PAAG электрофорез нативных белков
Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля размером 70х80х1 mm 3 , используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN II Electrophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США).
Стеклянные пластины, одна из которых несколько длиннее другой (83х102 и 73х102 mm 2 ), отделяли друг от друга с помощью прокладок из органического стекла толщиной 1 mm и вставляли в устройство для заливки геля, прилагаемое к прибору для электрофореза. В просвет между стеклянными пластинами заливали раствор мелкопористого полиакриламидного геля, а после его полимеризации заливали крупнопористый гель. В последний погружали зубчатый шаблон для формирования карманов для нанесения белковых проб.
Верхним электродным буфером служил трис-глицин, pН 8.3 (25 mM Трис и 192 mM глицин) с добавлением 0.01% SDS. Нижний электродный буфер имел такой же состав без SDS. Рабочий гель (7%) полимеризовали в 375 mM Трис-НСl буфере с добавлением 0.01% SDS, рН 8.8, а формирующий гель в 62.5 mM Трис-НСl буфере, рН 6.8. Для того, чтобы полимеризация проходила равномерно, полимеризующиеся блоки охлаждали. Для создания ровной верхней границы разделяющего геля на него наслаивали изобутанол, насыщенный водой.
Электрофорез проводили, используя электрофоретическую ячейку прибора Mini-PROTEAN II. Стеклянные блоки прижимали специальными зажимами к передней части катодного отсека так, чтобы меньшая пластина была на уровне выреза в передней стенке прибора, а большая пластина была выше этого выреза. В электродный резервуар наливали верхний электродный буфер. Пластины опускали в нижний электродный буфер.
Анализируемые белки растворяли в буфере, состоящем из Трис-НСl (62.5 mM, рН 6.8), 1% ß-меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,001% бромфенолового синего, и наносили на гель, предварительно выровняв концентрации, не более 25-30 µg белка на трек (20-25 µl образца). Первые полчаса, когда образцы входили в гель, устанавливали силу тока 50 mA на блок. Далее электрофорез проводили при постоянной силе тока 80 mA три часа, пока свидетель (бромфеноловый синий) не доходил до конца гелевого блока. После окончания электрофореза стеклянные пластины вынимали из прибора, и освободившийся гель помещали в камеру для окрашивания или использовали для переноса на нитроцеллюлозную мембрану.
- Методика применялась в нашей лаборатории в течение длительного времени.
- Сдвиг заряда белков за счет присутствия в буферах и геле низкой концентрации SDS позволяет добиваться значительного сокращения времени проведения электрофореза (4 часа против 48 часов по сравнению с электрофорезом в градиенте плотности ПААГ) и значительно улучшает картинку при последующем блоттинге, при этом при данной концентрации SDS (ее все-же необходимо подбирать в зависимости от исследуемого образца) не наблюдается изменения белкового спектра за счет развала белков на субъединицы.
Дополнения, комментарии, вопросы
Какой же это форез нативных белков, если есть SDS?
Ак, в многих методиках присутствует, кажись и в методах на этом сайте есть, только концентрации ДСН не те, что в денатурирующем
В принципе при малой концентрации додецилсульфата можно получить даже полосы димеров.
А нету ли какого-нибудь варианта нативного препаративного фореза?
Вообще-то рН буферов нужно подбирать каждый раз для каждого белка индивидуально. Лично я гоню гели без капли SDS, а буфер для нанесения представляет собой просто подкрашенный бромфеноловым синим р-р глицерина. Но данная методика была предварительно обкатана на моём образце другими товарищами. Так что ищите и обрящите.
Мне очень нужно программы DenStar и SigmaGel
Если есть SDS то это вам соыершенно не нативный эликтрофорез.
А как было правильно замечено выше — надо гнать разные белки при разном pH
Сдается мне, что такой форез со следывыми количествами SDS может быть очень полезен при работе с тотальными лизатами и последующим вестерном.
Я как-то пытался определить димеризуется или олигомеризуестя мой рецептор при активации ростовым фактором, приходилось как раз использовать тотальные лизаты и нативный форез. Картинка была страшная, и выходило, что мой рецептор в клетках тетрамеризовался. При добавлении в гель следовых количеств саркозила окрашивание антителами показало присутствие только димера. Позже мы показали что это действительно так — обычный димер. Думаю, что и мизерные кол-ва SDS будут также работать. Хотя нкто не даст грантии, что если есть димер то нет более высокой олигомеризации.
Очень интересная методика. особенно если учесть, что использовали и ДДС, и меркаптоэтанол.
Лично я подбирал условия для нативного фореза (концентрация «геля», сила тока, рН буфера для разделяющего геля и рН электродного буфера), причем НИГДЕ не присутствовали даже следовые количества ДДС, а пробы подготавливали простым смешением анализируемого раствора с бромфеноловым синим с добавлением глицерина. При этом удавалось «пронаблюдать» наличие тетрамеров, додекамеров, икосамеров. 🙂
З.Ы. К минусам стоит отнести то, что «загружать» белка приходится больше, чем для «обычного» денатурирующего фореза. Дерзайте.
Скажите, при постановке нативного фореза при каком рН нужно гнать АТ, очищенные на DEAE?
Имеется в виду рН буфера, конечно! Заранее спасибо.
А это зависит от того куда вы гнать их хотите от плюса к минусу или от минуса к плюсу и нужно ли вам концентрирование или вполне достаточно дифузной зоны. К тому же это еще зависит от рI антител она у них тоже разная бывает.
Ja etim kak raz vchera zanimalsja
Скажите, при каких условиях фореза можно выделить чистый гемагглютинин вируса гриппа, окрашивать белок или нет?
как готовить образцы белков из растительного мотериала и как нанести их в гель? я не понимю процесс выравнеивания концентраций. и вообще у меня элетрофорез не получается.
про гемагглютинин могу подсказать, если конечно еще интересует
каким методом лучше выделить ГА в чистом виде (форез)? Белок нужен для получения моноспецифической сыворотки (объём выделенного белка тоже важен).
Ух, это Вам надо в НИИ Гриппа ..
Возможно, дадут подробную методику.
1. Вырастить вирус в курином эмбрионе или на культуре клеток
2. Инактивировать формальдегидом
3. Детергент Триметил-Цетил-Аммониум Бромид (TCAD) позволяет выделять гемагглютинин и нейраминидазу в самостоятельные субъединицы.
4. Поверхностные белки выделяются с помощью очередного ультрацентрифугирования. Белки очищаются от детергента и внутренних составляющих вирусной частицы при помощи диализа.
Активность выделенного белка зависит от штамма. Некоторые вообще не растут на яйцах, а только на клетках и тд. Там нюансов много. Идентифицировать ГА Вы можете в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)
А чью сыворотку Вы собираетесь получать, если не секрет? Протокол иммунизации у Вас есть? Метод РТГА умеете ставить? Условия, чтоб с живым вирусом работать?
А подскажите пожалуйста поподробней, как именно с помощью TCAD выделять гемагглютинин и нейраминидазу в самостоятельные субъединицы? есть ли прописи, методики, где можно прочитать?
К сожалению, я этим не занимаюсь. Не знаю. Могу только предполагать, где Вам могут помочь. Это НИИ Гриппа, у них есть сайт, обратитесь для начала туда.
В УФЕ этим занимается Микроген. Но будут ли они кому помогать — вопрос.
А Вы откуда ? И чем занимаетесь, если не секрет.
Пишите мне в личку.
Ооочень прошу подсказать методику количественного извлечения нативного белка из нативного акриламида.Концентрация белка в полосе очень хилая. Yuri/26.04.2007 11:40/
—Ооочень прошу подсказать методику количественного извлечения нативного белка из нативного акриламида.Концентрация белка в полосе очень хилая. Yuri/26.04.2007 11:40/
Дык! это! Пихаете куски геля с вырезанной зоны в диализный пакетик и подвергаете электрофорезу в трис глициновом или трис боратном буфере. Потом извлекаете раствор из мешочка и концентрируете на микроконе или центриконе от милипора.
Антихимик! Ваша просьба отдельным топом помещена в форуме СОФТ. Здесь она совсем не в тему.
Помогите, пожалуйста, как провести нативный форез смеси IgG IgM IgA. Пробовала в 4% нативном ПААг — смесь не входит в гель. Хочу попробовать агарозный гель. Подскажите, какой нужно использовать буфер для фореза?
2-D native-PAGE/SDS-PAGE visualization of
an oligomer’s subunits: Application to the
analysis of IgG
Leticia Gonzalez et. at.
Electrophoresis 2006, 27, 2016–2023
© 2006
2.2.1 First-dimensional native PAGE
IgG oligomers in sample buffer (60 mM potassium hydroxide,
63 mM glacial acetic acid, 25% v/v glycerol,
pH 4) were electrophoresed in a 1 mm thick first-dimensional
discontinuous native polyacrylamide slab gel
(4% T, 2.1% CBIS stacking gel, pH 4; 6% T, 2.1% CBIS
running gel) under acidic conditions (pH 4) according to
Reisfeld et al. [3] in a BioRad Mini-Protean II cell. The
aqueous anode buffer contained potassium hydroxide
(48.5 mM) and glacial acetic acid (4.3% v/v). The aqueous
cathode buffer contained b-alanine (350 mM) and glacial
acetic acid (0.8% v/v). Proteins were electrophoresed at
constant voltage (200 V) until the tracking dye (dimethyl
green) reached the bottom of the gel.
2.2.2 Staining of native polyacrylamide gels
Separated proteins were visualized by staining polyacrylamide
gels by either the native fast silver method of
Shevchenko et al. [4], the permanganate silver stain
tion for 26 h at room temperature in the dark, and then
visualizing using a Chromato-Vac Transilluminator Model
TM 10 with a wavelength of 302 nm. Table 1 provides a
summary of the fixing and staining protocols.
извиняюсь что стайку не привожу полностью.
Модеры не дают пдф файл прикреплять гы-гы)))
Лучше так. Статейка через две недели того. А в такой форме будет долго лежать.
нативный форез по мне это так себе метод, лучше уж на калиброваной колонке гель-фильтрации все делать, если уж нужно чтобы белок не денатурировал. кстати и препаративность присутствует)
малые кол-ва ддс между прочим все равно меняют конформацию белка. Пусть это не полная денатурация, но св-ва все равно меняются
Никому не приходилось гонять лизоцим форезом без сдс? Я попытался, взяв стандартную методику SDS PAAG, но все растворы готовил без SDS и DTT, вместо бромфенолового синего взял метиловый зеленый и при гнал с обратной полярностью ( к минусу). Дак у меня в разделяющем геле краситель исчез а при проявке в кумасе оказалось что у меня белок вообще в разделяющий не пошел.
Белочек то щелочной, может дело в рН буферов?
Однозначно, кто ж щелочные белки в щелочных буферах, гоняет обратная полярность здесь не поможет.
Кислый буфер надо, например бета-аланин-ацетатный (80mM Beta-alanine + 40 mM Acetic ac >
— ТЕМЕDа надо раз в пять больше — полимеризация идет хуже при низком рН
Лучше рибофлавин и свет, если есть возможность. Много темеда портит картинку в геле.
буфер для нанесения тоже кислый надо
— ТЕМЕDа надо раз в пять больше — полимеризация идет хуже при низком рН
Лучше рибофлавин и свет, если есть возможность. Много темеда портит картинку в геле.
Во-во, к тому же 1% витамин В2 в любой аптеке продаётся и стоит копейки.
Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/
источник
ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Минздрава России
Кафедра медицинских нанобиотехнологий МБФ
Учебно-методическое пособие для проведения практических занятий со студентами фармакологического факультета
Денатурирующий электрофорез белков а полиакриламидных гелях.
кафедры медицинских нанобиотехнологий
Абакумов Максим Артемович
Для занятия студентов фармакологического факультета на 2 академических часа.
Цель занятия: Ознакомиться с основами метода определения молекулярной массы белков с помощью электрофореза в денатурируюших условиях в присутствии додецилсульфата натрия.
1) Физические принципы лежащие в основе метода электрофореза.
2) Химические основы метода получения акриламидных гелей.
3) Условия необходимые для эффективного разделения белков.
4) Правила безопасности при работе с источниками постоянного тока.
5) Устройство прибора для элекрофореза.
1) Объяснить принцип работы прибора .
2) Подготовить прибор к проведению эксперимента.
3) Определять молекулярную массу белка по электрофореграмме.
Базовые знания, необходимые для выполнения работы:
3) Основы молекулярной биологии
Основная литература: Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. (практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.
Электрофорез — способ разделения веществ, основанный на различной скорости их передвижения под действием электрического поля. При пропускании электрического поля через водный раствор происходит перераспределение ионов. Катионы, находящиеся в растворе мигрируют к отрицательно заряженному электроду (катоду), а анионы к отрицательно заряженному (аноду). Скорость миграции определяется несколькими параметрами, в частности величиной напряжения, размером мигрирующего иона (пропорционального молекулярной массе), зарядом иона, плотностью раствора. Необходимо учитывать, что белок является полиэлекролитом, а его заряд зависит от аминокислотного состава и рН окружающего раствора. Таким образом, на подвижность белка влияет несколько факторов, что затрудняет определение его молекулярной массы и идентификацию. Чтобы нивелировать эти факторы был предложен метод дентатурирующего гель электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Это было впервые предложено Лэмли в 1970г для определения строения белкового капсида бактериофага Т4. Им было предложено проводить разделение не в воде, где скорость миграции относительно высока, а полиакриламидном геле (Рисунок 1). Трёхмерная сетка геля создаёт ячеистую структуру, в которой размер ячейки контролируется процентным содержанием мономеров в геле. Чем больше мономера в растворе, тем более плотная структура образуется, и тем меньше размер ячеек. Добавление 2-меркаптоэтанола и прогревание образца с белком до 95°С в течении 5 минут полностью разрушает дисульфидные связи и вызвает денатурацию белка до линейной полипептидной цепи. Добавление додецилсульфата натрия вызывает его сорбцию на поверхности белка, а собственный заряд додецилсульфата нивелирует собственный заряд белка.
При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:
· белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
· количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
· собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.
В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы. Практика подтверждает верность данных предположений в подавляющем большинстве случаев.
Рисунок 1. Структура и получение полиакриламидного геля.
После проведения электрофореза необходима визуализация результатов, которая производиться с помощью прокрашивания геля белок-специфичными красками, например Comassie G250. При этом места расположения белков прокрашиваются синим цветом (Рисунок 2).
Рисунок 2. Вид электрофореграммы после окрашивания красителем Comassie.
Поскольку время и напряжение во время электрофореза может варьироваться, для построения калибровочной кривой на гель наносят образец белков маркеров, с заранее известной молекулярной массой. На основании положения маркеров строится график зависимости десятичного логарифма молекулярной массы от расстояния, которое прошёл белок (Рисунок 3).
Рисунок 3. Примерный вид калибровочной кривой.
Дата добавления: 2015-04-12 ; просмотров: 10 | Нарушение авторских прав
источник
Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили в полиакриламидном геле (система Laemmli.).В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор “Kalibration kit»: молекулярный вес — 14.4, 20.1, 30.0, 43.0, 67.0, 94.0 кДа (Pharmacia).
Использовали двухступенчатый гель: верхний (концентрирующий) — 3,5% ПААГ в буфере UTB, нижний (разделяющий) — 15% ПААГ в буфере LTB с инициатором полимеризации персульфата аммония (1/100 объема геля) катализатором полимеризации и TEMED (1/1000 объема). Размер и толщина геля определялся размерами стёкл, толщиной спейсеров и составлял 9х12х0,05 см.
Электрофорез проводили в 1х трис-глициновом буфере с SDS при постоянном силе тока в 22 мА. Электрофорез прекращали, когда фронт красителя бромфенолового синего не выходил в буфер. Затем гель помещали на 15 минут в фиксирующий раствор (10% ТХУ, 10% метанол), потом — на 15 минут в красящий раствор (0,2% Кумаси R-250, 10% уксусной кислоты, 10% изопропанола) при 60єС. Краску геля отмывали кипячением в 5%-ом растворе уксусной кислоты.
Определение концентрации белка методом Бредфорд
Реактив Бредфорд готовили следующим образом: кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяли в 50 мл 95% — ного EtOH. К полуяеному раствору добавили 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты и водой довили объём смеси до 1л.
К анализируемому образцу, содержащему белок в диапазоне 0,5 -9 мг/мл добавили 2,5 мл реагента-красителя и хорошо перемешали. Измеряли поглощение при длине волны 595 нм относительно чистого реагента.
Концентрацию белка находили по градуировочному графику построенному по БСА.
В ходе выполнения курсовой работы на тему «Получение рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста» нами был осуществлён химико-ферментативный синтез из перекрывающихся олигонуклеотидов гена человеческого VEGF165. Ген hVEGF165 был оптимизирован по встречаемости кодонов для экспрессии в E. coli. Он был клонирован в экспрессионный вектор pET-23d(+) и получен штамм продуцент E. coli ER2566/ pER-VEGF165. Однако, продукция целевого белка hVEGF165 в клетках E. coli ER2566 была незначительной.
В статье (Hyo Jin Ihm, et al., 2008) была предложена «стоп старт» конструкция для бактериальной системы экспрессии косного морфогенного белка. Авторы отмечали высокий уровень экспрессии BMP-2 за счёт сопряжённой транскрипции мРНК BMP-2 с тиоредоксином. На подобии описанной в литературе конструкции было решено клонировать ген hVEGF165 под стоп кодон тиоредоксина. Кодирующая последовательность тиоредокцина была взята из вектора pET32b+. В кодирующую последовательность тиоредоксина была встроена по сайтам EcoR I и Hind III вставка TRX_STOP. Вставка содержала стоп кодон ТАА, старт кодон ATG и следующий за ним сайт рестрикции Sap I.
Рис. 9. Схема вставки TRX_STOP
Рис. 10. Схема клонирования вставки Trx STOP в вектор pET32b+
Полученную последовательность тиоредоксин TRX_STOP переклонировали по сайтам Nde I и Xho I в вектор pTTS, производный вектора pTWIN1 (Рис. 11).
Вектор pTTS был получен из коммерчески доступного вектора pTWIN1. Из вектора pTWIN1 был удалён участок фланкированный сайтами Xba I и Bam HI и по образовавшимся липким концам была лигирована вставка, содержащая сайт рестрикции Xho I (Рис. 12).
Рис. 11. Схема олигонуклеотидной вставки TTS
Рис. 12. Схема получения плазмиды pTTS
Амплифицированный ген TrxSTOP был клонирован в вектор pTTS по сайтам рестрикции Xba I и Xho I (Рис.13).
Рис. 13. Схема получения плазмиды pTTS-TrxSTOP
Из плазмиды pTTS-TrxSTOP был вырезан фрагмент фланкированный сайтами Sap I и Xho I. По образовавшимся липким концам лигировали амплифицированный ген hVEGF165. В итоге, была получен плазмидный вектор pTTS-VEGF165 (Рис.14).
Рис. 14. Схема получения плазмиды pTTS- VEGF165
Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566 и высеивали на твёрдую питательную среде LB Agar, содержащую 100 мкг/мл ампицилина. Полученные колонии рекомбинантов анализировали на содержание и уровень экспрессии тиоредоксина и hVEGF165 методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. На основании данных SDS ПААГ электрофореза были отобраны клоны №2,3 для дальнейшей работы.
Рис. 15. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов различных клонов E. coli ER2566/ pTTS- VEGF165. Где A-h VEGF165, B-тиоредоксин.
Из клонов №2, 3 выделили плазмидную ДНК (pTTS-hVEGF165). Плазмидной ДНК клона № 2 (pTTS-hVEGF165) трансформировали клетки E. coli ER2655 и осуществили наработку биомассы ER2566/pTTS-hVEGF165. Полученную биомассу лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора. Осветлённый лизат после центрифугирования хроматографировали на анионообменной смоле Q Sepharose (GE Healthcare). Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях на наличие целевого белка. Фракции, содержащие 90% hVEGF165, были объединены. В объединенных фракциях методом Бредфорд определяли концентрацию белка. В результате конечный выход целевого белка составил 7 мг с литра культуры. Не смотря на низкий выход целевого белка, продукция тиоредоксина была значительной, что отчётливо видно на хроматограмме. (Рис.15).
Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF165 из биомассы E. coli ER2566/ pTTS- VEGF165.
Осветлённый клеточный лизат
Ионообменая хроматография на сорбенте Q XL
Получение гибридного белка Trx-hVEGF165
На основании результатов ранее описанного эксперимента по получению hVEGF165 с помощью «стоп старт» конструкции было решено осуществить получение hVEGF165 в виде химерного белка. Так как уровень продукции тиоредоксина, несмотря на низкий выход hVEGF165, был, достаточно, высокий.
В качестве экспрессионного вектора решили выбрать ранее полученный в лаборатории вектор pTVG производный вектора pET32 b(+). Вектор pTVG содержит ген тиоредоксина, последовательность кодирующую сайт TEV протеазы и удобный полилинкер. Ген hVEGF165 был клонирован в плазмиду pTVG по сайтам Xho I и Nco I. В результате получили плазмиду pTVG-VEGF165 (Рис. 16). В качестве штамма носителя взяли E. coli Origami (DE3).
За счёт делеций гена глутатион редуктазы (gor522) и тиоредоксин редуктазы (trxB) биосинтез hVEGF165 в штамме Origami (DE3) идёт с образованием внутри и межмолекуляных дисульфидных мостиков стабилизирующих молекулу белка и способствующие правильному фолдированию молекулы.
Рис. 16. Схема клонирования hVEGF165 в pTVG
Данной плазмидой трансформировали клетки Origami (DE3) и осуществили наработку биомассы Origami (DE3)/pTVG-hVEGF165. Полученную биомассу дезинтегрировали с помощью ультразвукового дезинтегратора. Осветленный лизат хроматографировали на колонке HiTrap Heparin Sepharose. За счёт наличия на С конце молекулы VEGF165 25 аминокислотных остатка, несущих сайты аффиности к гепарину (N. Ferrara, 2010) было решено фракционировать белки осветленного клеточного лизата на гепарин сефарозе.
Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Объединяли фракции, в которых содержание ГБ превышало 90%. Фракции, содержащие ГБ концентрировали методом ультрафильтрации на мембране YM 30. К концентрату, содержащему гибридный белок, была добавленная TEV протеаза в соотношении субстрат — фермент 100:1 соответственно. Протеолитическое расщепление было не значительным, менее 40% (Рис. 17.).
Рис. 17. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Результаты протеолитического расщепления ГБ TEV протеазой. Где A- гибридный белок (Trx-hVEGF165), B-тиоредоксин.
Вероятной причиной низкого уровня протеолитического расщепления были неспецифические взаимодействия hVEGF165 с тиоредоксином, экранировавшие сайт TEV.
Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF165 из биомассы Origami (DE3)/pTVG-hVEGF165
Осветлённый клеточный лизат
Аффинная хроматография на колонке HiTrap Heparin Sepharose
Расщепление ГБ TEV протеазой
Получение гибридного белка CBD-hVEGF165
Высокий уровень экспрессии гибридного белка Trx-hVEGF165 подтвердил правильность выбранного способа продукции целевого белка. Однако, трудности возникшие на стадии сайт специфичного протеолитического расщепления TEV протеазой были, скорей всего, вызваны специфической природой тиоредоксина, влияющего на фолдинг молекулы гибридного белка. В результате снижалась доступность сайта TEV для TEV протеазы. Поэтому мы решили использовать в качестве лидерного полипептида белок с принципиально другой структурой, а также обладающего небольшой молекулярной массой в сравнении с молекулой тиоредоксина. Таким образом, было решено создать конструкцию, содержащую на N конце хитинсвязывающий домен (CBD) соединённый с hVEGF165 через сайт TEV.
CBD фрагмент амплифицировали с pTWIN1 с помощью праймеров Т7-prim и CBD2, содержащими сайты рестриктаз Xba I и Bgl II соответственно. В качестве вектора была выбрана плазмида pET-32b(+). Данный вектор содержит в полилинкерной последовательности сайты рестрикции Xba I и Bgl II (Рис. 19), по которым и была произведена вставка амплифицированного фрагмента с учетом корректной рамки считывания (Рис. 18).
Рис. 18. Схема получения плазмиды pET-CBD
Рис. 19. Полилинкерная последовательность вектора pET-32b(+).
Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.coli ER2566. Суспензию трансформированных клеток рассевали на чашки с селективной средой. Клоны, полученные при высевании трансформированных клеток на агаризованную среду пересевали в жидкую среду с добавлением ампициллина для выращивания и отбора клонов.
Отбор клонов осуществляли по результатам данный полученных при электрофорезе клеточных лизатов клонов в ПААГ. (Рис. 20).
Рис. 20. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов клонов E. coli ER2566/ pET-CBD
Из отобранных клонов выделили плазмидную ДНК для дальнейшей работы.
Получение экспрессионного вектора pCBD-VEGF165.
Ранее полученный ген человеческого VEGF165 был амплифицирован при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, содержащими сайты эндонуклеаз рестрикции Bgl II и Xho I, в качестве матрицы использовали плазмиду pTVG-VEGF165.
Амплифицированый ген hVEGF165 был клонирован по сайтам Xho I и Bgl II в ранее созданную для этого генетическую конструкцию pET-CBD. В результате получили плазмиду pCBD-VEGF165 (Рис. 21).
Рис. 21. Схема получения плазмиды pCBD-hVEGF165
Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER 2566, которые затем рассеивали на твёрдой питательной среде, с целью отбора клонов. В результате было проверенно 9 клонов на наличие экспрессии гибридного белка (Рис. 22).
Рис. 22. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов клонов E. coli ER2566/pCBD-hVEGF165. Где А — гибридный белок CBD-hVEGF165
Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы (в компании Евроген).
Из биомассы клона №4 была выделена плазмида pCBD-VEGF165 для дальнейшей работы.
Получение штамма продуцента гибридного белка CBD-VEGF165
Выделенной плазмидой pCBD-VEGF165 трансформировали клетки E. coli Origami (DE3). Полученный штамм продуцент проверяли на наличие продукции гибридного белка. Элетрофорез проводили в восстанавливающих и в невосстанавливающих условиях с целью обнаружения димера гибридного белка. Электрофореграмма в невосстанавливающих условиях показала наличие димера химерного белка (Рис. 23). Целевой белок после ультразвуковой дезинтеграции биомассы клетки E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 в основном присутствовал в растворённой фракции. Таким образом, нам удалось избежать образования телец включения, характерных для гетерологической экспрессии многих белков в клетках E. coli.
Рис. 23.Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в восстанавливающих и невостанавливающих условиях. Где A- димер гибридного белка CBD-hVEGF165, B- мономер гибридного белка CBD-hVEGF165.
Подбор условий культивирования штамма E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165
В ходе дальнейшей работы был проведен подбор оптимальных условий культивирования штамма-продуцента. Для этого в процессе культивирования клеток после добавления ИПТГ каждый час отбирались пробы биомассы. Культивирование проводили при 30 о С.
Результаты данного эксперимента представлены на рис. 24.
Рис. 24. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) образцов биомассы E. coli Origami (DE3)/pCBD-hVEGF165после индукции ИПТГ. Где А — гибридный белок CBD-VEGF165.
Из полученной электрофореграммы видно, что оптимальное время культивирования клеточной культуры E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 15-16 часов после добавления ИПТГ.
Выделение и очистка гибридного белка CBD-hVEGF165.
Полученный продуцент E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 культивировали при 37 0 С до оптической плотности 0,6-0,7, затем добавляли ИПТГ и выращивали при 30 0 С в течение 16 часов.
Биомассу штамма-продуцента E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 подвергали ультразвуковой дезинтеграции в буфере, содержащем 2 М мочевину. Центрифугированием отделили растворимую фракцию, содержащую гибридный белок, от нерастворимого осадка. Используя сродство VEGF165 к гепарину, гибридный белок, содержащийся в осветлённом лизате, очищали от белков E. coli на колонке HiTrap HP Heparin-Sepharose. Полученные фракции анализировали на наличие димера гибридного белка с помощью SDS-ПААГ электрофореза в невосстанавливающих условиях.
Рис. 25. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в невостанавливающих и восстанавливающих условиях фракций после элюции с гепарин сефарозы. Где A — димер гибридного белка CBD-hVEGF165. B — мономер гибридного белка CBD-hVEGF165.
По результатом электрофореза в невостанавливающих условиях были отобраны фракции для дальнейшей работы.
Полученные фракции были объедены и сконцентрированы методом ультрафильтрацией на мембране YM 30 с целью дальнейшего протеолитического расщепления гибридного белка TEV-протеазой.
Протеолитическое расщепление гибридного белка CBD-hVEGF165 TEV протеазой.
Концентрат нанесли на колонку, заполненную хитиновым сорбентом (New England Biolabs). Колонку заполнили буферным раствором, содержащим TEV протеазу, инкубировали при 37 о С на 15 часов. Продукты протеолитического расщепления элюировали буферным раствором А. Элюат и хитиновый сорбент анализировали методом SDS-электрофорезом.
Эффективность ферментативного гидролиза составила менее 50%. В качестве альтернативного пути осуществления протеолитического расщепления ГБ было решено отказаться от предварительной сорбции на хитиновый сорбент, а расщеплять, непосредственно, в растворе. К полученному концентрату добавили экстракт тел включения TEV в соотношении фермент-ГБ 1:100, а также добавили 1М раствор дитиотриэтола до концентрации последнего в реакционной среде 1 мм.
Рис 26. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) результаты протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка на колонке заполненной хитиновым сорбентом. Где A- димер гибридного белка CBD-hVEGF165, B — мономер гибридного белка CBD-hVEGF165, C — hVEGF 165.
Инкубировали в течение 15 часов при температуре 37 о С и слабом перемешивании. Гидролиз гибридного белка прошёл, практически, полностью (Рис. 27).
Рис. 27. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Кинетика протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка в растворе. Где A — димер hVEGF165, B — мономер гибридного белка CBD-hVEGF165, C — мономер hVEGF165.
Далее смесь, содержащую продукты ферментативного гидролиза, фракционировали, с помощью аффинной хроматографии на сорбенте гепарин сефароза по ранее описанной методики. Фракции содержащие целевой белок очищали с помощью ВЭЖХ на колонке Диасорб С18 (Рис. 28).
Рис. 28 Профиль ВЭЖХ хроматографии на колонке Диасорб С18 фракций, содержащих hVEGF165
hVEGF165 чистотой 98% элюировался с колонки начиная 18,6 мин по 19,1 минуту. Полученный элюат, содержащие чистый rhVEGF165 был лиофилизирован. Итоговый выход целевого белка составил 22,4 мг с литра культуры.
Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF165 из биомассы E. coli Origami/pCBD-VEGF165.
источник
Содержимое (Table of Contents)
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Электрофорез ОФС.1.2.1.0023.15
в полиакриламидном геле Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также в зависимости от конфигурации молекул. Изменяя концентрацию полимера, можно получать гели с широким диапазоном размеров пор, позволяющих проводить разделение белков и пептидов с молекулярными массами от 2 до 300 тыс. кДа. Можно также изменять электрический заряд макромолекул (путем вариации рН буферного раствора) и их конформацию за счет введения в буферный раствор денатурирующих агентов или детергентов.
Протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима с целью исключения изменений вязкости, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов.
Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними, причем скорость миграции наиболее подвижных макромолекул пробы должна быть несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда фронт красителя достигает противоположной границы геля, электрофорез прекращают.
Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и выдерживают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты фиксируются в том самом месте, где закончилась их миграция. После фиксации или одновременно с ней проводят окрашивание зон путем выдерживания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.
Вместо окрашивания или наряду с ним могут использоваться радиоактивные метки и приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.
Гель полиакриламида имеет ряд преимуществ, определяющих его широкое использование. Он прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей, и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос.
Разделяющие свойства полиакриламидных гелей (ПААГ) определяются трехмерной сетью волокон и пор, которая сформирована за счет бифункциональных бисакриламидных связей между смежными полиакриламидными цепями. Полимеризация катализируется системой, производящей свободные радикалы, составленной из аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина.
С увеличением концентрации акриламида в геле эффективный размер пор уменьшается. Эффективный размер пор геля определяет его разделяющие свойства, то есть сопротивление геля к перемещению макромолекул. Существуют пределы концентраций акриламида, которые могут использоваться. При высоких концентрациях акриламида гели становятся более ломкими и трудны в обращении. С уменьшением размера пор геля уменьшается скорость перемещения белка через гель. Регулируя размер пор геля путем изменения концентрации акриламида, можно оптимизировать разрешающую способность метода для конкретного анализируемого образца. Таким образом, физическое состояние ПААГ характеризуется по составу акриламида и бисакриламида. Обычно используются гели, в которых общая концентрация мономера и сшивающего агента находится в диапазоне от 3 до 30 %, а количество сшивающего агента обычно составляет от одной десятой до одной двадцатой от количества мономера. При этом содержание сшивающего агента тем меньше, чем выше общая концентрация геля.
Электрофорез в полиакриламидных гелях с использованием натрия додецилсульфата (SDS) – наиболее распространенный способ электрофореза, используемый для оценки подлинности и чистоты белковых продуктов. Денатурированные под воздействием высокой температуры полипептиды, связываясь с анионным детергентом SDS, становятся отрицательно заряженными и приобретают конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы независимо от типа белка. Поскольку количество связанного SDS почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от последовательности аминокислот в полипептиде, SDS-полипептидные комплексы мигрируют через полиакриламидные гели с подвижностью, прямо пропорциональной молекулярной массе полипептида.
Молекулярная масса белка может быть оценена по его относительной подвижности на прокалиброванном геле, и обнаружение отдельной полосы в таком геле является критерием чистоты.
Однако, наличие у полипептида радикалов типа N- или O-связанных гликозидов оказывает существенное влияние на оценку молекулярной массы белка, поскольку SDS не связывается с углеводной частью молекулы так же, как с полипептидной. Таким образом, пропорциональность отношения «заряд к массе» не выдерживается и электрофоретическая подвижность белков, подвергшихся посттрансляционным модификациям, не является истинным отражением молекулярной массы полипептидной цепи.
Трехмерная структура белков часто поддерживается за счет дисульфидных связей. Цель анализа SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить эту структуру путем расщепления дисульфидных связей. Денатурация и дезагрегация белков заключается в обработке их 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (DTT), в результате которой происходит разрыв S-S связей, разворачивание полипептидной цепи и последующее связывание с SDS. В этих условиях молекулярная масса полипептидных субъединиц может быть рассчитана методом линейной регрессии при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.
Без обработки восстанавливающими агентами типа 2-меркаптоэтанола или DTT дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Невосстановленные белки не могут полностью насыщаться SDS и, следовательно, не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Это делает определение молекулярных масс этих молекул методом SDS-ПААГ менее стандартизованным, чем исследование полностью денатурированных полипептидов. Однако, выявление одной полосы в таком геле (т.е. отсутствие любых компонентов, отличных от основного компонента) является показателем чистоты белка.
Электрофорез белков в полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом (SDS-PAGE), как правило, проводится в неоднородной буферной системе, которая описывается ниже.
Электрофорез в геле с неоднородной буферной системой (диск—электрофорез)
Метод диск-электрофореза, благодаря своей высокой разрешающей способности, рекомендуется для характеристики смесей белков и для обнаружения примесей, которые могут иметь подвижность, близкую к подвижности главного компонента.
Метод подразумевает использование прерывистой системы, состоящей из двух отличных гелей: разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего) геля. Эти два геля имеют различную пористость (верхний – крупнопористый, нижний – мелкопористый). Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. Пористость, длина и тип буфера для нижнего геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза.
Отличительной особенностью данного вида электрофореза является обязательное использование в составе электродного буферного раствора подвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки; например, применение иона Cl — для щелочных буферных растворов или иона K + – для кислых. В этом буферном растворе подвижность иона, мигрирующего в том же направлении, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для этого удобно использовать цвиттерионы: например, простые аминокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки лежат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97).
Под действием электрического поля ионы глицина, входящие в состав электродного буферного раствора, следуют за белками в концентрирующий гель. Область перемещающихся границ быстро формируется под действием высоко подвижных хлорид-ионов во фронте и относительно медленных замыкающих ионов глицина. Хлорид-ион из-за его небольшого размера мигрирует быстрее, чем любой из белков, присутствующих в образце. Величина рH образца и концентрирующих слоев выбирается так, чтобы быть приблизительно на 3 единицы ниже, чем верхнее значение pKa глицина. Поэтому, на пересечении этих слоев только около 0,1% глициновых молекул имеют отрицательный заряд. Таким образом, быстродвижущиеся хлорид-ионы постепенно замещаются ионами глицина, которые при рН 6,8 в концентрирующем геле нейтрализуются и перестают участвовать в проведении тока. Сопротивление верхней части концентрирующего геля резко возрастает, а вместе с ним возрастает и напряженность поля. Локализованные зоны высоковольтового градиента между передним и задним ионными фронтами вызывают относительно высокую скорость миграции белков в концентрирующем геле, которая не ограничивается благодаря крупнопористой структуре этого геля.
На границе концентрирующего и разделяющего гелей белки достигают высокоплотных слоев геля и замедляются из-за уменьшающегося размера пор разделяющего геля. Более высокое значение pH, с которым фронт электродного буферного раствора встречается в разделяющем геле, также заставляет глицинат мигрировать быстрее, и напряженность поля падает, что также снижает скорость движения белков. Таким образом, происходит концентрирование пробы и все компоненты образца, независимо от первоначальной высоты столбика пробы в лунке, входят в нижний гель практически одновременно в виде узкой зоны с высокой концентрацией белка.
В мелкопористом разделяющем геле начинается процесс медленной миграции белков и их фракционирования в зависимости от молекулярных масс, а то обстоятельство, что процесс разделения начинается с узкой исходной зоны, обеспечивает высокую разрешающую способность системы вцелом.
Прибор для электрофореза состоит из:
1) источника постоянного тока с регулируемым напряжением и со стабилизатором напряжения;
2) камеры для электрофореза, служащей для размещения пластинки или трубки геля и поддержания постоянных условий проведения анализа. Камера обычно имеет прямоугольную форму, изготовлена из стекла или твердой пластмассы с двумя изолированными буферными резервуарами (анодным и катодным), содержащими раствор электролита. В каждый резервуар погружен электрод (например, платиновый), подключенный к соответствующему полюсу источника тока. Должен поддерживаться одинаковый уровень электролитов в резервуарах, чтобы предотвратить поток жидкости и гидростатическое давление на гель. Камера для электрофореза оснащена крышкой, которая предотвращает испарение растворителей и обеспечивает равномерно насыщенную влагой атмосферу во время всего процесса. Предпочтительно использование предохранителя для отключения электропитания, когда крышка камеры снята. Если мощность тока, приложенного к электрофоретической пластинке, превышает 10 Вт, то рекомендуется применять охлаждение камеры.
3) устройства для заливки геля, представляющего собой стеклянную трубку, стеклянную пластину или пару прямоугольных пластин (ячейку), служащих для формирования поддерживающей среды, в которой непосредственно проводится процесс электрофоретического разделения. Пластины могут быть расположены в камере вертикально или горизонтально (вариант горизонтального электрофореза обычно применяется для агарозных гелей) и должны быть погружены или иметь контакт посредством фитилей с катодным и анодным изолированными буферными резервуарами, содержащими раствор электролита. Преимуществом пластин для проведения процесса является возможность сравнения образцов в одной общей ячейке геля, что более информативно по сравнению с набором гелей из ряда трубок. Преимущество горизонтальных пластин по сравнению с вертикальными заключается в отсутствии проблемы герметизации швов, а недостаток – в большой поверхности контакта с воздухом и, соответственно, риске испарения жидкости.
Сборку прибора и его очистку после использования проводят в соответствии с инструкцией производителя.
Перед заливкой геля основание и боковые стороны ячейки закрывают подходящими прокладками, толщина которых определяет толщину рабочего геля (при этом после полимеризации геля прокладку в основании убирают). Ячейку заполняют раствором мономера с поперечно-сшивающим агентом и катализатором. Растворы должны быть дегазированы перед полимеризацией и гели должны использоваться свежеприготовленными. Заливку растворов проводят таким образом, чтобы исключить попадание внутрь ячейки пузырьков воздуха.
Гребенку, имеющую зубцы соответствующего размера (в зависимости от объемов наносимого образца), устанавливают в верхнюю часть ячейки на разделяющий гель и оставляют там до окончания полимеризации геля. Формирование геля обычно занимает не менее 30 мин и может считаться законченным, когда между гелем и водным слоем появляется четкая граница. После удаления гребенки из геля, прошедшего полимеризацию, остается ряд лунок.
Заполняют нижний и верхний резервуары камеры предписанным электродным буферным раствором. Готовят испытуемый и стандартный растворы, содержащие краситель и сахарозу или другой плотный и вязкий растворитель. Наносят образцы шприцем или микропипеткой в основания лунок, сразу включают электрический ток и начинают электрофорез, соблюдая предписанные условия (температуру и величину напряжения).
После окончания процесса (когда краситель достигает нижней границы пластины) ток выключают, пластину удаляют из камеры, зоны фиксируют, окрашивают и при необходимости пластину высушивают.
Подготовка полиакриламидного геля для вертикального электрофореза с SDS в неоднородной буферной системе
Сначала готовят и заливают в подготовленную ячейку нижний разделяющий гель, а затем сверху наслаивают концентрирующий гель.
В конической колбе готовят рассчитанное в зависимости от объема ячейки количество раствора для разделяющего геля, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в Таблице 1. Смешивают компоненты в указанном порядке. В тех случаях, где требуется, перед добавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (TEMED) раствор фильтруют, и, если необходимо, дегазируют раствор через мембрану из ацетата целлюлозы (с диаметром пор
0,45 мкм) под вакуумом при перемешивании. Добавляют соответствующие количества раствора аммония персульфата и TEMED как указано в табл. 1, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки. Оставляют достаточное место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя суженную стеклянную пипетку, тщательно наслаивают на гель сверху воду или изобутанол. Оставляют гель в вертикальном положении при комнатной температуре до завершения полимеризации.
После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.
В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл.2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 5 мл | 10 мл | 15 мл | 20 мл | 25 мл | 30 мл | 40 мл | 50 мл | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 4% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 2,6 | 5,3 | 7,9 | 10,6 | 13,2 | 15,9 | 21,2 | 26,6 |
| Раствор акриламида 1) | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | 8,0 | 10,0 |
| 1,5М Трис | ||||||||
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 1 мл | 2 мл | 3 мл | 4 мл | 5 мл | 6 мл | 8 мл | 10 мл | |
| Вода очищенная | 0,68 | 1,4 | 2,1 | 2,7 | 3,4 | 4,1 | 5,5 | 6,8 |
| Раствор акриламида 1) | 0,17 | 0,33 | 0,5 | 0,67 | 0,83 | 1,0 | 1,3 | 1,7 |
| 1,0М Трис | ||||||||
(рН 6,8) 6)
1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1)
2) 1,5М Трис (рН 8,8): 1,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 8,8
3) 100 г/л SDS: раствор натрия додецилсульфата 100 г/л
4) 100 г/л APS: раствор аммония персульфата 100 г/л. Аммония персульфат является источником свободных радикалов, которые управляют полимеризацией акриламида и бисакриламида. Таким образом, раствор аммония персульфата должен добавляться медленно.
5) TEMED: тетраметилэтилендиамин.
6) 1,0М Трис (рН 6,8): 1 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 6,8
Гель со вставленной гребенкой оставляют в вертикальном положении при комнатной температуре до окончания полимеризации.
Если в фармакопейной статье нет других указаний, то определение молекулярных масс проводят при нагрузке на лунку 10 мкг общего белка, а определение чистоты – при нагрузке 40 мкг при окрашивании Кумасси бриллиантовым R250, а при окрашивании нитратом серебра достаточно 2–5 мкг белка на лунку.
Толщина гребенки выбирается точно в соответствии с толщиной используемых прокладок, а размер зубцов – в соответствии с предполагаемым объемом образцов. Необходимый и достаточный объем формируемой лунки определяется как произведение длины, ширины и высоты (в микрометрах) одного зубца гребенки: V = L ∙ D ∙ H.
Объем наносимого образца вычисляют следующим образом:
где: k – коэффициент разбавления пробы буферным раствором для образца;
Х – требуемое для нанесения на гель количество белка в зависимости от целей анализа, в мкг;
С – концентрация общего белка, определяемая по методу Лоури, в мкг/мл.
После окончания полимеризации аккуратно удаляют гребенку, немедленно ополаскивают лунку водой, чтобы удалить любые остатки неполимеризованного акриламида. Если необходимо, выправляют зубцы концентрирующего геля при помощи тупой подкожной иглы, насаженной на шприц.
Устанавливают гель в прибор для электрофореза согласно инструкциям изготовителя оборудования. Добавляют электродный буферный раствор в верхнюю и нижнюю буферные емкости. Обычно, если нет других указаний в фармакопейной статье, в качестве электродного буферного раствора используется трис-глициновый буферный раствор с рН 8,3-8,4.
Удаляют любые пузыри, которые могут появиться у основания геля между стеклянными пластинами. Не следует включать электрический ток до внесения образцов, так как это уничтожит неоднородность буферных систем.
Готовят испытуемый раствор и раствор сравнения в рекомендованном буферном растворе для образцов в соотношении, указанном в фармакопейной статье или нормативной документации.
Обычно для обеспечения полной денатурации образец в смеси с буферным раствором подвергают дополнительно температурной обработке, режим которой должен быть указан в фармакопейной статье или нормативной документации.
Наносят соответствующие объемы каждого из растворов в лунки концентрирующего геля. Начинают электрофорез, используя условия, рекомендуемые изготовителем оборудования.
Изготовители оборудования для SDS-ПААГ могут обеспечивать применение гелей различной площади и толщины. Соответственно продолжительность электрофореза и сила тока (или напряжение) могут быть изменены, как описано изготовителем прибора, чтобы достичь оптимального разделения, что проверяют по скорости перемещения фронта индикатора в разделяющем геле.
Когда индикатор достигает основания геля, электрофорез останавливают. Удаляют ячейку с гелем из прибора и отделяют стеклянные пластины. Удаляют прокладки, отрезают и удаляют концентрирующий гель и немедленно проводят процедуру окрашивания. Для того, чтобы можно было выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель рекомендуется обрезать не полностью, оставляя 2–3 мм.
Так называемые, «готовые к использованию» коммерческие гели и наборы реактивов к ним могут быть применены при условии, что они дают результаты, отвечающие валидационным критериям, приведенным ниже в разделе «Оценка пригодности системы».
Окрашивание Кумасси бриллиантовым R250 – наиболее распространенный метод окрашивания белков с пределом обнаружения порядка от 1 до 10 мкг белка в полосе. Окрашивание нитратом серебра – более чувствительный метод окрашивания белков в гелях, позволяющий выявлять до 1 нг белка.
Для селективного окрашивания гликозилированных белков или липопротеидов иногда применяют другие красители или их смеси, о чем должно быть сделано дополнительное указание в фармакопейной статье или нормативной документации.
Все процедуры окрашивания геля проводят, как правило, при комнатной температуре и при слабом перемешивании в любом удобном контейнере. При окрашивании геля следует использовать одноразовые перчатки, иначе на геле могут быть прокрашены отпечатки пальцев.
Погружают гель в большой избыток красящего раствора Кумасси раствора и выдерживают, по крайней мере, 1 ч. Поскольку кислотно-спиртовой состав окрашивающего раствора не позволяет полностью фиксировать белки на геле, это может приводить к потерям некоторых низкомолекулярных белков во время окрашивания и обесцвечивания тонких гелей. Полная фиксация возможна при выдерживании геля в 10 % растворе трихлоруксусной кислоты в течение 1 ч перед погружением в окрашивающий Кумасси раствор.
Для ускорения процедуры окрашивания допускается подогрев геля в окрашивающем растворе в микроволновой печи. Режим подогрева должен быть описан в фармакопейной статье или нормативной документации. Затем окрашивающий раствор удаляют и гель промывают водой.
Обесцвечивают гель избытком обесцвечивающего раствора. Заменяют порции обесцвечивающего раствора несколько раз до тех пор, пока окрашенные полосы белка не станут ясно различимы на прозрачном фоне. Чем более полно обесцвечен гель, тем меньшие количества белка могут быть обнаружены этим методом. Обесцвечивание может быть ускорено при добавлении в обесцвечивающий раствор нескольких граммов анионобменной смолы или маленького кусочка пористого материала.
После обесцвечивания гель промывают водой и либо высушивают, либо оставляют в воде для хранения при температуре от 2 до 8 °С.
Погружают гель в большой избыток фиксирующего раствора и выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий раствор сливают, добавляют новую порцию того же раствора и инкубируют, по крайней мере 1 ч или оставляют на ночь. Сливают фиксирующий раствор и промывают гель в большом избытке воды в течение 1 ч. После этого пропитывают гель в течение 15 мин в 1 % растворе глутарового альдегида. Промывают гель дважды по 15 мин большим количеством воды. Выдерживают гель в темноте в свежеприготовленном 2 % растворе серебра нитрата в течение 15 мин. Промывают гель три раза по 5 мин в большом количестве воды. Погружают гель приблизительно на 1 мин в проявляющий раствор, пока не будет достигнуто удовлетворительное окрашивание. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в треке с минимальным количеством препарата (например, 0,001 мкг). Останавливают развитие окраски погружением в стоп-раствор на 15 мин. Ополаскивают гель водой.
Целесообразно использовать готовые наборы реактивов для окрашивания гелей серебра нитратом.
В зависимости от используемого метода окрашивания подготовку геля к высушиванию проводят различными способами:
– при окраске Кумасси после процедуры обесцвечивания гель выдерживают в смеси 10,0 г глицерина и 92 мл воды очищенной не менее 2 ч (возможна инкубация «на ночь»);
– при окраске нитратом серебра гель после заключительной процедуры ополаскивания выдерживают в течение 5 мин в смеси 2,0 г глицерина и 98 мл воды очищенной.
Погружают два листа пористой целлюлозной пленки в воду и выдерживают в течение 5–10 мин. Растягивают один из листов на рамке для высушивания. Аккуратно помещают пропитанный в глицериновом растворе гель на натянутую целлюлозную пленку. Удаляют все случайно попавшие воздушные пузыри, и заливают вокруг граней геля несколько миллилитров воды. Помещают второй лист пленки сверху и снова удаляют все воздушные пузыри. Заканчивают сборку рамки для сушки геля и помещают ее в сушильный шкаф или оставляют при комнатной температуре до полного высыхания.
Молекулярные массы белков определяют по сравнению их подвижностей с подвижностью нескольких белков-маркеров известной молекулярной массы. Готовые смеси белков с точно известными молекулярными массами (маркеры) для калибрования гелей предлагаются производителями материалов и оборудования для электрофореза в различных диапазонах молекулярных масс. Концентрированные исходные растворы полипептидов известной молекулярной массы готовят в соответствующем буферном растворе для образцов и наносят на гель одновременно с образцом испытуемого белка.
Сразу после того, как электрофорез завершен, следует отметить положение полосы красителя бромфенолового синего, которая соответствует электрофоретическому ионному фронту. Это может быть сделано при помощи меток-надрезов в геле или путем прокола геля в зоне окрашенного фронта иглой, предварительно обмакнутой в черную тушь или другой подходящий контрастный краситель.
После окрашивания геля измеряют расстояния пробега для каждой полосы белка (маркеров и испытуемого образца) от вершины разделяющего геля. Вычисляют отношение расстояния пробега каждого белка к расстоянию пробега фронта красителя. Нормализованные расстояния пробега, вычисленные таким образом, называются относительными подвижностями белков (относительно фронта красителя) и обозначаются как Rf.
где: R – расстояние пробега белка;
RS – расстояние пробега красителя
Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс стандартов белка (Мr) от значения Rf. Неизвестные молекулярные массы могут быть оценены методом линейной регрессии или интерполяцией кривых зависимости logMr от Rf в том случае, если значения, полученные для испытуемых образцов, находятся в линейной части графика.
В тех случаях, когда в фармакопейной статье указан предел примесей, то перед анализом должен быть приготовлен раствор сравнения, соответствующий этому уровню примеси, путем разбавления испытуемого раствора. Например, в случае 5 % предела, раствор сравнения должен быть приготовлен разведением испытуемого раствора в соотношении 1:20. При этом примесь (полоса, отличная от главной полосы) на электрофореграмме с испытуемым препаратом не должны быть интенсивнее, чем полоса, полученная с раствором сравнения. При наличии нескольких полос примесей должно быть предусмотрено требованию к содержанию каждой из них и к содержанию суммы примесей.
Приемлемым условием определения примесей может считаться метод количественной нормализации с использованием денситометрического интегрирования. В этом случае предварительно должна быть показана линейность отклика прибора.
Результаты анализа считаются достоверными только в том случае, если:
- белки маркера молекулярных масс распределены приблизительно на 80 % длины геля и охватывают весь требуемый диапазон разделения (например, диапазон молекулярных масс продукта и его димера или продукта и родственных примесей);
- зависимость логарифма молекулярной массы белков-маркеров и Rf – линейна в необходимом диапазоне.
Дополнительные требования приемлемости результатов анализа должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
1) Приготовление 30% раствора акриламида/бисакриламида. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 29,2 г акриламида и 0,8 г N,N’-метиленбисакриламида, растворяют в воде очищенной при перемешивании, доводят объем раствора водой до 100 мл и вновь перемешивают (при необходимости раствор фильтруют, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации). Раствор хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
2) Приготовление раствора натрия додецилсульфата. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде очищенной при аккуратном перемешивании, избегая вспенивания, доводят объем раствора до 100 мл и вновь перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре.
3) Приготовление раствора аммония персульфата. Растворяют 100,0 мг аммония персульфата в 1,0 мл воды очищенной. Раствор используют свежеприготовленным.
4) Приготовление 1,5М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 8,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 90,8 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 8,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
5) Приготовление 1,0 М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 60,6 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 6,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
6) Приготовление электродного буферного раствора (10×) (рН 8,3). В мерный стакан, вместимостью 1000 мл помещают 30,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 144,0 г глицина и 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Фильтруют и измеряют рН раствора, который должен быть 8,3 — 8,4. Доводить рН раствора кислотой или щелочью до необходимого значения не допускается.
Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.
Непосредственно перед анализом 1 часть приготовленного раствора смешивают с 9 частями воды очищенной.
7) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанавливающих условиях с 2-меркаптоэтанолом. В химическом стакане смешивают 4,7 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,4 мл 2-меркаптоэтанола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
8) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанвливающих условиях с дитиотреитолом. В химическом стакане тщательно перемешивают 5,0 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,06 г 1,4-дитиотреитола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор используют свежеприготовленным.
9) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в невосстанвливающих условиях. В химическом стакане тщательно смешивают 5,1 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 3 мес.
10) Приготовление красящего раствора Кумасси. Раствор готовят по одному из способов приготовления (№ 1 или № 2):
Раствор № 1. Растворяют 0,3 г Кумасси бриллиантового R250 в смеси 100 мл спирта метилового или этилового и 100 мл воды очищенной. Перемешивают до полного растворения (в течение 1 ч). Добавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 250 мл и перемешивают. Хранят окрашивающий раствор в темной бутыли при комнатной температуре. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.
Раствор № 2. 1,0 г Кумасси ярко-голубого R-250 помещают в химический стакан, доводят до объема 250,0 мл этиловым спиртом, перемешивают не менее 3,5 часов до полного растворения красителя, добавляют 100,0 мл кислоты ледяной уксусной и доводят объем деионизованной водой до 1000,0 мл. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.
11) Приготовление обесцвечивающего раствора. К 400 мл спирта метилового или этилового добавляют 100 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора до 1000 мл и перемешивают.
12) Приготовление фиксирующего раствора. К 250 мл спирта метилового или этилового добавляют 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.
13) Приготовление 1 % раствора глутарового альдегида. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 4 мл 25 % глутарового альдегида или 2 мл 50 % глутарового альдегида, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают.
14) Приготовление раствора серебра нитрата. Смешивают 2,75 мл 25 % раствора аммиака и 40 мл 1 М раствора натрия гидроксида, прибавляют по каплям при постоянном перемешивании 8 мл 20 % раствора серебра нитрата, доводят объем раствора водой очищенной до 200 мл и перемешивают.
15) Приготовление 20 % раствора серебра нитрата. Растворяют в воде очищенной 2,0 г (точная навеска) серебра нитрата, доводят объем раствора водой до 10 мл и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
16) Приготовление проявляющего раствора. Смешивают 2,5 мл 2,0 % раствора лимонной кислоты и 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.
17) Приготовление стоп-раствора. К 50 мл воды прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 100 мл и перемешивают.
В случае использования других реактивов и растворов они должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
источник