Детекция в гель электрофорезе

Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») —метод разделения макромолекул, различающихся по размеру, молекулярной массе, пространственной конфигурацией, вторичной структурой или электрическому заряду. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.

Молекулы в буферном растворе обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. При пропускании электрического тока через раствор в нем формируется направленное электрическое поле, напряженность которого измеряется разностью потенциалов по концам емкости, в которой производится электрофорез. Под действием поля молекулы начинают движение в направлении катода или анода. Скорость движения зависит от величины заряда, размеров и трения окружающей среды. С течением времени смесь разделяется на фракции, состоящие из молекул, движущихся с одинаковой скоростью. В современных экспериментах рабочий канал приборов для электрофореза заполняют гелем, имеющим структуру сетки. В этом случае основное влияние на подвижность молекул и их степень разделения оказывают их линейные размеры. В некоторых случаях может возникнуть ситуация, при которой особо крупные молекулы не проходят через поры геля.

Электрофорез в агарозном геле в различных модификациях широко применяется для разделения молекул нуклеиновых кислот, белков и других макромолекул в биологии и медицине. На водяной бане или в лабораторной печи плавят смесь агарозы, буфера и воды. Затем ее охлаждают до 50-60 °C и заливают в форму. Лунки для нанесения делаются при помощи гребенки. Исследуемый образец наносят в лунку при помощи дозатора. Когда краситель, помещаемый в лунки в начале эксперимента, достигает конца геля, электрофорез останавливают. Затем гель окрашивают красителем, который связывается с исследуемыми молекулами. Интенсивность окраски полос красителя дает представление о концентрации молекул в образце. Кроме концентрации, метод электрофореза позволяет определить относительную молекулярную массу исследуемых молекул, для этого в крайнюю лунку помещают набор маркеров молекулярной массы, который должен полностью покрывать диапазон молекулярных масс исследуемой системы.

Бромфеноловый синий и ксиленцианол — могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. Краситель Cresol red совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV. OrangeG наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV. Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле.

Самое широкое применение агарозные гели имеют в исследованиях, связанные с разделением нуклиновых кислот. Последние имеют довольно значительные отрицательный заряд, величина которого слабо зависиот от pH раствора, вследствие чего разделение на фракции происходит в основном за счет различия в линейных размеров молекул. В таких экспериментах используют 0.089М Трис-боратный, 0.05 Трсфосфатный и Трис-ацетатный буфер. Стоит отметить, что при обычном электрофорезе в геле можно разделять фрагменты нуклеиновых кислот, размер которых менее 50 тыс п.н. Также часто из эксперимента нужно получить оценку размеров молекул. Для этого используются наборы молекул известной длины. Например, для регистрации продуктов амплификации ДНК применяется электрофорез в агарозном геле в присутствии бромистого эитидия, который образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением длиной волны 290-330 нм.

источник

Впоследствии были предложены технологии разделения на плотных носителях, среди которых особое место заняли гели. Последние сочетали удобства разделения в свободном растворе (в геле 95-99% воды) с возможностью фиксировать результаты электрофореза путем высушивания геля. Среди гелеобразующих веществ вначале получил признание крахмал, затем полисахариды из водорослей агар-агар (агароза) и наконец гели, искусственно получаемые путем полимеризации акриламида.

Полиакриламидный гель стал одним из наиболее популярных носителей для электрофореза. Полимеризацию проводят в буферном растворе. Затем гель помещают в электрофоретическую камеру, заполненную буферным раствором и содержащую электроды для образования электрического поля (рис.1.8). рН и другие параметры буферного раствора выбираются из расчета, чтобы разделяемые молекулы несли отрицательный заряд и двигались в электрическом поле слева направо. Поскольку разделяемые молекулы движутся в геле, те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к месту нанесения, чем меньшие.

Рис.1.8. Виды проведения электрофореза в полиакриламидном геле (слева — в трубках с гелем, справа — в прямоугольных блоках)

Следует иметь ввиду, что этот метод позволяет разделять молекулы большей частью по их размеру, и совсем необязательно, — по их молекулярной массе. Для примера рассмотрим две молекулы белка по 1000 аминокислот каждая. Одна из них представляет вытянутую цепь (А), а вторая (за счет образования связей между соседними участками) имеет форму шпильки (Б):

Поскольку они движутся внутри геля, обе молекулы будут вести себя как сферы, диаметр которых равняется длине вытянутой части молекулы. Обе молекулы имеют одинаковую молекулярную массу, однако благодаря тому, что вторичная структура Б де-лает её молекулу короче, чем А, быстрее будет передвигаться Б. Дабы устранить влияние различий по форме и оставить только различия по молекулярной массе, разделяемые молекулы должны иметь развернутую конформацию (без вторичной структуры). Для разрушения вторичной и третичной структуры используются различные методы подготовки препаратов белка.

Подготовка белков. Все белки обладают вторичной и третичной структурной организацией. При этом их молекулы не всегда несут отрицательный заряд в растворе. Для разрушения вторичной и третичной структуры и образования на поверхности белков отрицательного заряда их нагревают и обрабатывают детергентом – додецилсульфатом натрия (ДДС-натрий).

Если соблюсти вышеприведенные условия, разделение молекул при электрофорезе будет осуществляться в зависимости от их молекулярной массы. При этом удается, например, разделить 2 молекулы полинуклеотида, различающиеся на 1 мононуклеотид. Высокомолекулярные молекулы будут двигаться медленнее низкомолекулярных. Длина пройденного молекулой расстояния будет пропорциональна логарифму величины, обратной её молекулярной массе (log 1/MM).

Обычно гели изображают в вертикальном положении, где место нанесения находится вверху, а движение разделяемых молекул направлено сверху вниз. Тогда в верхней части геля располагаются большие молекулы, а в нижней – с меньшей молекулярной массой.

Как правило, рядом с опытными пробами на гель наносится смесь белковых (или каких-то других разделяемых) молекул с известной молекулярной массой. Такие стандарты «молекулярной массы» позволяют прокалибровать пробег молекул. Тогда, зная какое расстояние прошло изучаемое вещество, можно установить его молекулярную массу. Ниже на рисунке 1.9 показан гель после обработки его красителем. Молекулы красителя связываются с каким-то определенным классом макромолекул независимо от последовательности расположения мономеров в их составе.

Рис.1.9. Результат проведения электрофореза в полиакриламидном геле после окраски геля неспецифическим красителем

Изображенный на рис.1.9 образец 1 содержит макромолекулы одного размера. Это может быть очищенный белок. При сравнении с подвижностью стандартов ясно, что молекулярная масса этого соединения около 3. Образец 2. Это может быть смесь белков после окраски геля неспецифическим красителем. Здесь находится так много полос, что среди них невозможно вычленить необходимую. В подобных условиях без зонда (который действует как специфический краситель) нам едва ли удастся получить полезную информацию об интересующем соединении. Учитывая это обстоятельство, для определения индивидуальных белков пользуются сочетанием электрофореза с иммунологическими реакциями (иммуноэлектрофорез) (рис.1.10).

Рис.1.10. Схема проведения иммуноблот анализа для обнаружения белка после проведения электрофореза в полиакриламидном геле (описание этапов приведено в гл.13)

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Студент — человек, постоянно откладывающий неизбежность. 10526 — | 7315 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

В результате ПЦР получается множество копий одного или нескольких фрагментов ДНК. Для дальнейшей работы эти фрагменты надо каким-то способом зарегистрировать или сделать видимыми — визуализировать. Регистрировать ПЦР-продукт можно на протяжении всей реакции («ПЦР в реальном времени»), либо только после ее завершения (метод «FLASH-PCR» или визуализация в геле) (см. параграф 5.4.4). В настоящем параграфе обратимся к визуализации результатов ПЦР при электрофоретическом разделении молекул ДНК по размеру.

Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 0,7—2,5% с добавлением специального интеркалирующего (т.е. способного встраиваться в молекулу ДНК между парами оснований и флуоресцирующего только после встраивания в двунитевую молекулу ДНК) красителя ДНК, например бромистого этидия (можно использовать и другие подобные красители, например «SYBR Green I»). При заливке в геле формируют лунки (с помощью специальных гребенок, помещаемых в гель перед заливкой), в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы (с повышением концентрации скорость замедляется), напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера. Молекулы ДНК одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель соединяется с молекулами ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося, как правило, от 10 мин до 1 ч, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия ультрафиолета, поглощаемая интеркалирующим красителем в области 260 нм (для бромистого этидия), передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 им для бромистого этидия). Пример электрофореграммы, показывающей идентификацию гриба Altemana altemata в пробах пораженных листьев томата с помощью ПЦР, приведен на рис. В.11.

По яркости полос на геле можно приблизительно оценить количество ДНК в ПЦР-продукте. Для этого обычно используют стандартный маркер длин фрагментов. Концентрация фрагментов определенной длины известна из инструкции к маркеру, поэтому сравнивая яркость полученных фрагментов с яркостью фрагментов маркера, можно приблизительно оценить концентрацию ПЦР-продукта.

Существует также метод оценки концентрации ДИК в исходной матрице (очень приблизительный). Для этого используют фрагмент ДНК (внутренний стандарт), который, как и фрагмент определяемой ДНК, содержит участки отжига тех же праймеров. Этот фрагмент амплифицируют одновременно с образцом определяемой ДНК. Количество ДНК внутреннего стандарта известно. При одновременной амплификации «внутренний стандарт» дает продукт иного размера, чем целевой фрагмент. «Внутренний стандарт» часто используют в диагностических системах для контроля прохождения ПЦР («внутренний контроль»).

Для разделения близких по размеру фрагментов используют метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле. Для работы с полиакриламидными гелями применяют специальные камеры для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее приготовления агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до одного или нескольких нуклеотидов возникает редко, то в рутинной работе этот метод обычно не используют.

Модификации метода ПЦР, используемые при идентификации фито- патогенов.

ПЦР с применением обратной транскрипции (ОТ-ПЦР; RT-PCR, от англ. reverse transcription polymerase chain reaction). Обычный метод ПЦР применим для анализа только ДНК-содержащих организмов. Его нельзя использовать для выявления РНК-содержащих организмов, среди которых встречаются высокопатогенные вирусы и вироиды. Используемая при классическом ПЦР Год-полимераза не способна обеспечивать синтез ДНК на РНК-матрице. При диагностике РНК-содержащих организмов используют дополнительный фермент — РНК-зависимую ДПК- полимеразу, или обратную транскриптазу (reverse transcriptase). Реакция с участием обратной транскриптазы приводит к образованию одноцепочечной кДНК, комплементарной имеющейся РНК. В дальнейшем фрагмент кДНК амплифицируется с участием ДНК-полимеразы.

У метода ОТ-ПЦР есть другое полезное применение. Как известно, мРНК (матричная РНК) может образовываться только живым организмом, в то время как ДНК может сохраняться и в мертвых. Поэтому с помощью ОТ-ПЦР можно одновременно проводить идентификацию и оценку жизнеспособности патогенов в пробе.

ОТ-ПЦР также широко используется для оценки экспрессии генов: чем активнее ген, тем больше производится мРНК, что можно оценить с помощью ОТ-ПЦР. Для оценки количества ПЦР-продукта лучше использовать Real-Time ПЦР (см. параграф 5.4.4).

ПЦР с вложенной парой праймеров (гнездовая ПЦР, Nested PCR). Характерной особенностью данного варианта ПЦР является то, что в реакции последовательно участвуют две пары праймеров, при этом вторая пара праймеров участвует в амплифицикации фрагмента ДНК внутри продукта, полученного после завершения цикла реакций с парой внешних праймеров.

Существуют две технические альтернативы проведения ПЦР с вложенной парой праймеров. Согласно первой, в реакционной пробирке после проведения 15—30 циклов амплификации получают базовый фрагмент ДНК с участием внешних праймеров. Затем переносят аликвоту содержимого в другую пробирку, в которой находится реакционная смесь с внутренними праймерами, взаимодействующими с нуклеотидными последовательностями внутри полученного фрагмента, и проводят вторую амплификацию (реамплификацию), также включающую 15—30 циклов.

Альтернативный вариант гнездовой ПЦР предполагает подбор такой температуры отжига для первой стадии, при которой вложенная пара праймеров не взаимодействует с ДНК. В этом случае температуру амплификации с внутренними праймерами поддерживают на 10—15°С ниже, чем при реакции с внешними праймерами.

Увеличение числа копий ПЦР-продукта после первой реакции позволяет существенно увеличить чувствительность и специфичность диагностики. Перенесение продукта после первого цикла реакций во вторую пробирку может способствовать снижению концентрации ингибиторов полимеразной реакции, которые иногда присутствуют в препарате. Однако, с другой стороны, в этом случае возрастает вероятность получения ложноположительных результатов из-за возможного загрязнения пробы.

ПЦР в комбинации с ELISA (Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay) (ПЦР с иммунным захватом, Immunocapture PCR). ПЦР с иммунным захватом является примером совместного использования иммунохимических (см. параграф 5.6.2) и основанных на ПЦР методов диагностики фитопатогенов.

Образец, подлежащий исследованию (например, экстракт, содержащий детектируемый вирус), добавляют в микропробирку или в лунки микропланшета, на поверхности которых сорбированы антитела, специфически связывающие искомые вирусные частицы. Это позволяет захватить из раствора нужные вирусные частицы и увеличить концентрацию ДНК- матрицы. На следующей стадии из этих частиц освобождают вирусную ДНК или РНК и проводят, соответственно, НЦР или ОТ-ПЦР.

Обычно ПЦР с иммунным захватом усиливает специфичность и чувствительность диагностики фитопатогенов. Он также полезен в случае, если в образце присутствуют компоненты, ингибирующие полимеразную реакцию, поскольку снижает или устраняет их влияние.

Метод БИО-ГЩР (BIO-PCR) совмещает в себе культивирование микроорганизмов из пораженной пробы па селективной среде и последующее проведение ПЦР с целью идентификации определенных патогенов, накопившихся во время инкубации. Этот метод, широко применяемый для обнаружения фитопатогенных бактерий, может быть использован и для грибов.

При проведении анализа с помощью БИО-ПЦР исследуемый образец помещают на агаризованную или в жидкую селективную среду и инкубируют при оптимальных для выявляемого патогена условиях внешней среды. После инкубации определяемые бактерии накопятся в количестве, достаточном для диагностики. Затем их смывают с поверхности агара или осаждают из жидкой среды центрифугированием и отбирают от 1 до 10 мкл образца для ПЦР.

Этот метод отличается высокой чувствительностью и особенно подходит для быстро растущих видов. Метод БИО-ПЦР позволяет выявлять даже единичные экземпляры искомого фитопатогена в пробе.

источник

Электрофорез в агарозном геле.

Принцип метода электрофореза.

Электрофорез – метод разделения макромолекул, различающихся по таким параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пр о- странственная конфигурация, вторичная структура и элек трический заряд.

Физический принцип метода заключается в следующем. Наход я- щиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым су м- марным электрическим зарядом, величина и знак которого зависит от рН среды. Если через этот раствор, зак люченный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т.е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью поте н- циалов по концам канала, отнесен ной к его длине (В/с). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом м и- грируют в направлении катода или анода, причем их трение об окр у- жающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от в е- личины заряда и размеров мол екулы приобретают различные скорости. Постепенно исходный препарат, состоящий из различных молекул, ра з- деляется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой скоростью. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем, наличие сетки которого вн осит важную дополнительную деталь в эле к- трофоретическую миграцию молекул. Фракционируемые молекулы сталкиваются с нитями полимера, образующую сетку геля, что увел и- чивает сетку геля и снижает скорость движения молекул. Препятствия для миграции становятся о собенно серьезными, если средний размер пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами ма к- ромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линей ных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот в о- обще не могут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекр а- титься.

В настоящее время используют ПААГ и агарозный гель. В а- рьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень шир оким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрич еские заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигур ацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.

В ходе электрофореза зоны макромолекул остаются невид и- мыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же зн а-

ка, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость м и-

грации наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их дифф у- зии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси, кислоты выпадают в осадок в том мес те, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачив а- ния геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.

Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат ра з- деляется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. Кроме того, поскольку гель заливают в форму для п о- лимеризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содерж а- ние добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следовательно, плотность тока и напряжение электрического поля также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия фракционирования ра з- ных препаратов и дает возможность достоверного сопоставления их с о- става путем сравнения положения полос в параллельных треках.

Особенности агарозного геля.

Агароза – это особо чистая фракция природного линейного пол и- сахарида агара, который получают из морских красных водорослей

(Gracilaria, Gelidium, Ahnfeltia).

Агароза состоит из строго чередующихся остатков 3-О- замещенной-β-D-галактопиранозы и 4-О-замещенной 3-6-ангидро-α-L- галактопиранозы. Молекулярная масса ее составляет 10 4 -10 5 . Гелеобразование идет путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обр а- зуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.

При температурах 84 -96 o (а у специальных типов – уже при 70 o ) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – «плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10 -15 с П, что примерно соответствует вязкости 50% -ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выр а- женным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значител ь- но более низких температурах (36 -42 o ). У легкоплавких типов агарозы

эта температура снижается до 30 o . Такая особенность облегчает ман и- пуляции с расплавленной агарозой — можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную агарозу пре д- варительно охлаждают до 50 -55 o и уже при этой температуре заливают

в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных те п- ловых деформаций.

Гели агарозы не вполне прозрачны, что обусловлено «кристалл и- зацией» геля.

Затвердевший гель представляет собой н е вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жи д- кость. Температура плавления и гелеобразования зависят от с одержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3 -4%. Наличие этих групп затрудняет гелеоб разование.

В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Чем меньше в агарозе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электр о- статического отталкивания между молекулами полимера и выше их способность к связыванию водородными связями. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза. В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе

в гелях агарозы явление эндосмоса, суть которого в след ующем: отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные ионы, находясь в водной фазе под действием электрического поля м и- грируют в направлении катода. Их место занимают катионы, которые увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и вместе с ней – растворенные в водной фазе геля макромолекулы. Эле к- трофорезом в агарозном геле чаще всего разделяют отрицательно зар я- женные макромолекулы, а эндосмос направлен в про тивоположную сторону и ухудшает разделение. Поэтому агарозу подвергают спец и- альной очистке, и содержание иона сульфата в продажных препаратах не превышает 0,5%.

Рис. 1. Влияние эндосмоса в агарозном геле на характер фракционирования двунитевых ДНК одина кового разме-

1 — сверхскрученная ДНК; 2 — линейная; 3 — кольцевая; степень эндосмоса увеличивается слева направо

Типы агарозы, отличающиеся слабо выраженным эндосмосом, с о- держат менее 0,3% сульфата. В случае необходимости мо жно провести дополнительную очистку агарозы от сульфата обработкой 1М NаОН в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаждением 50% -ным этанолом. Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и не специфическую сорбцию белков на агарозе, в результате чег о полосы расплываются с образованием «хвостов». Степень эндосмоса колич е- ственно оценивают с помощью коэффициента относительной миграции

(-m r ) – представляющего собой отношение скоростей миграции незаряженного полимера (за счет только эндосмоса) и сходного с ним по структуре полианиона при электрофорезе в агарозе данного типа.

Некоторые типы агарозы по номенклатуре фирмы « Miles»: тип LE – малая степень эндосмоса -m r =0,1-0,15;

тип HE – сильно выраженный эндосмос -m r =0,23-0,26.

Агароза с повышенными темпера турами плавления и гелеобразования (тип HGT) имеет -m r r >0,3) , но не за счет увеличения сульфатов, б лагодаря чему неспецифической сорбции белков на агарозе этого типа почти не происходит.

Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентр а- ции навеску порошка растворяют в соответствую щем буфере и нагре-

вают до 90-95 o . Перед заливкой в форму раствор агарозы охлаждают до 50 o .

Выбор концентрации агарозы, т.е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2% — ного геля агарозы приблизительно соот ветствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель -фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для м о- лекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрич е- ском поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют аг а-

розные гели с концентрацией 0,4 -2%. Ниже представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %) для некоторых распространенных объектов фракционирования:

Высокомолекулярная ДНК вирусов и пла з-

Рестрикты ДНК (5-20 тыс. пар оснований)

Реовирусная двунитевая РНК (500 -5000 пар

Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100 -1000

Разновидности электрофореза в агарозном геле.

Современные варианты электрофореза используют пластинки или колонки с агарозным гелем.

В зависимости от цели исследований эоектрофорез в агарозном геле может быть аналитическим и/или препаративным.

Аналитический электрофорез в агарозном геле имеет целью электрофоретическое разделение макромолекул с последующей визуализ а- цией и анализом полученных результатов.

Агарозный электрофорез применяют в препаративных целях. Для извлечения из геля разделенных компо нентов используют несколько способов: агарозный гель подвергают элюции буферными растворами, центрифугированию, замораживанию и оттаиванию.и др.

Вертикально расположенные трубки

Вертикальное расположение гелей и меет то преимущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность геля. Затруднение при вертикал ь-

ном расположении могут возникать при недостаточной сцепле нности геля со стеклом, он будет сползат ь вниз.

Все приборы для с вертикальным расположением гелей ко н- структивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположением, т.к. верхний электродный резервуар должен быть поднят над гелем.

Необходимо уплотнение в местах сочленения его с трубками или пл а- стинами.

Трубки (12-18штук) с уже заполимеризованным в них гелем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верхние концы выступали над дном резервуара. Если используют не все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе с трубками в ерхний электродный резервуар устанавливают на нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором расстоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар электродным буфером до такого уровня, что трубки оказываются почти полностью погруженными в буфер. Это делается для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза. С этой же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой или вводят допо л-

нительную охлаждающую систему. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной формы изготавливают из плексигласа , что позволяет следить за продвижением фронта красителя. В резервуарах должны быть закреплены электроды из платиновой проволоки. Нижний эле к- трод при этом должен располагаться так, чтобы поднимающиеся от н е- го пузырьки газа не попадали на нижние торцы трубо к, что создавало бы помехи протекания через них тока. Объемы электродных резерву а- ров достаточно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изм е- нялся под влиянием продуктов электролиза.

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок з а- клеивают парафильмом и устанавливают строго вертикально в штатив. Заливают гель. Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный резервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой наслаивают препарат, в который добавляют предварительно 5 -10% сахарозы. При любом варианте эле к- трофореза надо быть уверенным в том, что исходный препарат своб о- ден от взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соб и- раться на торце геля и однородность тока по его сечению, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон. В этом случае препарат сл е- дует отфильтровать или очистить центрифугированием.

По окончанию электрофореза гель из трубки извлекают. В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и зату п- ленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов трубки, кр у- говыми движениями отслаивая гель от ее стенок. Если необходимо т а- кую операцию проводят и с другого конца. Через иглу при этом пост у- пает вода из закрепленного выше резервуара. Если гель отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5 -1% раствор детергента. Во избеж а-

ния поломки следует дать гелю возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над которым проделывают эти манипуляции. Иногда д ля удаления геля из очень длинных трубок по его периферии с концов впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой из присоединя е- мого к трубке шприца. Если гель высокой концентрации вынуть не уд а- ется, его приходится замораживать, а трубку разбивать моло тком. Иногда можно решить проблему путем вымачивания трубки с гелем в мет а- ноле: гель постепенно съеживается и отстает от стенки.

Основным недостатком электрофореза в трубках является з а- трудненный отвод тепла даже при диаметре 5мм. На оси геля темпер а- тура оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности.

Это приводит к изгибу зон и соответственно окрашенных полос, п о- скольку электрофоретическая подвижность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотвода можно вести микроэлектрофорез в к а- пиллярах диаметром 0,7 -1,5мм.

Вертикально расположенные пластины

Для электрофореза белков обычно используют пластины ш и- риной 8-14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 -28 см.

Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а затем и электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зе р- кального стекла толщиной 5 -6мм. Расстояние между пластинами зад а- ется толщиной прокладок из тефлона или плексигласа («спейсеров») и определяет толщину геля. Прокладки шириной 10 -15мм устанавливают вдоль боковых краев стекол. Эти же прокладки можно использовать и для уплотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердевш е- го геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно такой же толщины по нижнему краю стекол и плотно прижимают ее к фрезер о- ванным торцам боковых прокладок.

При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить проще — заклеить торцы стекол липкой лентой. Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать. Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с прокладками и лент ой быстро застынет и заметного ее вытекания не будет. Для надежности можно сначала залить н е- большой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а п о- том залить остальной ее объем.

Собранную и уплотненную форму устанавливают вертикал ь- но и заливают в нее раствор мономеров ПААГ или расплавленную аг а- розу.

В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно затем с о- поставить при идентичных условиях разделения. Сопоставляемые пр е- параты фракционируют в параллельных друг другу «треках». В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы — «карманов», в которые затем вн о-

сят исследуемые препараты. Для этого в еще незаполимеризовавшийся

гель или горячую агарозу вставляют гребенку из тефлона или плекс и- гласа. Прямоугольные зубцы гребенки и формируют карманы.

Гель или агарозу заливают между пластинами с таким расч е- том, что при опускании гребенки до упора жидкий гель заполнил пр о- межутки между ее зубцами. Гре бенку начинают вставлять с некоторым перекосом, чтобы под ее зубцами не задерживались пузырьки воздуха. Когда гель готов, вынимают нижнюю прокладку или снимают липкую ленту и осторожно вытаскивают гребенку. При работе с концентрир о- ванным ПААГ гель может прилипать к зубцам гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться неровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос в геле. В таком случае имеет смысл вв е- сти еще один слой геля пониженной концентрации, и гребенку устана в- ливают в него.

Для проведения электрофореза чаще всего используются приборы конструкции, предложенной Стадиером. Верхний и нижний резервуары прямоугольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой имеется вырез, ведущий в полость верхнего резе рвуара. Такой

же вырез имеет и одна из двух стеклянных пластин, меду которыми п о- лимеризуется гель. Пластины прижимаются пружинными зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпадали. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, чтобы он через в ырез покрывал верхний торец геля. При этом вторая, не вырезанная, стеклянная пл а- стинка выступает в роли передней стенки резервуара. В месте совм е- щения двух вырезов, между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осуществлено уплотнение, препятствующее вытеканию верхне го буфера. В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой пр о- волоки. При установке в прибор форму с гелем частично погр ужают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец оказывается приподнят ым над дном резервуара. После погружения необходимо удалить пузырьки воздуха.

По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаивая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают между пласт и- нами со стороны карманов и слегка поворачивают. Со вто рой пластины гель снимают руками и переносят в ванночку для фиксации или окр аски. Необходимо проводить манипуляции в перчатках, т.к. случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверхности геля при современных чувствительных методах окрашивания может остави ть на геле артефактное белковое пятно.

Горизонтально расположенные пластины

Преимущество-отсутствие проблемы уплотнения. Оба эле к- тродных буфера находятся в резервуарах, расположенных ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель.

Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке или плашке из плексигласа, помещают на столик открытой поверхн о- стью кверху, поскольку препарат вносят не с торца, а в ряд специал ь- ных «колодцев», расположенных на некотором расстоянии от края. Электрофорез проводят в форезных камерах. Препараты вносят в «к о- лодцы» вместе с красителем — бромфеноловым синим, содержащим также глицерин, который «прижимает» краситель и препарат, не позв о- ляя им диффундировать в геле или в буфере.

Пластины для горизонтального элект рофореза в агарозе можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально установленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло определенного размера и на него выливают расплавленный раствор агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB рекомендует наносить препараты прямо на поверхность

агарозы через прорези наложенного на пластину специального шаблона со щелями. Препарат объемом 2 — 4 мкл вносят в щель шаблона, откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравнительно пр о- стое приспособление, смонтированное на столике для заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при з аливке агарозы образовать колодцы для препаратов. Перед использованием пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфере в течение суток.

Итак, электофорез в агарозном геле позволяет идентифицировать большое количество белковых фракций. Пример – электрофоретическое разделение белков сыворотки крови.

Электрофорез проводят в 1% -ном агарозном геле в мединал — вероналовом буфере рН=8,6 с ионной силой 0,05. Все белки сыворотки крови при рН=8,6 заряжаются отрицательно заряд и движутся от катода к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую молекулярную массу, затем располагаются 1 -, 2 -, — и -глобулины. Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на н е- сколько подфракций. Первоначальная оценка результатов электрофор е- тического разделения сывороточных белков (выявление нормы или п а- тологии) должна проводиться визуально, путем сравнения с картиной нормальной сыворотки, а количественные данные предназначены тол ь- ко для документирования результатов и динамического наблюдения.

Для электрофореза белков используются различные аппараты, как ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных мембран или гелевых пластинок (определения относительного колич е- ства белков в каждой фракции) используется электронный цветной ск а-

нер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность

и воспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает во з- можность усредненного расчета оптической плотности отдельных фракций путем автоматического определения границ «дорожек» и мн о- гократного сканирования каждой из них в нескольких «разрезах», что позволяет исключить ошибки из -за локальных микродефектов и неро в- ного положения носителя, а также до определенной степени нивелир о- вать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится график — денситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций. При необходимости маркеры границ фракций на графике можно ско р- ректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофор е- грамм; их можно в любое время извлечь и просмотреть. Электрофорез белков, позволяющий определить их количественные сдвиги и физико — химические характеристики, помогает выявить заб олевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразов а- ния (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетически е поломки

Методика электрофореза в агарозном геле.

Для приготовления агарозного геля в СВЧ-печи или на водяной бане расплавляют смесь агарозы, буфера и воды. Охлажденную до 50-60 о С смесь тонким слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле лунки для нанесения образца. Исследуемый препарат (раствор белка, ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля — полужидкой среды с сетчатой пространственной структурой (обычно для электрофореза используют тонкие пластины геля). Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещаются в электрическом поле. Молекулы одинакового размера (и одинакового заряда) движутся единым фронтом, образуя в геле дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся. Постепенно исходный препарат, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распределенные по длине пластинки. За ходом электрофореза следят по перемещению в геле красителя — заряженного низкомолекулярного вещества, которое вносят в каждую лунку перед началом электрофореза. Когда краситель достигает конца пластины, электрофорез останавливают, а гель окрашивают красителем, прочно связывающимся с белками или нуклеиновыми кислотами. Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после электрофореза получается набор четких полос, расположенных одна под другой. Если же распределение молекул по размеру более или менее непрерывно, то получается смазанная картина. По интенсивности окраски полос можно судить о концентрации макромолекул в образце. Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров

источник

Владельцы патента RU 2465576:

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Способ предусматривает введение в буфер для гель-электрофореза С₆-алкилоксибензола (гексилрезорцина). Изобретение обеспечивает увеличение сроков возможной визуальной детекции разделенных молекул ДНК при их длительном экспонировании на транслюминаторе при 254 нм, усиление контрастных свойств фона и сохранение структурных и функциональных характеристик разделенных молекул ДНК при детекции результатов гель-электрофореза посредством визуализации в ультрафиолетовом излучении. 1 ил., 4 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и ДНК-технологий, а именно к методам разделения и обнаружения молекул ДНК. В частности, изобретение предназначено для сохранения структурной целостности и функциональных свойств ДНК при ее детекции с использованием УФ-облучения после разделения методом гель-электрофореза для последующего применения при проведении молекулярно-генетических исследований и генно-инженерных манипуляций.

Открытие структуры ДНК [1 — Watson J.D., Crick F.H. Molecular structure of nucleic acids. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature, 171(4356): 737-738 (1953)] и ее главной роли в передаче генетической информации [2 — Crick F.H. Central Dogma of Molecular Biology. Nature, 227: 561-563 (1970)] положили начало молекулярной биологии и ее важнейшим разделам — генной инженерии, генетике человека и медицинской генетике. Важным условием для этого стала разработка методов электрофоретического разделения нуклеиновых кислот в агарозных гелях, после которого фрагменты ДНК разной длины или конформации визуализируют с использованием специфично взаимодействующих с ними флюоресцирующих красителей. В частности, наиболее распространенным подходом стала окраска гелей бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями ДНК-дуплекса и флюоресцирует при УФ-облучении [3 — Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с англ. — М.: Мир, 1982, 448 с.]. В дальнейшем, помимо визуализации разделенных фрагментов ДНК при электрофорезе, их стали выделять из геля для проведения различных генно-инженерных манипуляций: введения изолированных фрагментов в плазмидные векторы, трансформации бактериальных клеток и т.д. [4 — Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. — М.: Мир, 1984, 403 с.].

Значимая проблема, возникающая при детекции ДНК на источниках УФ-излучения (трансиллюминаторах) с максимумом 254 нм, определяется развитием различных видов ее фотоповреждений: внутри- и межмолекулярных сшивок [5 — Lyamichev V.I., Frank-Kamenetskii M.D., Soyfer V.N. Protection against UV-induced pyrimidine dimerization in DNA by triplex formation. Nature, 344(6266): 568-570 (1990)], а также одно- и двуцепочечных разрывов в молекуле ДНК [6 — Cariello N.F., Keohavong P., Sanderson B.J.S., Thilly W.G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nuc. Acids Res., 16: 4157-4161 (1988)]. Соответственно, конечным результатом подобных процессов является ухудшение качества препаратов ДНК, что негативно сказывается на результатах последующих генно-инженерных манипуляций [7 — Hartman P.S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques, 11: 747-748 (1991)].

Известные из уровня техники способы защиты молекул ДНК от ультрафиолетового излучения на этапах их разделения и детекции могут быть объединены в две основные группы: 1) использование для детекции результатов гель-электрофореза трансиллюминаторов с отличными от 254 нм длинами волн УФ-излучения; 2) введение в систему для гель-электрофореза специальных химических веществ (фотопротекторов), снижающих уровень повреждения ДНК при УФ-облучении.

Первый из названных подходов по своей сути является приборным (аппаратным) решением описанной проблемы. При этом использование длинноволновых трансиллюминаторов [8 — Daum H.A., Meis R., Fiandt М., Hoffman L.M., Seville М. Tutorial: Dark reader transilluminator — maintains biological activity and cloning efficiency when viewing DNA in gels. Genetic Engineering News, 21 (19): 1-3 (2001)] уменьшает повреждение ДНК [9 — Brunk C.F., Simpson L. Comparison of various ultraviolet sources for fluorescent detection of ethidium bromide-DNA complexes in polyacrylamide gels. Anal. Biochem., 82: 455-462 (1977)], но требует замены стандартного оборудования, по сравнению с которым характеризуется относительно более высокой стоимостью.

Вторая группа способов является наиболее близкой к заявляемому изобретению и может рассматриваться в качестве его аналогов. При этом их общим достоинством является то, что использование фотопротекторов во многих случаях является наиболее простым, дешевым и эффективным подходом, позволяющим сохранять структурную целостность и функциональные свойства молекулы ДНК от повреждающего действия УФ-излучения.

Так известен способ защиты ДНК от УФ-облучения при детекции результатов гель-электрофореза путем добавления в электрофоретический буфер нуклеозидов (азотистых оснований, связанных с сахаром): цитидина или гуанозина [10 — Grendemann D., Schumig E. Protection of DNA during preparative agarose gel electrophoresis against damage induced by ultraviolet light. BioTechniques, 21: 898-903 (1996)]. Эффективность данного способа подтверждена результатами последующей транскрипции, трансформации и полимеразной цепной реакции (ПЦР), выделенных из гелей ДНК.

Другим известным способом защиты ДНК от УФ-облучения после проведения гель-электрофореза является ее детекция в присутствии цинк-имидазолевых солей [11 — Hardy E., Sosa A. E., Pupo E., Casalvilla R., Femandez-Patron C. Zinc-imidazole positive: a new method for DNA detection after electrophoresis on agarose gels not interfering with DNA biological integrity. Electrophoresis, 17 (I): 26-29 (1996)]. Сохранение функциональных свойств полученных препаратов ДНК проверено с помощью повторного гель-электрофореза и трансформации.

На этом фоне новизна заявляемого способа определяется использованием в качестве фотопротекторов ДНК принципиально иной группы веществ — алкилоксибензолов (алкилрезорцинов), воспроизводящих естественные природные механизмы защиты микроорганизмов от стрессовых факторов среды обитания [12 — Эль-Регистан Г.И, Мулюкин А.Л., Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов. Микробиология, 75(4): 446-456 (2006)]. Кроме того, из уровня техники данная группа веществ известна как УФ-адсорберы, входящие в состав косметических композиций, предназначенных для снижения пигментации кожи [13 — Ratan К. Chaudhuri. Skin lightening compositions and methods. Patent US 2008/0305059 Al], а также композиций, предотвращающих фотодеструкцию синтетических полимеров — пластмасс и резин [14 — Vagel A., Roo E. Alkylresorcinols — rare chemicals available in bulk. Innov. Pharm. Tech.: 94-95 (2004)].

Однако в доступных источниках научной и патентной литературы не содержатся сведения о возможности использования алкилоксибензолов (алкилрезорцинов) для защиты ДНК от повреждающего действия УФ-облучения, в том числе при детекции результатов гель-электрофореза с сохранением ее структурной целостности и функциональных свойств для последующего использования при проведении генно-инженерных манипуляций.

Таким образом, заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.

Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является защита ДНК от повреждений, вызываемых ультрафиолетовым излучением при детекции результатов гель-электрофореза, с сохранением ее структурной целостности и функциональной активности.

Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее: введение в буферный раствор для электрофореза С₆-алкилоксибензола (гексилрезорцина) в концентрации 10 -3 М (0,194 г/л) с его последующим использованием для разделения молекул ДНК в агарозном геле под действием электрического поля и детекции результатов путем УФ-облучения с длиной волны 254 нм эффективно защищает ДНК от фотоповреждений, предупреждая утрату их структурной целостности, а также сохраняя функциональную активность для последующих манипуляций.

Соответственно, при реализации заявляемого способа характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления представляются следующим образом:

1) готовится водный раствор одного из стандартных электрофоретических буферов (трис-ацетатного, трис-фосфатного или трис-боратного) с конечной рН=8,0;

2) с использованием данного буфера путем нагревания готовится 0,4-2,0% расплав агарозы;

3) в остуженный до 50°C расплав агарозы вносится краситель бромистый этидий в концентрации, необходимой для последующей визуализации разделенных молекул при УФ-облучении с длиной волны 254 нм;

4) расплав агарозы переливается в горизонтально расположенную кювету, где с помощью гребенки формируются лунки для внесения препаратов ДНК, и оставляется до застывания в гелеобразное состояние;

5) агарозный гель с внесенными в лунки препаратами ДНК переносится в электрофоретическую ванну;

6) готовится навеска С₆-алкилоксибензола (гексилрезорцина) категории х.ч., который вносится в электрофоретический буфер до достижения конечной концентрации 10 -3 М (0,194 г/л);

7) буфер, содержащий указанные количества С₆-алкилоксибензола (гексилрезорцина), переносится в электрофоретическую ванну;

8) ванна подключается к источнику тока, на котором устанавливаются режимы электрофореза;

9) по прошествии времени разделения препаратов ДНК, определяемого размерными характеристиками разделяемых молекул, источник тока отключается и агарозный гель переносится на трансиллюминатор;

10) на трансиллюминаторе под действием УФ-излучения производится визуализация результатов электрофоретического разделения молекул ДНК, в том числе документируемая с использованием цифровых устройств;

11) при необходимости фрагменты агарозного геля, в которых визуализированы разделенные молекулы ДНК, вырезаются из геля и из них выделяется ДНК для последующих генно-инженерных манипуляций.

Таким образом, разделение, визуализация и при необходимости последующее извлечение ДНК из геля проводятся без каких-либо дополнительных действий, а основным отличием описанного выше способа от стандартной процедуры постановки электрофореза является добавление в электрофоретический буфер перед процедурой электрофоретического разделения ДНК С₆-алкилоксибензола (гексилрезорцина) в концентрации 10 -3 М (0,194 г/л), проявляющего свойства фотопротектора и эффективно сохраняющего структурную целостность и функциональную активность молекул ДНК.

Возможность получения технического результата при выполнении перечисленных действий в указанных интервалах значений определяется следующим комплексом причинно-следственных связей:

1) использование для заявленных целей именно С₆-алкилоксибензола (гексилрезорцина) определяется тем, что при проведении сравнительной серии экспериментов с использованием ряда иных алкилоксибензолов, отличающихся длиной алкильного радикала: C₁-, C₃— и С₅-алкилоксибензола, было установлено, что именно он проявляет наибольшие фотопротекторные свойства (табл.1). При этом в качестве критерия эффективности фотопротекции служила остаточная интенсивность флуоресценции фрагментов ДНК под действием УФ-излучения 254 нм с энергетической освещенностью 0,24 В/м 2 , оцениваемая по уменьшению степени яркости полос на цифровых фотографиях с помощью инструментов универсальной компьютерной программы для анализа и обсчета биологических изображений «Image J»;

2) экспериментальным обоснованием применения Сб-алкилоксибензола (гексилрезорцина) в оптимальной концентрации 10 -3 М, соответствующей 0,194 г/л, является то, что использование данного вещества в концентрациях выше указанной достоверно не увеличивало защитный эффект по сравнению с контролем (табл.1), а уменьшение приводило к существенному снижению желаемого эффекта;

3) обоснованием использования С₆-алкилоксибензола (гексилрезорцина) именно в качестве добавки к электрофоретическому буферу при проведении гель-электрофореза ДНК являются результаты экспериментов с его внесением в различные среды при проведении электрофореза, а именно: добавление в лунки геля к препаратам ДНК, в агарозный гель, а также в электрофоретический буфер. При этом использование последнего пути внесения продемонстрировало свою наибольшую эффективность, обеспечив увеличение сохранности препаратов ДНК в 2,63 раза по сравнению с обычным способом (табл.2), в то время как иные пути внесения увеличивали данный показатель только на 1,63-15,45%.

Таким образом, при разработке заявляемого способа использованы оригинальные экспериментальные данные о наибольшей выраженности фотопротекторных свойств у С₆-алкилоксибензола (гексилрезорцина) при оптимальной концентрации 10 -3 М (0,194 г/л) и его использовании в качестве добавки к электрофоретическому буферу. Соответственно, резюмируя приведенные выше материалы о сущности заявляемого способа, характеристике действий, порядке их выполнения и условиях осуществления, можно констатировать, что заявляемый способ не следует из уровня техники и по этому показателю должен быть оценен как соответствующий критерию «изобретательский уровень».

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается, следующими примерами.

Пример 1. Реализация способа при визуализации результата разделения продуктов амплификации ПЦР в агарозном геле при различной длительности экспозиции на УФ-трансиллюминаторе

Заявляемый способ использован при детекции результатов полимеразной цепной реакции (ПЦР), проведенной с целью лабораторной ДНК-диагностики хламидийной инфекции.

При проведении данного исследования использовались биологические образцы, содержащие ДНК, взятые у лиц, обратившихся по поводу подтверждения или исключения наличия заболевания, сравниваемые с положительными контрольными образцами ДНК Chlamydia trachomatis набора «Полимик-ХЛ» размером 273 п.н. (НПФ «Литех», Россия). Миграцию исследуемых и контрольных продуктов ПЦР после 20 минут электрофореза в 0,8% геле в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия в трис-боратном буфере (pH 8,0) при силе тока 100 мА и напряженности электрического поля 5 В/см, задаваемыми источником питания (ДНК-Технология, Россия), оценивали на трансиллюминаторе (Vilber Lourmat, Франция), оснащенном 6 лампами на 254 нм с энергетической освещенностью W=0,24 В/м 2 . Заключение о наличие заболевания принимали при обнаружении продукта амплификации — молекул ДНК, соответствующих по своему расположению в геле положительному контролю, для чего визуально сравнивали дорожки с внесенными препаратами ДНК при их экспонировании на трансиллюминаторе в течение 5, 30, 300 и 600 секунд (чертеж.). С целью объективизации результата степень сохранения структурной целостности амплифицированных фрагментов ДНК оценивали по уменьшению интенсивности яркости полос на цифровых изображениях гелей агарозы, обработанных с помощью инструментов универсальной компьютерной программы для анализа и обсчета цифровых изображений «ImageJ» (табл.3).

Проведение подобного диагностического исследования обычным и заявляемым способом свидетельствовало о принципиальной идентичности получаемого результата в динамике детекции на трансиллюминаторе, однако имеющего различную стабильность. Так при обычном способе наблюдалась достаточно быстрая деградация фрагментов ДНК под действием УФ-излучения, что проявлялось как снижение интенсивности свечения и последующее исчезновение «полос». Данное обстоятельство существенно затрудняло регистрацию результатов, в том числе при необходимости его представления нескольким специалистам и коллегиальной оценки, тем самым негативно сказываясь на правильности постановки диагноза при диагностике хламидийной инфекции. В свою очередь, положительный эффект от использования заявляемого способа заключался в стабильности картины разделения ДНК (вплоть до 300 секунд УФ-облучения), что представляло условие для принятия правильного диагностического заключения. Кроме того, дополнительным позитивным результатом при реализации заявляемого способа являлось сохранение оптических свойств (прозрачности) геля, обеспечивающих контрастность полос ДНК относительно фона (фиг.).

Пример 2. Реализация способа при сохранении функциональных характеристик молекул плазмидной ДНК для последующей трансформации

Заявляемый способ использован при детекции результатов разделения молекул плазмидной ДНК с их последующим выделением из агарозного геля и трансформации клеток Escherichia coli.

При проведении данного исследования использовались образцы вектора pUC19 размером 2686 н.п. («Сибэнзим», Россия) с клонированными генами luxAB, а также производная от него плазмида. После процедуры электрофоретического разделения в агарозном геле последняя переносилась на трансиллюминатор (Vilber Lourmat, Франция), оснащенный 6 лампами на 254 нм с энергетической освещенностью W=0,24 В/м 2 , где под визуальным контролем в течение 30 секунд вырезались блоки, содержащие флюоресцирующие «дорожки» плазмидной ДНК. Блоки обрабатывали с использованием набора для извлечения ДНК («Цитокин», Россия), после чего полученные экстракты, а также контрольные образцы исходного вектора pUC19 переносили к заранее подготовленным компетентным клеткам Escherichia coli (выращивание в LB-бульоне до ОП₆₀₀=0,20-0,30, концентрированно в 25 раз в 100 мМ ледяном растворе CaCl₂) и инкубировали при 0°C в течение 15 мин. Комплексы «клетка-ДНК» выдерживали при 42°C в течение 90 секунд и быстро охлаждали во льду. На следующем этапе к клеткам добавляли 1000 мл LB-бульона и инкубировали при 37°C в течение 60 мин, после чего высеивали на LB-агар с селективным маркером — антибиотиком ампициллином (50 мг/мл) для определения числа трансформантов. Эффективность трансформации оценивалась по количеству колоний на поверхности плотной селективной среды после инкубации при 37°C в течение 18-24 ч (табл.4).

Результаты трансформации клеток Escherichia coli исходным вектором pUC19 и плазмидной ДНК свидетельствовали о том, что в последнем случае эффективность трансформации оказывалась более чем на порядок ниже. На этом фоне положительный эффект от использования заявляемого способа заключался в 1,25-кратном увеличении эффективности трансформации: до 9,82% от эффективности трансформации вектором pUC19 по сравнению с аналогичной величиной 7,88% при использовании обычного способа. Таким образом, положительный эффект заявляемого способа защиты ДНК от повреждающего действия УФ-облучения при оценке результатов гель-электрофореза проявлялся в сохранении функциональных характеристик разделенной и детектированной плазмидной ДНК с целью ее последующего применения для процедуры трансформации бактериальных клеток.

Способ защиты ДНК от повреждающего действия ультрафиолетового облучения с длиной волны λ=254 нм при детекции результатов гель-электрофореза, заключающийся в том, что перед проведением разделения молекул ДНК в буфер для гель-электрофореза вводят химический фотопротектор С₆-алкилоксибензол гексилрезорцин в конечной концентрации 10 -3 М, что соответствует 0,194 г/л.

источник