Электрофорез белков диагностическое значение

Для разделения белков сыворотки крови на их составляющие используют метод электрофореза, основанный на различной подвижности белков сыворотки крови в электрическом поле.

Принцип разделения белков сыворотки крови на фракции состоит в том, что в электрическом поле белки сыворотки крови движутся по смоченной буферным раствором хроматографической бумаге (ацетатцеллюлозной пленке, крахмаловому, агаровом гелям) со скоростью, зависящей в основном от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц.

Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются обычно на пять основных фракций: альбумины, альфа-1-глобулины, альфа-2-глобулины, бета-глобулины, гамма-глобулины, содержание которых определяется с помощью фотометрии или денситометрии.

Электрофорез в агаровом, крахмальном и особенно полиакриламидном геле дает лучшие результаты: четкое разделение и большое количество белковых фракций сыворотки. Недостатки метода: сложность процедуры приготовления геля (дороговизна готовых гелевых пластин).

Преимущества электрофореза на ацетатцеллюлозной пленке:

1. Химическая однородность пленки и одинаковый размер пор

2. Требует малый объем пробы (0,2-2 мкл) для разделения

3. Быстрота разделения и окраски белков, легкость отмывания фона

В сыворотке крови здорового человека при электрофорезе можно обнаружить шесть белковых фракций: преальбумины, альбумины, альфа-1-глобулины, альфа-2-глобулины, бета-глобулины и гамма-глобулины.

Это исследование в диагностическом отношении более информативно чем определение только общего белка или альбумина. При многих заболеваниях изменяется процентное соотношение белковых фракций, хотя общее содержание белка в сыворотке крови остается в пределах нормы.

Анализ фореграммы белков позволяет установить, за счет какой фракции происходит увеличение или дефицит белка, а также судить о специфичности изменений, характерных для данной патологии. Исследование белковых фракций, позволяет судить о характерном для какого-либо заболевания избытке или дефиците белка только в самой общей форме.

Белковые фракции сыворотки крови в норме:

При анализе результатов исследования сыворотки крови на белковые фракции выявляются три типа нарушений:

1. Диспротеинемия (изменение соотношения белковых фракций)

2. Генетические дефекты синтеза белков

3. Парапротеинемия (аномальные белки в крови)

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8374 — | 8007 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

В плазме человеческой крови находится множество белковых компонентов. Они различны по своему составу, строению и подвижности в определенной среде, проводящей электрический ток. На этом и строится разделение общего белка, который локализуется в плазме, на различные белковые фракции. При проведении электрофореза сыворотки крови выясняют количественное отношение отдельных белковых составляющих и структур. Это необходимо для определения наличия у человека различных патологических явлений, например инфекций или онкологии. Именно электрофорез белков сыворотки крови имеет большое значение при проведении диагностики различных болезней.

Для расщепления белковых фракций применяют электрофорез сыворотки крови, принцип которого основан на разной подвижности белковых компонентов в созданном электрическом поле. Такой метод исследования является более точным и информативным, в отличие от стандартного общего анализа крови. Но при этом электрофорез показывает только количество определённой фракции белка, характер и степень патологического процесса в общей форме. Анализ проведенных исследований позволяет медицинским специалистам выяснить, какое именно соотношение белковых фракций наблюдается в организме человека, и определить специфику патологии, присущую конкретному заболеванию.

Большую часть основной биологической жидкости человека, или крови, составляют белки. В общем количестве их норма находится в пределах 60-80 г/л. Для получения точного анализа проводится электрофорез сыворотки крови на бумаге. Это исследование является самым распространенным способом анализа. Основной средой является особая фильтровальная бумага. Главная ее особенность – высокая гигроскопичность. Такая бумага может поглотить воды больше своего веса в 130-200 раз. В зависимости от применяемого оборудования электрофорез на бумаге длится 4-16 часов. Происходит подразделение белковых структур. Затем полосы бумаги обрабатывают специальными красками для получения анализа. Такая методика является самой распространенной в работе медицинских лабораторий. За счёт воздействия электрического тока белковые фракции, заряженные отрицательно, двигаются в сторону положительно заряженного электрода. Благодаря этому белковые составляющие крови подразделяются на 5 известных фракций:

Альбумины заряжены отрицательно, имеют маленькую, по сравнению с другими фракциями, молекулярную массу. За счет этого скорость их передвижения гораздо выше, чем у остальных фракций, и они дальше всех локализуются от участка старта. Первые три фракции глобулина передвигаются с более низкой скоростью из-за своей массы. Но самая маленькая скорость регистрируется у γ-глобулинов. Эти белки имеют большую массу и крупные, относительно других, размеры. Их заряд почти нейтрален, поэтому данная белковая фракция практически не сдвигается с линии старта.

В настоящее время электрофорез сыворотки крови часто проводимый анализ для постановки точного диагноза болезни. Этот анализ могут назначить как терапевты, так врачи узкого профиля. Показаниями по проведению исследований будут:

• различные воспаления;
• болезни хронической природы;
• патологические процессы в соединительной ткани;
• внутреннее кровотечение;
• злокачественные новообразования.

Для того чтобы полученные результаты поведенных исследований были верными, не менее чем за 8 часов до сдачи крови необходимо отказаться от приёма еды. Кроме того, необходимо согласовать прием лекарственных средств, если таковые имеются, с лечащим врачом.

Для того чтобы результаты не были по ошибке завышены, необходимо снизить до минимума возможность свертывания крови для определения показателя белковых фракций и общего белка. Электрофорез сыворотки крови проводится аккуратно, поскольку существует вероятность искажения полученных результатов из-за фибриногена. Он может прятать ненормальные белки или быть спутанным с ними.

В течение суток после сдачи пробы будет готов анализ на электрофорез белков сыворотки крови. Норма полученных показателей по категориям у взрослых людей:

1. Общий белок – 63-82 г/л.
2. Альбумины – 40-60 % от общего количества фракций.
3. α₁-глобулины – 2-5 %.
4. α₂-глобулины – 7-13 %.
5. β-глобулины – 8-15 %
6. γ-глобулины – 12-22 %.

Изменение количества любой белковой фракции в большую или меньшую сторону может свидетельствовать о развитии той или иной патологии. Для получения достоверной информации об этом необходим электрофорез белков сыворотки крови. Расшифровка результатов облегчит медицинским специалистам постановку диагноза и выбор лечения.

В самом начале при анализе полученных результатов определяют количество альбумина. Увеличение этой фракции может говорить об обезвоживании. Такое может произойти, если у больного отмечается затяжная рвота или нарушения в пищеварительной системе. Также увеличение альбумина происходит при ожогах большой площади кожного покрова.

Гораздо опаснее, если в организме снижается количество альбуминов, это может говорить о следующих патологиях:

1. Поражения почек и печени.
2. Патологии желудочно-кишечного тракта.
3. Инфекционные процессы.
4. Нарушения в деятельности сердечно-сосудистой системы.
5. Кровотечения.
6. Злокачественные новообразования.
7. Сепсис.
8. Ревматизм.

Незначительное уменьшение количества альбуминов может быть также:

1. У будущих матерей.
2. При превышении дозы лекарственных препаратов.
3. При длительной лихорадке.
4. У заядлых курильщиков.

Уменьшение количества a1-глобулинов регистрируется при недостатке α₁-антитрипсина. Увеличение же отмечают при обострении воспалений в организме, нарушениях в работе печени, при тканевом распаде.

Регистрируют его при сахарном диабете, воспалительных процессах в поджелудочной железе, у новорожденных детей при желтухе, при гепатитах токсического происхождения. Свидетельствует оно и о неправильном, несбалансированном питании.

Происходит при наличии следующих заболеваний:

1. Воспаления, особенно с присутствием гнойного экссудата (воспаление легких и другие процессы с наличием гноя).
2. Поражения соединительной ткани (например, ревматизм).
3. Злокачественные новообразования.
4. Периоды восстановления после ожогов.
5. Поражение почек.

Кроме того, такое явление характерно для гемолиза крови в пробирке во время проведения исследования.

Проявляется при гиперлипопротеидемии (увеличении количества липидов в крови), патологиях печени и почек. Можно обнаружить при открытой язве желудка, а также гипотиреозе (нарушение работы щитовидной железы). Снижение фракции регистрируют при гипобеталипопротеинемии (повышение в крови компонента беталипопротеин).

Эта фракция включает в свой состав иммуноглобулины. Поэтому увеличение γ-глобулинов регистрируется при сбоях в иммунитете. Обычно это происходит при различных инфекциях, развитии воспалительного процесса, изменениях ткани и ожоговых поражениях. Рост γ-глобулинов отмечают у больных хронической формой гепатита. Практически такая же картина характерна для цирроза печени. При запущенных случаях данного заболевания количество белковой фракции γ-глобулинов значительно выше показателя альбуминов. При определенных болезнях могут возникать сбои в образовании γ-глобулинов, и происходит развитие измененных протеинов в крови – парапротеинов. Для выяснения характера такого развития производится дополнительное исследование – иммуноэлектрофорез. Такая картина характерна для миеломного заболевания и патологии Вальденстрема.

Увеличение количества γ-глобулинов также присуще следующим патологиям:

• красной волчанке;
• эндотелиоме;
• ревматоидной форме артрита;
• остеосаркоме;
• хронической форме лимфолейкоза;
• кандидомикозу.

Снижение показателя γ-глобулинов подразделяют на 3 вида:

1. Физиологический (характерен для детей в возрасте от трех до пяти месяцев).
2. Врожденный (развивается с момента рождения).
3. Идиопатический (когда причину развития установить не удается).

Вторичное снижение регистрируется при развитии заболеваний, которые вызывают истощение иммунной системы. В последнее время в медицинской практике все чаще проводится анализ на определение количества преальбуминов. Обычно такое исследование проводят больным, находящимся в реанимации.

Уменьшение количества преальбуминов очень важный и точный тест на определение недостаточности белковых структур в организме пациента. При проведении анализа на преальбумины выполняют коррекцию белкового метаболизма у таких пациентов.

Принцип проведения подобного анализа схож с технологией выполнения электрофореза сыворотки крови. Проводят его для более точной постановки диагноза или обнаружения других патологий. Кроме того такой анализ поможет выявить у больного наличие протеинурии.

Электрофорез сыворотки крови и мочи – важные методы в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря методике исследования и высокой точности они помогают определить вид патологии. Точный диагноз – верный путь к правильному лечению и полному выздоровлению.

источник

Электрофорез сывороточных белков: современные возможности анализа

Гильманов А.Ж., д.м.н., профессор
Саляхова Р.М., к.м.н., доцент
Кафедра лабораторной диагностики ИПО Башкирского медуниверситета, г. Уфа

Информативность и экономичность – важнейшие требования к лабораторным исследованиям, которые приходится учитывать как в отечественной, так и в зарубежной практике. Одним из достаточно информативных лабораторных тестов, используемых в настоящее время, является электрофорез белков биологических жидкостей (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.), который позволяет получить значительную диагностическую информацию. К сожалению, в большинстве лабораторий нет необходимых приборов. В то же время часть лабораторий, имеющих оборудование для электрофореза, им зачастую не пользуется из-за поломок, отсутствия расходных материалов или, как нередко бывает, невостребованности этого типа анализов лечащими врачами вследствие их недостаточной осведомленности о современных возможностях и клинической значимости этого метода. Исследование белкового и липопротеинового спектра сыворотки крови особенно значимо для диагностики патологических состояний, сопровождающихся нарушениями обмена белков и дислипопротеидемиями. При многих заболеваниях в сыворотке крови изменяется соотношение отдельных белков (диспротеинемия), хотя общее содержание белка может остаться нормальным.

В настоящее время известно более 150 индивидуальных сывороточных белков; значительную часть из них можно количественно определить современными иммуноферментными, иммунохемилюминесцентными и иммунотурбидиметрическими методами. Но при всей информативности и доказательности таких анализов пока они в основном малодоступны из-за сравнительной дороговизны: себестоимость одного количественного определения апопротеинов, антитрипсина или иммуноглобулинов составляет от 2 до 8 долларов США. Вместе с тем типовые сдвиги белкового состава сыворотки крови можно определить гораздо более доступным электрофоретическим методом, который к тому же позволяет «одним взглядом» оценить общую картину белкового спектра и получить значимую диагностическую информацию.

Принцип электрофоретического разделения молекул состоит в их движении с раз-личной скоростью в постоянном электрическом поле. Наиболее часто в клинической практике используется электрофорез на поддерживающих средах-носителях – хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозных мембранах, различных гелях, а также на комбинированных средах. Электрофорез на бумаге до недавнего времени широко применялся во многих лабораториях, однако он имеет много недостатков. Основной из них – в том, что результаты фракционирования белков этим методом могут быть получены лишь на 2-3 день исследования. Электрофорез в агарозном, крахмальном и особенно в полиакриламидном геле дает существенно лучшие результаты, позволяя идентифицировать большее количество белковых фракций сыворотки (до 30), но и ему присущи недостатки – сложность приготовления геля или дороговизна готовых гелевых пластин. Использование мембран из ацетата целлюлозы позволяет достигнуть компромисса и использовать их главные особенности — однородность материала, очень малую емкость слоя, требующую микроколичеств пробы (0,4–2,0 мкл), быстроту разделения и окраски белков (20-80 мин), легкость отмывания фона, а также относительно низкую стоимость пленок и их доступ-ность. В целом применение ацетатцеллюлозных мембран позволяет повысить четкость фракционирования и значительно сократить время, требуемое для разделения, окраски и анализа.

Знак и величина электрического заряда молекул белков сыворотки крови, а значит, направление и скорость их движения при электрофоретическом разделении, зависят от значения рН и ионной силы среды. Кроме того, скорость движения белковых молекул оп-ределяется их молекулярной массой, ионным окружением (составом и концентрацией бу-фера), приложенным напряжением и другими факторами. В связи с этим для получения сопоставимых данных электрофорез должен осуществляться при строго определенных значениях указанных параметров. В буферном растворе с рН=8,6 или 8,9 и ионной силой 0,08–0,15 моль/л все белки сыворотки крови приобретают отрицательный заряд и движутся от катода к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую молекулярную массу, затем располагаются a ₁-, a ₂-, b — и g -глобулины. Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на несколько подфракций.

Следует указать, что результаты электрофореза сильно зависят от подготовки про-бы и мастерства лабораторного персонала. Сыворотку крови для исследования лучше брать свежей, хранившейся не более нескольких часов. В пробе не должно быть следов гемолиза; в противном случае свободный гемоглобин и его комплекс с гаптоглобином мо-гут образовать дополнительные полосы в области a ₂— и b -глобулинов. В присутствии ионов кальция и под влиянием некоторых лекарственных веществ возможно расслоение b -фракции на две подфракции, что объясняется нарушением подвижности С3-компонента комплемента. Наконец, в целом качество «картинки» зависит от навыков нанесения пробы (это тоже определенное искусство, формирующееся практикой) и используемых инструментов-аппликаторов.

Необходим постоянный контроль рН буфера, применяемого для электродных камер и для смачивания пленок, т.к. от его значения зависит качество разделения фракций. Дело в том, что в ходе электрофореза на аноде и катоде протекают различные электрохимические процессы, приводящие к изменениям характеристик буферных растворов (в ча-стности, рН). В связи с этим для восстановления его значения некоторые специалисты рекомендуют по окончании рабочего дня смешивать буферные растворы из разных элек-тродных камер путем сливания в один сосуд, что позволяет существенно продлить срок службы буфера (в зависимости от интенсивности работы — до нескольких недель и более, но с условием периодического контроля рН; при выходе этого показателя за пределы ±0,1 0,2 от требуемых величин буферный раствор подлежит замене на свежеприготовленный). Срок работы электродных буферных растворов уточняется опытным путем; обычный признак потери их годности – сокращение длины разгонной дорожки, «наложение» белковых фракций друг на друга и «обрезанный» задний край гамма-глобулиновой фракции при обычных значениях тока (напряжения) и времени электрофореза. Замачивание пленок необходимо всегда осуществлять в свежем буферном растворе, не применявшемся в качестве электродного буфера.

Надо помнить, что электрофорез относится к полуколичественным исследованиям. Это определяется самой «технологией» его этапов, в частности, окраски проб и денситометрии. По принятым международным правилам, первоначальная оценка результатов электрофоретического разделения сывороточных белков (выявление нормы или патологии) должна проводиться визуально, путем сравнения с картиной нормальной сыворотки, а количественные данные предназначены только для документирования результатов и динамического наблюдения. При оценке фракций только по процентному их содержанию возможны ошибки трактовки анализа. Например, при гипергаммаглобулинемии относительное количество альбумина (в %) автоматически окажется сниженным, хотя его абсолютная концентрация (в г/л) реально не изменялась. Для исключения недоразумений желательно количественно определять белковые фракции — в г/л, что легко осуществить умножением процентного содержания отдельных фракций на концентрацию общего белка в сыворотке крови. Можно дополнительно провести определение уровня сывороточного альбумина колориметрическим методом и результат сравнить со значением, полученным при электрофорезе; эта процедура одновременно поможет оценить качество анализа.

С учетом приведенного выше, при интерпретации результатов клиницистам нет смысла придавать диагностическое значение, например, снижению содержания альбумина у пациента на 2-3% от справочных данных. Само понятие нормы в лабораторной практике весьма условно; нормальные значения параметров зависят от местных факторов и должны формироваться в первую очередь «на местной базе», т.е. в конкретной лаборатории при обследовании здорового контингента. Вместе с тем для общего контроля качества разделения белков выпускаются специальные контрольные сыворотки, которые желательно иметь в каждой лаборатории, работающей этим методом.

Приведенные положения о количественной оценке фракций в полной мере относятся и к электрофоретическому разделению липопротеинов сыворотки крови, применяе-мому для оценки типа и тяжести гиперлипопротеинемии (ГЛП) с учетом количества триглицеридов, холестерина общего и холестерина в составе ЛПВП. Наибольшее значение электрофоретический метод имеет для дифференциальной диагностики атерогенной ГЛП III типа и умеренно атерогенной ГЛП V типа: ГЛП-III характеризуется наличием патоло-гически измененных (аномальных) ЛП, отличающихся значительным содержанием ТГ, ХС и одновременно высокой электрофоретической подвижностью; на графике будет видно слияние фракций ЛПНП и ЛПОНП ( b -ЛП и пре- b -ЛП). Но надо помнить, что методом электрофореза выявляется только относительное распределение фракций, количественная оценка отдельных ЛП не рекомендуется, поскольку для этого метода не существует стандартных калибровочных и контрольных материалов.

Для электрофореза белков используются различные аппараты, как ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных мембран или гелевых пластинок (определения относительного количества белков в каждой фракции) используется электронный цветной сканер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность и воспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает возможность усредненного расчета оптической плотности отдельных фракций путем автоматического определения границ «дорожек» и многократного сканирования каждой из них в нескольких «разрезах», что позволяет исключить ошибки из-за локальных микродефектов и неровного положения носителя, а также до определенной степени нивелировать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится график-денситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций. При необходимости маркеры границ фракций на графике можно скорректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофореграмм; их можно в любое время извлечь и просмотреть.

Электрофорез белков, позволяющий определить их количественные сдвиги и физико-химические характеристики, помогает выявить заболевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразования (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетические поломки и др. Известен ряд своеобразных электрофоретических «синдромов» – типичных картин электрофореграмм, характерных для некоторых патологических состояний. Среди них можно отметить:

1.Острое воспаление с активацией системы комплемента и увеличением синтеза острофазных белков ( a ₁-антитрипсина, гаптоглобина, фибриногена и др.). Оно проявляется увеличением доли a ₁— и a ₂-глобулинов и может быть подтверждено измерением СОЭ, исследованием концентрации С-реактивного белка, фибриногена (в динамике) и других острофазных белков.

2.Хроническое воспаление с усилением синтеза ряда острофазных белков, а также имму-ноглобулинов; проявляется умеренным возрастанием a ₂— и b -глобулинов, повышением g -глобулинов и некоторым снижением альбумина. Подобные отклонения могут наблюдаться при хронических инфекциях, коллагенозах, аллергии, аутоиммунных процессах и при малигнизации.

3.Тяжелые заболевания печени сопровождаются снижением синтеза альбумина и a -глобулинов, что и отражается на электрофореграммах. Как указывалось выше, нужно помнить, что процентная концентрация альбумина может оказаться сниженной лишь относительно, из-за накопления других белков, поэтому оценивать нарушения белково-синтезирующей функции печени следует по абсолютному содержанию альбумина (в г/л). При хронических гепатитах и циррозах печени возрастает как относительное, так и абсолютное количество g -глобулинов ( b — и g -фракции могут сливаться из-за накопления IgA), причем превышение g -глобулинов над альбуминами является весьма неблагоприятным прогностическим признаком.

4.Нефротический синдром сопровождается увеличением фильтрации белков в почках и селективной протеинурией – потерей с мочой большого количества альбумина и части низкомолекулярных глобулинов ( a ₁-антитрипсина, трансферрина). При этом в печени усиливается синтез более крупных протеинов семейства a ₂-глобулинов (макроглобулин, апо-В), которые накапливаются в крови и формируют картину со значительным снижением альбумина и повышением a ₂-глобулинов.

5.Нарушение всасывания или значительная потеря белков возможна как при нефротическом синдроме, так и при массивных ожогах, синдроме Лаэлла, патологии желудочно-кишечного тракта и т.д. В последнем случае снижается абсолютное содержание общего белка и особенно альбумина, а на протеинограмме оказывается уменьшенной доля альбумина при относительно равномерном возрастании всех глобулинов. Введение белковых препаратов (иммуноглобулины, альбумин или плазма крови) в ходе лечения больных немедленно отражается на электрофоретической картине, что позволяет следить за динамикой потерь или выведения поступивших белков.

6.Тяжелый иммунодефицит врожденного или приобретенного генеза обычно сопровождается выраженным снижением g -глобулиновой фракции. При этом желательно провести дополнительное количественное определение IgG, IgA и IgM.

7.Парапротеинемия при злокачественных и доброкачественных процессах – симптом, для выявления которого именно электрофорез является методом выбора. При накоплении в крови моноклональных иммуноглобулинов или фрагментов их цепей, как бывает, в частности, при миеломной болезни и некоторых лейкозах, на протеинограмме появляется более или менее острый пик в области от a ₂— до g -глобулинов (так называемый М градиент), хорошо заметный визуально. Электрофорез белков мочи, проведенный параллельно, в этом случае выявит пик, находящийся в той же области. Для дифференцировки парапротеинов и идентификации белковых цепей можно использовать современнейшую модификацию электрофореза – иммунофиксацию, для которой выпускаются специальные гелевые пластины с антисыворотками.

Ниже представлены примеры интерпретации данных исследования сыворотки крови нескольких пациентов, проведенного с помощью устройства электрофореза с анализатором электрофореграмм УЭФ-01-«Астра» производства НПЦ «Астра» (г. Уфа).

Рис. 1. На протеинограммах хорошо виден М-градиент в области g — глобулинов, что свидетельствует о гаммапатии (скорее всего моноклональной), сопровождающейся резким повышением g -глобулиновой фракции, снижением b -глобулинов и альбуминов. Это может быть характерно для g -плазмоцитом, макроглобулинемии Вальденстрема, амилоидоза, лимфомы, а также возможно при введении некоторых антикоагулянтов. Для уточнения диагноза необходимо определение содержания общего белка в сыворотке крови и белка Бенс-Джонса в моче, проведение электрофореза с иммунофиксацией и др.

Рис. 2. Изменения на представленных электрофореграммах также характерны для моноклональной гаммапатии. Резко повышена g -глобулиновая фракция (хорошо заметен М-градиент).

Рис. 3. На протеинограмме — значительное снижение альбуминов, резкое повышение a ₂-глобулинов и некоторое возрастание b -глобулинов. Значительное уменьшение уровня как альбуминов, так и общего белка в сыворотке крови характерно для нефротического синдрома; косвенным свидетельством гипопротеинемии может быть низкая интенсивность окраски белковых фракций данной дорожки по сравнению с соседними. Другие, более редкие состояния со сходным изменением фракций: a ₂-плазмоцитома, опухоли, термические ожоги, ряд острых и подострых заболеваний, а также анальбуминемия. Для уточнения диагноза необходимо определение общего белка в сыворотке крови, электрофорез с иммунофиксацией, электрофорез белков мочи и т.д.

Рис. 4. Отмечается небольшое избирательное снижение фракции g -глобулинов, что возможно при иммунодефиците, иммуносупрессии на фоне лечения кортикостероидами, иммунодепрессантами, химиотерапии, а также при некоторых лимфопролиферативных заболеваниях.

Рис.5. На данной электрофореграмме представлены результаты разделения липопротеидов сыворотки крови, выполненного параллельно с сывороточными белками. Отмечается увеличение фракции пре- b -липопротеинов, что в сочетании с повышением уровня общего холестерина и триглицеридов и равномерно-мутным видом сыворотки харак-терно для ГЛП IV типа. Для окончательного фенотипирования необходимы данные о клинических проявлениях заболевания, наследственной отягощенности и индексе атерогенности.

Рис. 6. Данная фореграмма отражает увеличение фракции b -липопротеинов на фоне повышения содержания общего холестерина (6,8 ммоль/л) и нормального уровня триглицеридов (1,1 ммоль/л), что при прозрачной сыворотке характерно для ГЛП IIа типа.

Рис. 7. Данная фореграмма также свидетельствует о ГЛП IIа типа (увеличение фракции b -липипротеинов, повышение содержания холестерина (7,2 ммоль/л), нормальный уровень триглицеридов (1,5 ммоль/л). Сыворотка у таких больных прозрачная.

Электрофоретические методы в клинической лабораторной диагностике имеют хорошую перспективу. Так, среди новинок можно отметить автоматические системы капиллярного электрофореза, которые выполняют быстрое разделение биомолекул внутри капилляра под действием высокого напряжения; для таких приборов требуются уже не микролитры, а нанолитры образца. В целом использование современных электрофоретических анализаторов позволяет с высокой точностью и минимальными затратами исследовать широчайший спектр биохимических параметров с целью уточнения диагноза, мониторинга патологического процесса и обоснования методов терапии заболеваний.

1. Сергеева Н.А. // Клин. лаб. диагн. – 1999. — № 2. — С. 25-32.
2. Титов В.Н., Амелюшкина В.А. Электрофорез белков сыворотки крови. –М., 1994.
3. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах). Минск, 2000. -463 С.

источник

Этот анализ является исследованием, которое позволяет определить их количественные и качественные показатели по тому, как белки распределяются в электрическом поле. Исследование основано на том, что белковые молекулы несут заряды, положительные или отрицательные в зависимости от того, какой кислотностью будет обладать среда, в которой будет проводиться непосредственно электрофорез. Молекулы, которые окажутся положительно заряженными, будут адсорбироваться лучше, нежели чем те, которые несут отрицательный заряд.

Носителями, которые будут применяться для электрофореза, могут быть хроматографическая бумага, агаровый гель, полиакриловой гель, ацетатцеллюлозная бумага или акриловый гель. Значительно реже применяется капиллярный электрофорез.

Во время анализа белки разделяют на 5 или 6 фракций, в зависимости от применяемого метода. Это будут гамма-глобулины, которые делятся на бета-1 и бета-2, альбумины — альфа-1 и альфа-2, а также бета-глобулины.

Имеются установленные нормы белковых фракций, которые должны присутствовать в крови. Отклонение их от показателей является признаком нарушения в организме, что требует проведения обследования для выявления причины.

Значения показателей, в зависимости от того какие реактивы применяются в конкретной лаборатории, могут несколько изменяться. Поэтому в бланке результатов исследования в каждом медицинском учреждении обязательно указываются значения нормы, которые приняты в нем. На них будет ориентироваться врач при расшифровке анализа.

Электрофорез белков крови назначают не очень часто, так как сегодня современные лабораторные исследования позволяют провести анализ на определенный белок, что ускоряет процесс диагностики. Абсолютным показанием к электрофорезу является наличие монолокальной гаммапатии. Также иногда анализ может быть показан в таких случаях:

• чрезмерно высокая скорость оседания эритроцитов, когда она превышает 50 мм/ч;
• значительно повышенный уровень гамма-глобулинов;
• скрининговое обследование для контроля эффективности лечения миеломной болезни;
• чрезмерно высокий общий белок в крови;
• ряд аутоиммунных заболеваний, поражающих печень и почки;
• слабость, для которой нет выраженной причины;
• развитие патологических переломов костей и постоянные боли в костях;
• частые рецидивы инфекционных заболеваний;
• нарушения, обнаруженные в прочих анализах, указывающие на то, что у человека могут развиваться анемии, лейкемии, гиперкальциемия или гипоальбуминемия.

При общей диспансеризации и получении медицинских справок для трудоустройства данное исследование крови не осуществляется. Не требуется оно и в процессе подготовки человека к хирургическому вмешательству.

Для получения наиболее точных результатов рекомендуется соблюдение правил подготовки к анализу. Они включают в себя голодную диету в течение 15 часов до того как будет взята кровь, когда пациент может употреблять только чистую не газированную воду. За 90 минут до проведения исследования необходимо полностью исключить нагрузки как эмоциональные, так и физические, и курение в активной или пассивной форме. Чтобы не допустить искажение данных, забор материала не проводят сразу после того, как был осуществлен гемодиализ или проведена процедура, при которой использовались радиоконтрастные составы. Важно также, чтобы за несколько дней до исследования полностью было исключено лечение пенициллином, так как он вызывает расщепление амбулина, что исказит результат.

Исказить показатели, кроме неправильной подготовки к проведению анализа, могут 2 фактора: недавно проведенная процедура гемодиализа, из-за которой произошло разрушение эритроцитов в крови, и повышенный уровень билирубина в организме. В любом из этих случаев потребуется пересдача анализа через некоторое время, которое определит врач.

источник

ПРИНЦИП МЕТОДА: Метод основан на различии величины заряда белков сыворотки крови. Если нанести каплю сыворотки на полоску хроматографической бумаги, смоченной буферным раствором, и пропустить через эту полоску постоянный электрический ток, отдельные белки будут продвигаться в электрическом поле с различной скоростью. При рН=8,6 белки сыворотки крови движутся по направлению к аноду, поскольку они обладают в этих условиях отрицательным зарядом. Наиболее быстро движутся альбумины, затем 1- и 2-глобулины, далее  — глобулины и наконец  — глобулины.

АППАРАТУРА: Прибор для определения белков в крови методом электрофореза на бумаге состоит из выпрямителя, электрофоретической кюветы и денситометра.

Кюветы заполняются вероналовым буфером рН = 8,6. Нарезают из хроматографической бумаги полоски длиной 38 см., шириной 3 см., полоски смачивают буферным раствором и помещают в кювету. Ближе к отрицательному полюсу наносится сыворотка (0,01 мл), затем прибор включается в электрическую сеть.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки на бумаге производится обычно в течение 6- 24 часов при напряжении 150 Вт и силе тока 6-8 А. По истечении указанного срока бумажные полоски сушат в сушильном шкафу при температуре около 100 градусов в течение 5 мин., затем красят бромфеноловым синим. Остатки красителя, не связавшегося с белками, отмывают с полоски бумаги 10% уксусной кислотой.

Количественное определение белковых фракций проводится с помощью денситометра или путём экстрагирования спиртовым раствором щелочи с последующим определением концентрация краски фотоколориметрически.

Минеральный состав крови чрезвычайно разнообразен и играет большую роль в жизнедеятельности организма, например, в процессе роста и развития ребенка обмен кальция и связанных с ним фосфатов. Снижение содержания кальция может сопровождаться повышением нервно-мышечной возбудимости, судорогами (тетания новорожденных). Развитию гипокальциемии у новорожденных способствует сахарный диабет у матери, недоношенность и т.д. Чрезмерные дозы витамина «Д» вызывают гиперкальциемию с отрицательными последствиями для организма.

Основным белком, осуществляющим снабжение тканей кислородом и освобождение их от углекислоты, является гемоглобин. В связи с этим, изучение обмена гемоглобина и определение его концентрации является чрезвычайно важным, а также актуальным является клиническое значение определения содержания желчных пигментов крови, моче и кале в дифференциальной диагностике различных видов желтух (гемолитическая, желтуха новорожденных, обтурационная, паренхиматозная).

Минеральные составные части крови, значение их для организма.

Различают несколько фракций кальция: ионизированный кальций, кальций неионизированный, но способный к диализу, и недиализирующийся (недиффундирующий), связанный с белками кальций.

Кальций принимает активное участие в процессах нервно-мышечной возбудимости (как антагонист ионов К + ), мышечного сокращения, свертывания крови, образует структурную основу костного скелета, влияет на проницаемость клеточных мембран и т.д.

Отчетливое повышение уровня кальция в плазме крови наблюдается при развитии опухолей в костях, гиперплазии или аденоме паращитовидных желез. В таких случаях кальций поступает в плазму из костей, которые становятся ломкими.

Важное диагностическое значение имеет определение уровня кальция при гипокальциемии. Состояние гипокальциемии наблюдается при гипопаратиреозе. Нарушение функции паращитовидных желе приводит к резкому снижению содержания ионизированного кальция в крови, что может сопровождаться судорожными приступами (тетания). Понижение концентрации кальция в плазме отмечают также при рахите, спру, обтурационной желтухе, нефрозах и гломерулонефритах.

Механизм свертывания крови.

Система свертывания крови представляет собой каскадную цепь протеолитических реакций.

Каскадность реакций обеспечивает постепенное усиление первоначального слабого сигнала – воздействия, вызывающего активацию внутреннего и внешнего пусковых механизмов свертывания. Каждая последующая стадия приводит к образованию все больших количеств активной формы очередного фактора. Происходит лавинообразное нарастание «мощности» каждой следующей ступени каскада, в результате стадия превращения фибриногена в фибрин протекает очень быстро.

Первая стадия – сокращение поврежденного сосуда.

Вторая стадия – образование белого тромба. Протромбин (VII фактор) под действием тромбопластина (III) тромбоцитов и ионов кальция (IV) превращается в активную форму – тромбин. В этой стадии участвуют факторы внешнего пускового механизма свертывания: проконвертин (VII); проакцелерин (V); фактор Стюарта (Х), а также факторы внутреннего пускового механизма свертывания: фактор Кристмаса (IХ); фактор Розенталя (ХI); фактор Хагемана (ХII)

Третья стадия – образование красного тромба. Тромбин активирует фибриноген (I), превращая его в активную форму фибрин – мономер. Затем образуется фибрин – полимер (фибриновый гель), который не отличается прочностью. Его легко может разрушить механическое воздействие. Под действием фермента трансглутаминазы (ХIIIa) образуются прочные ковалентные связи между мономерами фибрина, а также между фибрином и белком фибронектином, стабилизируя гель фибрина.

Через час тромб сжимается (ретракция тромба). Затем происходит фибринолиз (четвертая стадия). Плазминоген под действием фермента урокиназы и тканевого активатора плазминогена (ТАП) превращается в активную форму – плазмин (частичный протеолиз), который расщепляет в фибрине – полимере пептидные связи.

Тромб в течение нескольких дней рассасывается.

Роль витамина К в свертывании крови.

Витамин К входит в состав ферментов, катализирующих карбоксилирование глутаминовой кислоты с образованием γ-карбоксиглутаминовой кислоты, входящей в состав факторов свертывания крови: II, VII, IХ, Х.

Ингибиторы факторов свертывания крови:

белок плазмы антитромбин III, инактивирующий большинство факторов свертывания крови;

другие белки – ингибиторы протеиназ (α- макроглобулин, антиконвертин, тромбомодулин).

гепарин, активирующий антитромбин III;

антивитамины К – дикумарин, неодикумарин и др.

Метаболизм гемоглобина. Синтез гема, гемоглобина.

источник

Электрофорез белков сыворотки крови (протеинограмма) является лабораторным исследованием, позволяющим определить количественные и качественные изменения основных белковых фракций. Данное исследование позволяет выявить острые и хронические воспаления инфекционной и неинфекционной природы, онкологические (моноклональные гаммапатии) и многие другие патологии, а также контролировать их лечение.

Благодаря ультрасовременной аппаратуре Юсуповской больницы и огромному опыту наших высококвалифицированных диагностов, грамотно интерпретирующих результаты исследования, обеспечиваются максимально точные результаты анализа в короткие сроки. Комплексным обследованием занимается мультидисциплинарная команда врачей, которые, в целях уточнения диагноза, назначают электрофорез белков сыворотки крови и другие высокотехнологичные лабораторные и инструментальные исследования, позволяющие выявить патологию на ранних стадиях развития, благодаря чему каждому пациенту подбирается наиболее эффективная индивидуальная схема лечения.

В состав общего белка сыворотки крови входят альбумины и глобулины, которые в норме находятся в определенных качественных и количественных соотношениях. Для оценки соотношения альбумина и глобулина в крови проводится электрофорез белков с применением агарозного геля.

Изменение качественного и количественного соотношения в протеинограмме может свидетельствовать о наличии в организме самых различных заболеваний (от вирусного гепатита до хронической сердечной недостаточности).

Для постановки точного диагноза, кроме результатов электрофореза белков крови, специалисты Юсуповской больницы назначают дополнительные клинические, лабораторные и инструментальные исследования.

Электрофорез белков крови позволяет точно оценить качественное и количественное соотношение основных белковых фракций у пациентов, страдающих следующими патологиями:

• острые и хронические инфекционные заболевания;
• заболевания печени (например, хронический вирусный гепатит);
• аутоиммунные состояния;
• почечные патологии (нефротический синдром);
• моноклональные гаммапатии (моноклональная гаммапатия неясного происхождения и множественная миелома);
• синдром иммунодефицита (агаммаглобулинемия Брутона).

Электрофорез белков сыворотки крови является довольно информативным исследованием, которое назначается пациентам Юсуповской больницы при подозрении на следующие заболевания и состояния:

• острые и хронические инфекционные заболевания, определенные заболевания печени и почек, аутоиммунные состояния;
• немотивированная слабость, множественная миелома, персистирующая лихорадка, патологические переломы или боли в костях, рецидивирующие инфекционные заболевания;
• подозрение на недостаточный уровень альфа-1-антитрипсина, синдром Брутона и другие иммунодефицитные состояния;
• отклонения в других лабораторных исследованиях, которые могут свидетельствовать о множественной миеломе: гиперкальциемия, гипоальбуминемия, лейкопения, анемия.

Нормальными значениями общего белка у детей считаются 44-80 г/л, в зависимости от возраста ребенка, у взрослых людей – от 64 до 83 г/л.:

• альбумина – от 55,8 до 66,1 %;
• альфа-1-глобулина – от 2,9 до 4,9%;
• альфа-2-глобулина – от 7,1 до 11,8%;
• бета-1-глобулина – от 4,7 до 7,2%;
• бета-2-глобулина – от 3,2 до 6,5%;
• гамма-глобулина – от 11,1 до 18,8%.

Изменение баланса тех или иных белковых фракций крови может сигнализировать о наличии в организме каких-либо патологических процессов.

Фракция альбумина может быть повышена при:

Фракция альбумина понижается при:

• остром холецистите;
• воспалительных и опухолевых заболеваниях ЖКТ;
• лейкозе;
• язвенной болезни;
• острой ревматической лихорадке;
• нефротическом синдроме;
• макроглобулинемии;
• сахарном диабете;
• саркоидозе;
• множественной миеломе;
• пневмонии;
• хронической сердечной недостаточности;
• остеомиелите;
• неспецифическом язвенном колите;
• системной красной волчанке;
• лимфоме;
• приеме глюкокортикоидов.

Фракция альфа-1-глобулина повышается при:

• лимфогранулематозе;
• острых или хронических воспалительных заболеваниях;
• язвенной болезни;
• циррозе печени;
• стрессе;
• беременности;
• приеме гормональных контрацептивов.

Фракция альфа-1-глобулина понижается при:

• остром вирусном гепатите;
• недостаточности альфа-1-антитрипсина;

Фракция альфа-2-глобулина повышается при:

• хроническом гломерулонефрите;
• острой ревматической лихорадке;
• сахарном диабете;
• циррозе печени;
• саркоидозе;
• лимфогранулематозе;
• узловатом полиартериите;
• нефротическом синдроме;
• системной красной волчанке;
• остеомиелите;
• ревматоидном артрите;
• пневмонии;
• диспротеинемии;
• стрессе;
• язвенной болезни;
• пожилом и младенческом возрасте;
• мальабсорбции;
• неспецифическом язвенном колите.

Фракция альфа-2-глобулина понижается при:

• гипогаптоглобинемии;
• остром вирусном гепатите;
• гипертиреозе;
• интраваскулярном гемолизе;
• мальабсорбции.

Фракция бета-глобулина повышается при:

• сахарном диабете;
• гломерулонефрите;
• острых воспалительных заболеваниях;
• гиперхолестеринемии;
• диспротеинемии;
• саркоидозе;
• макроглобулинемии;
• подпеченочная желтуха;
• железодефицитной анемии;
• нефротическом синдроме;
• ревматоидном артрите;
• беременности;
• приеме гормональных контрацептивов.

Фракция бета-глобулина понижается при:

• лейкозе;
• аутоиммунных заболеваниях;
• системной склеродермии;
• циррозе печени;
• лимфоме;
• нефротическом синдроме;
• системной красной волчанке;
• стеаторее;
• неспецифическом язвенном колите.

Фракция гамма-глобулина повышается при:

• циррозе печени;
• хроническом лимфолейкозе;
• амилоидозе;
• множественной миеломе;
• муковисцидозе;
• моноклональной гаммапатии неясного генеза;
• ювенильном ревматоидном артрите;
• синдроме Шегрена;
• системной склеродермии;
• системной красной волчанке;
• тиреоидите Хашимото;
• криоглобулинемии;
• саркоидозе;
• ревматоидном артрите;
• макроглобулинемии Вальденстрема.

Фракция гамма-глобулина понижается при:

• агаммаглобулинемии;
• остром вирусном гепатите;
• склеродермии;
• мальабсорбции;
• лейкозе;
• нефротическом синдроме;
• стеаторее;
• лимфоме;
• гломерулонефрите;
• неспецифическом язвенном колите.

За 12-15 часов до исследования рекомендуется отказаться от приема пищи.

Минимум за час-полтора до забора крови для анализа необходимо избегать физического и эмоционального перенапряжения, исключить курение.

Во избежание получения искаженных результатов не стоит проводить электрофорез белков сыворотки крови сразу после процедуры гемодиализа и процедур с использованием радиоконтрастных веществ. Необходимо также исключить прием пенициллина, который может привести к расщеплению полосы альбумина.

Электрофорез белков сыворотки крови является важной частью комплексного обследования пациентов в Юсуповской больнице. Данное исследование назначается при подозрении на наличие в организме той или иной из вышеперечисленных патологий.

Узнать стоимость услуг лабораторной диагностики и записаться на проведение исследования можно по телефону или онлайн на сайте Юсуповской больницы.

источник

Электрофорез белков – вид анализа крови для оценки соотношения между различными белками крови и для выявления парапротеина.

Синонимы: serum protein electrophoresis, protein ELP, SPE, SPEP.

исследование количественых и качественных характеристик белков крови по их распределению в электрическом поле.

Из белков построены все клетки тела. Белок — сложная молекула, состоит из более простых «кирпичиков» — аминокислот. Суммарно все белки крови называют «общий белок», в свою очередь он состоит из компонентов — альбуминов, глобулинов.

Белки способны нести положительный или отрицательный заряд в зависимости от кислотности среды, в которой проводят электрофорез. Движение белков зависит от величины заряда, формы и размера молекулы, ее веса, свойств среды.

Позитивно заряженные молекулы белков лучше адсорбируются, чем отрицательно заряженные, поэтому при электрофорезе белков применяют негативные заряды. Альбумин несет наибольший отрицательный заряд, поэтому быстрее двигается к аноду.

• хроматографическая бумага
• ацетатцелюлозная бумага
• агаровый гель
• акриловый гель
• полиакриловый гель
• капиллярный электрофорез

Электрофорезом белки крови разделяются на 5-6 фракций – альбумины, альфа-1-, альфа-2-, бета- и гамма-глобулины (иногда на бета-1 и бета-2-глобулины).

• диагностика моноклональных гаммапатий (множественной миеломы)!
• повышенный общий белок крови
• повышенный уровень гамма-глобулинов
• очень высокого СОЭ – более 50 мм/час (когда нет других причин для его роста)
• скрининг, диагностика и контроль лечения моноклональных гаммапатий (миеломной болезни)

Единственное прямое показание для проведения электрофореза белков крови – выявление моноклональной гаммапатии. Сегодня врач может назначить анализ конкретного интересующего белка крови, а не электрофорез, который дает лишь ориентировочные результаты.

Моноклональная гаммапатия — появление в крови однородного по свойствам клона иммуноглобулинов — парапротеинов, синтезированных одним клоном клеток

• миеломная болезнь
• асимптоматическая миелома
• моноклональная гаммапатия неустановленной этиологии (МГУС)
• плазмоцитома
• первичный AL амилоидоз

При миеломной болезни в крови появляется значительное количество «неправильного» белка – парапротеина или М-белка. Это «моноклональный белок», поскольку синтезируется только в клетках из одного злокачественного клона В-лимфоцитов, он весь одинаков и его очень хорошо видно на кривой электрофореза белков. Количество парапротеина (затемнение, скачок вверх) указывает на наличие миеломы, позволяет оценить ее размеры, прогрессию, а изменения концентрации – ранний симптом обострения или ремиссии.

• боли в костях – особенно позвоночника и таза
• сильная головная боль
• изменения в общем анализе мочи — протеинутрия
• выраженная общая слабость, усталость
• частые инфекционные заболевания

Помните, что у каждой лаборатории, а точнее у лабораторного оборудования и реактивов есть «свои» нормы. В бланке лабораторного исследования они идут в графе – референсные значения или норма.

• общий анализ крови
• общий анализ мочи
• печеночные пробы – билирубин, АСТ, АЛТ, ГГТ, щелочная фосфатаза
• почечные пробы – креатинин, мочевина, мочевая кислота
• общий белок крови, альбумин, глобулины
• иммунофиксафия белков сыворотки крови
• моноклональные иммуноглобулины
• поликлональные иммуноглобулины
• свободные легкие цепи в крови
• бета-2-микроглобулин
• альбумин в моче
• электрофорез белков мочи
• иммунофиксация белков мочи
• свободные легкие цепи в моче

1. Преальбумин (транстиретин) — печеночный белок, расположен перед альбумином с коротким временем полувыведения, связывает гормоны щитовидной железы, транспортный белок для витамина А (предупреждает его потерю с мочой). Количество преальбумина позволяет оценить обеспеченность белками периферических тканей. Снижен при печеночных заболеваниях и дефиците питания.

2. Альбумины — наиболее крупная фракция белков крови, хорошо виден пик. Причины снижения альбуминов подробно описаны в данной статье. Редко при врожденной мутации развивается дисальбуминемия – фракция альбумина раздваивается.

3. Альфа-1-липопротеины — слабая однородно окрашенная область между альбумином и альфа-1-глобулином.

4. Размеры зоны альфа-1-глобулина определяются уровнем альфа-1-антитрипсина, орозомукоида, альфа-1-фетопротеина, альфа-1-микроглобулина. При остром воспалении — видимое затемнение.

• альфа-1-антитрипсин — генетическая вариабельность может проявиться изменением движения белков, циррозом печени, повышением печеночных проб, при беременности — снижение
• альфа-1-фетопротеин — маркер опухолей печени и врожденной патологии в пренатальной диагностике
• при снижении скорости гломерулярной фильтрации — повышение в крови альфа-1-микроглобулина

5. Альфа-2-глобулины — на формировании данной зоны влияют альфа-2-макроглобулин, церулоплазмин, гаптоглобин, пре-бета-липопротеин. Изменения не имеют клинического значения.

6. Интерзона между альфа-2- и гамма-глобулинами — окрашивается слабо, при гемолизе возникают комплексы гемоглобин-гаптоглобин, формирующие в этой области видимую полоску.

7. Бета-1-глобулины – размер затемнения определяется количеством трансферрина, фибриногена, С-реактивного белка, гемопексина. Интенсивность коррелирует с общей железосвязывающей способностью сыворотки крови. При железодефицитной анемии и при беременности повышается синтез трансферрина и усиливается контрастность зоны

8. Интерзона между бета-1- и бета-2- глобулинами образована иммуноглобулином А (IgA). Типичную полоску формирует бета-липопротеин.

9. Бета-2-глобулины — сформированы С4 компонентом комплемента, повышение — при остром воспалении, снижение — образование иммунокомплексов при аутоиммунных заболеваниях.

Комплемент — 11 белков, факторы неспецифического гуморального иммунитета.

• бета-2-микроглобулин — часть HLA системы на поверхности клеток, отображает скорость деления клеток, повышение в крови — снижение скорости фильтрации в почках, лимфопролиферативные заболевания
• фибриноген — белок системы свертывания крови, расположен между бета- и гамма-глобулинами, повышен при остром воспалении, снижен при тяжелой печеночной недостаточности, диссеминированном внутрисосудистом свертывании

10. Гамма-глобулины — характеристики зоны определяются свойствами классов иммуноглобулина G (IgG). Иммуноглобулин М (IgM) расположен ближе к старту.

Моноклональные иммуноглобулины – выявляются только при наличии заболевания, продукт одного клона клеток из В-лимфоцитов. С возрастом выявление парапротеина растет, появляется доброкачественная гипериммуноглобулинемия без каких-либо симптомов.

источник

Метод электрофореза является одним из самых распространенных, мощных и доступных методов исследования белков. Этот метод широко применяется как в научных исследованиях, так и при экспертизе качества продуктов питания и медицинских препаратах, а также в клинических лабораториях.

С помощью метода электрофореза производят:

1) анализ сложных смесей белков (в генетических исследованиях, при выделении и биотехнологической наработке белков)

2) обнаружение определенного белка (при проведении экспертизы, контроле биотехнологических процессов, клинических анализах)

3) определение молекулярной массы белков (в фундаментальных исследованиях)

4) исследование структуры белков (анализ расположения в биологических мембранах, взаимодействия с другими белками, изучение вопросов фолдинга белков)

В основе метода электрофореза лежит тот факт, что молекулы белков в водных растворах заряжены, то есть фактически представляют собой ионы. Как любая частица, несущая электрический заряд, молекулы белков способны перемещаться в электрическом поле. Таким образом, если к раствору белка приложить электрическое поле (опустить в него электроды и подать постоянное напряжение), то все молекулы белков начнут двигаться. Вследствие разницы в аминокислотном составе разные белки заряжены разноименно — положительно или отрицательно. По этой причине различные белки будут двигаться в разных направлениях: положительно заряженные – к катоду (отрицательный электрод), отрицательно заряженные – к аноду (положительный электрод). Кроме того, величина заряда белковых молекул также неодинакова – молекулы одних белков заряжены сильнее, других – меньше. Белки, молекулы которых имеют больший заряд, будут двигаться быстрее, чем те, что несут меньший заряд. Также на разделение белков методом электрофореза большое влияние оказывает размер молекул белков. Более крупные белки движутся медленнее, чем белки небольших размеров, вследствие того, что вода оказывает сопротивление перемещению (является вязкой средой).

По причине того, что аминокислотный состав белков и их масса различаются достаточно сильно, электрофорез позволят анализировать очень сложные смеси белков. Для решения различных исследовательских задач было предложено множество различных вариантов электрофореза.

4.9 Электрофорез по Леммли

Электрофорез по Леммли — один из методов электрофореза в геле, применяемый для анализа сложных белковых смесей. Данный метод позволяет разделять белки по их молекулярной массе. Также электрофорез по Леммли может быть использован для определения молекулярной массы белков.

Белки, подлежащие анализу методом электрофореза по Леммли, предварительно обрабатывают концентрированным 5%-ным раствором додецилсульфата натрия (рис. 15) при 100С в присутствии β-меркаптоэтанола. При этом белковые молекулы приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий её собственный. При последующем разделении в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофоре граммах в соответствие с логарифмом их молекулярной массы

Рис. 15. Додецилсульфата-анион, присутствует в растворах додецилсульфата натрия

В качестве геля для электрофореза по Леммли используются полиакриламидные гели, что позволяет достичь высокой разрешающей способности данного метода. Полиакриламидный гель представляет собой продукт сополимеризации акриламида (рис. 16)

и сшивающего агента N,N- метиленбисакриламда (рис. 17)

Рис. 17. N,N- метиленбисакриламид

В результате процесса сополимеризации образуется прочный, упругий, термостабильный гель, обладающий высокими механическими свойствами и химической инертностью. Пространственная структура геля представляет собой сетку со структурой (рис. 18). Пористость геля зависит от концентрации мономеров и её можно варьировать в значительных пределах от 40 до 0,1 нм (2-30% мономеров). Регулярно чередующиеся амидные группы делают гель гидрофильным. Отсутствие ионизирующихся групп существенно снижает эндосмос, а также взаимодействие белков со структурой геля.

Рис. 18. Структура полиакриламидного геля

В качестве катализатора реакции сополимеризации применяют источник свободных радикалов — персульфат аммония или калия. Катализатором реакции выступает N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин.

Полимеризацию геля ведут в стеклянных трубочках длиной 70-100 мм с внутренним диаметром 5 мм либо плоских пластинах. Для этого в одной трубке последовательно полимеризуют два геля для электрофореза, располагая их один под другим: 1) верхний – крупнопористый гель в котором образец сжимается в узкую полосу (концентрирующий гель), 2) нижний — мелкопористый гель, в котором происходит разделение белковой смеси на компоненты под действием эффекта «молекулярного сита».

Для проведения электрофореза гелевыми столбиками соединяют расположенные друг над другом резервуары с буферами, в которые введены электроды и подают на электроды напряжение 40-800 вольт.

В качестве отчета о проделанной работе:

1. Зарисуйте структурные формулы додецилсульфата натрия, акриламида, N,N- метиленбисакриламида, структуру полиакриламидного геля

2. Зарисуйте расположение белковых полос, полученных в результате электрофореза по Леммли, сделайте вывод о составе выданного вам раствора белка (количество компонентов, примерная доля главных компонентов и их число, примерная доля минорных компонентов и их число)

Подготовить пробу белка для электрофореза. Для этого в эппендорф объемом 2 мл поместить 100 мкл раствора белка с концентрацией 4 мг/мл и добавить 100 мкл буфера пробы. Содержимое перемешать инжектированием.

Поместить пробирки в поплавок и поместить в водяную баню. Нагреть до кипения и кипятить 5 минут, затем охладить

Растворить навеску персульфата калия в 2,5 мл ДВ. Для этого внести автоматической пипеткой 2,5 мл ДВ и перемешивать инжектированием до полного растворения соли (растворение идет медленно)

Собрать трубку для электрофореза и поместить её вертикально в штатив

В центрифужной пробирке приготовить смесь для разделяющего геля

Раствор Мономеров 1250 мкл

1,5 М Трис-HCl рН8,8 167 мкл

р-ра Персульфата калия 20 мкл

После внесения раствора персульфата калия , содержимое пробирки перемешивают инжектированием и немедленно вносят в трубку для электрофореза

Смесь для разделяющего геля вносят в трубку для электрофореза тремя порциями по 800 мкл. Раствор вносят осторожно, по стенке трубки не вспенивая его.

После внесения в трубку раствора для разделяющего геля поверх него осторожно наслоить примерно 100 мкл ДВ

Оставить трубку на 15-20 мин для полимеризации. Об окончании полимеризации свидетельствует появление четкой границы между раствором для разделяющего геля и наслоенной водой.

По окончании полимеризации слить воду с геля, остатки жидкости убрать с поверхности геля фильтровальной бумагой, скрученной в трубочку

В центрифужной пробирке приготовить смесь для концентрирующего геля

Раствор Мономеров 340 мкл

0,5 М Трис-HCl рН6,8 125 мкл

р-ра Персульфата калия 20 мкл

После внесения раствора персульфата калия , содержимое пробирки перемешивают инжектированием и немедленно вносят в трубку для электрофореза

250 мкл смеси для концентрирующего геля вносят в трубку для электрофореза. Раствор вносят осторожно, по стенке трубки не вспенивая его.

После внесения в трубку раствора для разделяющего геля поверх него осторожно наслоить примерно 100 мкл ДВ

Оставить трубку на 5-10 мин для полимеризации. Об окончании полимеризации свидетельствует появление четкой границы между раствором для разделяющего геля и наслоенной водой.

По окончании полимеризации геля с трубки снимаю заглушку и устанавливают трубки для электрофореза в катодную камеру прибора (рис. 19) так, чтобы граница концентрирующего и разделяющего геля была видна в верхней (катодной камере)

Рис. 19. Прибор для вертикального гель-электрофореза в трубках.

1- верхняя, анодная камера, 2 – нижняя, катодная камера, 3 – трубки с гелем для электрофореза, 4 – положительный электрод, анод, 5 — отрицательный электрод, катод.

Приготовить 1,2 л анодного буфера. Для этого разбавить исходный анодный буфер в 4 раза ДВ с помощью мерного цилиндра объемом 1 л.

Заполнить анодную камеру анодным буфером. Поместить в камеру анод (красный провод). Поместить катодную камеру над анодной и зафиксировать её винтами. При этом нижние концы трубок должны быть погружены в буфер в нижней камере (анодный буфер).

Приготовить 1,2 л катодного буфера. Для этого разбавить исходный катодный буфер в 4 раза ДВ с помощью мерного цилиндра объемом 1 л. заполнить катодную камеру катодным буфером. При этом концы трубок должны оказаться под слоем электродного буфера.

Промыть нижние и верхние концы трубок для удаления остатков растворов для полимеризации гелей и пузырьков воздуха.

60 мкл подготовленного раствора белка в эппендорфе смешивают со 180 мкл ДВ и перемешивают инжектированием. 200 мкл полученной смеси вносят в трубки для электрофореза, осторожно наслаивая на поверхность геля.

Включают напряжение 250 вольт, через 10 минут поднимают его до 300 вольт, а еще через 10 минут до 400.

Примерно через 40 минут, когда фронт бромфенолового синего пройдет практически всю трубку, напряжение выключают, внимают электрод из катодной камеры. Разбирают прибор и выливают катодный буфер. Затем вынимают трубки для электрофореза и выталкивают столбики геля из трубок стеклянным штоком. Концентрирующий гель отрезают скальпелем.

Разделяющий гель окрашивают коллоидным раствором кумасси бриллиантового голубого в течение 20 мин на кипящей водяной бане. Затем переносят окрашенный гель в кипящую воду и отмываю до проявления белковых полос.

Вопросы для самоподготовки

В чем практическое значение электрофореза?

Что можно установить с помощью электрофореза?

В чем суть метода электрофореза?

От каких параметров зависит скорость перемещения молекулы белка?

В чем особенность электрофореза по Леммли?

По какому параметру разделяются белки при проведении электрофореза по Леммли?

Вопросы к коллоквиуму по теме «Белки»

2. Элементный состав белков

3. Какие органические соединения называют аминокислотами, химические свойства аминокислот

4. Кислотно-основные свойства аминокислот (амфотерность аминокислот, биполярные ионы, кривые титрования)

5. Классификация аминокислот (биологическая, физико-химическая, химическая)

6. Физические свойства аминокислот, стереоконфигурация аминокислот

7. Специфические реакции на аминокислоты

8. Связь аминокислот в белках, пептидная связь – структура и свойства

9. Биуретовая реакция. Определение белка биуретовым методом.

10. Аминокислотный анализ. Методы хроматографии аминокислот.

11. Нингидриновая реакция. Практическое значение

12. Первичная структура белка. Методы установления первичной структуры белка

13. Вторичная структура белка, α-спираль, β-слой

14. Третичная и четвертичная структура белка

15. Химические связи, стабилизирующие структуру белка (первичную, вторичную, третичную и четвертичную)

16. Растворимость и осаждение белков. Силы удерживающие белок в растворе, условия осаждения белков.

17. Реакции обратимого и необратимого осаждения белков, их практическое значение.

18. Белки как носители электрических зарядов, кислотно-основные свойства белков, изоэлектрическая точка

19. Диализ. Электрофорез. Изоэлектрическое фокусирование

21. Выделение белков из тканей. Методы выделения и очистки белков

Использованная литература

The protein protocols handbook, 2 nd edition – edited by Walker J.M. – Humana press, 2002

Петров К.П. – Методы биохимии растительных продуктов – Киев: Вища школа, 1978.

Шапиро Д.К. – Практикум по биологической химии, 2-е изд. перераб. и доп. – Минск: Высшая школа, 1976

Практикум по биохимии: учебное пособие, 2-е изд. пререаб и доп. – под ред. Северина — М.: МГУ, 1989

Р.Досон, Д.Элиот и др. – Справочник биохимика, пер. с англ. – М.: Мир, 1991

Скурихин И.М., Нечаев А.П. – Все о пище с точки зрения химика: справочное издание. — М.: высшая школа, 1991

Степин Б.Д. — Техника лабораторного эксперимента в химии: учеб пособи для ВУЗов – М.: Химия, 1999

Химическая энциклопедия ТТ.1-5., гл. ред. Кнунянц И.Л. – М.: Советская энциклопедия, 1988-1998

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2019 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.007 с) .

источник