Что такое электрофорез в пцр

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)— экспериментальный метод молекулярной биологии, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro.

Идея разработки метода ПЦР принадлежит американскому исследователю Kary Mullis, который в 1983 г. создал метод, позволивший амплифицировать ДНК в ходе циклических удвоений с помощью фермента ДНК-полимеразы в искусственных условиях. Через несколько лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., К. Mullis получил за нее Нобелевскую премию.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания- охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. ее существенно модифицировали за счет использования ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты способны выдерживать множество циклов реакции, что позволяет автоматизировать проведение ПЦР. Одна из наиболее часто использовавшихся термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-ДНК-полимеразой.

Суть метода.Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи фермента Taq- ДНК-полимеразы. Полимеразная цепная реакция позволяет получить амплификаты длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для увеличения длины ПЦР-продукта до 20-40 тыс. пар нуклеотидов применяют смесь различных полимераз, но все равно это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукаротической клетки.

Реакция проводится в программируемом термостате (амплификаторе) — приборе, который может проводить достаточно быстро

охлаждение и нагревание пробирок (обычно с точностью не менее 0,1 °С). Амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта» и последующего хранения. Для ПЦР в режиме реального времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-45 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации, отжига праймеров, элонгации (рис. 6.1 и 6.2). На рис. 6.1 представлена динамика изменения температуры в пробирке при проведении цикла ПЦР.

Рис. 6.1.График изменения температуры в пробирке в течение одного цикла полимеразной цепной реакции

Денатурация ДНК-матрицыпроводится с помощью нагревания реакционной смеси до 94-96 °С на 5-90 с, чтобы цепи ДНК разошлись. Следует отметить, что перед первым циклом осуществляют предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин для полной денатурации исходной матрицы, что позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Рис. 6.2.Схема первого цикла полимеразной цепной реакции

Стадия отжига праймеров.При плавном снижении температуры праймеры комплементарно связываются с матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно она на 4-5° ниже расчетной температуры плавления. Длительность стадии — 5-60 с.

Во время следующей стадии — элонгации— происходит синтез дочерней цепи ДНК на матрице материнской. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые ДНК-полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °С. Время элонгации, в основном зависящее от длины ПЦР-продукта, обычно составляет 1 мин на каждую тысячу пар оснований.

После проведения ПЦР проба инкубируется при температуре 72 °С в течение 10 мин. Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) при 100% эффективности теоретически возрастает в геометрической прогрессии по формуле Р = 2 n , где Р — количество специфического продукта, а η — число циклов реакции. Практически эффективность ПЦР меньше 100%, поэтому в действительности P = (1 + E) n ,где P — количество продукта; Е — средняя эффективность цикла; а n — число циклов реакции.

При большем, чем указано, количестве циклов реакции происходит накопление неспецифических продуктов последней. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен числом реагентов, присутствием ингибиторов и побочных продуктов реакции. На последних циклах рост замедляется, это называют «эффектом плато» (рис. 6.3). Кинетика ПЦР имеет экспоненциальный характер только на начальном этапе, после чего начинается выход на плато в силу истощений в реакции компонентов (dNTP, праймеров) и нарастающего температурного повреждения Таq-ДНК-полимеразы, конкуренции за фермент амплификонов.

Компоненты полимеразной цепной реакции.Компоненты, используемые в ПЦР, следующие: Taq-ДНК-полимераза, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буферный раствор, «прямой» и «обратный» праймеры, а также ДНК-матрица.

Фермент Taq-ДНК-полимераза. При оптимальных условиях в реакционной смеси ПЦР (50-100 мкл) фермент содержится в количестве 0,5-2 единиц на пробу. Taq-ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК до 1000 пар оснований в минуту. Увеличивая время полимеризации и подбирая новые разновидности ДНК-полимеразы, обладающие и экзонуклеазной (редактирующей) активностью, вырезающей ошибочные (некомплементарные) нуклеотиды, удалось получить очень

длинные амплифицированные ДНК — до 42 тыс. пар оснований (Лонг-ПЦР). Избыток Таq-ДНК-полимеразы увеличивает образование неспецифических продуктов ПЦР.

Рис. 6.3.Динамика накопления продукта при полимеразной цепной реакции

dNTP. Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), используемые в ПЦР, следующие: dATP, dGTP, gTTP, dCTP. dNTP содержатся в реакционной смеси в эквивалентных концентрациях от 200 до 500 мкм, так как избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание нуклеотидов в ПЦР.

Праймеры. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, каждый из последних комплементарен одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляет начало и конец амплифицируемого участка (рис. 6.4).

Поскольку праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты ДНК-матрицы (амплификоны), то они должны в реакционной смеси ПЦР присутствовать в избытке, и концентрация их составляет 0,5-1 мкМ. Специфичность получаемого продукта

ПЦР в значительной степени определяется так называемой температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепочечные структуры.

Рис. 6.4.Пример «прямого» и «обратного» праймеров

Буферная система. 10-кратный буфер для ПЦР чаще всего имеет состав: 0,5 М KCl; 0,2 М Трис-HCl, pH 8,4; 25 мМ MgCl₂; 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) — пример стандартной прописи буферной системы.

Tris Cl.Высокое значение рН нужно из-за того, что при повышении температуры рН Tris-буфера падает и при 72 °С составляет

KCl.Средние концентрации KCl стимулируют на 40-60% активность Taq-ДНК-полимеразы (но 0,2 M полностью ингибирует полимеразную активность).

MgCl₂.Диапазон рабочих концентраций: 0,5-5 мМ. Увеличение концентрации Mg 2+ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность ПЦР: увеличивается выход, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров.

Таким образом, слишком низкая концентрация Mg 2+ — низкий выход, слишком высокая — неспецифическая амплификация.

На молекулярном уровне: Mg 2+ образует комплексы с dNTP’s. Именно эти комплексы являются субстратом для Taq-ДНК- полимеразы. C Mg 2 + стехиометрически связываются dNTP’s, PPi, EDTA, PO₄. Повышение концентрации Mg 2+ вызывает повышение температуры плавления ДНК.

В полимеразной цепной реакции используется вода высокой очистки (MQ). В зависимости от конструкции прибора (если «крышка» амплификатора не нагревается) в реакцию бывает необходимым на ПЦР-смесь наслаивать стерильное минеральное масло для предотвращения испарения пробы.

ДНК-матрица. Общее количество ДНК, вносимой в пробирку для ПЦР, не должно превышать 1 мкг, ибо большой избыток неспецифической ДНК снижает специфичность и чувствительность ПЦРамплификации ДНК-матрицы. Подготовка пробы материала (выделение ДНК или РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами.

