Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру и форме.

Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту: TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.
После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флуоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК.

Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.

Ежемесячно мы предлагаем скидки до 80% на буферы, агарозу и акриламид Sigma-Aldrich. Вы можете узнавать о актуальных акциях из нашей рассылки. Если хотите подписаться, напишите письмо на mailbox@galachem.su

Полный перечень реактивов, пластика и приборов, а также подробное описание, Вы можете получить, загрузив каталоги:

Скачать каталог Sigma-Aldrich: Nucleic Acid Amplification Перейти на сайт Sigma-Aldrich

Полный перечень реактивов и подробное описание на сайте Sigma-Aldrich.Также Вы можете заказать агарозу фирмы Electran. Для получения дополнительной информации обратитесь к нашим менеджерам

Полный перечень реактивов и подробное описание на сайте Sigma-Aldrich.

У нас вы можете заказать самые разнообразные макеры молекулярной массы ДНК и РНК.

Подробная информация о всех маркерах доступна по ссылке и в виде таблицы.

Полный перечень реактивов и подробное описание на сайте Sigma-Aldrich.

Камеры для проведения гель-электрофореза различных размеров по каталогам наших поставщиков: Sigma-Aldrich,и WENK.

источник

Для предварительной оценки степени деградации РНК можно провести ее электрофорез в агарозном геле в ТБЭ. В препаратах РНК хорошего качества содержание 28S-PHK должно быть примерно в три раза выше, чем 18S-PHK. Если это отношение меньше, значит, РНК частично деградирована. Для более точной оценки качества образцов нужно провести гель-электрофорез денатурированной РНК или электрофорез в денатурирующих гелях. Эти два метода описаны соответственно в протоколах.

Материалы
Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• 6 М глиоксаль: глиоксаль обычно поставляют в виде 40% (6 М) раствора. Поскольку глиоксаль быстро окисляется на воздухе, перед использованием его деионизуют с помошью катионо-обменной и анионообменной смол (например, Bio-Rad AG 501-Х8), перемешивая глиоксаль вместе со смолами на орбитальном шейкере до достижения рН менее 5,0, Деионизован-ный глиоксаль хранят разлитым на аликвоты в плотно закрытых пробирках при —20 °С. Пробирки должны быть заполнены максимально полно и каждую аликвоту можно использовать только один раз
• ДМСО: обычно высококачественный ДМСО можно использовать в том виде, в каком он поступает от фирмы, без какой-либо дополнительной обработки. Тем не менее бутыль со свежим ДМСО лучше разлить на аликвоты и хранить при —20 «С. Каждую аликвоту необходимо использовать только один раз
• 10 х буфер для электрофореза: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,0
• Смесь для денатурации: 3 мл 6 М глиоксаля, 7,5 мл ДМСО и 1,5 мл 10 х буфера для электрофореза. Эту смесь хранят разлитой на аликвоты в плотно закрытых пробирках при —20 СС. Пробирки должны быть заполнены практически полностью и использоваться только один раз
• Буфер для нанесения: 50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий в 1 х буфере для электрофореза
• Агароза (для электрофореза)

Методика
1. Растворяют каждый образец РНК (содержащий примерно 20 мкг РНК) в 3 мкл обработанной ДЭПК воды и добавляют 12 мкл смеси для денатурации.
2. Денатурируют РНК прогреванием при 50 °С в течение 1 ч.
3. Готовят 1,1% (в/о) агарозный гель в 1 х буфере для электрофореза и охлаждают его до 70 С. Для инактивации РНКаз добавляют в гель сухой иодацетат натрия до конечной концентрации 10 мМ.
4. Охлаждают смесь до примерно 50 С, выливают в кювету и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

5. Добавляют к каждому образцу РНК 2,5 мкл буфера для нанесения, осторожно перемешивают и быстро центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g.
6. Вносят образцы в лунки агарозного геля и проводят электрофорез при градиенте напряженности 1—2 В/см в 1 х буфере для электрофореза. Во время электрофореза должна быть обеспечена рециркуляция буфера, чтобы его рН поддерживался на уровне 7,0, поскольку при рН 8,0 комплекс глиоксаль/РНК диссоциирует.
7. Когда бромфеноловый синий дойдет до конца геля, электрофорез останавливают и окрашивают гель бромистым этидием (0,5 мкг/мл в 25 мМ трис-HCl, рН 9,0) в течение 1 ч при осторожном покачивании. При сильном фоновом окрашивании лишний бромистый этидий можно отмыть водой (две смены по 30 мин каждая).
8. Просматривают гель в УФ-трансиллюминаторе и фотографируют его фотоаппаратом «Поляроид».

— Важно полностью денатурировать РНК до электрофореза и поддерживать ее в таком состоянии во время его проведения, поскольку электрофоретическая подвижность РНК изменяется при образовании вторичной структуры. Чтобы электрофорез прошел успешно, необходимы качественные реактивы, использующиеся при приготовлении смеси для денатурации, и постоянная циркуляция буфера во время проведения электрофореза.
— Глиоксаль реагирует с бромистым этидием, поэтому при приготовлении геля и проведении электрофореза данный краситель не используют.
— Для препаратов интактной РНК интенсивность флуоресценции полосы, отвечающей 28S-PHK, должна быть как минимум в два раза выше, чем у полосы 18S-PHK.

источник

Электрофорез оц- и дц-нуклеиновых кислот в неденатурирующих и денатурирующих условиях. Зависимость подвижности нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий электрофореза. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего образования

«НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МОРДОВСКИЙ

Факультет биотехнологии и биологии

Кафедра биотехнологии, биоинженерии и биохимии

«Электрофорез белков и нуклеиновых кислот»

202 группы направления подготовки 020501.65 Славкина О.А.

Проверил: канд., биол., наук, преподаватель кафедры биотехнологии, биоинженерии и биохимии И.В. Сюсин

Введение
• 1. Электрофорез нуклеиновых кислот
• 1.1 Электрофорез НК в неденатурирующих условиях. Зависимость подвижности оц — и дц — нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий э/ф (% и тип геля). Подвижность кольцевых молекул дц-ДНК, влияние на нееEtBr
• 1.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность
• 1.2.1 Щелочные гели
• 1.2.2 Денатурирующие гели с формамидом
• 1.2.3 Денатурирующие гели с формальдегидом.
• 1.2.4 Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем
• 1.3 Разделение цепей дц-ДНК электрофорезом: принцип и особенности электрофореза
• 1.4 Двумерный электрофорез нуклеиновых кислот
• 2. Электрофорез белков
• 2.1 Электрофорез в неденатурирующих условиях Параметр разделения
• 2.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. — Денатурация белка. Параметр разделения. — ПринципDISC-электрофореза (система буферов Орнштейна и Дэвиса, электрофорезSDS-денатурированных белков по Лэммли). Использование градиента концентрации геля, равноесный электрофорез
• 2.3 Изоэлектрофокусирование. — Принцип метода, параметр разделения. — Амфолины
• 2.4 Двумерный электрофорез белков
• Заключение
• Список использованных источников

Под действием электрического поля заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление носит название электрофореза. Скорость движения частицы (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность см 2 •с -1 •В -1 , а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ в аналитических или препаративных целях. Определение подвижности используется также для характеристики вещества.

Существуют три основных типа электрофоретических систем — электрофорез с подвижной границей (метод подвижной границы), зональный электрофорез и стационарный (или вытесняющий) электрофорез. В системах первого типа электрическое поле прикладывается к исходно резкой границе между раствором макромолекул и буфером. Скорость миграции заряженных частиц определяется путем наблюдения за перемещением этой границы. Если раствор содержит гетерогенную смесь ионизированных макромолекул, то можно увидеть множество движущихся границ. В такой системе индивидуальные компоненты нельзя разделить на отдельные зоны, так как наслоенный сверху буферный раствор имеет более низкую плотность по сравнению с находящимся под ним раствором макромолекул. Если бы и удалось достигнуть разделения зон, то все равно произошло бы их перемешивание, так как плотность раствора внутри этих зон была бы выше, чем между ними.

В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. Существует несколько способов получения стабильных зон. В свободном растворе зоны можно стабилизировать с помощью вращения или непрерывного потока тонкого слоя жидкости. В качестве среды для зонального электрофореза могут успешно применяться градиенты плотности. Но наиболее широко используемый вариант зонального электрофореза основан на применении пористой стабилизирующей среды, такой, как фильтровальная бумага, блоки гранулированного материала или различные гели.

Электромиграция третьего типа (стационарный, или вытесняющий, электрофорез) характеризуется тем, что через некоторое время после начала разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся два метода: изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т.е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза.

В составе нуклеиновых кислот имеется некоторое количество основных групп, эти соединения нельзя подвергать электрофорезу в виде катионов, так как при низких значениях pH высокомолекулярные нуклеиновые кислоты нерастворимы в воде. В нейтральной и щелочной средах молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, поскольку их заряд определяется диссоциацией фосфатных групп. Оливера и др. обнаружили, что в этом диапазоне значений pH электрофоретическая подвижность РНК и денатурированной ДНК в свободном растворе не зависит от их молекулярной массы. Такая закономерность объясняется постоянством отношения заряда молекулы к ее массе и указывает на то, что нуклеиновые кислоты невозможно разделить с помощью электрофореза с подвижной границей.

Для электрофоретического разделения различных полинуклеотидов используют эффект молекулярного сита, присущий целому ряду гелей. Детальные исследования показали, что посредством электрофореза в гелях можно получить данные о некоторых характеристиках молекул нуклеиновых кислот. Так, например, методом электрофореза можно определить молекулярную массу того или иного полинуклеотида и установить, является ли он рибо- или дезоксирибонуклеотидом. Кроме того, можно выяснить, состоит ли данная молекула из одной или двух полинуклеотидных цепей, а в случае ДНК определить, какую форму имеет молекула — линейную или кольцевую. Несмотря на существование более точных физических и химических методов определения указанных свойств, электрофорез в некоторых отношениях имеет преимущество перед ними. Оно состоит в том, что электрофоретические методы относительно просты, требуют сравнительно недорогого оборудования и могут быть использованы в тех случаях, когда для анализа доступно лишь небольшое количество неочищенного материала. Некоторые физические параметры разделенных нуклеиновых кислот изучают, не прибегая к их элюции из гелей. Фрагменты геля, содержащие анализируемые зоны, вырезали, промывали соответствующим раствором, вставляли в кварцевые трубки и с помощью спектрофотометра определяли изменения оптической плотности, вызванные нагреванием.

Перечисленные выше факты позволяют понять, почему, начиная с момента своего появления, электрофорез нуклеиновых кислот находит все более широкое применение в биохимии, генетике, вирусологии, микробиологии и других областях биологии.

1.1 Электрофорез НК в неденатурирующих условиях. Зависимость подвижности оц — и дц — нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий э/ф (% и тип геля). Подвижность кольцевых молекул дц-ДНК, влияние на нее EtBr

Электрофорез в агарозном геле — стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности. Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем — бромистым этидием в низкой концентрации.

Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется пятью главными параметрами, рассмотренными ниже.

Размер молекул ДНК. Молекулы линейной двухцепочечной ДНК перемещаются в геле предположительно одним концом вперед со скоростями, обратно пропорциональными десятичному логарифму их молекулярных масс (Таблица 1)

Концентрация агарозы. Фрагменты ДНК данного размера перемещаются в геле, содержащем разные концентрации агарозы, с разными скоростями. Между логарифмом электрофоретической подвижности ДНК m и концентрацией геля t существует прямая зависимость. Таким образом, применяя гели разных концентраций, можно разделить большой набор фрагментов ДНК, различиающихся по размеру (Таблица 2).

Конформация ДНК. ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформации, например кольцевая неповрежденная (форма I), кольцевая с одноцепочечным разрывом (форма II) и линейная (форма III), движутся в агарозном геле с разными скоростями. Относительная подвижность трех указанных форм зависит главным образом от концентрации агарозы в геле, а также и от таких факторов, как сила тока, ионная сила буфера или плотность сверхспиральных витков в форме I. В одних условиях форма I перемещается быстрее, а в других — медленнее, чем форма III.

ДНК (одно — и двухцепочечные) и РНК при ЭФ движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные той же длины. Поскольку молекулярная масса НК пропорциональна их длине (в парах нуклеотидов или в тысячах пар нуклеотидов), можно построить стандартную кривую зависимости расстояния, на которое перемещается маркерный фрагмент, от десятичного логарифма длины этого фрагмента. С ее помощью можно определять размеры фрагментов нуклеиновых кислот в данном препарате по расстоянию, на которое они перемещаются при электрофорезе.

Одноцепочечные молекулы ДНК с мол. массой от 1,2 млн. до 40 млн. можно разделять в 0,6% -ном агарозном геле при условии, что разница в молекулярной массе между молекулами составляет не менее 5%.

Подвижность двухцепочечных молекул ДНК почти не зависит от их молекулярной массы. С помощью электрофореза в агарозном геле можно также разделять комплементарные цепи ДНК бактериофагов.

Описан простой метод отделения линейных ДНК от открытых кольцевых. Перед полимеризацией геля препарат ДНК смешивают с раствором агарозы. В процессе гелеобразования кольцевые молекулы захватываются гелем, тогда как линейные молекулы остаются свободными и могут быть затем выделены путем электрофореза.

Чтобы однозначно определить конформацию ДНК, необходимо провести ее электрофорез в присутствии возрастающих концентраций бромистого этидия. С увеличением концентрации красителя число его молекул, связанных с ДНК, растет. При этом отрицательные сверхспиральные витки в молекулах формы I постепенно исчезают, а скорость движения ДНК в геле уменьшается. При некоторой критической концентрации свободных молекул красителя, когда в ДНК больше не остается сверхспиральных витков, скорость движения формы I достигает минимальной величины. Последующее добавление новых порций бромистого этидия приводит к образованию положительных сверхспиральных витков, в результате чего подвижность формы I начинает быстро возрастать. Подвижность формы II и формы III в описанных условиях снижаются, хотя и по-разному, вследствие нейтрализации зарядов и увеличения жесткости молекул ДНК под влиянием бромистого этидия. Для большинства препаратов ДНК, находящейся в форме I, критическая концентрация бромистого этидия находится в области 0,1 — 0,5 мкг/мл.

Напряженность электрического поля. При низких напряженностях скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. Однако с увеличением напряженности электрического поля подвижность фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой дифференциально возрастает. Следовательно, с увеличением напряженности область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается. Максимальное разделение фрагментов происходит при напряженности, и не превышающей 5 В/см.

Состав оснований и температура. Электрофоретическое поведение ДНК в агарозных гелях слабо зависит от состава оснований ДНК (Thomas, Davis, 1975) или температуры геля. В агарозных гелях в области температур от 4 до 30 о С изменения относительной электрофоретической подвижности фрагментов ДНК разного размера не наблюдается. Обычно электрофорез в агарозных гелях ведут при комнатной температуре. Однако следует отметить, что гели, содержащие менее 0,5% агарозы, очень мягкие, поэтому с ними лучше работать при 4 о С — в этих условиях они становятся более плотными [2].

1.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность

Воспроизводимое фракционирование однонитевых молекул ДНК и РНК, а также определение их молекулярной массы по скорости миграции в геле оказываются возможными только при сохранении условий денатурации в ходе самого электрофореза. Поэтому во всех случаях, когда нет необходимости сохранить нативную структуру, нуклеиновые кислоты предпочитают фракционировать электрофорезом в денатурирующих условиях, или, как говорят, в «денатурирующих» гелях. Это означает, что внутри геля создается среда, препятствующая комплементарному спариванию одинарных нитей нуклеиновых кислот или их участков.

В некоторых случаях эта среда способствует распрямлению нитей, что делает зависимость скоростей миграции от значений длины полинуклеотидов более строгой, обеспечивает возможность их тонкого фракционирования и оценки молекулярной массы (сопоставлением с маркерами). Рассмотрим различные варианты электрофореза в денатурирующих гелях и их использование [1].

Вместо буфера в ПААГ и гелях агарозы можно использовать разбавленные водные растворы щелочи (0,02-0,03 М NaOH). Полимеризация акриламида в щелочной среде идет вполне успешно, но требует примерно трехкратного увеличения концентрации персульфата аммония и соответственно ТЕМЕД. На застывании раствора агарозы присутствие щелочи не сказывается. В щелочной среде благодаря электростатическому отталкиванию остатков фосфорной кислоты однонитевые ДНК и РНК не свертываются в клубки, а мигрируют в виде расправленных нитей. Жесткость таких нитей тем больше, чем они короче, подобно тому как это имеет место и для двунитевых молекул. При этом и скорость миграции однонитевых молекул оказывается приблизительно такой же, как у двунитевых, нативных молекул той же длины.

В щелочную среду обязательно надо вносить достаточное количество ЭДТА (2-3 мМ) для того, чтобы связать все остаточные Mg 2+ . В противном случае ионы магния «сшивают» нити нуклеиновых кислот и они даже могут выпадать в осадок.

Если исходный раствор нуклеиновых кислот был сильно забуферен, его надо предварительно подтитровать щелочью. Бромфеноловый синий в щелочной среде постепенно обесцвечивается, поэтому его следует вносить в исходный препарат непосредственно перед началом электрофореза. Еще лучше в качестве лидирующего красителя в этом случае использовать бромфеноловый зеленый. Он устойчив к воздействию щелочи, а по электрофоретической подвижности сходен с бромфеноловым синим.

Как и для нативной ДНК, при выбранной пористости геля скорость миграции денатурированной ДНК в щелочной среде становится независимой от молекулярной массы, если она превышает определенное значение. Это происходит тем раньше, чем мельче поры геля и чем выше напряженность электрического поля.

Электрофорез в щелочной среде, помимо оценки молекулярной массы, позволяет обнаружить однонитевые разрывы в исходных двунитевых структурах ДНК. Но в сильнощелочных значениях pH остатки гуанина и тимина приобретают отрицательный заряд. Это надежно обеспечивает невозможность ренатурации ДНК, но может сказаться на соотношении электрофоретических подвижностей разных молекул ДНК или двух комплементарных нитей одной молекулы, особенно если размеры — этих молекул невелики и различия нуклеотидного состава не усредняются [1].

Формамид является весьма сильным денатурирующим агентом. Он полностью разрушает вторичную структуру полинуклеотидов. Электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в гелях с формамидом зависит только от молекулярной массы, что открывает возможность ее определения С помощью маркеров и для высокомолекулярной РНК.

Акриламид хорошо полимеризуется в формамиде, давая несколько более мягкие гели, так что 4% -ный ПААГ в формамиде имеет примерно такие же механические свойства, как 2,5% -ный водный ПААГ. Вместе с тем и подвижность РНК в гелях на основе формамида выше, ием в обычном ПААГ такой же концентрации

Денатурацию нуклеиновых кислот успешно обеспечивает и более низкая концентрация формамида. Например, показано, что 3% -ный денатурирующий гель (С = 11) для электрофореза РНК можно готовить на 65% -ном водном формамиде. Электропроводность обеспечивал 0,02 М Na-фосфатный буфер, pH 7 [4].

Формальдегид легко реагирует с аминогруппами нуклеиновых оснований, давая их метоксипроизводные (Рисунок 1):

Эта реакция успешно конкурирует с образованием водородных связей по этим же аминогруппам, в результате чего формальдегид является сильным денатурирующим агентом для нуклеиновых кислот. Разумеется, нити нуклеиновой кислоты после денатурации формальдегидом оказываются модифицированными, однако эта реакция обратима — выдерживанием в воде при 60° можно удалить формальдегид и восстановить нормальную структуру нитей нуклеиновой кислоты, что видно, например, по восстановлению их способности к гибридизации.

Большую опасность представляет возможность образования прочных метиленовых мостиков между основаниями. Однако при 3% -ной концентрации формальдегида в рабочем буфере и сравнительно небольшой загрузке геля (4-5 мкг на трубку) метиленовые мостики не образуются. В цитируемой работе ПААГ, полимеризованный в 0,02 М Na-фосфатном буфере (pH 7) с 3% формальдегида, использовали для определения молекулярных масс фрагментов ДНК. В таком геле имеет место линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы ДНК и расстоянием ее миграции при электрофорезе. Использованный в этой работе 3% -ный (1 М) раствор формальдегида вполне обеспечивает денатурацию нуклеиновых кислот, хотя в последнее время нередко используют и вдвое большую концентрацию.

Ввиду его высокой концентрации формальдегид должен быть очень чистым. Следует работать со свежеприготовленным раствором формальдегида, без следов помутнения. Нейтрализовать раствор до pH 7 можно NaOH. Для приготовления денатурирующего геля на основе агарозы формальдегид добавляют к расплавленному водному раствору агарозы при 60° вместе с буфером [4].

Для полноты картины отметим, что нуклеиновые кислоты перед электрофорезом можно денатурировать и обработкой глиоксалем. При этом нет необходимости вносить глиоксаль в гель и вообще создавать в нем денатурирующие условия, так как денатурация глиоксалем в обычных условиях необратима. Глиоксаль прочно присоединяется по двум атомам азота гуанина (Рисунок 2):

электрофорез белок нуклеиновая кислота

Денатурацию глиоксалем ведут в пластмассовых пробирках с крышками в 0,01 М растворе Na-фосфата (pH 7), содержащем 1 М глиоксаль в 50% -ном диметилсульфоксиде, при 50° в течение 1часа [4].

Так, в работе [Garel et al., 1977] двумерным электрофорезом разделяли до 40 индивидуальных тРНК из суммарного препарата. В первом направлении (пластина 20X40X0,15 см) фракционирование вели в 9,6% -ном ПААГ, полимеризованном в обычном 0,089 М Трис-боратном буфере (pH 8,2) с 7 М мочевиной. Разделение происходило по длине молекул, полностью утративших свою вторичную структуру. Гель второго направления полимеризовали в таком же буфере, но мочевину добавляли лишь до концентрации 4 М. По-видимому, вторичная структура тРНК при этом частично восстанавливалась — в различной степени для разных индивидуальных тРНК. Концентрацию ПААГ во втором направлении соответственно увеличивали до 20%.

Особенности применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Исследование методом ЯМР комплексов нуклеиновых кислот с протеинами и биологических мембран. Состав и структура полисахаридов.

курсовая работа [3,5 M], добавлен 26.08.2009

Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).

презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014

Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая — ДНК, рибонуклеиновая — РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.

реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014

Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.

презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014

История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.

контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012

Распад нуклеиновых кислот, гидролиз. Классификация нуклеаз по месту и специфичности действия. Экзодезоксирибонуклеазы, рестриктазы. гуанилрибонуклеазы. Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Образование 5-фосфорибозиламина, присоединение глицина.

презентация [8,7 M], добавлен 13.10.2013

История изучения нуклеиновых кислот как биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды, функции и значение в жизнедеятельности организма. Правила Чаргаффа. Первичная и вторичная структура ДНК. Особенности репликации у эукариот, ее разновидности.

презентация [533,6 K], добавлен 05.11.2014

Механизм действия и модификация антисмысловых олигонуклеотидов. Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени. Буферные растворы, использовавшиеся в работе. Электрофорез нуклеиновых кислот. Проведение полимеразной цепной реакции.

курсовая работа [1,3 M], добавлен 18.01.2013

Электрофорез как один из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии. Электрофорез белков в полиакриламидном и агарозном геле. Оборудование для проведения капиллярного электрофореза.

реферат [25,5 K], добавлен 31.08.2014

Клетка как элементарная единица строения и жизнедеятельности организмов. Молекулярная масса белков, методы ее определения. Классификация белков по степени сложности. Виды нуклеиновых кислот, их биологическая роль. Витамины в питании человека и животных.

контрольная работа [1,1 M], добавлен 17.10.2015

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

источник

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Биология — самая быстро развивающаяся наука во второй половине ХХ и ХХI веке. Связано это, в первую очередь, с появлением нового ее раздела — молекулярной биологии, подоплекой возникновения которой, в свою очередь, стало стремительное развитие физики, химии и физико-химических методов. Я расскажу о важнейших (на мой взгляд) методах молекулярной биологии, с помощью которых были сделаны многие открытия, известные не только в узких научных кругах, но и среди широкой публики. Они принесли множество Нобелевских премий как тем, кто их открыл, так и тем, кто их использовал. Многие из них применяются не только в биологии, но и в других областях: медицине, криминалистике, археологии.

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2011 в номинации «Лучшая обзорная статья».

Началом молекулярной биологии принято считать открытие структуры ДНК (рис. 1) в 1953 году Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком, за что они (совместно с Морисом Уилкинсом) в 1962 году получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине [1], [2]. Они выяснили, что молекула ДНК представляет из себя две противоположно направленные цепочки полинуклеотидов, закрученных вокруг общей оси в двойную спираль, причем друг напротив друга в спирали всегда стоят определенные азотистые основания: напротив гуанина (Г или G) — цитозин (Ц или C), а напротив аденина (А) — тимин (Т) (рис. 1). Это называют правилом комплементарости: цепи удерживаются вместе за счет водородных связей, возникающих между нуклеотидами. Водородная связь гораздо слабее ковалентной, с помощью которой нуклеотидные остатки соединяются между собой в одной цепи ДНК, формируя так называемый сахаро-фосфатный остов. Его так называют, поскольку в нем остатки сахара (дезоксирибозы) в нуклеотидах связаны друг с другом через остатки ортофосфорной кислоты — фосфаты. Концы обеих цепей не равноценны: по порядковому номеру атома углерода в остатке сахара один из них называют 3´, а другой — 5´. Синтез ДНК (как и РНК) в природе, как правило, идет от 5´ к 3´-концу.

Возможно, следовало бы начать отсчет с экспериментов Бидла, Татума, Ледерберга, но это дело вкуса. — Ред.

Рисунок 1. Схема строения двуцепочечной молекулы ДНК.

Однако ДНК не обязательно бывает двуцепочечной — иногда встречаются и одноцепочечные молекулы (например, в геномах некоторых вирусов). Это очень важно, поскольку, как будет рассказано ниже, двуцепочечные молекулы могут денатурировать на одноцепочечные, и, наоборот, одноцепочечные образовывать двуцепочечные.

Строение РНК аналогично (хотя обычно она состоит из одной цепи и часто образует комплементарные взаимодействия между участками одной молекулы), только вместо тимина в ее состав входит урацил, а вместо дезоксирибозы — рибоза. Подробнее обо всем этом написано в учебниках по молекулярной биологии [3].

Я кратко напомню так называемую центральную догму молекулярной биологии, в первоначальном виде сформулированную Фрэнсисом Криком [4]. В общем случае она гласит, что генетическая информация при реализации передается от нуклеиновых кислот к белку, но не наоборот. А точнее, возможно передача ДНК → ДНК (репликация), ДНК → РНК (транскрипция) и РНК → белок (трансляция). Так же существуют значительно реже реализуемые пути, свойственные некоторым вирусам: РНК → ДНК (обратная транскрипция) и РНК → РНК (репликация РНК). Также напомню, что белки состоят из аминокислотных остатков, последовательность которых закодирована в генетическом коде организма: три нуклеотида (их называют кодон, или триплет) кодируют одну аминокислоту, причем одну и ту же аминокислоту может кодировать несколько кодонов.

Во второй половине XX века получили развитие технологии рекомбинантной ДНК (то есть, методы манипуляции ДНК, позволяющие различными способами изменять последовательность и состав нуклеотидов в молекуле). Именно на их основе происходит развитие всех молекулярно-биологических методов и поныне, хотя они стали значительно сложнее, как идейно, так и технологически. Именно молекулярная биология вызвала такой бурный рост количества биологической информации за последние полвека.

Я расскажу о методах манипуляции и изучения ДНК и РНК, совсем немного коснусь белков, поскольку в основном методы, связанные с ними, ближе к биохимии, чем к молекулярной биологии (хотя грань между ними в последнее время стала очень расплывчатой).

Ферменты — белки, ускоряющие прохождение химических реакций. Они очень эффективны: ускорение может составлять несколько порядков! Например, фермент каталаза, расщепляющий перекись водорода, ускоряет реакцию примерно на 12 порядков, то есть в триллион раз! В то же время неорганический катализатор — мелкодисперсная платина — ускоряет эту же реакцию только на шесть порядков, или в миллион раз. Однако за это приходится платить очень строгими условиями работы большинства из них.

Рисунок 2. Сайты рестрикции. Сверху — целевая последовательность рестриктазы SmaI, при работе которой образуются «тупые» концы. Снизу — целевая последовательность рестриктазы EcoRI, при работе которой образуются «липкие» концы.

Одним из первых и важнейших из шагов молекулярной биологии стала возможность разрезать молекулы ДНК, причем в строго определенных местах [3]. Этот метод был изобретен при изучении в 1950—1970-е годы такого феномена: некоторые виды бактерий при добавлении в среду чужеродной ДНК разрушали ее, в то время, как их собственная ДНК оставалась невредимой. Оказалось, что они для этого используют ферменты, позднее названные рестрикционными нуклеазами или рестриктазами. Существует множество видов рестриктаз: к 2007-му году их было известно более 3000 [5]. Важным свойством каждого подобного фермента является его способность разрезать строго определенную — целевую — последовательность нуклеотидов ДНК (рис. 2). Рестриктазы не воздействуют на собственную ДНК клетки, поскольку нуклеотиды в целевых последовательностях модифицированы так, что рестриктаза не может с ними работать. (Правда, иногда, наоборот, они могут разрезать только модифицированные последовательности — для борьбы с теми, кто модифицирует ДНК, защищаясь от вышеописанных рестриктаз.) Из-за того, что целевые последовательности бывают различной длины, частота встречаемости их в молекулах ДНК варьирует: чем длиннее необходимый фрагмент, тем меньше вероятность его появления. Соответственно, образующиеся при обработке различными рестриктазами фрагменты ДНК будут иметь различную длину.

Новые эндонуклеазы продолжают открывать и по сей день. Многие из них до сих пор не клонированы, то есть, не известны гены, которые их кодируют, и в качестве «фермента» используют некую очищенную фракцию белков, обладающую нужной каталитической активностью. Новосибирская компания СибЭнзим долгое время успешно соревновалась с компанией New England Biolabs — признанным во всем мире лидером по поставке рестритаз (то есть предлагала такое же или большее различных рестриктаз, некоторые из которых весьма экзотичны). — Ред.

За выделение первой рестриктазы, изучение ее свойств и первое применение для картирования хромосом Вернер Арбер (Werner Arber), Дэн Натанс (Dan Nathans) и Гамильтон Смит (Hamilton Smith) в 1978 году получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Для создания новых молекул ДНК, разумеется, кроме разрезания, необходима еще и возможность сшивания двух цепей. Это делают с помощью ферментов, называемых ДНК-лигазами, которые сшивают сахаро-фосфатный остов двух цепей ДНК. Поскольку по химическому строению ДНК не отличается у разных организмов, можно сшивать ДНК из любых источников, и клетка не сможет отличить полученную молекулу от своей собственной ДНК.

Часто приходится иметь дело со смесью молекул ДНК разной длины. Например, при обработке химически выделенной из организма ДНК рестриктазами как раз получится смесь фрагментов ДНК, причем их длины будут различаться.

Поскольку любая молекула ДНК в водном растворе отрицательно заряжена, появляется возможность разделить смесь фрагментов ДНК различных размеров по их длине с помощью электрофореза [3], [6]. ДНК помещают в гель (обычно, агарозный для относительно длинных и сильно отличающихся молекул или полиакриламидный для электрофореза с высоким разрешением), который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к положительному электроду (аноду), причем их скорости будут зависеть от длины молекулы: чем она длиннее, тем сильнее ей мешает двигаться гель и, соответственно, тем ниже скорость. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины. С помощью маркеров (смесей фрагментов ДНК известных длин) можно установить длину молекул в образце (рис. 3).

Рисунок 3. Схема проведения электрофореза ДНК в агарозном геле.

Визуализовать результаты фореза можно двумя способами. Первый, наиболее часто используемый в последнее время — добавление в гель веществ, флуоресцирующих в присутствии ДНК (традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества). Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков (рис. 4). Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения (этот метод визуализации называют авторадиографией).

Рисунок 4. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете (слева). Вторая слева дорожка — маркер с известными длинами фрагментов. Справа — Установка для проведения электрофореза в геле.

Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем (обычно полиакриламидным). Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте ниже в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру.

С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них. С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Гибридизация ДНК основана на образовании водородных связей между двумя цепями ДНК, приводящем к их соединению [3], [7].

Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10–1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть.

Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего (Edwin Southern). Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК. Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке (рис. 5).

Рисунок 5. Схема проведения Саузерн-блоттинга.

Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом (northern blotting: southern по-английски означает «южный», а northern — «северный»). В этом случае проводят электрофорез в геле с молекулами мРНК, а в качестве зонда выбирают одноцепочечную молекулу ДНК или РНК.

Мы уже знаем, каким образом можно разрезать геном на части (а их сшивать с произвольными молекулами ДНК), разделять полученные фрагменты по длине и с помощью гибридизации выбрать необходимый. Теперь настало время узнать, как, скомбинировав эти методы, мы можем клонировать участок генома (например, определенный ген). В геноме любой ген занимает крайне маленькую длину (по сравнению со всей ДНК клетки). Клонирование ДНК буквально означает создание большого числа копий определенного ее фрагмента. Именно за счет этой амплификации мы получаем возможность выделить участок ДНК и получить его в достаточном для изучения количестве.

Каким образом разделить фрагменты ДНК по длине и идентифицировать нужный — было рассказано выше. Теперь надо понять, каким образом можно копировать необходимый нам фрагмент. Существует два основных метода: использование быстро делящихся организмов (обычно бактерий Escherichia coli — кишечной палочки — или дрожжей Saccharomyces serevisiae) или проделать аналогичный процесс, но in vitro с помощью полимеразной цепной реакции.

Поскольку при каждом клеточном делении бактерии (как и любые другие клетки, не считая предшественников половых клеток) удваивают свою ДНК, это можно использовать для умножения количества необходимой нам ДНК [3]. Для того, чтобы внедрить наш фрагмент ДНК в бактерию, необходимо «вшить» его в специальный вектор, в качестве которого обычно используют бактериальную плазмиду (небольшую — относительно бактериальной хромосомы — кольцевую молекулу ДНК, реплицирующуюся отдельно от хромосомы). У бактерий «дикого типа» часто встречаются подобные структуры: они часто переносятся «горизонтально» между разными штаммами или даже видами бактерий. Чаще всего в них содержатся гены устойчивости к антибиотикам (именно из-за этого свойства их и открыли) или бактериофагам, а также гены, позволяющие клетке использовать более разнообразный субстрат. (Иногда же они «эгоистичны» и не несут никаких функций.) Именно такие плазмиды обычно и используют в молекулярно-генетических исследованиях. В плазмидах обязательно содержится точка начала репликации (последовательность, с которой начинается репликация молекулы), целевая последовательность рестриктазы и ген, позволяющий отобрать те клетки, которые обладают этой плазмидой (обычно, это гены устойчивости к какому-нибудь антибиотику). В некоторых случаях (например, при изучении очень больших фрагментов ДНК) используют не плазмиду, а искусственную бактериальную хромосому.

В плазмиду с помощью рестриктаз и лигаз встраивают необходимый фрагмент ДНК, после чего добавляют ее в культуру бактерий при специальных условиях, обеспечивающих трансформацию — процесс активного захвата бактерией ДНК из внешней среды (рис. 6). После этого проводят отбор бактерий, трансформация которых прошла успешно, добавляя соответствующий гену в плазмиде антибиотик: в живых остаются только клетки, несущие ген устойчивости (а, следовательно, и плазмиду). Далее, после роста культуры клеток, из нее выделяют плазмиды, а из них с помощью рестриктаз выделяют «наш» фрагмент ДНК (или использую плазмиду целиком). Если же ген вставили в плазмиду для того, чтобы получить его белковый продукт, необходимо обеспечить культуре условия для роста, а потом просто выделить требуемый белок.

Рисунок 6. Схема клонирования участка ДНК (гена) в бактериях.

На этом месте сразу же должен возникать вопрос: как же все это возможно было использовать до того, когда были расшифрованы геномы, да и чтение последовательности ДНК было еще дорогим и малораспространенным? Положим, с помощью рестрикции и клонирования полученных фрагментов мы получим библиотеку ДНК, то есть набор бактерий, несущих различные плазмиды, содержащие суммарно весь геном (или заметную его часть). Но каким образом мы сможем понять, в каком из фрагментов содержится необходимый ген? Для этого использовали метод гибридизации. Сначала необходимо было выделить белок нужного гена. После чего отсеквенировать его фрагмент, обратить генетический код и получить последовательность нуклеотидов (конечно, из-за вырожденности генетического кода приходилось пробовать много различных вариантов). В соответствии с ней химически синтезировали короткую молекулу ДНК, которую и использовали в качестве зонда для гибридизации.

Но в некоторых случаях этот метод давал сбои — например, так произошло с фактором свертывания крови VIII. Этот белок участвует в свертывании крови , и нарушения в его функциональности являются причиной одного из самых распространенных генетических заболеваний — гемофилии А. Раньше для лечения приходилось выделять этот белок из большого числа организмов, потому что не удавалось клонировать его для производства бактериями. Связано это было с тем, что его длина составляет около 180000 пар нуклеотидов, и он содержит много интронов (некодирующих фрагментов между кодирующими) — неудивительно, что ни в одну плазмиду этот ген не попал целиком.

Полимеразная цепная реакция — молекулярно-биологический метод, позволяющий добиться колоссального (до 10 12 раз) увеличения числа копий определенного фрагмента ДНК in vitro [3], [9]. Она была изобретена Кэри Муллисом (Kary Mullis) в 1983 году, за что в 1993 году он получил Нобелевскую премию по химии (совместно с М. Смитом). (См. также: «Кари Маллис, изобретатель ПЦР» [10].)

Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. При этом происходит копирование только того участка ДНК, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от репликации ДНК в клетках живых организмов, с помощью ПЦР амплифицируют сравнительно короткие участки ДНК (обычно, не более 3000 пар нуклеотидов, однако есть методы позволяющие «поднимать» до 20 тысяч пар нуклеотидов — так называемый Long Range PCR).

Фактически, ПЦР является искусственной многократной репликацией фрагмента ДНК (рис. 7). ДНК-полимеразы так устроены, что не могут синтезировать новую ДНК, просто имея в наличии матрицу и мономеры. Для этого необходима еще и затравка (праймер), с которого они начинают синтез. Праймер — это короткий одноцепочечный фрагмент нуклеиновой кислоты, комплементарный ДНК-матрице. При репликации в клетке такие праймеры синтезируются специальным ферментом праймазой и являются молекулами РНК, которые позже заменяются на ДНК. Однако в ПЦР используют искусственно синтезированные молекулы ДНК, поскольку в этом случае не нужна стадия удаления РНК и синтеза на их месте ДНК. В ПЦР праймеры ограничивают амплифицируемый участок с обеих сторон.

Рисунок 7. Репликация ДНК — важнейший для живых организмов процесс, основа множества молекулярно-биологических методов. Поскольку каждая из цепей ДНК содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную другой цепи (их информационное содержание одинаково), при удвоении ДНК цепи расходятся, а затем каждая цепь служит матрицей, на которой выстраивается комплементарная ей новая цепь ДНК. В результате образуются два дуплекса ДНК, каждый из которых является точной (без учета ошибок синтеза) копией первоначальной молекулы.

Итак, пора объяснить, как же ПЦР работает. Изначально в реакционной смеси находятся: ДНК-матрица, праймеры, ДНК-полимераза, свободные нуклеозиды (будущие «буквы» в новосинтезированной ДНК), а также некоторые другие вещества, улучшающие работу полимеразы (их добавляют в специальные буферы, используемые в реакции).

Чтобы синтезировать ДНК, комплементарную матрице, необходимо, чтобы один из праймеров образовал с ней водородные связи (как говорят, «отжегся» на ней). Но ведь матрица уже образует их со второй цепью! Значит, сначала необходимо расплавить ДНК, — то есть разрушить водородные связи. Делают это с помощью простого нагревания (до ≈95 °С) — стадия, называемая денатурацией. Но теперь и праймеры из-за высокой температуры не могут отжечься на матрице! Тогда температуру понижают (50–65 °С), праймеры отжигаются, после чего температуру немного поднимают (до оптимума работы полимеразы, обычно, около 72 °С). И тогда полимераза начинает синтезировать комплементарные матрице цепи ДНК — это называют элонгацией (рис . 8). После одного такого цикла количество копий необходимых фрагментов удвоилось. Однако ничто не мешает повторить это еще раз. И не один, а несколько десятков раз! И с каждым повтором количество копий нашего фрагмента ДНК будет удваиваться, ведь новосинтезированные молекулы тоже будут служить матрицами (рис. 9)! (На самом деле эффективность ПЦР редко настолько высока, что количество копий именно удваивается, но в идеале это так, да и реальные числа часто бывают близки к этому.)

Рисунок 8. Схема ПЦР.

Рисунок 9. С каждым циклом ПЦР количество целевой ДНК удваивается.

Увидеть результаты ПЦР очень просто: достаточно провести электрофорез реакционной смеси после ПЦР, и будет видна яркая полоса с полученными копиями.

Раньше полимеразу, инактивирующуюся при нагревании с каждым циклом, приходилось все время добавлять, но вскоре было предложено использовать термостабильную полимеразу из термофильных бактерий, которая выдерживает такой нагрев, что сильно упростило проведение ПЦР (чаще всего используют Taq-полимеразу из бактерии Thermus aquaticus [11]).

Чтобы избежать сильного испарения воды из реакционной смеси, в нее добавляют масло, покрывающее ее сверху, и/или используют нагревающуюся крышку термоциклера — прибора, в котором проводят ПЦР. Он быстро меняет температуру пробирок, и их не приходится постоянно перекладывать из одного термостата в другой. Для предотвращения неспецифического синтеза еще до нагрева и собственно начала циклов, часто использую ПЦР с «горячим стартом»: вся ДНК и полимераза разделяются между собой парафиновой прослойкой, которая плавится при высокой температуре и дает им взаимодействовать уже в правильных условиях. Иногда же используют модифицированные полимеразы, которые не работают при низкой температуре.

Можно еще много говорить о различных тонкостях ПЦР, но важнее всего сказать об альтернативных классическому форезу методах определения результатов. Например, довольно очевидным вариантом является добавление в реакционную пробирку перед началом реакции веществ, флуоресцирующих в присутствии ДНК. Тогда, сравнив изначальную флуоресценцию с конечной, можно увидеть, синтезировалось ли значительное количество ДНК или нет. Но этот способ не специфичен: мы никак не сможем определить, синтезировался ли необходимый фрагмент, или это какие-то праймеры слиплись и достроились до непредсказуемых последовательностей.

Наиболее интересным вариантом является ПЦР «в реальном времени» («real-time PCR») . Существует несколько реализаций этого метода, но идея везде одна и та же: можно прямо в ходе реакции наблюдать за накоплением продуктов ПЦР (по флуоресценции). Соответственно, для проведения ПЦР «в реальном времени» нужен специальный прибор, способный возбуждать и считывать флуоресценцию в каждой пробирке. Самое простое решение — добавить в пробирку те же самые вещества, которые флуоресцируют в присутствии ДНК, однако минусы такого метода уже были описаны выше.

Строго это называется «ПЦР с регистрацией флуоресценции в режиме реального времени» или «количественная ПЦР». — Ред.

Рисунок 10. Схема работы ПЦР «в реальном времени»: Taq Man Assay.

Рисунок 11. Пример кривых накопления флуоресценции в ПЦР «в реальном времени»: зависимость интенсивности флуоресценции (в нескольких пробирках — на каждую своя кривая) от номера цикла.

Самой популярной реализацией такого подхода является метод выщепления флуорофора за счет разрушения зонда (TaqMan Assay; рис. 10). В этом случае в реакционной смеси должен присутствовать еще один компонент — специальный одноцепочечный ДНК-зонд: молекула ДНК, комплементарная последовательности амплифицируемого фрагмента, расположенной между праймерами. При этом к одному его концу должен быть химически приделан флуорофор (флуоресцирующая молекула), а к другому — гаситель (молекула, поглощающая энергию флуорофора и «гасящая» флуоресценцию). Когда такой зонд находится в растворе или комплементарно связан с целевой последовательностью, флуорофор и гаситель находятся относительно недалеко друг от друга, и флуоресценции не наблюдается. Однако за счет 3´-экзонуклеазной активности, которой обладает Taq-полимераза (то есть она расщепляет ДНК, на которую «натыкается» в ходе синтеза, и на ее месте синтезирует новую), зонд при синтезе второй цепи разрушается, флуорофор и гаситель за счет диффузии удаляются друг от друга, и появляется флуоресценция.

Поскольку число копий в ходе ПЦР растет экспоненциально, так же растет и флуоресценция. Однако это продолжается недолго, поскольку в какой-то момент эффективность реакции начинает падать из-за постепенной инактивации полимеразы, нехватки каких-то компонентов и т. п. (рис. 11). Анализируя графики роста флуоресценции, можно много понять о протекании ПЦР, но, самое важное, можно узнать, сколько ДНК-матриц было изначально: это так называемая количественная ПЦР (quantitative PCR, qPCR).

Все варианты применения ПЦР в науке невозможно перечислить. Выделение фрагмента ДНК, секвенирование, мутагенез. ПЦР — один из самых востребованных для ненаучных целей метод (видео 1). Он широко применяется в медицине для ранней диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, определения отцовства, в расследованиях для установления личности и для многого другого.

Видео 1. Восторг ученых по поводу изобретения ПЦР хорошо передает песня «Scientists for Better PCR» (хотя это и реклама фирмы BioRad, производящей, в том числе, оборудование и реагенты для ПЦР).

Все основные молекулярно-биологические процессы могут быть легко проведены in vitro (то есть, в пробирке). Пример приведен выше: ПЦР — это аналог репликации ДНК. Для этого достаточно просто смешать необходимые реагенты в подходящих условиях: для транскрипции нужны ДНК-матрица, РНК-полимераза и рибонуклеотиды, для трансляции — мРНК, субъединицы рибосом и аминокислоты, для обратной транскрипции — РНК-матрица, обратная транскриптаза ( она же ревертаза) и дезоксирибонуклеотиды. Эти методы широко применяются в различных областях биологии, когда необходимо, например, получить чистую РНК определенного гена. В этом случае нужно сначала провести обратную транскрипцию его (гена) мРНК, с помощью ПЦР амплифицировать ее, а затем с помощью in vitro-транскрипции получить много мРНК. Первая стадия необходима из-за того, что перед образованием зрелой мРНК в клетке проходит сплайсинг и процессинг РНК (у эукариот; у бактерий в этом смысле все проще) — подготовка к работе матрицей для синтеза белка. Иногда этого удается избежать, если вся кодирующая последовательность гена расположена в одном экзоне.

Можно сказать, важнейшие методы манипуляции с ДНК уже описаны. Следующий этап — определение собственно нуклеотидной последовательности цепи в молекуле — секвенирование. Определение нуклеотидной последовательности ДНК крайне важно для множества фундаментальных и прикладных задач. Особое место оно занимает в науке: для анализа результатов секвенирования геномов была, фактически, создана новая наука — биоинформатика. Секвенированием сейчас пользуются молекулярные биологи, генетики, биохимики, микробиологи, ботаники и зоологи, и, конечно же, эволюционисты: практически вся современная систематика основана на его результатах. Секвенирование широко применяется в медицине как метод поиска наследственных заболеваний и изучения инфекций. (См., например, «Уточнение „родословной“ членистоногих» и « Ск верный анекдот: негр, китаец и Крейг Вентер. ». — Ред.)

На самом деле хронологически методы изобретались совсем в другом порядке. Например, секвенирование по Сэнгеру было разработано в 1977 году, а ПЦР, как говорилось выше, только в 1983-м.

Существует множество различных методик секвенирования, но все методы можно разделить на две категории: «классические» и нового поколения. Сейчас используется фактически только один «классический» метод — секвенирование по Сэнгеру , или метод терминаторов. По сравнению с новыми методами, у него есть важное преимущество: длина прочтения, то есть количество нуклеотидов в последовательности, которое можно получить за один раз, у него выше — до 1000 нуклеотидов [12]. В то же время у самого «хорошего» в этом плане «нового» метода секвенирования — 454-, или пиросеквенирования [13] — этот параметр не превышает 500 нуклеотидов . Именно длина прочтения ограничивает возможности новых методов: оказывается крайне сложно «собрать» целый геном из фрагментов размером в несколько десятков нуклеотидов. Как минимум, для этого требуются суперкомпьютеры, а некоторые места в геноме разрешить оказывается просто невозможно, если они содержат высокоповторяющиеся последовательности. В таком случае может помочь сравнение полученных фрагментов с уже имеющимся целым геномом, но таким образом невозможно прочесть геном организма впервые (de novo). (См. также: «Код жизни: прочесть не значит понять». — Ред.)

Английский биохимик и корифей молекулярной биологии, дважды лауреат Нобелевской премии по химии: за определение аминокислотной последовательности инсулина (1955 г.) и за разработку метода секвенирования ДНК (1980 г.). — Ред.

Есть метод нового поколения, позволяющий читать несколько тысяч пн, но с большими ошибками (Pacific Biosciences). 454/Roche сегодня могут читать и больше 500 пн; то же самое уже может и молодое «полупроводниковое секвенирование». — Ред.

Оба упомянутых выше метода секвенирования уже достаточно подробно описаны на «биомолекуле» [13]: очень советую ознакомиться. Я же для примера расскажу про другой распространенный быстрый и дешевый метод (в расчете на один прочитанный нуклеотид) — метод, реализованный в секвенаторах Illumina (видео 2). Основной его недостаток — чтение фрагментов очень короткой длины, не больше 100 нуклеотидов, и вытекающая отсюда сложность прочтения геном «с нуля» [14].

В этом методе можно выделить три стадии: подготовку библиотеки фрагментов (1), создание кластеров (2) и собственно секвенирование (3).

Видео 2. В интернете есть несколько хороших видео, на которых описан процесс секвенирования Illumina, например на официальном сайте компании (вкладка Technology). Правда, они все на английском языке.

1. Сначала создается библиотека фрагментов ДНК из секвенируемого генома (или любого другого источника ДНК). ДНК с помощью ультразвука или специального фермента расщепляется на произвольные фрагменты длиной в несколько сотен нуклеотидов, из которых выбираются обладающие заданной длиной (выбирается экспериментатором). После этого к ним с двух концов ковалентно присоединяются различные адаптерные последовательности (рис. 12: 1);

Рисунок 12. Подготовка к секвенированию Illumina.

Рисунок 13. Собственно секвенирование Illumina.

Было уже довольно много сказано про методы работы с нуклеиновыми кислотами и их изучения. Пришло время узнать, каким образом можно выяснить, как же клетка работает — в частности, попытаться определить функцию гена и белка, который он кодирует.

Для изучения функции белка очень важно научиться вносить в него мутации. Например, имея организм с неработающим ферментом, можно по биохимическим отличиям понять, что делает нормальный белок. Существуют разные способы создать полностью неработающий ген (как произвольный из всего генома, так и совершенно конкретный — тогда это называется нокаутом этого гена). Один из таких способов — вставка какого-то фрагмента ДНК в геном: если эта вставка придется на ген, то он (точнее, скорее всего, белок, который он кодирует) перестанет нормально функционировать.

Однако существуют способы очень точного изменения последовательности гена и, соответственно, белка. Про один из таких методов — сайт-специфичный мутагенез — я и расскажу. Суть его заключается в изменении конкретного (обычно одного) нуклеотида в последовательности. Для его использования сначала необходимо клонировать этот ген в плазмиде. После этого нужно провести как бы ПЦР с одним праймером. Причем этот праймер должен как раз включать в себя последовательность, которую мы хотим изменить — уже в нужном нам виде. Например, на рис. 14 вместо буквы А, которая должна была бы стоять напротив Т в родительской цепи, в праймере стоит Ц. После синтеза второй цепи ДНК плазмиды, содержащей праймер, в нее будет внесена мутация — А заменится на Ц. Такие плазмиды вводятся в клетки, в которых при делении две цепи окажутся в разных дочерних клетках. Таким образом, в половине клеток-потомков будет изначальный вариант плазмиды, а в половине — мутантный. Тогда, соответственно, половина клеток будет производить нормальный белок, кодируемый этим геном, а половина — мутантный. В случае, изображенном на рис. 14, в нем вместо одной аминокислоты (аспарагина) будет стоять другая (аланин). По аналогии можно вносить случайные мутации с помощью специальной ДНК-полимеразы, вносящей повышенное число ошибок.

Рисунок 14. Схема проведения сайт-специфичного мутагенеза.

Bruce Alberts et al. Molecular biology of the cell. 5 th edition.

РНК-интерференция — недавно (менее 20 лет назад) открытый феномен подавления экспрессии генов в присутствии определенных коротких фрагментов РНК. За открытие и изучение этого явления Эндрю Файер (Andrew Fire) и Крейг Мелло (Craig Mello) получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2006 году. Биомолекула уже достаточно писала про РНК-интерференцию: «Обо всех РНК на свете, больших и малых» [15], я же расскажу о так называемой системной РНК-интерференции у «модельной» нематоды C. elegans, — то есть, об отключении гена во всех (почти) клетках этого червя.

Такой поразительный эффект достигается с помощью введения в клетку двуцепочечных молекул РНК (дцРНК), одна из цепей в каждой из которых комплементарна участку мРНК «выключаемого» гена. Это открывает поразительные возможности для изучения функций генов. Раньше для отключения генов приходилось создавать «нокаутных» животных (что ученые все равно вынуждены делать, например, с мышами — см. «Нобелевскую премию по физиологии и медицине вручили за технологию нокаутирования мышей». — Ред.), у которых изучаемый ген в принципе отсутствует в геноме. Однако создание нокаутов достаточно сложно, а обратно включить ген у таких организмов уже невозможно. С помощью РНК-интерференции отключить ген очень легко, — так же, как и включить, перестав водить в организм соответствующие дцРНК [16].

Существует три основных способа введения дцРНК в организм. Самый очевидный — впрыскивание в животное их раствора. Пользуются также «вымачиванием» нематод в растворе РНК. Однако оказалось, что можно делать все гораздо проще: скармливать нематодам эти молекулы! Причем особенно удобно то, что это так же замечательно работает, если нематод кормить бактериями (E. coli), синтезирующими эти дцРНК (рис. 15) [17].

Рисунок 15. Системная РНК-интерференция. Червь C. elegans экспрессирует зеленый флуоресцентный (светящийся) белок в клетках глотки (ph) и мышцах стенки тела (bm). Слева — изначальный внешний вид. Справа — при РНК-интерференции с помощью «подкормки» бактериями ген инактивируется.

В принципе то, что молекулы РНК из кишечника распространяются практически по всем тканям, довольно удивительно. Известно, что за попадание молекул РНК в клетки кишечника отвечает белковый канал s > .

К слову, использование РНК-интерференции именно на культуре клеток человека позволило выявить, что многие гены человека способствуют развитию вируса гриппа: «Молекулярное двурушничество: гены человека работают на вирус гриппа». — Ред.

При изучении функции гена очень важно узнать, когда и в каких тканях организма он работает (экспрессируется), а также вместе с какими другими генами. Если требуется узнать это про небольшое число генов и тканей, то можно это сделать очень просто: выделить РНК из ткани, провести обратную транскрипцию (то есть, синтезировать кДНК — комплементарную ДНК) и затем, провести количественную ПЦР. В зависимости от того, прошла ли ПЦР, мы узнаем, имеется ли мРНК исследуемого гена в ткани.

Однако если необходимо проделать то же самое для множества тканей и многих генов, то эта методика становится очень долгой и затратной. В таком случае используют ДНК-микрочипы [3]. Это небольшие пластинки, на которые нанесены и прикреплены молекулы ДНК, комплементарные РНК изучаемых генов, причем заранее известно, где на них (пластинках) какая молекула расположена. Одним из способов создания чипа является синтез молекул ДНК прямо на нем с помощью робота.

Чтобы изучать экспрессию генов с помощью чипов, необходимо также синтезировать их кДНК и пометить ее флуоресцентным красителем (не разделяя кДНК разных генов). Такую смесь наносят на микрочип, добиваясь, чтобы кДНК гибридизовалась с молекулами ДНК на чипе. После этого смотрят, где наблюдается флуоресценция и сравнивают это с расположением молекул ДНК на чипе. Если место флуоресценции совпадает с положением молекулы ДНК, то в данной ткани этот ген экспрессирован. Кроме того, пометив кДНК из разных тканей разными красителями, можно изучать экспрессию сразу нескольких (обычно все-таки не больше 2) тканей на одном чипе: по цвету флуоресценции можно определить, в какой из тканей он экспрессирован (если сразу в нескольких — получится смешанный цвет) (рис. 16).

Рисунок 16. Флуоресценция на ДНК-микрочипе после обработки раствором кДНК. Всего тут примерно 37500 прикрепленных молекул ДНК.

Однако в последнее время все чаще вместо чипов используют массовое секвенирование всей кДНК из ткани (создание так называемых транскриптомов), что сильно упростилось из-за развития методов секвенирования. Это оказывается дешевле и эффективнее, поскольку знание полных последовательностей всех мРНК дает больше информации, чем просто сам факт их наличия или отсутствия.

Мы рассмотрели основные методы молекулярной биологии. Надеюсь, что вам стало немного понятнее, каким образом делаются молекулярно-биологические исследования, за что дают Нобелевские премии, и как они могут помочь в некоторых прикладных задачах. Но, более всего, я надеюсь, что вы тоже увидели красоту идей, лежащих в их основе, и, возможно, вам захотелось узнать о каких-то из этих методик подробнее.

источник