анализ. Полуколичественным результатом считается определение концентрации компонента пробы по площади или высоте пика при соотношении сигнал/фон от 2:1 до 3:1.

Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по формуле:

где: H – высота пика целевого компонента на электрофореграмме раствора сравнения, измеренная от максимума пика до базовой линии сигнала;

h – уровень шума на электрофореграмме, полученной после ввода холостой пробы.

Количественный анализ. Количественным результатом является определение концентрации искомого компонента пробы по площади пика при соотношении сигнал/шум больше, чем 3:1.

При количественном анализе образца для компенсации различий во временах миграции от анализа к анализу и для устранения различий в сигналах компонентов образца, обладающих различными временами миграции, площади пиков должны быть нормированы на соответствующие времена миграции. При использовании внутреннего стандарта необходимо убедиться, что ни один пик исследуемого вещества не маскируется пиком внутреннего стандарта.

Абсолютное содержание компонентов рассчитывают по отношению площадей анализируемого пика и пика стандарта. Процентное содержание одного или более компонентов анализируемого образца рассчитывают путем определения процентной доли скорректированных площадей пиков от общей площади всех пиков, за исключением пиков, вызванных растворителями или другими добавленными реактивами (процедура нормализации).

В качестве параметров пригодности системы используются: кажущееся число теоретических тарелок (N), разрешение (R_s), фактор емкости (k’) (только для мицеллярной электрокинетической хроматографии) и фактор симметричности (A_s).

Кажущееся число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано эмпирически по формуле:

где t_r – время миграции или расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика соответствующего компонента;

w_0,5 – ширина пика на половине высоты.

Разрешение (R_s) между пиками схожей величины двух компонентов вычисляют по формуле:

где t_r,b и t_r,a – времена миграции или расстояния вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков;

Фактор симметричности пика рассчитывают по формуле:

где w_0,05 – ширина пика на 1/20 от его высоты;

d – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передним краем пика на 1/20 от высоты пика.

В качестве параметров пригодности используются также испытания на воспроизводимость площади (стандартное отклонение площади или отношения площади к времени миграции) и воспроизводимость времени миграции (стандартное отклонение времени миграции).

В фармакопейной статье указывают использование определенного капилляра, буферного раствора, метода предварительной подготовки капилляра, пробоподготовки и условий миграции.

источник

Курс является частью большого практикума и предназначен для студентов III курса кафедры биохимии. В курсе рассматриваются общетеоретические вопросы электрофоретических и хроматографических методов исследования и приводятся примеры практического использования методов электрофореза для анализа белков и нуклеиновых кислот, а также анализируется использование методов электрофореза для исследования протеома.

Лекторы — заведующий кафедрой биохимии, чл.-корр. РАН, профессор, д.б.н. Н.Б. Гусев, доцент М.И. Сафронова

Время проведения: весенний семестр III курса
Продолжительность курса: 8 лекций
Форма отчетности: Зачет
Альтернативный курс: Нет

Лекция 1. Классификация различных электрофоретических методов разделения макромолекул (аналитически и препаративные методы разделения в электрическом поле, электрофорез со свободной границей, зональный электрофорез, вытеснительные методы электрофореза). Перемещение частицы в электрическом поле. Зависимость скорости перемещения от напряженности электрического поля, заряда частицы и силы трения, препятствующей перемещению. Частицы в электрическом поле. Зависимость скорости перемещении заряженной частицы от ее молекулярной массы и формы.

Лекция 2. Электрофорез с подвижной границей. Электрофоретический прибор Тизхелиуса и современные жидкостные сортировщики клеток. Различные виды зонального электрофореза. Бумажный электрофорез и разделение аминокислот и пептидов. Зависимость электрофоретической подвижности аминокислот от рК и рН. Условия разделения аминокислот и пептидов на бумаге. Используемые буферы и приборное оснащение. Электрофоретическое разделение мононуклеотидов на бумаге. Методы детекции аминокислот, пептидов и нуклеотидов при электрофорезе на бумаге. Электрофорез на нитроцеллюлозе.

Лекция 3. Электрофорез в крахмале, агарозе и полиакриламидном геле. Достоинства полиакриламидного геля. Строение и свойства акриламида, метиленбисакриламида, инициаторов и катализаторов полимеризации. Полимеризация с использованием персульфата аммония и рибофлавина. Зависимость пористости геля от концентрации мономеров и «сшивки». Механические и оптические свойства полиакриламидных гелей. Использование окислителей и восстановителей и специальных видов «сшивок» для деполимеризации гелей. Уравнение Фергюссона и его использование для определения молекулярной массы белков и их олигомерного состава. Гомогенные и гетерогенные (прерывистые) буферные системы, используемые для электрофоретического разделения белков. Диск-электрофорез при щелочных и кислых значениях рН. Использование ионных детергентов для электрофоретического определения молекулярной массы белков и пептидов. Додецилсульфат натрия и цетилтриметиламмоний бромид и их использование для определения кажущейся молекулярной массы белков. Факторы, влияющие на определение молекулярной массы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, возможные артефакты и пути их преодоления. Сопоставление различных способов определения молекулярной массы с помощью электрофореза.

Лекция 4. Способы детекции белков в полиакриламидном геле (окрашивание анионными красителями Кумасси, амидовый черный, окрашивание универсальным красителем stains-all, окрашивание серебром). Способы электропереноса белков и пептидов на нитроцеллюлозные фильтры. Сухие и влажные блоттеры, состав буферных растворов, используемых для электропереноса. Детекция белков на нитроцеллюлозной мембране (красители, авидин-биотиновый метод, «окрашивание» антителами, окрашивание коллоидным золотом, использование радиоактивных изотопов для детекции катион-связывающих белков) Секвенирование белков, перенесенных на нитроцеллюлозные фильтры.

Капиллярный электрофорез. Приборное оснащение, влияние электроэндоосмоса. Различные варианты капиллярного электрофореза (зональный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярных электрофорез, использование изоэлектрофокусирования и изотахофореза в капиллярном электрофорезе)

Лекция 5. Использование методов электрофореза для решения задач современной протеомики. Одно- и двумерное электрофоретическое разделение белков. Элюция белков с геля и определение их молекулярной массы с помощью методов масс-спектроскопии. Различные виды масс-спектроскопии (MALDI и электроспрей). Гидролиз белков геле и разделение полученных пептидов методами масс-спектроскопии. Высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектроскопия. Тандемная масс-спектроскопия и определение частичной и полной первичной структуры неизвестных белков. Изучение экспрессии различных белков на разных этапах жизнедеятельности клетки.

Лекция 6. Особенности электрофореза нуклеиновых кислот (размер молекулы, постоянство соотношения заряд/масса, высокая гибкость, наличие вторичной структуры). Пульсовый электрофорез. Разделение нуклеиновых кислот в агарозе. Электрофорез олигонуклеотидов в полиакриламидном геле. Принципы секвенирования нуклеиновых кислот. Эффективность определения первичной структуры белка по структуре гена.

Лекция 7. Изоэлектрофокусирование как один из методов вытеснительного электрофореза. Искусственные градиенты рН (градиенты рН, создаваемые с помощью градиента температуры или градиента неэлектролитов). Структура амфолинов и их свойства. Требования, предъявляемые к амфолинам. Препаративное и аналитическое изоэлектофокусирование, носители, используемые при проведении опытов по изоэлектрофокусированию. Роль электроэндоосмоса и катодный дрейф. Особенности окрашивания гелей после проведения изоэлектрофокусирования. Иммобилины и электрофокусирование на гелях с иммобилизованным градиентом рН. Изотахофорез. Принципы метода и его разрешающая способность. Управляющее уравнение Кольрауша и соотношение концентрации исследуемых веществ в разделяемых зонах. Техническое оснащение метода изотахофореза. Использование амфолинов для разделения зон веществ, фракционируемых при изотахофорезе. Разрешающая способность изотахофореза и сравнение процессов, происходящих при изотахофорезе, с процессами, происходящими при диск-электрофорезе.

версия для печати
Страница последний раз обновлялась 17.04.2018

источник