Чтобы ПЦР прошла успешно, должна произойти гибридизация праймеров с нужной последовательностью-мишенью. Если эта последовательность слегка различается у разных индивидуумов или у микроорганизмов из разных изолятов (т.е. имеет место полиморфизм), может произойти ее неполное спаривание с амплимером и нарушение нормальной амплификации, что приведет к получению ложноотрицательного результата. Следует отметить: у человека большая часть геномных последовательностей консервативна и не различается у разных индивидуумов, а потому обычно в таких случаях для работы подходят одинаковые наборы «консервативных» праймеров.

Контаминация.Для исключения ложноположительного результата необходимо обязательное использование чистых перчаток, одноразовых пробирок и наконечников к автоматическим пипеткам, проведение предварительной ультрафиолетовой обработки помещения и рабочих поверхностей столов и приборов. Подчеркнем: ДНКматрицы генов клеток, вирусов и бактерий пригодны для ПЦР в течение десятков лет даже после замораживания, высушивания, температурной или химической денатурации белков и др.

Чувствительность ПЦР порой достигает математически возможного предела (детекции 1 копии ДНК-матрицы), поэтому существует высокая степень опасности получения ложноположительного результата в силу переноса через предметы и реагенты как самой ДНКматрицы (реже), так и амплификонов (очень часто), получаемых в больших количествах во многих пробирках в течение ежедневной работы.

Причинами ложноположительных результатов являются следующие 3 вида контаминаций.

1. Контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов.

2. Контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена.

3. Контаминация продуктами амплификации (амплификонами). Она — наиболее частая причина ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики амплификоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы. Поэтому детекция продуктов ПЦР должна проводиться в изолированной комнате сотрудником, не производящим обработку клинических образцов и не готовящим реактивы для ПЦР. Приготовление основных растворов также должно производиться в отдельной чистой комнате. Все растворы следует хранить и использовать небольшими порциями.

Необходимо постоянно осуществлять собственные виды лабораторного контроля и периодически применять зашифрованные отрицательные и положительные контрольные образцы для оценки специфичности и чувствительности ПЦР-генодиагностических исследований. Неуклонно выполняя эти требования и выполняя в каждой ПЦР отрицательный контроль разных типов (на процедуру обратной транскрипции, буферный раствор, праймеры), можно практически исключить ложноположительные результаты ПЦР.

Очень важен для правильной интерпретации результатов выбор способов контроля. Положительный и отрицательный контроль должен быть хорошо охарактеризован. Часто используют ДНК из клеточных линий, заведомо содержащих или не содержащих последовательность-мишень. В каждом анализе нужны как минимум три вида контроля:

1) положительный контроль (образец заведомо содержит последовательность-мишень);

2) отрицательный контроль (образец заведомо не содержит последовательность-мишень);

3) бланк-контроль (реакционная смесь, в которой присутствуют все компоненты за исключением ДНК; бланк-контроль является индикатором загрязнений).

Один тип положительного контроля должен содержать максимальное число последовательностей-мишеней, другой — небольшое их число. Это позволяет определить чувствительность и эффективность ПЦР.

Детекция.Для анализа ПЦР-амплифицированной ДНК существуют разные методы: гель-электрофорез, дот-блот-гибридизацию и блот-гибридизацию по Саузерну. С их помощью можно анализировать большинство ПЦР-продуктов, но абсолютно точные результаты получают только при секвенировании. Следует отметить: в дальнейших главах будет описана модификация ПЦР — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, в которой детекция возрастания количества ПЦР-продуктов осуществляется непосредственно в пробирке при прохождении реакции (см. ниже).

Рис. 6.5.Фотография электрофоретического геля с ПЦР-продуктами

Присутствие специфического ПЦР-продукта (амплификона) в подавляющем большинстве случаев детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенных бромистым этидием агарозном или полиакриламидном гелях. Для такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНКстандарту. Дополнительные доказательства специфичности амплификона получают путем расщепления специфическими рестриктазными

ферментами или путем гибридизации со специфическим радиоактивным или флуоресцентным олигонуклеотидным зондом.

Рис. 6.6.Устройство горизонтальной электрофоретической камеры

Электрофорез в агарозном геле позволяет легко, без применения радиоизотопов, обнаружить амплифицированную ДНК и определить ее размер (рис. 6.5 и 6.6). Остановимся на некоторых ее особенностях применительно к анализу ПЦР-амплифицированной ДНК:

а) 10-20 мкл амплифицированной ДНК разделяют в 2% агарозном геле вместе со стандартными фрагментами размером 50-1000 пар нуклеотидов;

б) электрофорез проводят при высоком напряжении (10-15 В/см), поскольку образующиеся при ПЦР небольшие фрагменты сложно детектировать после электрофореза в течение ночи при небольшом напряжении вследствие их интенсивной диффузии.

Разрешение можно повысить, используя полиакриламидные или агарозные гели с высокой концентрацией агарозы (3-4%). Впрочем, если анализ нужно провести быстро и с небольшими затратами, вполне приемлемы 2% агарозные гели. Обычно при амплификации ДНК, выделенной из фиксированных тканей, выход ПЦР-продуктов ниже, и они менее специфичны, чем в случае амплификации высокоочищенной ДНК.

Метод гибридизации ПЦР-амплифицированной ДНК (по Саузер- ну) позволяет идентифицировать полосы в геле, наблюдаемые после электрофореза амплифицированной ДНК. Для гибридизации используются как изотопно, так и неизотопно меченые зонды.

Дот-блот-гибридизация дает простой ответ по типу «да-нет» и особенно полезна в тех случаях, когда проводится анализ большого числа образцов.

Прямое секвенирование амплифицированной ДНК — также высоконадежный метод доказательства ее специфичности, но применяется в основном для определения точечных мутаций генов. В последние годы для детекции и одновременно количественной оценки амплифицированной ДНК все больше начинают применять гибридизационно-ферментный метод на микропланшетах. Но существуют и другие варианты: используются олигонуклеотидный зонд, его метят дигоксигенином или флуоресцеином с последующим проявлением моноклональными антителами к дигоксигенину или флуоресцеину; меченные ферментами моноклональные антитела к двухцепочечной ДНК; зонд, меченный рутением (электрохемилюминесцентный метод). Весьма перспективна для количественных детекций амплификонов на гель-электрофореграммах миниатюрная видеокамера, передающая на экран монитора интенсивность флуоресценции полос ДНК-амплификонов, что позволяет одновременно получить соотношение полос ДНК-стандарта и ДНК-амплификонов исследуемого гена.

Результат ПЦР можно квалифицировать как положительный или отрицательный в зависимости от того, обнаружена в образце интересующая вас последовательность-мишень или нет. Однако нарушение нормального хода амплификации, недостаточная чувствительность метода и непредвиденный полиморфизм последовательности-мишени в области связывания праймеров или гибридизационного зонда порой обусловливают ложноотрицательный результат. При загрязнении образцов и случайной гомологии между зондом, праймерами и последовательностью, сходной с мишенью, получаются ложноположительные результаты.

Модификации.В последние годы широко используется такой простой прием, как «горячий старт ПЦР», который заключается в предварительном прогревании пробирок с ПЦР-амплификационной смесью при температуре 95 °С в течение 3-5 мин. Такой прием предупреждает амплификацию неспецифических ДНК-фрагментов

вследствие низкотемпературного, неспецифического спаривания праймеров.

При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице посредством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратная транскриптаза, ревертаза) синтезируют комплементарную ДНК (кДНК), затем использующуюся в качестве матрицы в ПЦР. ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) широко применяется для детекции РНК вирусов, определения экспрессии вирусных, бактериальных и клеточных генов по их РНК.

Существуют различные модификации ПЦР, использующиеся в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два этапа, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации продукты ПЦР, синтезированные на первом этапе. Часто в этих случаях для повышения специфичности посадки праймеров применяют систему так называемых вмонтированных праймеров, т. е. при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицированного на первом этапе участка ДНК.

В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР, т.е. одновременную амплификацию нескольких участков матричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые dNTP. Особого внимания заслуживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК. На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии генов и получения больших количеств кДНК. Реакция амплификации осуществима не только в растворах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации гибридизуются и выявляют комплементарные им участки ДНК на хромосомах. До настоящего времени доступными амплификации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 тыс. пар оснований. В последнее время благодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований (особый подбор праймеров, использование сразу двух различных ДНК-полимераз, специального температурного режима полимеразных циклов) возможно про-

ведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 тыс. пар оснований.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

В результате ПЦР получается множество копий одного или нескольких фрагментов ДНК. Для дальнейшей работы эти фрагменты надо каким-то способом зарегистрировать или сделать видимыми — визуализировать. Регистрировать ПЦР-продукт можно на протяжении всей реакции («ПЦР в реальном времени»), либо только после ее завершения (метод «FLASH-PCR» или визуализация в геле) (см. параграф 5.4.4). В настоящем параграфе обратимся к визуализации результатов ПЦР при электрофоретическом разделении молекул ДНК по размеру.

Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 0,7—2,5% с добавлением специального интеркалирующего (т.е. способного встраиваться в молекулу ДНК между парами оснований и флуоресцирующего только после встраивания в двунитевую молекулу ДНК) красителя ДНК, например бромистого этидия (можно использовать и другие подобные красители, например «SYBR Green I»). При заливке в геле формируют лунки (с помощью специальных гребенок, помещаемых в гель перед заливкой), в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы (с повышением концентрации скорость замедляется), напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера. Молекулы ДНК одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель соединяется с молекулами ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося, как правило, от 10 мин до 1 ч, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия ультрафиолета, поглощаемая интеркалирующим красителем в области 260 нм (для бромистого этидия), передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 им для бромистого этидия). Пример электрофореграммы, показывающей идентификацию гриба Altemana altemata в пробах пораженных листьев томата с помощью ПЦР, приведен на рис. В.11.

По яркости полос на геле можно приблизительно оценить количество ДНК в ПЦР-продукте. Для этого обычно используют стандартный маркер длин фрагментов. Концентрация фрагментов определенной длины известна из инструкции к маркеру, поэтому сравнивая яркость полученных фрагментов с яркостью фрагментов маркера, можно приблизительно оценить концентрацию ПЦР-продукта.

Существует также метод оценки концентрации ДИК в исходной матрице (очень приблизительный). Для этого используют фрагмент ДНК (внутренний стандарт), который, как и фрагмент определяемой ДНК, содержит участки отжига тех же праймеров. Этот фрагмент амплифицируют одновременно с образцом определяемой ДНК. Количество ДНК внутреннего стандарта известно. При одновременной амплификации «внутренний стандарт» дает продукт иного размера, чем целевой фрагмент. «Внутренний стандарт» часто используют в диагностических системах для контроля прохождения ПЦР («внутренний контроль»).

Для разделения близких по размеру фрагментов используют метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле. Для работы с полиакриламидными гелями применяют специальные камеры для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее приготовления агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до одного или нескольких нуклеотидов возникает редко, то в рутинной работе этот метод обычно не используют.

Модификации метода ПЦР, используемые при идентификации фито- патогенов.

ПЦР с применением обратной транскрипции (ОТ-ПЦР; RT-PCR, от англ. reverse transcription polymerase chain reaction). Обычный метод ПЦР применим для анализа только ДНК-содержащих организмов. Его нельзя использовать для выявления РНК-содержащих организмов, среди которых встречаются высокопатогенные вирусы и вироиды. Используемая при классическом ПЦР Год-полимераза не способна обеспечивать синтез ДНК на РНК-матрице. При диагностике РНК-содержащих организмов используют дополнительный фермент — РНК-зависимую ДПК- полимеразу, или обратную транскриптазу (reverse transcriptase). Реакция с участием обратной транскриптазы приводит к образованию одноцепочечной кДНК, комплементарной имеющейся РНК. В дальнейшем фрагмент кДНК амплифицируется с участием ДНК-полимеразы.

У метода ОТ-ПЦР есть другое полезное применение. Как известно, мРНК (матричная РНК) может образовываться только живым организмом, в то время как ДНК может сохраняться и в мертвых. Поэтому с помощью ОТ-ПЦР можно одновременно проводить идентификацию и оценку жизнеспособности патогенов в пробе.

ОТ-ПЦР также широко используется для оценки экспрессии генов: чем активнее ген, тем больше производится мРНК, что можно оценить с помощью ОТ-ПЦР. Для оценки количества ПЦР-продукта лучше использовать Real-Time ПЦР (см. параграф 5.4.4).

ПЦР с вложенной парой праймеров (гнездовая ПЦР, Nested PCR). Характерной особенностью данного варианта ПЦР является то, что в реакции последовательно участвуют две пары праймеров, при этом вторая пара праймеров участвует в амплифицикации фрагмента ДНК внутри продукта, полученного после завершения цикла реакций с парой внешних праймеров.

Существуют две технические альтернативы проведения ПЦР с вложенной парой праймеров. Согласно первой, в реакционной пробирке после проведения 15—30 циклов амплификации получают базовый фрагмент ДНК с участием внешних праймеров. Затем переносят аликвоту содержимого в другую пробирку, в которой находится реакционная смесь с внутренними праймерами, взаимодействующими с нуклеотидными последовательностями внутри полученного фрагмента, и проводят вторую амплификацию (реамплификацию), также включающую 15—30 циклов.

Альтернативный вариант гнездовой ПЦР предполагает подбор такой температуры отжига для первой стадии, при которой вложенная пара праймеров не взаимодействует с ДНК. В этом случае температуру амплификации с внутренними праймерами поддерживают на 10—15°С ниже, чем при реакции с внешними праймерами.

Увеличение числа копий ПЦР-продукта после первой реакции позволяет существенно увеличить чувствительность и специфичность диагностики. Перенесение продукта после первого цикла реакций во вторую пробирку может способствовать снижению концентрации ингибиторов полимеразной реакции, которые иногда присутствуют в препарате. Однако, с другой стороны, в этом случае возрастает вероятность получения ложноположительных результатов из-за возможного загрязнения пробы.

ПЦР в комбинации с ELISA (Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay) (ПЦР с иммунным захватом, Immunocapture PCR). ПЦР с иммунным захватом является примером совместного использования иммунохимических (см. параграф 5.6.2) и основанных на ПЦР методов диагностики фитопатогенов.

Образец, подлежащий исследованию (например, экстракт, содержащий детектируемый вирус), добавляют в микропробирку или в лунки микропланшета, на поверхности которых сорбированы антитела, специфически связывающие искомые вирусные частицы. Это позволяет захватить из раствора нужные вирусные частицы и увеличить концентрацию ДНК- матрицы. На следующей стадии из этих частиц освобождают вирусную ДНК или РНК и проводят, соответственно, НЦР или ОТ-ПЦР.

Обычно ПЦР с иммунным захватом усиливает специфичность и чувствительность диагностики фитопатогенов. Он также полезен в случае, если в образце присутствуют компоненты, ингибирующие полимеразную реакцию, поскольку снижает или устраняет их влияние.

Метод БИО-ГЩР (BIO-PCR) совмещает в себе культивирование микроорганизмов из пораженной пробы па селективной среде и последующее проведение ПЦР с целью идентификации определенных патогенов, накопившихся во время инкубации. Этот метод, широко применяемый для обнаружения фитопатогенных бактерий, может быть использован и для грибов.

При проведении анализа с помощью БИО-ПЦР исследуемый образец помещают на агаризованную или в жидкую селективную среду и инкубируют при оптимальных для выявляемого патогена условиях внешней среды. После инкубации определяемые бактерии накопятся в количестве, достаточном для диагностики. Затем их смывают с поверхности агара или осаждают из жидкой среды центрифугированием и отбирают от 1 до 10 мкл образца для ПЦР.

Этот метод отличается высокой чувствительностью и особенно подходит для быстро растущих видов. Метод БИО-ПЦР позволяет выявлять даже единичные экземпляры искомого фитопатогена в пробе.

источник

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Может быть использовано для диагностики инфекционных заболеваний, иммунологических исследований. Для проведения электрофоретического разделения продуктов ПЦР используют гель, приготовленный из агара. При этом используют агар со следующими характеристиками: содержание серы и общего азота не более 0,3 мас.% и 0,1 мас.% соответственно, зольность не превышает 1,2 мас.%. Полученный гель имеет прочность не ниже 500 г/см 2 , а показатель ЭЭО — 0,340,01. Способ обеспечивает расширение ассортимента гелеобразователей и снижение затрат на его использование.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, конкретно к способам диагностики инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Метод ПЦР применяют для выявления в исследуемых образцах специфических фрагментов нуклеиновых кислот микроорганизмов. Метод позволяет выявить единичные клетки возбудителей инфекционных заболеваний независимо от их природы, так как основан на многократном увеличении числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК), характерного для исследуемого организма.

Метод ПЦР состоит из трех основных процедур: подготовки исследуемого материала, которая обычно сводится к изоляции ДНК или РНК, собственно проведения ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК).

Реакцию обычно проводят в пробирках Эппендорфа. Все компоненты реакции вносят автоматической микропипеткой со съемным наконечником. Перед внесением в реакцию исследуемый материал обычно подвергается предварительной обработке. Тип обработки зависит как от вида возбудителя, так и от вида клинического материала. В простейших случаях достаточно прокипятить пробу в течение 5-10 минут, в более сложных время обработки может составить 3-4 часа. При постановке реакции в пробирку последовательно вносят определенные количества: деинонизированной стерильной воды; буфер для проведения реакции; стабилизатор реакции (бычий сывороточный альбумин или желатин); смесь всех четырех типов дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (элементов, из которых происходит синтез новых нитей ДНК); водный раствор обоих праймеров, специфичных в отношении связывания с исследуемым образцом; материал исследуемого клинического образца и термостабильную ДНК-полимеразу Tag. Сверху на пробу наслаивают стерильное вазелиновое масло для предотвращения испарения реакционной смеси во время проведения ПЦР.

Пробирки помещают в термоциклер (амплификатор) и проводят реакцию по заданной программе в автоматическом режиме. Контроль реакции осуществляют одновременно с постановкой ПЦР на клиническом материале путем внесения в две дополнительные пробирки всех компонентов реакции, но в одну из них вместо материала клинического образца вносят контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя — положительный контроль, а в другую — вместо клинического материала вносится соответствующее количество деинонизированной воды — отрицательный контроль.

Заключительной стадией ПЦР является детектирование продуктов ПЦР. Присутствие специфического ПЦР-продукта в подавляющем большинстве случаев детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием геле. Используемый для разделения смеси гель должен обладать строго определенными физико-химическими характеристиками: низкой токсичностью по отношению к культуре клеток, хорошими диффузионными свойствами, высокой прозрачностью, иметь определенные показатели прочности студня, электроэндоосмоса (ЭЭО), зольности и содержания серы, как показателя присутствия сульфат-групп, что обеспечивается применением гелеобразователя определенного вида.

В настоящее время для детектирования продуктов ПЦР известно применение только двух типов гелеобразователей: агарозы и полиакриламида с различными добавками.

Известно использование полиакриламида для приготовления 4-6% геля, используемого в качестве инертного носителя для проведения электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК с последующим окрашиванием зон их локализации бромистым этидием или нитратом серебра (з. РФ N 97101436, опубл. 27.02.99).

Однако при приготовлении вышеназванного геля требуется соблюдать осторожность, избегать попадания сухого гелеобразователя или раствора на слизистые и кожные покровы из-за токсичности используемого мономера акриламида, что приводит одновременно и к повышенной нейротоксичности полученного геля, а, кроме этого, полученный полиакриламидный гель используется для разделения и извлечения коротких фрагментов ДНК.

Наиболее близким к заявляемому является способ детекции продуктов ПЦР посредством электрофоретического разделения ПЦР — амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием геле, приготовленном из агарозы (Федоров И.А., Суханов Ю. С., А.Х. Асади Мобархан, Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция(ПЦР).- М.,- 1996,- с.14).

Электрофорез ДНК в агарозном геле является стандартным методом разделения и идентификации ДНК, особенно для высокомолекулярной ДНК. Детекцию осуществляют следующим образом. Готовят агарозный гель, растворяя навеску агарозы в буферном растворе при нагревании, затем вносят краситель, заливают полученный раствор в пластиковую подложку с вставленными гребенками и оставляют до застывания геля. Гребенки поднимают и промывают полученную пластину с лунками электрофорезным буфером. В лунки геля вносят продукты ПЦР клинического образца, положительного и отрицательного контроля, пластину помещают в аппарат для электрофореза. После окончания электрофоретического разделения продуктов ПЦР гель помещают на стекло трансиллюминатора и просматривают его в УФ-свете. По появлению в исследуемом образце светящейся полосы, характерной по форме и расположению для полосы положительного контроля, говорят о наличии искомой ДНК.

Агароза является составной частью природного гелеобразователя агара и получается выделением из агара путем его ацетилирования. В зависимости от свойств исходного агара и от способа выделения агарозы из него получают различные марки агароз, отличающиеся друг от друга по физико-химическим свойствам.

Для получения электрофоретического геля, используемого при детекции ПЦР, применяют только определенные марки агароз, которые пригодны для биомолекулярного разделения. Качество очистки этих агароз достаточно высокое, а их количество ограничено. Так, например, фирма «Sigma» выпускает 12 марок агароз, однако для ПЦР- детектирования пригодны только две. Фирмой ICN выпускается более 15 типов агароз, но для ПЦР детектирования используют только агарозу марки «HGT»(high genetictechnology grade). Такое же соотношение и на фирмах «Serva» и «Difco», специализирующихся на выпуске биопрепаратов. Выпускаемые зарубежными фирмами агарозы нетоксичны, обладают высокими показателями прочности и прозрачности образуемого геля, имеют показатель ЭЭО 0,17 — 0,23 и зольность 0,46 0,1.

Получение агароз данных марок (electrophoresis grade и genetictechnology grade) сопряжено со значительными материальными затратами первоначально на очистку агара, используемого для дальнейшей переработки, а затем на выделение из него агарозы путем его ацетилирования и последующей либо экстракцией агарозы либо осаждения агаропектина и неагаровых примесей. Стоимость агароз такого типа составляет от 135 до 350 $ за 100 г. В России агароз подобного качества не выпускается. Высокая стоимость тест-систем, в состав которых входит и агароза, является одним из недостатков, препятствующих в настоящее время широкому использованию ПЦР в клинической практике диагностики заболеваний (Ж.микроб., эпидемиол. и иммунологии, -1997, N 5, с. 87).

Опыты по использованию агароз других марок для приготовления электрофоретической среды с целью детектирования продуктов ПЦР показали их низкую эффективность и неэкономичность. Применение агароз различной степени очистки требует подбора их концентрации для приготовления геля необходимой прочности, прозрачности и электрофоретической подвижности ДНК для качественного учета результатов. При этом прочность и прозрачность гелей из агароз находится в обратнопропорциональной зависимости с подвижностью детектируемой ДНК. Испытанные гели из агароз других марок дают либо низкую прозрачность, либо высокую диффузию полос, что затрудняет учет результатов, повышает вероятность ошибок и ведет к повторному проведению анализа, т.е. удлинению и удорожанию анализа.

Технической задачей изобретения является увеличение числа способов электрофоретического детектирования продукта ПЦР за счет использования нового гелеобразователя.

Поставленная задача решается способом детектирования продукта ПЦР, включающим приготовление геля с использованием гелеобразователя и проведения электрофореза реакционной смеси в геле с последующим просмотром его в УФ-свете, при этом в качестве гелеобразователя используют агар, содержащий серы и азота не более 0,3 мас.% и 0,1 мас.% соответственно, имеющий зольность не более 1,2%, прозрачность и прочность 1% геля не ниже 80% и 500 г/см 2 , соответственно, а показатель ЭЭО составляет 0,34 0,01.

Применение заявляемого агара с вышеприведенными характеристиками приводит к получению высокопрозрачного, прочного геля, обладающего высокой разрешающей способностью при разделении фрагментов ДНК, что позволяет использовать такой агар как гелеобразователь в предложенном способе детектирования продуктов ПЦР.

Агар представляет собой смесь двух полисахаридов: агарозы — линейного нейтрального галактанового гидроколлоида и агаропектина. Кроме этих двух основных компонентов природные агары содержат значительное количество неагаровых примесей органического и неорганического происхождения. Органические примеси, как правило, азотистые соединения (белки), а минеральные вещества представлены солями кальция, магния, железа, алюминия, сульфатами. В зависимости от степени очистки агар используется в пищевой, фармацевтической, текстильной, бумажной и других отраслях промышленности. Очищенный агар является незаменимым препаратом, используемым для приготовления питательных сред в микробиологии, для вирусологических, иммунологических и иммунохимических исследований, а также специальных исследований в области молекулярной биологии и генетики, генной инженерии и биотехнологии.

Существует большое количество марок агаров, отличающихся по своим свойствам из-за качества исходного сырья и применения различных способов его выделения. Так, для проведения вирусологических, иммунохимических, генетических и специальных бактериологических исследований агар должен быть максимально очищенным от всякого рода органических и минеральных загрязнений, что позволяет получить предельно осветленный, прозрачный и прочный гель. Для оценки качества агаров используют следующие показатели: содержание серы и азота, зольность, прозрачность и прочность образуемого ими геля, а также величина ЭЭО.

Увеличение содержания в агаре серы (более 0,3%) приводит к образованию геля, в котором вследствие выраженного эндоосмоса и адсорбции при электрофорезе искажается картина полос ДНК. Кроме того, повышенное содержание сульфатированных полисахаридов (повышенное содержание серы) вызывает гидролиз нуклеиновых кислот, что также ведет к снижению качества ЭЛЕКТРОФОРЕЗА и тем самым затрудняет идентификацию ДНК. Наличие сульфогрупп является также причиной низкой прочности и прозрачности агарового геля. Присутствие в агаре неагаровых примесей, характеризуемое зольностью, ведет к таким же последствиям, что и повышенное содержание серы (Rees D.A. «Advan. Carbohyd. Chem. — 1969. — N.25 — P.321 — 328).

Использование агара с более высоким показателем ЭЭО (выше 0,34) приводит к ухудшению разрешающей способности геля при электрофорезе, увеличивая диффузию и размытость полос.

В случае, если агар имеет показатель прочности геля ниже 500 г/см 2 , это приводит к быстрому разрыву геля.

Температура плавления агара с вышеперечисленными свойствами составляет (34,0 0,3) o C (как и у высококачественных агароз), что позволяет использовать высокое напряжение (от 1- до 20 В/см), тем самым увеличивая подвижность ДНК и снижая диффузию полос, получая узкие полосы, в целом добиваясь минимального времени электрофореза (8-15″) и высокой разрешающей способности при идентификации ДНК.

В России в настоящее время выпускают микробиологический агар (ГОСТ 17206-84), однако он оказался непригодным для вирусологических и иммунохимических исследований из-за своего токсического воздействия на клетки и ингибирующего действия на вирусы, а кроме того, он дает искаженную картину распределения белков по фракциям и число фракций (Н.П. Дмитриенко. Лабораторное дело, -1973, — N 6, с.378).

Данный агар, содержащий 3,5 0,005% золы и 0,63 0,0005% серы (в пересчете на SO 4 -2 ), имеющий прозрачность образованного им 1% геля 45 0,7 и прочность 320 5,7 г/см 2 , оказался непригодным и в качестве электрофоретического геля для детектирования продуктов ПЦР, т.к. образует малопрочный гель с низкой прозрачностью и высокой диффузией полос, что дает искажение полос ДНК при облучении УФ-светом.

Зарубежными фирмами «Serva», «Difco», «Ferak» и др. выпускается несколько типов агаров для микробиологических исследований, имеющих следующие физико-химические показатели: агар «Difco»(США): прозрачность и прочность 1,5% геля 51 0,6 300 5,1 г/см 2 , соответственно, зольность 1,86 0,003%; содержание серы 0,91 0,0004%; агар «Ferak» (ФРГ) имеет зольность 4,06% и прочность 1% геля 440 г/см 2 . Также как и для российского микробиологического агара, картина, которую получают при их использовании в качестве электрофоретической среды для детектирования продуктов ПЦР, искажена: полосы ДНК широкие, не имеют четкой границы за счет высокой диффузии.

Таким образом, способ получения и степень очистки агара изменяют его физико-химические показатели, что приводит к изменению областей его использования. При этом не удалось обнаружить сведений об использовании именно агара для приготовления геля, используемого в качестве электрофоретического носителя для детектирования амплификационных продуктов ПЦР.

Сочетание заявляемых физико-химических показателей агара позволило впервые применить данный высокоочищенный агар в качестве гелеобразователя для целей детектирования продуктов ПЦР и заменить им чрезвычайно дорогие импортные агарозу и полиакриламид.

В основу способа получения агара с заявляемыми свойствами положен принцип последовательного удаления неагаровых примесей и фракций кислых полисахаридов для снижения в нем содержания высокосульфатированных молекулл. Способ представляет из себя цикл со строгой хронологической последовательностью этапов экстракций и коагулирования неагаровых примесей в градиенте pH, экстракции сульфатных групп, освобождения коагеля от коагулянта, желировании агара, удаления из геля агара растворимых в воде примесей с последующим его дегидрированием методом прессования и сублимационного высушивания (Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1997. -N 5, с. 101-104; Технологическая инструкция по изготовлению высокоочищенного агара в производственных условиях, N 95-90; Фармокопейная статья 42 — 359 ВС — 90).

Для оценки качества агара определение физико-химических показателей производили по следующим методикам: прочность, оптическую плотность, зольность и температуру застудневания геля агара проводили в соответствии с ГОСТ-26185-84; содержание общего азота по Нееслеру; серу определяли путем сжигания пробы в хлорной кислоте с последующим турбидиметрическим определением сульфат иона модифицированным методом Dodgson и Pricce (Biochim.biophys. Acta, v.86, p.l69, 1964); содержание неорганических химических примесей — с помощью атомно-абсорбционного спектрометра фирмы Hitachi; качественное определение на присутствие химических элементов осуществляли методом оптической эмиссионной спектроскопии в дуге постоянного тока; электроэндоосмос (ЭЭО) — в качестве маркеров определения использовали реополиглюкин с содержанием декстрана (молекулярной массой 30-40 тыс) и бычий сывороточный альбумин («Методические указания по применению физико-химических и химических методов контроля медицинских биологических препаратов», 1982).

Для детекции использовали гель, приготовленный из высокоочищенного агара, имеющего следующие физико-химические показатели: зольность — 1,20 0,002%, содержание серы — 0,29 0,0002% (в пересчете на SO 4 -2 ), содержание кальция — 0,19 0,0001%, магния 0,02 0,00001%; железа -0,02 0,00001%; показатель ЭЭО 0,34 0,001, прочность 1% геля 650 г/см 2 и прозрачность 1% геля 82%.

В качестве красителя для окрашивания геля при электрофоретическом детектировании продуктов ПЦР используют различные интеркалирующие и флюоресцирующие красители, например бромистый этидий или акридиновый оранжевый (Sharp Р.А., Sugden В. и др. «Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilis parainfluenzae using analytical agarose «. Biochemistry, 1973. V.12, p. 3055).

Способ детектирования осуществляли методом электрофореза в агаровом геле на образцах, содержащих ДНК Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis и т.д.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Детекцию продуктов амплификации проводят путем гельэлектрофореза реакционной смеси в окрашенном бромидом этидия 2% агаровом геле с последующим просмотром его в ультрафиолетовом свете. Амплифицированные фрагменты ДНК идентифицируют сравнением с положительным контролем, в котором содержалась ДНК Chlamydia trachomatis. В лунку для отрицательного контроля вместо образца вносят дистиллированную воду.

Обнаружение Chlamydia trachomatis проводят в четыре этапа:
а) приготовление агарового геля
Агаровый гель готовят на основе высокоочищенного агара, имеющего вышеприведенные показатели.

2 г агара растворяют в 98 мл буфера для электрофореза. Буфер состоит из 10,7 г Трис, 5,5 г борной кислоты, 4 мл 0,5 М ЭДТА на 1 литр дистиллированной воды, pH — 7,6. Агар вносят в буфер, доводят до кипения и полного растворения агара в буфере. Затем, после остывания геля до 50-60 o C вносят бромистый этидиум в конечной концентрации 5 мг в 1 мл. Готовый гель вместе с красителем заливают на пластиковую подложку с вставленными гребенками и оставляют на 30 минут до застывания геля. Гребенки вынимают, промывают лунки электрофорезным буфером.

б) внесение образца
В лунки геля под буфер вносят по 7 мкл полученной после амплификации смеси из клинических образцов, положительного и отрицательного контроля. Пластину помещают в аппарат для электрофореза.

в) проведение электрофореза
Электрофорез проводят при напряжении 20 V/см в течение 10 минут (напряжение, устанавливаемое в блоке питания при расстоянии между электродами 10 см равно 200 V).

г) учет результатов
Вынимают гель из прибора для электрофореза и помещают его на стекло трансиллюминатора. При освещении геля ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. Наличие полосы, характерной по форме и расположению для полосы положительного контроля? свидетельствует о том, что в клиническом образце присутствует искомая ДНК. При отсутствии такой полосы или ее размытости и смещении результат принимают за отрицательный или проводят повторное исследование.

Определение присутствия Trichomonas vaginalis проводят аналогично вышеприведенному способу, за исключением того, что в качестве положительного контроля в лунку вносят ДНК Trichomonas vaginalis и дальше осуществляют определение аналогично примеру 1. Получают четкие линии, позволяющие их однозначное отнесение.

Таким образом, заявляемый способ детекции позволяет расширить объем исследований методом ПЦР в стране и снизить затраты на постановку этого метода за счет использования в качестве гелеобразователя агара с определенными характеристиками взамен дорогостоящей агарозы.

Способ детекции продукта полимеразной цепной реакции, включающий приготовление геля с использованием гелеобразователя и проведения электрофореза реакционной смеси в геле с последующими просмотром его в УФ-свете, отличающийся тем, что в качестве гелеобразователя используют агар, содержание серы и общего азота в котором не более 0,3 мас.% и 0,1 мас.% соответственно, зольность не превышает 1,2 мас.%, прочность и прозрачность 1% геля не ниже 500 г/см 2 и 80% соответственно, а показатель ЭЭО составляет 0,34 0,01.

источник

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

источник

Сущность метода электрофореза. В настоящее время фракционирование и детекция флуоресцентно меченых продуктов ПЦР проводятся в автоматизированных системах (секвенаторах или генетических анализаторах). В этих системах автоматизированы этапы электрофореза, детекции флуоресцентно меченых фрагментов ДНК и учета результатов электрофореза (рис. 4.11).

4. В « В Е F Й
Рис. 4.11. Электрофорез различных фрагментов ДНК

Используя метод электрофореза, фрагменты ДНК различной длины могут быть фракционированы. Этот метод является важнейшим методом исследования ДНК и широко используется в криминалистическом ДНК-анализе.
Средой для электрофореза служит среда на основе полиакриламида, формирующая сетчатую структуру с величиной ячеек, соизмеримой с величиной молекулы ДНК. Исследуемые пробы ДНК вносят в среду для электрофореза и накладывают электрическое поле. Фрагменты ДНК (имеющие отрицательный заряд) начинают перемещаться к аноду (положительно заряженному электроду), испытывая сопротивление сетчатой среды геля. Чем короче фрагмент, тем меньшее сопротивление он испытывает и тем быстрее он движется (скорость миграции обратно пропорциональна логарифму
длины фрагмента). В результате электрофореза в среде образуются участки, содержащие фрагменты ДНК. Те области, которые располагаются ближе к аноду, соответствуют меньшим по длине фрагментам, а те, которые дальше, — большим (см. рис. 4.11).
В автоматизированных приборах электрофорез проводят до тех пор, пока все фрагменты ДНК не пересекут область детекции, которая располагается со стороны анода (рис. 4.12). В этой области среда электрофореза освещается лазером, который возбуждает свечение флуоресцентных меток продуктов ПЦР. Цифровая камера фиксирует свечение меток, которое сохраняется на компьютере.
Электрофорез

Энергия , Г Возбужденный Компьютер ‘ |’ свет
’S-

РИС. 4.12. Схема электрофореза ДНК с автоматизированной детекцией флуоресцентных меченных продуктов П11Р
В результате фракционирования продуктов ПЦР STR-локусов ДНК на приборах получают первичные графические данные элек- трофореграмм. Эти данные представляют собой график измерений детектором интенсивности свечения флуоресцентных меток (рис. 4.13).
Для определения длины исследуемых фрагментов ДНК перед электрофорезом каждую исследуемую пробу смешивают с денатурирующим реагентом формамидом и специальным маркером — внутренним стандартом, содержащим смесь фрагментов известной длины (рис. 4.14).

Рис. 4.13. Первичные данные электрофореза продуктов ПЦР STR-локусов ДНК

alt=»Рис. 4.14. Электрофорез фрагментов внутреннего стандарта» />

Рис. 4.14. Электрофорез фрагментов внутреннего стандарта

Фрагменты внутреннего стандарта содержат флуоресцентную метку, отличающуюся от флуоресцентных меток продуктов ПЦР.

После электрофореза по расположению исследуемых фрагментов относительно фрагментов внутреннего стандарта, используя специальный компьютерный анализ, имеется возможность с высокой точностью установить величины исследуемых фрагментов ДНК.
Виды автоматизированных систем для электрофореза ДНК. В настоящее время существует два основных варианта автоматизированных систем: для электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле; для электрофорез в капилляре в среде специального полимера при денатурирующих условиях (капиллярный электрофорез).
Примером прибора, позволяющего проводить фракционирование и детекцию флуоресцентно меченых продуктов секвенирую- щих реакций по первому варианту является секвенатор ABI Prism 377 DNA Sequencer, производства фирмы Applied Biosystems, США. Примером приборов, работающих по второму варианту — ABI Prism 310 Genetic Analyzer, 3100 и 3130 Genetic Analyzer, производства фирмы Applied Biosystems, США (рис. 4.15).

Рис. 4.15. Генетический анализатор ABI Prism 3130 Genetic Analyzer

Достоинством первого варианта электрофореза являются меньшие требования, предъявляемые к чистоте и качеству реактивов, меньшая стоимость анализа, проведение традиционных для ручного исследования процедур (приготовление полиакриламидного геля, подготовка образцов, их нанесение и т.д.)- Недостатком этого варианта является необходимость проведения значительного количества ручных операций, цикличность работы, требующая накопления объектов исследования.
Приборы капиллярного электрофореза лишены вышеприведенных недостатков, однако для них характерна более высокая стоимость анализа. Важным достоинством этих приборов является значительно более высокая скорость проведения электрофореза, что позволяет оперативно проводить анализ исследуемых объектов. Кроме этого, приборы капиллярного электрофореза могут быть встроены в единую автоматизированную линию исследования ДНК.
В настоящее время в отличие от традиционных систем электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле происходит активное развитие систем капиллярного электрофореза. Их следует рассматривать как основные приборы для криминалистических лабораторий ДНК-анализа.
Расшифровку первичных электрофореграмм проводят с помощью компьютерной программы GeneMapper ID, производства фирмы Applied Biosystems.
Интерпретация результатов электрофореза с помощью программы GeneMapper ID. Интерпретация результатов электрофореза с помощью программы GeneMapper ID заключается в установлении аллелей исследуемых STR-локусов.
Для установления аллелей при электрофорезе продуктов ПЦР исследуемых проб используют также пробу специального аллельного маркера или лэддера. Эта проба содержит фрагменты ДНК, соответствующие по последовательности и размерам всем встречающимся аллелям исследуемых локусов (рис. 4.16). Аллельный лэддер является внешним стандартом исследования. Аллельные лэддеры производятся изготовителями реактивов для амплификации.

Рис. 4.16. Электрофорез фрагментов аллельного маркера

С помощью компьютерной программы GeneMapper ID общая электрофореграмма пробы разделяется на электрофореграммы по отдельным флуоресцентным красителям. Сначала величина исследуемых фрагментов определяется по их расположению относительно фрагментов внутреннего стандарта. Далее полученные величины сравниваются с величинами фрагментов аллельного лэдде- ра. Допустимое отклонение исследуемых фрагментов от фрагментов аллельного лэддера не должно превышать ± 0,5 нуклеотида. При наличии совпадений фрагмент обозначается в соответствии с принятой номенклатурой аллелей, при отсутствии — обозначается как неопределенный.
Все фрагменты, обозначенные как неопределенные или локализующиеся выше и ниже крайних аллелей лэддера, должны быть проанализированы. При необходимости электрофорез повторяют.
При воспроизводимости результатов фрагменты, не совпадающие с фрагментами аллельного лэддера обозначают вручную в соответствии с принятой номенклатурой аллелей. В случае отсутствия воспроизводимости выявленные первоначально фрагменты являются неспецифическими и дальнейшему анализу не подлежат.
При анализе электрофореграмм могут быть обнаружены и другие неспецифические фрагменты, которые необходимо отличать от истинных аллелей. Часто выявляют так называемые статтеры (рис. 4.17) — фрагменты, которые короче истинного аллеля на одну повторяющуюся единицу (т.е. по уровню расположения соответствуют фрагменту лэддера, предшествующему истинному аллелю).
Для статтера характерны два признака, по которым его отличают от истинных аллелей, а также отличают гомозиготный профиль со статтером от гетерозиготного профиля: если появляется статтер, то он всегда ассоциирован с истинным аллелем (он короче истинного аллеля на одну повторяющуюся единицу); интенсивность статтера обычно не превышает 15 % интенсивности истинного аллеля, с которым он ассоциирован.
Другими, часто выявляемыми неспецифическими фрагментами являются так называемые N-фрагменты (рис. 4.18). Их появление связано с тем, что ДНК-полимераза обладает свойством достраивать во вновь синтезированную цепь ДНК один лишний нуклеотид.

200 210 230 2» 240 290 2U />

ogt;
О)

117 (N+Tj]ll8 W-nil
Рис. 4.18. Неспецифические явления — N-фрагменты

В результате этого свойства на основе матричной цепи ДНК синтезируются два типа фрагментов: N+1-фрагменты, которые длиннее на один нуклеотид, и N-фрагменты, соответствующие истинной длине исходной ДНК. Интенсивность N-фрагментов всегда ниже, чем N+1-фрагментов. Присутствие N-фрагментов обычно не усложняет установление истинных аллелей, однако следует особенно внимательно анализировать электрофореграммы локусов, аллели которых могут отличаться на одну пару оснований (например, аллели 9.3 и 10 локуса ТН01).
Особые неспецифические сигналы возникают в случае электрофореза проб с избыточным количеством продуктов ПЦР. В этом случае детекционная система прибора (цифровая камера) оказывается перенасыщенной, и становится невозможно корректно разделить флуоресцентные сигналы, получаемые в результате свечения разных флуоресцентных меток. В итоге на электрофореграммах отдельных флуоресцентных красителей детектируются фрагменты, равные по размеру (рис. 4.19).
Рис. 4.19. Неспецифические явления, возникающие в случае электрофореза проб с избыточным количеством продуктов ПЦР

Истинным фрагментом является только тот, у которого интенсивность свечения (высота пика) является большей. Сигналы других флуоресцентных красителей, равные по размеру, но меньшие по интенсивности следует считать неспецифическими. При неясных случаях следует повторить электрофорез с внесением меньшего количества продуктов ПЦР.
Фрагменты, которые были определены как статтеры или иные неспецифические фрагменты, в дальнейшем исследовании не учитывают.
Экспертный анализ результатов электрофореза начинают с изучения электрофореграмм контролей реакции амплификации и кон- тролей выделения ДНК.
Данные считаются достоверными, если: а) в отрицательных контролях реакции амплификации и контролях выделения ДНК отсутствуют амплифицированные фрагменты; б) профиль ДНК, выявленный в положительном контроле реакции амплификации, соответствует генотипу контрольной ДНК.
После оценки электрофореграмм контролей проводят анализ электрофореграмм исследуемых проб ДНК.
Сравнение установленных генетических признаков по STR- локусам и их интерпретация зависит от задач исследования. При исследовании объектов, содержащих ДНК одного лица, и сравнении их генетических признаков с генетическими признаками определенных лиц возможны два варианта: генетические признаки исследуемых объектов полностью совпадают. генетические признаки исследуемых объектов имеют различия.
В первом случае это означает, что исследуемые объекты могут иметь общий источник происхождения (один и тот же индивидуум или его однояйцовый близнец). Однако не исключается случайное совпадение генетических признаков неродственных лиц.
Контрольные вопросы Перечислите основные этапы исследования ядерной ДНК. Охарактеризуйте объекты исследования.
68
Что влияет на выбор того или иного метода выделения ДНК? С какими основными методами выделения ДНК вы познакомились? Что такое ПЦР? Охарактеризуйте три фазы цикла амплификации. Какие компоненты нужны, чтобы поставить ПЦР? Что такое праймеры? Что такое амплификатор? Какие амплификационные системы используются в настоящее время? Особенности мультипликационных систем. Каков принцип метода RT-PCR? Что такое зонд TaqMan? В каких целях применяют RT-PCR в судебно-генетических исследованиях? Что представляет собой калибровочный график для определения концентрации ДНК? Перечислите возможные варианты контроля ПЦР. Охарактеризуйте метод электрофореза. Что является средой для электрофореза? Как происходит электрофорез в автоматизированных приборах? Что такое внутренний стандарт? Какие варианты автоматизированных систем для электрофореза ДНК существуют в настоящее время? Перечислите достоинства и недостатки каждого варианта. Для чего нужна программа GeneMapper ID? Что такое лэддер? Охарактеризуйте термины статтеры, N-фрагменты. Когда полученные данные считаются достоверными? Как оценивают достоверность события?

источник

Классы МПК:	C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты G01N33/559 через гель, например метод Оухтерлони
Автор(ы):	Ващенко В.В. , Иванец Т.А. , Глазырина Т.А. , Долматова Л.С.
Патентообладатель(и):	Иванец Татьяна Алексеевна
Приоритеты: