Анализ нуклеиновых кислот с помощью электрофореза

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

«Харьковский политехнический институт»

Кафедра биотехнологии, биофизики и аналитической химии

по курсу: «Физико — химические методы анализа»

Выполнил: студент группы ХТ-57б

Нобатова Огулсенем Аганиязовна

1.2. Варианты метода электрофореза белков…………………………………. 5

1.3. Оборудования для электрофореза. Форезная камера……………….……..6

2.3. Процесс полимеризации ПААГ…………………………………………..12

2.4. Выбор концентраций мономеров…………………………………………14

2.5. Миграция белков в геле…………………………………………………. 17

3. Красители используемые для проявления белков …………. 19 Заключение………………………………………………………………………. 20 Список использованных источников……………………………………………. 21

Электрофорез (от электро- и греч. переносить) — это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.

С помощью электрофореза удаётся покрывать мелкими частицами поверхность, обеспечивая глубокое проникновение в углубления и поры. Различают две разновидности электрофореза: катафорез — когда обрабатываемая поверхность имеет отрицательный электрический заряд (то есть подключена к отрицательному контакту источника тока) и анафорез — когда заряд поверхности положительный.

Электрофорез применяют в физиотерапии, для окраски автомобилей, в химической промышленности, для осаждения дымов и туманов, для изучения состава растворов и др. Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии.

Цели и задачи данной курсовой работы: — изучение истории электрофореза — изучение теоретических основ электрофореза — изучение методик использования электрофореза в полиакриламидном геле для анализа различных белков — умение использовать правильную плотность геля — изучение сути процесса полимеризации ПААГ — изучение миграции белков в геле — изучение красителей, используемых для проявления белков.

1. Электрофорез. 1.1. Основы электрофореза.

Электрофорез – это перемещение заряженных частиц в растворе (в зависимости от знака их суммарного электрического заряда) к аноду или катоду под действием электрического поля. Поскольку скорость движения молекул в электрическом поле зависит от их заряда, формы и размера, то электрофорез может быть использован для их разделения. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят в основном от рН среды. Если через этот раствор начать пропускать электрический ток, то под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров макромолекулы приобретают разные скорости, и в этом – сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул мигрирующих с одной и той же скоростью. Однако в жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны, поэтому обычно электрофорез проводят в гелеобразной среде. Наличие сетки геля приводит к тому, что теперь фракционируемые макромолекулы сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных молекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Электрофорез позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности. Биологические макромолекулы – белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и др. – находятся в водном растворе в виде частиц, несущих определённый электрический заряд. Заряд макромолекулы определяется входящими в ее состав группами, способными к электролитической диссоциации. Степень диссоциации групп зависит от многих факторов, в частности, от рН среды. Общий заряд биологической макромолекулы также может изменяться при её взаимодействии с ионами или другими молекулами. Наиболее широкое применение электрофорез получил для анализа и очистки белков и нуклеиновых кислот, хотя этот метод может быть использован и для других заряженных биологических молекул, таких как сахара, аминокислоты, пептиды, нуклеотиды и др. Для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез. Наиболее широко используются полиакриламидные (ПААГ) гели и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. В качестве других «носителей» жидкой фазы широко используют пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества.

1.2. Варианты метода электрофореза белков.

Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются (или использовались в определённые периоды развития биохимии) в различных областях: 1) электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды) 2) электрофорез с подвижной границей 3) зональный электрофорез без поддерживающей среды 4) капиллярный электрофорез 5) зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой 6) электрофорез на фильтровальной бумаге 7) электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране 8) электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды 9) электрофорез белков в ПААГ 10) электрофорез белков в крахмальном геле 11) электрофорез белков в агарозном геле 12) электрофорез в полиакриламидном геле.

1.3. Оборудования для электрофореза. Форезная камера.

Для проведения практикума необходима лаборатория (примерная площадь — 20 м х 20 м) оснащенная следующим оборудованием и расходными материалами: 1. Вертикальная камера для электрофореза с комплектующими; 2. Источник питания с регулировкой силы тока или/и напряжения; 3. Система гель-документирования; 4. Холодильник (+4º), с морозильной камерой (-20º) для хранения растворов; 5. Электронные аналитические весы и набор шпателей для взвешивания; 6. Система для получения деионизированной воды (milliQ); 7. Магнитная мешалка с набором магнитных якорей; 8. Мерные цилиндры (100 и 500 мл), мерные стеклянные стаканы. 9. Стеклянные бутыли для хранения растворов. 10. Один комплект пипеток-дозаторов (10, 200 и 1000 мкл); 11. Пробирки конусные (15 и 50 мл), пробирки типа эппендорф (0,5 и 1,5 мл), наконечники для пипеток (20, 200, 1000, 5000 мкл). 12. Список необходимых реактивов: акриламид, N,N’ –метиленбисакриламид, Трис, додецилсульфат натрия (SDS), персульфат аммония, N,N,N’,N’ – тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), глицин, трицин, глицерин, β-меркаптоэтанол, ЭДТА, Бромфеноловый синий, Кумасси R 250, Кумасси G 250, изопропанол, уксусная кислота, глутаровый альдегид, набор маркеров молекулярных масс белков (15-150 кДа) и набор низкомолекулярных маркеров молекулярных масс белков и пептидов (1-30 кДа).

Рисунок – 1.3. Оборудование для электрофореза.

Форезная камера: Форезные камеры бывают двух типов: с двумя или с одним платиновым электродом. * камеры с двумя платиновыми электродами можно подключать к источнику напряжения в любой полярности. * камеры с одним — только одним способом. Обычно на таких камерах указана полярность подключения. Будьте внимательны. Подготовка камеры: мыть губкой, смоченной детергентом; сполоснуть раз 10 водопроводной водой; сполоснуть раза 2-3 дистиллятом. Форезные камеры имеют два уязвимых места: * сравнительно легко при мытье отодрать

платиновый электрод; * если при споласкивании или переносе держать камеру за один бортик, то в этом бортике появится трещина. Рисунок – 1.3. Вертикальная форезная камера.

Прибор для электрофореза в вертикальных трубках (в разрезе)

1 — верхний электродный резервуар; 2 — центральный цилиндр; 3 — верхний платиновый электрод; 4 — резиновая прокладка; 5 — трубочка с гелем; 6 — нижний электродный резервуар; 7 —нижний платиновый электрод. Для электрофореза белков обычно используют пластины шириной 8 — 14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 —28 см. Электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов, например при секвенировании, нередко ведут в больших пластинах размером 33 43 см, что диктуется максимальным размером рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гидролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины ПААГ длиной 90 см.

1. Гели для электрофореза. 2.1. Плотность геля.

Стандартно используют следующие обозначения: Т – процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему раствора, С – процентное отношение массы бисакриламида к общей массе обоих мономеров. (Т = акриламид + мономер, образующий сшивки) и количество сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров (С): Т = (a + b)/m x 100 % C = b/(a + b) x 100 %

a – количество акриламида; b – количество мономера, образующего сшивки (бисакриламида); m – объем буфера, мл. Т — обычно варьируется в пределах 3-30%, а С 1-5%. Выбор значений С и Т определяется диапазоном фракционирования белков и ограничивается механическими и адсорбционными свойствами геля. Для крупнопористых гелей необходимо увеличивать степень сшивки (повышать С до 3-5%), для мелкопористых гелей величина С не должна превышать 1-2%. На первый взгляд чем больше Т, тем мельче поры, но это не всегда так, поскольку ПААГ не является регулярной пространственной решеткой с жесткими ячейками определенного среднего размера. При малых значениях С он представляет собой скорее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных точках случайно сшитые между собой. Такая система не может быть внутренне жесткой. Поэтому мигрирующие в геле макромолекулы, по-видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных полимеров акриламида, при этом миграция молекул замедляется и происходит своеобразное трение их о гель. Однако жестких ограничений на размер мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это очень существенно. Чем выше концентрация заполимеризованного акриламида, тем меньше размер пор в геле:

p = 1,5 d / Ö` c р – размер пор в ангстремах c – объемная концентрация акриламида d – диаметр молекулы акриламида Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания «сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля, т.к. средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется. Однако далее картина меняется, экспериментально показано, что с увеличением С выше 10% тормозящий эффект геля (при одних и тех же значениях Т) ослабляется. При С>15% гель ведет себя как крупнопористый даже при высоких значениях Т. Внутренняя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому, совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам оказывается энергетически выгодным и вероятным многократное связывание нескольких параллельно идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют хаотически сшитую пространственную сетку. Эта сетка оказывается действительно жесткой – нити в пучках раздвинуть невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образуются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биополимеров. Поэтому содержание сшивки С в геле должно быть в пределе 2-5%. Соотношение между акриламидом и сшивающим агентом определяют механические и физические свойства геля. Для гелей с концентрацией Т 5 – 15 % С рекомендуется выбирать в пределах 2-4 %. Для выбора С была предложена следующая эмпирическая формула: С (%) = 6,5 – 0,3 Т (%) Концентрация полиакриламидных гелей, используемых для разделения макромолекул с различными молекулярными массами Концентрация геля Т, % | Концентрация бисакриламида С, % | Пределы разделения, дальтоны |15-2010-155-1052-5 | 0,20,32 – 356 | 1 х 104 — 4 х 1044 х 104 — 1 х 1051 х 105 — 3 х 1053 х 105 — 5 х 105выше 5 х 105|

2.2. Полиакриламидныи гель (ПААГ).

Исходные материалы: Акриламид (СН2 = СН — CONH2) представляет собой белый кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный препарат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный водный раствор должен иметь рН не ниже 5, а оптическая плотность 1%-ного раствора при 290 нм (А290) не должна превышать 0,15. Такой препарат можно использовать без дополнительной очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоду. В этих условиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воздействует на кожу и нервную систему), поэтому отвеши-вать и растворять его следует в перчатках и под тягой. Недостаточно чистый пре-парат можно перекристаллизовать. Для этого 70 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при 50°, фильтруют при этой же температуре, затем охлаждают до — 20°, быстро промывают кристаллы холодным хлороформом и высушивают в вакуум-эксикаторе. Для освобождения от УФ-поглощающих примесей акриламид можно обработать активированным углем. Для этого в маточный 30 — 40%-ный водный раствор акриламида в смеси с метиленбисакриламидом добавляют акти-вированный уголь (примерно 50 г/л), суспензию перемешивают в течение 30 мин и фильтруют сначала через бумажный, а затем через стекловолокнистый фильтр. NN’-Метиленбисакриламид («Бис») — используют в качестве «сшивки» линейных полимеров акриламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02% акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке. В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из ацетона (12 г/л) в тех же усло-виях, что и акриламид. Условия хранения и токсичность — такие же, как у акриламида. В качестве «сшивки» иногда используют этилендиакрилат — СН2 = СН — СО — O — СН2 — СН2 — О — СО — СН = СН2, а также NN’-диаллилтартардиамид (ДАТД) —

CH2 = CH — CH2 — NH —CO — CH(OH) — CH(OH) — CO — NH — CH2 — CH = CH2. С их помощью получают «растворимые» гели. В первом случае эфирную связь можно разорвать обработкой геля щелочью или водным раствором пипери-дина. Гели, сшитые ДАТД, растворяются за 20 — 30 мин при комнатной темпера-туре в 2%-ной йодной кислоте.

2.3. Процесс полимеризации ПААГ.

При подготовке определенной серии опытов удобно заранее приготовить концентрированный (30 — 40%) водный раствор акриламида и метиленбисакрил-амида с определенным соотношением обоих мономеров. Такой раствор можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель. Так же хранят и маточный раствор буфера, например 10-кратной концентрации. ТЕМЕД хранится хорошо, а персульфат аммония растворяют в воде непо-средственно перед началом опыта. Для приготовления геля маточные растворы мономеров и буфера смешивают в такой пропорции, чтобы получить нужную конечную концентрацию акриламида и буфера, дополняют до расчетного объема водой и вносят ТЕМЕД. После этого раствор деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к водоструйному насосу, добавляют расчетный объем раствора персульфата и заливают в трубку или между стеклами для формирования пластин. При правильном выборе концентраций персульфата и ТЕМЕД полимеризация занимает 30 — 40 мин.Ее следует вести вдали от яркого источника света. Рассмотрим некоторые факторы, влияющие на этот процесс. Наибольшую опасность для нормального протекания полимеризации акриламида представляет растворенный в воде кислород, молекула которого является опреде-ленного рода бирадикалом и потому способна оборвать цепную реакцию свободно-радикальной полимеризации акриламида. Деаэрация смеси растворов необходима именно для удаления из нее растворенного кислорода. Ее можно вести достаточно энергично и с перемешиванием — так, чтобы жидкость при пониженном давлении закипела, но как только интенсивное выделение пузырей газа закончится, деа- эрацию следует прекратить, не допуская заметного испарения воды. Обычно эта процедура занимает несколько минут при комнатной температуре. Кислород воздуха в контакте с раствором мономеров может помешать полимеризации, поэто-му на поверхность раствора осторожно наслаивают до высоты 3 — 5 мм деаэри-рованную кипячением воду или изобутанол. Наслаивать следует по стенке формы через иглу от шприца с помощью перистальтического насоса. Им же удобно отсо-сать воду после окончания полимеризации геля. Вначале граница между гелем и водой исчезает, но затем вновь появляется, что указывает на окончание процесса полимеризации. Если в качестве инициатора используют рибофлавин, то форму с раствором мономеров освещают люминесцентной лампой «дневного света» с расстояния около 5см в течение30 — 45мин. Уже указывалось, что рибофлавин является более эффективным инициатором, чем персульфат. Кроме того, продукты его распада не опасны для белков и нуклеиновых кислот, в то время как ион пер-сульфата может вступать в реакцию с белками, создавая артефакты при их фракци-онировании. В тех случаях, когдаэто существенно, персульфат удаляют путем предварительного электрофореза («преэлектрофореза») геля до внесения в него препарата, однако полностью это сделать не удается. Тем не менее в последние годы в качестве инициатора предпочтение отдают персульфату, поскольку при работе с рибофлавином довольно трудно подобрать оптимальную степень деаэри-рования растворов. С одной стороны, растворенный кислород препятствует полимеризации, а с другой — он необходим, хотя и в небольшом количестве, для самого процесса инициации с участием рибофлавина. Полимеризация — экзотер-мический процесс, поэтому в случае высокой концентрации акриламида во избежа-ние образования пузырей газа и нарушения однородности геля необходимо обес-печить отвод тепла. Вместе с тем скорость полимеризации увеличивается с ростом температуры за счет ускорения образования свободных радикалов. Этим можно воспользоваться для замедления полимеризации: при охлаждении геля на 1° ее продолжительность увеличивается примерно на 2 мин. Полимеризацию гелей, содержащих более 15% акриламида, лучше вести на холоду. Гель получается наи-более однородным, если время полимеризации составляет 30 — 40 мин. Обычно этого добиваются эмпирически, подбирая оптимальную концентрацию персуль-фата. Она может варьировать в пределах от 0,02 до 0,2% в зависимости от концен-трации акриламида и качества самого персульфата. С увеличением содержания акриламида концентрацию персульфата приходится уменьшать. Имеет смысл предварительно внести различные количества данного препарата персульфата в ряд пробирок с рабочим раствором мономеров акриламида, наблюдая продолжи-тельность полимеризации в них.

2.4. Выбор концентраций мономеров.

Для удобства изложения используются следующие обозначения: Т — процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему их раствора, С — процентное отношение массы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров. Величина Т практически варьирует в пределах 3 — 30%, а С, как правило, составляет 1—5%, что соответствует отношению акриламид/Бис в пределах от 99:1 по 19:1. Однако в некоторых особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать С до 20% и более. При указании значений Т и С значок «%» далее будет опущен. Для крупнопористых гелей надо увеличивать степень сшивки (повышать величину С до 3 — 5), т. е. отношение акриламид/Бис брать в пределах от 35:1до20:1. При этом происходит одновременное повышение прочности геля и ухудшение его способности прилипать к стеклу — гель как бы «замыкается». Мелкопористые гели (T около 20) при высоком содержании «сшивки» оказываются хрупкими и мутными, поэтому для них величина С не должна превышать 1 — 2. Неправильно было бы считать ПААГ регулярной пространственной решеткой с жесткими ячейками определенного среднего размера. При малых зна-чениях С он представляет собой скорее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь вот дельных точках случайным образом сшитые между собой. Расстояние между этими точками вдоль нити (при C 2) в среднем равно 50 — 100 мономерных единиц. Такая система не может быть внутренне жесткой. Мигрирующие в геле мак- ромолекулы, по-видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линей-ных полимеров акриламида. Разумеется, на это расходуется энергия, миграция мо-лекул замедляется и происходит своеобразное «трение» их о гель. Однако жестких ограничений на размер мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это очень существенно. Чем больше содержание акриламида, тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания «сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля, так как средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биопо-лимеров в геле замедляется, — именно этого и можно было ожидать. Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень высоким содержанием метиленбисак-риламида (С > 15) хрупки, легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окраши-ваются. Этих недостатков лишены гели, сшитые NN/-диaллилтapтapдиaмидом. Например, гель с T = 5 и С = 15, сшитый ДАТД, оказывается настолько крупно пористым, что не тормозит миграцию биополимеров с молекулярной массой 0,5млн. дальтон; при этом он механически прочен, хорошо сцепляется со стеклом и прозрачен. Вспомним, что такой гель к тому же растворим в йодной кислоте.

Недавно описано успешное использование для электрофореза белков еще сильнее сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27,т.е. отношение акриламид/ДАТД не превышало 4 : 1. Рассмотрим теперь подробнее влияние выбора значений Т и С для обыч-ного ПААГ на скорость миграции в нем биополимеров. Тормозящий эффект тре-ния о гель проявляется в снижении электрофоретической подвижности заряженных макромолекул вгеле (и’) по сравнению с их подвижностью в свободной жидкости с такими же, как у буфера геля, значениями рН и ионной силы раствора (u0). Электрофоретическую подвижность определяют как величину скорости миграции заряженных молекул(см/ч)при напряженности поля 1 В/см. Величина и0 зависит от соотношения суммарного электрического заряда макромолекулы(при данном рН) и ее массы. Сила, действующая на молекулу в электрическом поле, пропорциональна заряду, а противодействующая миграции вдоль силовых линий поля сила трения о жидкость пропорциональна линейному размеру молекулы, а следовательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки заметим, что электрофоретическая подвижность большинства кислых белков в свободной жид-кости при рН 8,8 лежит в пределах 0,1 — 0,5 см/ч на 1 В/см. Прямой корреляции между массой молекулы и величиной и0, очевидно, быть не должно. В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее, чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е. чем больше величина Т (для малых значений С).

Показано, что имеет место соотношение: ln(и’/и0) = — kRT. Величина коэффициента торможения kR (порядка 0,1— 0,4) зависит от среднего радиуса молекулы R и степени сшивки геля С, слабо увеличиваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобулярных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина(M = 12400) до 3,61 нм для церулоплазмина (M = 151 000). Для эффективного разделения белков при электрофорезе в ПААГ соотношение u’/u0 должно составлять 0,1 — 0,2. Отсюда следует, что оптимальная электрофорети-ческая подвижность белков в ПААГ лежит в пределах 0,01— 0,1 см/ч на 1 В/см. При напряженности поля 10 — 20 В/см этому соответствуют скорости миграции белков в диапазоне 0,1 — 2 см/ч. Таким образом, прирабочей длине геля 10см за 5ч электрофореза наиболее быстрые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентировки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения от них. Например, если заранее известно, что разделяемые белки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижностей (и’), т. е. в более крупно пористых гелях, и тем сократить время фракционирования в 2 — 3 раза. Выбор значения Т зависит от природы различия электрофоретических подвижностей белков в геле. Если сильно различаются размеры молекул, а отноше-ние заряда к массе у них более или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным. Разделение в этом случае будет происходить только за счет трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при этом в связи с увеличени-ем продолжительности электрофореза усилится диффузия белков. Если же компо-ненты анализируемой смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле при малых значениях Т), т.е. как бы в свободной жидкости, почти не используя эффект трения молекул о гель. По крайней мере, это обеспечит выигрыш во времени фракционирования.

2.5. Миграция белков в геле.

Отличие и’ от uо является сила трения о гель, которая зависит от соотно-шения линейных размеров макромолекул и пор геля, а следовательно, от молеку-лярных масс белков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляющего большинства индивидуальных белков не превышают 500 000. Поэтому исполь-зование гелей агарозы оказывается нецелесообразным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести только по величине отношения заряда к массе. Как правило, электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем 5 — 20% акриламида. Белки являются, цвиттерионами. Их суммарным зарядом, а следовательно и отношением заряда к массе, можно управлять путем изменения рН буфера, в котором полимеризуют ПААГ и ведут электрофорез и который далее будем именовать рабочим. Очевидно, что оптимальное значение рН рабочего буфера обусловливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков, состав-ляющих исходную смесь. Поэтому в большинстве случаев нецелесообразно ис-пользовать экстремальные величины рН рабочего буфера, слишком удаленны не от изоэлектрических точек всех белков смеси. Для обычных кислых белков оптималь-ные значения рН буфера оказываются в нейтральной или слабощелочной области; миграция белков идет в направлении от катода к аноду. Для щелочных белков (гистонов, белков рибосом и др.) целесообразно использовать слабокислые буферы (рН 4 — 5). Эти белки различаются по величине суммарного положительного заряда и мигрируют в направлении от анода к катоду. Отметим, что эффект трения о гель зависит не только от молекулярной массы, но и от конфигурации и жесткости белковой макромолекулы. Глобулярные белки, неспособные к агрегации или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или менее одинаково, хотя их размеры зависят от плотности упаковки глобу-лы. Рыхлые глобулярные и, особенно, фибриллярные белки могут деформировать-ся при взаимодействии с гелем и тем самым облегчать себе миграцию между его нитями. Этот эффект особенно сильно выражен у высокомолекулярных нуклеино-вых кислот. Для однозначного определения молекулярной массы белка по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесообразно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей жесткость. Именно такой прием используется при электрофорезе белков, обработанных додецилсульфатом натрия.

1. Красители используемые для проявления белков. Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препарат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом связываться с белками, а скорость его продвиже-ния по гелю должна быть заведомо больше, чему наиболее быстро мигрирующего белка. Вместе с тем краситель не должен слишком сильно отрываться от белков, чтобы его прохождению до конца пластины или трубки соответствовало исполь-зование большей частинаходящегося в них геля для фракционирования белков. В щелочных и нейтральных буферах, когда кислые белки заряжены отрицательно и мигрируют к аноду, а также для любых белков в комплексе с ДДС-Na используют отрицательно заряженные красители. Наибольшее распространение получил Бромфеноловый синий, имеющий достаточно сложную структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфенольных остатка. Иногда используют еще более сложно построенный краситель — ксиленцианол, электрофоретическая подвижность которого примерно вдвое ниже, чем бромфенолового синего, поэтому его используют при фракционировании крупных белков и нуклеиновых кислот. Для характеристики электрофоретической подвижности белка в данных условиях электрофореза принято указывать отношение расстояния, пройденного белковой полосой от начала рабочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя в этом же геле. Это отношение, как и в хроматографии, обозначают Rf В качестве положительно заряженного красителя для электрофореза в кислой среде, когда белки мигрируют в направлении катода, используют метиловый зеленый или пиронин.

В ходе работы был изучен метод электрофореза белков. Использование метода электрофореза в полиакриламидном геле для анализа и разделения сложных смесей белков и нуклеиновых кислот значительно расширило наши знания о белках. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет ряд преимуществ перед другими аналитическими методами: он отличается простотой в исполнении, хорошей воспроизводимостью результатов и не требует сложного оборудования.

Все цели и задачи которые были поставлены – изучены.

Список использованных источников.

источник

Электрофорез нуклеиновой кислоты представляет собой аналитический метод , используемый для разделения ДНК или РНК фрагменты по размеру и реакционной способности . Молекулы нуклеиновых кислот , которые должны быть проанализировано установлены на вязкие среды, гель , где электрическое поле индуцирует нуклеиновые кислоты (которые отрицательно заряженные из — за их сахарный фосфатный позвоночник) , чтобы мигрировать по направлению к аноду (который положительно заряженная потому это электролитический , а не гальванический элемент ). Разделение этих фрагментов достигается за счет использования подвижностей с которыми разного размера молекулы , которые способны пройти через гель. Более длинные молекулы мигрируют медленнее , потому что они испытывают большее сопротивление внутри геля. Поскольку размер молекулы влияет на его подвижность, более мелкие фрагменты , в конечном итоге ближе к аноду , чем более длинные в течение определенного периода. Через какое — то время, напряжение снимается и градиент фрагментации анализируется. Для больших расстояний между аналогичными фрагментами размером, либо напряжение , либо время выполнения может быть увеличено. Расширенные проходят через гель низкого напряжения дает наиболее точное разрешение. Напряжение, однако, не является единственным фактором, определяющим электрофорез нуклеиновых кислот.

Нуклеиновая кислота должны быть разделены , может быть получена несколько способов перед разделением с помощью электрофореза. В случае больших молекул ДНК, ДНК часто режут на более мелкие фрагменты с использованием ДНК эндонуклеазы рестрикции (или рестриктазы). В других случаях, такие как ПЦР амплифицированных образцы, ферменты , присутствующие в образце , которые могут повлиять на разделение молекул удаляются с помощью различных средств перед проведением анализа. После того, как нуклеиновая кислота должным образом подготовлены образцы раствора нуклеиновой кислоты помещают в лунки геля и напряжение прикладывается через гель в течение определенного промежутка времени.

Фрагменты ДНК различной длины визуализировали с использованием флуоресцентного красителя , характерным для ДНК, таких как бромид этидия . Гель показывает полосы , соответствующих различные молекулы нуклеиновых кислот популяций с различной молекулярной массой. Размер фрагмента, как правило , сообщается в «нуклеотидов», «пар оснований» или «т.п.н.» (для тысяч пар оснований) в зависимости от того, был ли отделен одно- или двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Определение размера фрагмента , как правило , осуществляется путем сравнения с коммерчески доступными ДНК — маркеры , содержащие линейные фрагменты ДНК известной длины.

Типы геля , наиболее часто используемые для электрофореза нуклеиновых кислот являются агарозы (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламида (за большой размер коротких молекул ДНК, например , в последовательности ДНК ). Гели были традиционно работают в формате «плиты» , такой как показано на рисунке, но капиллярный электрофорез стало важным для таких применений, как секвенирования ДНК с высокой пропускной способностью . Методы , используемые для электрофореза в оценке повреждений ДНК , включают щелочной гель — электрофорез и электрофорез в импульсном поле геля .

Для коротких сегментов ДНК , такой как от 20 до 60 пар оснований двухцепочечной ДНК, запуская их в полиакриламидном геле (ПААГ) даст лучшее разрешение (родное состояние). Аналогичным образом , РНК и одноцепочечной ДНК можно запускать и визуализировали с помощью PAGE гелей , содержащих денатурирующих агентов , таких как мочевина. PAGE гели широко используются в методах , такие как ДНК — футовых печати, EMSA и другие методы взаимодействия ДНК-белок.

Измерение и анализ в основном осуществляются с помощью специализированного программного обеспечения для анализа геля. Капиллярная результаты электрофореза , как правило , отображается в виде следов , называемого electropherogram .

Ряд факторов может повлиять на миграцию нуклеиновых кислот: размерность поры геля, напряжение , используемое, ионную силу буфера и концентрации интеркалирующего краситель , такие как бромид этидий , если используются во время электрофореза.

Гель сит ДНК размером молекулы ДНК в результате чего более мелкие молекулы движутся быстрее. Двухцепочечной ДНК движется со скоростью , которая приблизительно обратно пропорциональна логарифму числа пар оснований. Это соотношение , однако ломается при очень больших фрагментах ДНК , и это не возможно , чтобы отделить их с использованием стандартного электрофореза в агарозном геле . Предел разрешения зависит от состава геля и напряженности поля. и подвижность большой кольцевой ДНК может быть более сильно , чем влияние линейной ДНК размера пор гель. Разделение очень больших фрагментов ДНК требует гель — электрофореза поля импульса (PFGE). В электрофорезе геля инверсии поля (ФИГА, своего рода PFGE), можно иметь «инверсию зон» — где большие молекулы могут двигаться быстрее , чем малые молекулы.

Конформации молекулы ДНК могут существенно влиять на движении ДНК, например, суперспирализовано ДНК , как правило , двигается быстрее , чем расслабленный ДНК , поскольку она плотно спиральная и , следовательно , более компактным. В нормальной подготовке плазмидной ДНК, множественные формы ДНК могут присутствовать, и гель — электрофореза из плазмид обычно показывает основную группу , которая была бы отрицательно суперспирализована форма, в то время как другие формы ДНК могут появляться как незначительные слабые полосы. Эти небольшие полосы могут быть зазубрины ДНК (открыть круглую форму) и расслаблена закрыта круглая форма , которые обычно работают медленнее , чем суперспиральный ДНК и одноцепочечная форма (которые иногда могут появляться в зависимости от способов получения) могут двигаться вперед суперспирального ДНК , Скорость , с которой различными формами перемещения , однако , может изменяться с использованием различных условий электрофореза, например , линейные ДНК могут работать быстрее или медленнее , чем суперспирализованная ДНК в зависимости от условий и подвижность большой кольцевой ДНК может быть более сильным влиянием , чем линейная ДНК с помощью поры размер геля. Если суперспиральной ДНК — маркеры не используются, размер кольцевой ДНК плазмиды , как , следовательно , может быть более точно судить после того, как она была линеаризована рестрикции дайджеста .

Повреждение ДНК из — за увеличенное поперечное сшивание также приведет к уменьшению электрофоретической миграции ДНК в зависимости от дозы.

Круговая ДНК более сильно зависит от концентрации бромида этидия, чем линейная ДНК, если бромид этидия присутствует в геле при электрофорезе. Все встречающиеся в природе круги ДНК underwound, но бромид этидия, который интеркалирует в кольцевую ДНК может изменить заряд, длину, а также superhelicity молекулы ДНК, поэтому его присутствие при электрофорезе может повлиять на его перемещение в геле. Повышение этидийбромид интеркалированный в ДНК может изменить его с отрицательно суперспирализованной молекулы в полностью расслабленный вид, то положительно спиральная суперспираль при максимальной интеркаляции. Электрофорез в агарозном геле может быть использован для решения круговой ДНК с различной топологией суперспирализации.

Концентрация геля определяет размер пор геля , который влияет на миграцию ДНК. Разрешение ДНК изменяется с процентной концентрацией геля. Повышение концентрации агарозы геля снижает скорость миграции и улучшает разделение на более мелкие молекулы ДНК, при одновременном снижении концентрации геля позволяет большие молекулы ДНК должны быть разделены. Для стандартного электрофореза в агарозном геле, 0,7% дает хорошее разделение или разрешение крупных 5-10kb фрагментов ДНК, в то время как 2% гель дает хорошее разрешение небольших фрагментов 0.2-1kb. До 3% может быть использованы для отделения очень маленьких фрагментов , но вертикальный полиакриламидный гель будет более подходящим для решения небольших фрагментов. Высокие концентрации геля , однако , требует больше времени запускать раз (иногда дней) и высокий процент гелей часто являются хрупкими и могут не устанавливать равномерно. Высокий процент гели агарозов должны работать с PFGE или ФИГОЙ. Низкий процент гели (0,1-0,2%) являются хрупкими и могут сломаться. 1% гели являются общими для многих приложений.

При низких напряжениях, скорость миграции ДНК пропорциональна приложенного напряжения, т.е. чем выше напряжение, тем быстрее движется ДНК. Тем не менее, в увеличении напряженности электрического поля, подвижность высокой молекулярной массы фрагментов ДНК увеличивается дифференциально, и эффективный диапазон разделения уменьшается и, следовательно, разрешение ниже при высоком напряжении. Для получения оптимального разрешения ДНК больше, чем 2 КБ размера в стандартной гель-электрофореза, от 5 до 8 В / см рекомендуется. Напряжение также ограниченно тот факт, что он нагревает гель и может вызвать гель, чтобы расплавить, если гель проводит при высоком напряжении в течение длительного периода, особенно для низкой температуры плавления агарозного геля.

Подвижность ДНК, однако, может измениться в нестационарном поле. В поле, которое периодически обращено, подвижность ДНК определенного размера может значительно снижаться при определенной частоте езды на велосипеде. Это явление может привести к инверсии зон в результате чего более крупные фрагменты ДНК движутся быстрее, чем более мелкие в PFGE.

Отрицательный заряд его остова ДНК перемещает в сторону положительно заряженного анода при электрофорезе. Тем не менее, миграция молекул ДНК в растворе, в отсутствии гелевой матрицы, не зависит от молекулярной массы при электрофорезе, т.е. не существует никакого разделения по размеру без гелевой матрицы. Гидродинамическое взаимодействие между различными частями ДНК отрезано потоковыми противоионами двигается в противоположном направлении, так что не существует никакого механизма, чтобы генерировать зависимость скорости от длины на шкале больше, чем скрининг длиной около 10 нм. Это делает его отличным от других процессов, таких как седиментация или диффузии, где дальнодействующий гидродинамическое взаимодействие является важным.

Гелевая матрица, следовательно , отвечает за разделение ДНК по размерам в процессе электрофореза, однако точный механизм , ответственное разделение не совсем понятно. Ряд моделей существует для механизма разделения биомолекул в гелевой матрице, широко распространенный из них является модель Ogston , которая рассматривает матрицу полимера в виде сита , состоящее из случайно распределенной сети взаимосвязанных пор. Шаровые белки или случайная катушка ДНК перемещается через подсоединенные поры достаточно большой , чтобы вместить его прохождение, и движение больших молекул, более вероятно, будет затруднено и замедлены столкновениями с гелевой матрицей, а молекулы различных размеров могут поэтому быть разделены в этом процессе просеивания.

Модель Ogston однако ломается при больших молекул в результате чего поры значительно меньше , чем размер молекулы. Для молекул ДНК размера более 1 кб, А рептации модель (или его варианта) наиболее часто используется. Эта модель предполагает , что ДНК может сканировать в моде «змеиной» (отсюда «рептации») через пору в виде удлиненной молекулы. При более высокой напряженности электрического поля, это превратилось в необъективную модель рептаций, в результате чего передний конец молекулы становится сильно предвзятым в прямом направлении, и это передний край тянет остальную часть молекулы вместе. В полностью предвзятом режиме, подвижность достигается точка насыщения и ДНК сверх определенного размера не могут быть разделены. Идеальное параллельное выравнивание цепочки с полем , однако, не наблюдается на практике , поскольку это означало бы такую же подвижность для длинных и коротких молекул. Дальнейшее уточнение необъективной модели рептаций учитывает внутренние колебания цепи.

Предвзятая модель рептаций также была использована для объяснения подвижности ДНК в PFGE. Ориентация ДНК постепенно застроена рептациями после начала поля, а время она достигла стационарного режим скорости зависит от размера молекулы. Когда поле изменяются, более крупные молекулы занять больше времени, чтобы перепрофилировать, поэтому можно различить длинные цепочки, которые не могут достичь своей установившегося состояние скорости от коротких, которые путешествуют большую часть времени в постоянной скорости. Другие модели, однако, также существуют.

В режиме реального времени флуоресцентной микроскопии окрашенных молекул показали более тонкие динамики при электрофорезе, с ДНК, показывая значительную эластичность, как она попеременно растяжения в направлении приложенного поля, а затем договаривающуюся в шарик, или становится замкнув в U-образную форму, когда он получает пойманы на полимерных волокон. Это наблюдение можно назвать модель «гусеница». Другая модель предполагает, что ДНК запутывается с полимерной матрицей, и чем больше молекулы, тем более вероятно, запутаться и его движение затруднено.

Наиболее распространенный краситель , используемый , чтобы сделать ДНК или РНК полосы открыты для электрофореза в агарозном геле является бромид этидия , как правило , сокращенно EtBr. Это флуоресцирует в УФ — свете , когда интеркалированная в большую бороздку ДНК (или РНК). Выполнив ДНК через EtBr обработанного геля и визуализации его с УФ — светом, любая группа , содержащая больше , чем

20 нг ДНК становится отчетливо видны. EtBr является известным мутагены , и более безопасные альтернативы, такие как GelRed , производства Biotium , который связывается с малой бороздкой.

SYBR Green I является еще дц пятно, произведенный Invitrogen . Это дороже, но в 25 раз более чувствительны, и , возможно , безопаснее , чем EtBr, хотя нет никаких данных адресации его мутагенность или токсичности в организме человека.

SYBR Safe представляет собой вариант SYBR Green , который , как было показано , чтобы иметь достаточно низкий уровень мутагенности и токсичности считается безвредным отходов в соответствии с федеральными правилами США. Он имеет такой же уровень чувствительности к EtBr, но, как SYBR Green, значительно дороже. В странах , где безопасное удаление опасных отходов является обязательным, стоимость утилизации EtBr может легко перегнать первоначальную разницу в цене, однако.

Так как EtBr окрашенных ДНК не видны при естественном освещении, ученые смешивают ДНК с отрицательно заряженными загрузки буферов перед добавлением смеси в гель. Загрузка буфера являются полезными , поскольку они видны при естественном освещении (в отличие от УФ — излучений для EtBr окрашенных ДНК), и они со-осадок с ДНК (то есть они двигаются с той же скоростью , как ДНК определенной длиной). Ксиленцианол и бромфеноловый синий являются общими красители найдены в загрузке буферов; они работают примерно такой же скоростью, что и фрагменты ДНК , которые являются 5000 пар оснований и 300 пар оснований в длину , соответственно, но точное положение изменяется в зависимости от процентной доли геля. Другие менее часто используемые маркеры прогресса Cresol Красный и оранжевый G , который при температуре около 125 б.п. и 50 б.п., соответственно.

Визуализация также может быть достигнуто путем переноса ДНК , после того, как SDS-PAGE на нитроцеллюлозную мембрану с последующим воздействием на гибридизации зонда . Этот процесс называется Southern блоттинга .

Для люминесцентных красителей, после электрофореза гель освещается с ультрафиолетовой лампой (обычно путем размещения его на коробке света, при использовании защитного механизма , чтобы ограничить воздействие ультрафиолетового излучения). Устройство подсветки основном также содержит устройство формирования изображения , который принимает изображение геля, после освещения с УФ — излучением. Этидийбромид флуоресцирует красновато-оранжевый в присутствии ДНК, поскольку она интеркалированный с ДНК. Полосу ДНК также может быть вырезана из геля, а затем может быть растворена для получения очищенной ДНК. Гель может быть затем сфотографировал , как правило , с цифровой или поляроидной камерой. Несмотря на то, окрашивали нуклеиновой кислоты флуоресцирует красновато-оранжевый, изображения, как правило , представлены в черно-белый (см фигуры). УФ повреждение образца ДНК может снизить эффективность последующей манипуляции с образцом, таким как лигирование и клонирование. УФ — излучение , длина волны (короче 302 или 312 нм) вызывает больший ущерб, например , воздействия всего за 45 секунд может значительно снизить эффективность трансформации . Поэтому , если ДНК будет использовать для последующих процедур, воздействие более короткой длиной волны УФ — излучения должна быть ограничена, а не более длины волны УФ — излучения (365 нм) , которые вызывают меньше повреждений , следует использовать. Более высокие длины волны излучения , однако производит более слабую флуоресценцию, поэтому , если необходимо , чтобы захватить изображение геля, более короткая длина волны ультрафиолетового света может быть использован короткий промежуток времени. Добавление цитидин или гуанозин в буфер электрофореза в концентрации 1 мМ может защищать ДНК от повреждений. В качестве альтернативы, синий источник света возбуждения с синимами-возбудимым пятном , такими как SYBR Green или GelGreen может быть использован.

Гель исследование электрофореза часто использует преимущества программного обеспечение на основе инструментов анализа изображений, такие как ImageJ .

источник

Часть 3. Современные вопросы генных технологий

Методы исследования нуклеиновых кислот. Методы выделения ДНК из растительных и животных тканей и её очищение. Ферменты, используемые для генно-инженерных исследований. Рестриктазы. ДНК-зонды. Электрофорез ДНК. Идентификация фрагментов ДНК и РНК методами гибридизации. Саузерн-, Норзерн-, Вестерн-блоттинг. Клонирование фрагментов нуклеиновых кислот in vitro. Полимеразная цепная реакция. Секвенирование ДНК.

Методы ДНК-диагностики. Показания к ДНК-диагностике. Прямые и непрямые методы. ДНК-чипы. Молекулярно-генетические методы исследования в судебной медицине.

Методы исследования нуклеиновых кислот.Молекулярно-генетические методы — большая и разнообразная группа методов, в конечном счете, предназначенных для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат «манипуляции» с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70—80-х годах и последующего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы широко вошли в медико-генетическую практику.

Чтобы познакомить с сутью и терминологией молекулярно-генетических методов, ниже схематично описаны их основные этапы и варианты. Освоение этих методов, как и других методов лабораторной диагностики, требует спе­циальной подготовки в соответствующих лабораториях.

Получение образцов ДНК (или РНК) является исходным этапом всех ме­тодов. Этот этап реализуется в двух вариантах: а) выделение всей ДНК (то­тальной или геномной) из клеток; б) накопление определённых фрагментов, которые предполагается анализировать, с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма, поэто­му такие образцы называют геномной ДНК. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культу­ры фибробластов. Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК. Для этого требуется действительно небольшое количество биологического материала, например 20—40 мг хориона, 1 мл крови, 5—10 мг культуры клеток. Для осуществления некоторых методов достаточно иметь 1 каплю крови, соскоб эпителия со щеки или несколько волосяных луковиц. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов названной группы. К этому ещё можно добавить, что выде­ленная ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов мето­дов и может долго сохраняться в замороженном виде.

Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

Иногда бывает достаточно прокипятить образец в течение 5-10 мин., однако в большинстве случаев требуются более сложные методы.

Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК по Мармуру. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента — гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и.т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, т.к. возможна перекрестная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, возможно использование простых методов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время, использование подобных методов пробоподготовки для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам, вследствие использования в реакционной смеси некачественного препарата ДНК.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

Образцы тканей, получаемые при хирургических операциях, обычно фиксируют формалином и заливают в парафин. Такие фиксированные препараты также могут использоваться для проведения ПЦР.

Ферменты, используемые для генно-инженерных исследований. Рестриктазы. Одним из важнейших инструментов генной инженерии являются эндонуклеазы — ферменты, расщепляющие ДНК по специфическим по­следовательностям нуклеотидов внутри цепи. Эти ферменты получили название рестриктаз. Рестриктазы расщепляют ДНК на относительно небольшие фрагменты в участках строго определенных последова­тельностей. Этим их воздействие отличается от большинства других ферментативных, химических или физических воздействий, приво­дящих к случайным разрывам цепей ДНК. Рестриктазы (уже открыто более 200 типов ферментов этого класса) являются частью защитной системы бактерий, охраняющих собственный геном от чужеродной, главным образом вирусной ДНК. Рестриктазы принято именовать по названию бактерий, из которых их выделяют. Так, название EcoRI свидетельствует о том, что этот фермент из Esherichia coli, ВатН1 — из Bacillus amilolquefacientsi. Каждый фермент узнает определенную 4-7-членную последовательность в двухцепочечной ДНК. Разрезание ДНК по этим сайтам приводит к образованию либо «тупых» (например, при действии рестриктаз Hpal), либо «липких», то есть перекрывающихся (например, ВатН1), концов. Для конструирования гибридных молекул особенно удобны липкие концы. Любой фрагмент ДНК об­ладает характерным расположением сайтов узнавания различных ре­стриктаз, что позволяет строить так называемые рестриктазные карты. При расщеплении ДНК какой-либо одной рестриктазой получают смесь фрагментов, каждый из которых имеет одни и те же концевые участ­ки. Такие фрагменты можно разделить и идентифицировать методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

Часть ферментов, применяемых для исследования ДНК, представлена в таблице 10.

ДНК-зонды. Информация обо всем многообразии организма заключена в его генетическом материале. Так патогенность бактерий определяется наличием в них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК детерминирующий данный биологический признак имеет строго определенную последовательность и может служить диагностическим маркером.

В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот — спаривание двух комплиментарных сегментов разных молекул ДНК.

Табл.10. Основные ферменты, используемые в генной инженерии

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала.

Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.

Чтобы обеспечить адекватность диагностического теста гибридизационные ДНК- и РНК-зонды должны быть высокоспецифичнными. Другими словами необходимо, чтобы зонд гибридизовался только с искомой нуклеотидной последовательностью. Если есть вероятность получения ложноположительного (наличие гибридизационного сигнала в отсутствии последовательности мишени) или ложноотрицательного (отсутствие сигнала при наличии последовательности — мишени) результата, то целесообразность применения теста значительно снижает специфичность зондов, которая может проявляться на разных уровнях: они могут «различать» два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК и РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представляют собой продукт химического синтеза, клонированные интактнные гены или их фрагменты.

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифических зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК- мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифициравать с помощью ПЦР.

В качестве примера использования ДНК-зонда для диагностики заболеваний можно привести процедуру обнаружения Plasmodium falciparum. Этот паразит вызывает малярию, заболевание, которое угрожает примерно трети всего населения Земли. Он инфицирует эритроциты и разрушает их, что приводит к развитию лихорадки, а в тяжелых случаях к поражению мозга, почек и других органов. Чтобы выявить источники инфекции, оценить эффективность мер по их ликвидации и обеспечить раннюю диагностику и лечение, необходимо достаточно чувствительные, простые и недорогие методы. В настоящее время малярию диагностируют с помощью микроскопического исследования мазков крови — эффективного, но трудоемкого и занимающего много времени процесса. Иммунологические методы обнаружения Plasmodium, такие как ELISA, достаточно быстрые и их легко автоматизировать, но с их помощью нельзя отличить текущую инфекцию от прошедшей, поскольку при этом определяются только наличие антител к Plasmodium в крови больного. Для избирательной ДНК-диагностики текущей инфекции, т.е. для выявления ДНК-возбудителя, в качестве основы используют высокоповторяющиеся последовательности ДНК Plasmodium falciparum. Сначала с помощью ДНК-зонда проводят скрининг библиотеки геномной ДНК паразита. Затем отбираются клоны дающие наиболее интенсивный гибридизационный сигнал, поскольку именно они предположительно содержат высокоповторяющиеся последовательности. ДНК каждого из отобранных клонов проверяют на способность к гибридизации с ДНК видов Plasmodium, не вызывающих малярию. В качестве специфического зонда выбирается последовательность гибридизующейся ДНК с Plasmodium falciparum, но не с ДНК Plasmodium vivax, Plasmodium cynomolgi или с ДНК человека. С его помощью можно обнаружить всего 10 пг очищенной ДНК Plasmodium falciparum или 1 нг той же ДНК в крови больного.

Получено и охарактеризовано более 100 различных ДНК-зондов,
позволяющих обнаруживать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. Так имеются зонды для диагностики бактериальных инфекций человека, вызываемых Legionella рheumoniae (респираторные заболевания), Salmonella typhimurium (пищевое отравление), Campylobacter hyointestinalis (racтриты), a также для выявления энтеротоксичного штамма Escherichia coli (гастроэнтериты) однако это лишь «верхушка айсберга»; в принципе с помощью гибридизации можно выявлять практически любые патогенные микроорганизмы.

В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего 32 Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошие отношение сигнал / шум. Радиоактивный меченый зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии.

Однако 32 Р является короткоживущим изотопом, испускающим высокоэнергетическое излучение; при работе с ним необходимо использовать специальное оборудование и обеспечить безопасную утилизацию отходов. Чтобы обойти эти трудности, были созданы не радиоактивные системы детекции. Для усиления гибридизационного сигнала в этом случае используется ферментативное превращение хромогенного или хемилюминесцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяют окраску, а второй — испускает свет.

Один из недавно разработанных нерадиоактивных методов детекции основан на использовании зонда — «молекулярного маяка».

Такой зонд состоит из 25 нуклеотидов. К 5′ концу присоединен флуоресцентный хромофор, а к 3′ концу — не флуоресцентный хромофор, на который передается энергия возбуждения флуорофора. В растворе при комнатной температуре маяк имеет такую конфигурацию, при которой флуорофор и тушитель находиться в тесном контакте и флуоресценция флуорофора тушится. Когда 15 средних нуклеотидов зонда гибридизуется с комплементарной последовательностью ДНК- и РНК-мишени, происходит пространственное разделение флуорофора и тушителя и зонд испускает свет. Необходимо также, чтобы все 15 нуклеотидов зонда были комплементарными соответствующей последовательности ДНК- и РНК-мишени.

Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещённом в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определённое положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путём сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.

Идентификация фрагментов ДНК и РНК методами гибридизации в геле является либо ко­нечным этапом диагностики, либо необходимым элементом дальнейшего анализа. Для идентификации и выделения, интересующих исследователя клонов бактерий с химерной ДНК разработан метод гибридизации в бак­териальных колониях. Для этого на многочисленные колонии бактерии, выращенные на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Часть бактерий прилипает к фильтру. После лизиса клеток, денатурации и фиксирования ДНК фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченым зондом. По окончании гибридизации фильтр отмывают от избытка зонда и выявляют образовавшийся меченый ги­бридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту из них, которая дала положительный сигнал.

Все разновидности методов гибридизации базируются на ком­плементарных взаимодействиях азотистых оснований разных цепей нуклеиновых кислот. Точное соответствие последовательностей гибридизующихся фрагментов приводит к быстрому образованию прочного устойчивого комплекса.

В целом методы гибридизационного анализа можна разделить на два типа:

· методы гибридизационного анализа, про­водимые в растворе (гомологичные);

· методы гибридизационного анализа, про­водимые на твердом носителе (гетерогенные).

Метод гибридизации в растворе. При гибридизации в растворе искомая нук­леиновая кислота и зонд свободно взаимодейст­вуют в водной реакционной смеси, что повышает скорость процесса гибридизации. Детекцию ре­зультатов гибридизации в растворе осуществля­ют путем нуклеазного гидролиза одноцепочечных ДНК и выделения оставшихся двухцепочеч­ных гибридов, содержащих меченый зонд.

Для успешного проведения реакции гибриди­зации в растворе необходимо применять одноце­почечные зонды, неспособные к самогибридиза­ции. Метод хорош еще и тем, что требует ми­нимальных объемов и количеств биологического и клинического образцов, поэтому может быть использован в диагностических целях. В то же время этот метод имеет один существенный не­достаток — на его основе можно создать диа­гностические тест-системы для выявления специ­фических фрагментов небольших участков ДНК при условии достаточно высокой концентрации искомых фрагментов или участков в исследуе­мом образце. Это снижает порог чувствительно­сти до уровня иммуноферментного анализа и да­же ниже.

Метод гибридизации на твердом носителе. Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверхности. В качестве твердой поверхности чаще всего используют поли­мерный мембранный фильтр, например, нейло­новую мембрану.

В большинстве случаев процедуру проведе­ния анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образца (в том числе экстра­кция и выделение ДНК), фиксация пробы на носителе, предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание не связавшихся продуктов, детекция.

Для подготовки пробы, может быть, необходи­мо предварительное «подращивание» исследуе­мого материала для идентификации отдельных колоний бактерий или увеличение концентрации вирусов в клеточной культуре. Проводится и непосредственный анализ образцов клеток, мочи, уретральных соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие инфек­ционных агентов. Для освобождения нуклеино­вых кислот из состава клеточных структур про­водят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т.е. переход в одноцепочечную форму, происходит при обработке щелочью. За­тем образец нуклеиновой кислоты фиксируют на носителе — нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 ч при 80°С в вакууме. Далее в процес­се предгибридизации достигается инактивация свободных мест связывания для уменьшения не­специфического взаимодействия зонда с мембра­ной. После чего искомые фрагменты ДНК (РНК) комплементарно связываются со специфичес­ким зондом, и тогда данный метод называют ДНК-зондовой диагностикой. Далее осуществля­ют детекцию одним из возможных методов (авторадиографическим, ферментативно-гибридизационным и т.д.).

Метод «сэндвич»- гибридизации. Метод является одной из разновидностей зондовой технологии (DNA-probe). При его исполь­зовании применяются два зонда, гомологичные различным участкам искомой нуклеиновой кис­лоты. Один зонд фиксируют на мем­бране для того, чтобы связать искомую нуклеи­новую кислоту, присутствующую в исследуемом образце. После осуществления гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий второй зонд, который имеет определенную метку. Процесс гибридизации проводят повторно, и при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым участ­ком ДНК (РНК).

Методы блот-гибридизации. Идентификация конкретных фрагментов в геле среди геномной ДНК явля­ется более сложной задачей. Из-за больших размеров генома человека после рестрикции образуется настолько большое число рестриктных фрагментов, что агарозный гель после электрофореза и окраски этидия бромидом при ультра­фиолетовом облучении выглядит как более или менее равномерно окрашен­ная поверхность. Задача генетика — выявить специфические фрагменты ДНК.

ДНК, разделенную гель-электрофорезом, можно перенести с геля на нитроцеллюлозный фильтр. Для этого ее денатурируют в геле щелочью, нейтрализуют гель, и затем прикладывают к нему нитроцеллюлозный фильтр, обеспечивая медленный ток буфера через гель и фильтр. Денатурированная ДНК диффундирует и задерживается на фильтре, после нагревания, которого в вакууме она «запекается» и иммобили­зуется, т. е. обездвиживается на фильтре. Ее распределение на плоскости фильтра точно такое же, как и на плоскости геля. Однако в отличие от геля фильтр с ДНК можно использовать для последующей гибриди­зации с меченой пробой, т. е. с мечеными ДНК и РНК. Для этого инкубируют фильтр с раствором, содержащим меченую пробу, при повышенной температуре, затем тща­тельно отмывают его и, наконец, подвергают авторадиографии, т. е. выдерживают с рентгеновской фотопленкой. При проявлении последней на ней выявляются полосы, соответствующие полосам ДНК на фильтре, сгибридизовавшимся с радиоактивной пробой.

Процедура переноса ДНК с геля на фильтр обознача­ется английским термином blotting (промокание). Поэтому для таких фильтров с ДНК используется термин «блот» (blot). По имени автора Э. Саузерна эти блоты называются «блотами Саузерна» (Southern blots).

Вместо ДНК можно перенести на фильтры с геля РНК. Такие фильтры называют Норзерн-фильтрами [игра слов: фамилия Саузерн означает «южный»; фильтры с ДНК по Саузерну — южные блоты; фильтры с РНК шутливо обоз­начили как северные блоты (Northern); фильтры с бел­ками— как западные (Western)].

Чтобы про­водить гибридизацию с Саузерн- и Норзерн- фильтрами, содержащими весьма малые количества индивидуальных ДНК и РНК, были нужны очень высокомеченные пробы. Их научились делать путем энзиматического введения метки в выделенные препараты нуклеиновых кислот. Наи­более распространенный метод — это так называемая ник-трансляция (nick-translation). ДНК инкубируют с двумя ферментами, ДНК-полимеразой I и ДНКазой I (последняя берется в ничтожных количествах вместе с высокомеченными предшественниками ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфатами). ДНКаза вносит в двухцепочечную ДНК одноцепочечные разрывы. На эти места садится ДНК-полимераза и разрушает одну из цепей ДНК, одновременно заново ее застраивая, но используя при этом меченые предшественники. Таким образом, большая часть ДНК замещается радиоактивной, сохраняя при этом свою нуклеотидную последовательность. Есть и другие методы вклю­чения метки в ДНК и РНК.

Рассмотрим блот-гибридизацию по Саузерну (1975). Эта методика состоит из нескольких этапов этапов (рис.49).

После окончания электрофореза гель помещают в раствор основания (щелочи), в котором двухцепочечные фрагменты ДНК теряют связи и стано­вятся одноцепочечными.

Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр про­изводится в буферном растворе. Непосредственно на поверхность геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. Из-за капиллярного эффекта созда­ётся ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверх­ности. После переноса одноцепочечные нити фиксируют на фильтре. Распо­ложение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.

Для того чтобы визуально выявить нужные фрагменты (фиксированная на фильтре ДНК не видна), проводят гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченым радионуклидом или флюоресцен­тной

Рис.49. Блот-гибридизация по Саузерну

меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом (16—30 пар нуклеотидов) либо клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично ком­плементарна изучаемому участку геномной ДНК.

При инкубации фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, проис­ходит гибридизация комплементарных цепей ДНК-зонда и фрагмента на филь­тре. Неспецифически связанные молекулы зонда отмываются с помощью спе­циальной процедуры. Радиоактивно меченые участки выявляют путём экс­понирования фильтра с рентгеновской плёнкой (авторадиография). После проявления на плёнке видны полосы меченной зондом ДНК. Нерадиоактив­ные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител. Блот-гибиридизация — высокочувствительный, но дорогостоящий и тру­доемкий метод выявления специфических после­довательностей ДНК.

Метод норзерн-блот-гибридизации — Northern-blot. Метод используется для определения уров­ня экспрессии гена путем количественной оцен­ки иРНК. Метод сложный и длительный по выпол­нению (5—7 суток). Трудности связаны с необ­ходимостью блокировать при выделении РНК так называемые РНКазы, которые чрезвычай­но стабильны и устойчивы по отношению ко мно­гим химическим процедурам, применяемым при экстракции РНК. Процедуры блот-гибридизации по Э. Саузер­ну и нозерн-блот-гибридизации не нашли применения в клинической микробиологии, поскольку они трудоемки. Точками приложения данных методов явились задачи, связанные с проведением научных исследований и задач по изучению геномной структуры ДНК (РНК), а также для выявления точечных мутаций.

Метод гибридизации in situ (ISH — in situ hybridization). Метод основан на проведении процессов гиб­ридизации непосредственно на срезе или в мазке с использованием любых зондов. Частная методи­ка гибридизации in situ — FISH (fluorescent in situ hybridization), позволяет установить наличие патогена в препаратах, фиксированных в форма­лине, и залитых парафином срезах и пунктатах ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе. Метод гибридизации in situ ба­зируется на основных принципах гибридизации твердофазной и гибридизации в растворе. Чув­ствительность метода гибридизации in situ огра­ничена возможностью проникновения зондов внутрь клеток для связывания с искомой мише­нью. Процесс гибридизации проходит в тканях, при этом зонд снабжен флуоресцентной меткой. После промывки материала и удаления несвязавшихся молекул осуществляется детекция, для чего мазок или срез просматривают в флуоре­сцентном микроскопе. Метод ISH сложен для осуществления и по сравнению с другими моле­кулярными методами малочувствителен. Метод наиболее удобен для определения мишеней, например, вирусов в инфицированных клетках, ко­торые представлены большим числом копий.

Метод разветвленной ДНК (branch-DNA). Искомая нуклеиновая кислота связывается с улавливающим зондом, один конец которой ком­плементарен мишени, а другой — определенно­му концу усиливающего зонда. При этом усили­вающий зонд может быть комплементарен сле­дующему зонду и т.д. Количество зондов может быть велико, и все они связаны с несколькими (от одного до нескольких десятков) люминофора­ми, которые по мере увеличения количества свя­занных зондов усиливают (хеми-, флуоро-) лю­минесценцию. Преимуществом данного метода является возможность использования в одной ре­акции нескольких улавливающих и связывающихся с мишенью зондов, что обеспечивает вы­явление агентов, характеризующихся значитель­ной геномной гетерогенностью, например, вирус иммунодефицита человека.

Дата добавления: 2014-11-29 ; Просмотров: 2641 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник