Электрокинетические явления
Влияние природы дисперсионной среды
Влияние рН среды
Введение в золь ионов Н + и ОН — может сильно сказываться на величине z-потенциала, так как эти ионы обладают высокой сорбционной способностью: первые – благодаря малому радиусу, что позволяет им близко подходить к поверхности твердой фазы, вторые – из-за большого дипольного момента (большой поляризуемости).
Дисперсионная среда обычно характеризуется двумя величинами: диэлектрической проницаемостью e и вязкостью m.
z-потенциал частиц золя тем больше, чем больше e (полярность растворителя).
Чем больше вязкость, тем толще слой дисперсионной среды, который прилипает к частице при разрыве мицеллы и, следовательно, тем меньше численное значение z-потенциала.
Электрокинетические явления – это явления, которые возникают при воздействии электрического поля на дисперсную систему (электрофорез, электроосмос), а также в результате перемещения частиц дисперсной фазы или дисперсионной среды (потенциал протекания, потенциал оседания).
Несмотря на различие электрокинетических явлений, все они связаны с наличием ДЭС на частицах дисперсной фазы. Интенсивность всех электрокинетических явлений определяется значением z-потенциала.
Электрофорез – направленное движение частиц дисперсной фазы относительно дисперсионной среды под действием внешнего электрического поля.
При наложении внешнего электрического поля происходит разрыв мицеллы: частицы дисперсной фазы вместе с адсорбированными на них потенциалопределяющими ионами и противоионами адсорбционного слоя перемещаются к электроду, знак которого противоположен знаку заряда коллоидной частицы (z-потенциалу), а противоионы диффузионного слоя – к другому электроду. Например, если дисперсная фаза заряжена отрицательно, коллоидные частицы движутся к аноду (положительному электроду), а положительно заряженные противоионы диффузного слоя – к катоду (рис. 32).
Если дисперсная фаза заряжена положительно, направление движения частиц меняется на противоположное.
|
Скорость движения, или электрофоретическая скорость, зависит от величины электрокинетического потенциала z, напряженности электрического поля E/L и свойств сплошной среды – динамической вязкости μ и диэлектрической проницаемости e:
,
где u – электрофоретическая скорость; z – электрокинетический потенциал; e – диэлектрическая проницаемость среды; e – электрическая постоянная, e = 8,85×10 -12 Кл/(В×м); Е – разность потенциалов внешнего электрического поля; L – расстояние между электродами; E/L=H –напряженность, или градиент, внешнего электрического поля; m – динамическая вязкость сплошной среды; y – фактор формы.
Коэффициент y учитывает форму частиц и их ориентацию в электрическом поле. Для шарообразных частиц коэффициент y равен 0,66, а для цилиндрических, ориентированных вдоль силовых линий электрического поля – 1.
Скорость движения в расчете на единицу напряженности электрического поля Н называется электрофоретической подвижностью
.
Электрофоретическая подвижность зависит только от свойств дисперсной фазы и дисперсионной среды.
На подвижность коллоидной частицы оказывают влияние электрофоретический и релаксационный эффекты.
Электрофоретический эффект (эффект торможения): под действием внешнего электрического поля противоионы передвигаются в направлении, противоположном движению частицы. За счет гидратации противоионы увлекают за собой и окружающую их жидкость (дисперсионную среду). Это приводит к тому, что частица перемещаются в направлении, противоположном движению жидкости, скорость ее уменьшается.
Релаксационный эффект вызывается нарушением симметрии ДЭС вокруг частицы при ее движении. ДЭС деформируется и отстает от частицы. В результате возникает добавочное электрическое поле, которое действует на частицу, стремясь двигать ее в обратном направлении, и тем самым влияет на скорость электрофореза.
Для учета влияния этих факторов в уравнение для расчета электрофоретической скорости и вводится коэффициент y.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Сдача сессии и защита диплома — страшная бессонница, которая потом кажется страшным сном. 8774 — 
| 7145 — 
или читать все.
195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
электрофоре́з (от электричество и греч. Phóorēsis несение, перенесение), передвижение заряженных частиц под действием внешнего электрического поля к электроду, знак которого противоположен заряду частиц; метод анализа и препаративного разделения аминокислот, пептидов, белков, нуклеотидов, нуклеиновых кислот и других веществ. Для Э. необходимы источник постоянного тока и камеры с электродами. Различают фронтальный, или свободный, и зональный Э. Фронтальный Э. проводят в буферных растворах. Метод требует больших количеств веществ, сложной регистрирующей аппаратуры, трудоёмок. Зональный Э. проводят на инертных носителях (на бумаге; в крахмальном, агаровом, агарозном и полиакриламидном гелях). С помощью Э. на бумаге разделяют сложные смеси органических веществ белков, гликопротеидов и липопротеидов плазмы или сыворотки крови, спинномозговой жидкости, экссудатов, транссудатов, жидкого гноя, синовиальной жидкости, мочи, экстрактов печени, мышц и других тканей животных, а также аминокислот, гидролизатов белков и азотсодержащих витаминов и других веществ. При Э. в полиакриламидном геле (диск-Э.) разделение частиц сочетается с эффектами концентрирования и молекулярного сита. Этот метод используют при исследовании белков, гликопротеидов и липопротеидрв сывороток крови и лимфы, при изучении фармакодинамики лекарств, веществ и др. Э. в крахмальном геле применяют при изучении изоферментов, полиморфизма сывороточных белков. Современными, с высокой разрешающей способностью методами Э. являются изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез. В основе электрофокусирования лежит способность коллоидных частиц изменять заряд в зависимости от pH среды. При изотахофорезе разделение смесей осуществляется с использованием прерывистой буферной системы на основе различий электрофоретической подвижности разделяющихся ионов. См. также Иммуноэлектрофорез.
Электрофорез лекарственный (гальваноионотерапия) электролечебная процедура, в процессе которой в ткани организма через неповрежденную кожу или слизистую оболочку вводят лекарств, вещества с помощью постоянного тока. Метод основан на перемещении ионов и ионизированных молекул растворов лекарственных веществ под действием постоянного тока и проникновении их в ткани на месте наложения электродов. При этом методе на ткани организма воздействует также постоянный ток. Действие лекарственных веществ при Э. л. обусловлено созданием их значительной концентрации непосредственно в патологическом очаге. Для Э. л. используют аппарат для гальванизации с его электродами и гидрофильными прокладками, но одну из гидрофильных прокладок пропитывают раствором вводимого лекарственного вещества. Эту прокладку надевают на электрод, имеющий одноимённый заряд с вводимым ионом лекарственные вещества. Так, ионы иода вводят из раствора йодистого калия, которым смачивают гидрофильную прокладку отрицательного электрода (К+, I-). Ионы кальция, наоборот, вводят с гидрофильной прокладки положит, полюса (Са+, Cl-). Для соблюдения правильной полюсности, особенно при введении веществ со сложной молекулой, пользуются специальными таблицами, в которых указаны полярность вводимого иона и концентрация раствора. В зависимости от характера болезни путём Э. л. вводят различные вещества новокаин (при болезнях периферической нервной системы), салициловые препараты при ревматизме), антибиотики, сульфаниламиды (при хронических воспалительных процессах).
Литература:
Кармолиев Р. Х., Современные биохимические методы исследования в ветеринарии и зоотехнии, М., 1971. См. также лит. при ст. Физиотерапия.
Ветеринарный энциклопедический словарь. — М.: «Советская Энциклопедия» . Главный редактор В.П. Шишков . 1981 .
электрофорез — электрофорез … Орфографический словарь-справочник
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ — ЭЛЕКТРОФОРЕЗ, движение электрически заряженных коллоидных частиц через ТЕКУЧУЮ СРЕДУ с одного ЭЛЕКТРОДА на другой при подаче напряжения на электроды. Это явление используют при исследовании и разделении коллоидных суспензий, особенно белковых; в… … Научно-технический энциклопедический словарь
электрофорез — ионофорез, ионтофорез, электрофорезис, ионогальванизация, катафорез Словарь русских синонимов. электрофорез сущ., кол во синонимов: 6 • ионогальванизация (1) … Словарь синонимов
электрофорез — – явление движения заряженных частичек дисперсной фазы относительно частиц дисперсионной среды под действием электрического поля. Общая химия : учебник / А. В. Жолнин [1] Электрофорез – направленное движение заряженных частиц коллоидных систем в… … Химические термины
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ — лекарственный (гальваноионотерапия) лечебный метод воздействия на организм постоянным током и лекарственными веществами, вводимыми при его помощи через кожу или слизистые оболочки. Сочетание электрофореза с индуктотермией называется… … Большой Энциклопедический словарь
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ — (от электро. и греч. phoresis несение перенесение) (катафорез), движение частиц, находящихся во взвешенном состоянии в жидкой или газообразной среде, под действием внешнего электрического поля. Одно из электрокинетических явлений, на котором… … Большой Энциклопедический словарь
электрофорез — перемещение заряженных коллоидных частиц, вызываемое действием внешнего электрического поля. В белковой химии метод Э. широко используется для разделения белков с использованием полиакрил–амида в качестве носителя. (Источник: «Микробиология:… … Словарь микробиологии
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ — перемещение частиц дисперсной фазы (суспензии, эмульсии, золи) в дисперсионной среде под действием внешнего электрического поля. Применяется для технического обогащения глин (обычно каолинов), а также для быстрого выделения нескольких или… … Геологическая энциклопедия
электрофорез — — [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN electrophoresis … Справочник технического переводчика
Электрофорез — – бет. перенос микродисперсных твердых частиц, находящихся в жидкой фазе во взвешенном состоянии, от одного электрода к другому при пропускании через бетонную смесь постоянного электрического тока. [Терминологический словарь по бетону и… … Энциклопедия терминов, определений и пояснений строительных материалов
Электрофорез — * электрафарэз * electrophoresis 1. Движение заряженных молекул в растворе, через который пропускается электрический ток. 2. Метод разделения заряженных биологических макромолекул (белков, нуклеиновых кислот и т. д.) в электрическом поле,… … Генетика. Энциклопедический словарь
источник
Электрофорез — направленное перемещение частиц дисперсной фазы под действием приложенной разности потенциалов. Это явление наблюдается в седиментационно устойчивых дисперсных системах. При наложении на такую систему внешней разности потенциалов происходит разрыв ДЭС по плоскости скольжения, в результате чего частица получает заряд и перемещается к соответствующему электроду.
Приведенные выше уравнения Гельмгольца — Смолуховского справедливы для электрофореза, в частности для электрокинетического потенциала используется уравнение (4.9). Отличие состоит только в системе координат: в одном случае рассматривается скорость жидкости, в другом — скорость движения частиц, которую обычно определяют по смещению цветной границы.
Электрофорез наблюдают в U-образном сосуде (см. лабораторный практикум). В нижнюю часть сосуда наливают золь, сверху — контактную (боковую) жидкость, имеющую одинаковую (или немного большую) с золем электрическую проводимость. Наблюдают за изменением уровня золя в обоих коленах трубки и по скорости перемещения частиц дисперсной фазы определяют линейную скорость электрофореза Wq :
где S — путь, пройденный золем за время г (время электрофореза).
При электрофорезе отношение линейной скорости к напряженности
электрического поля 
называют электрофоретической подвижностью:
Напряженность электрического поля Е зависит от приложенной разности потенциалов на электродах U и расстояния между ними L:
Рассмотренные уравнения справедливы при допущениях: 1) частицы движутся в однородном электрическом поле; 2) частицы могут иметь любую форму и не проводят электрический ток; 3) толщина ДЭС много меньше размеров частиц золя.
Для расчета ^-потенциала частиц, находящихся в разбавленных водных растворах при 293 К, можно использовать простое соотношение:
в котором электрофоретическая подвижность и, выражена в(тогда
^-потенциал будет иметь размерность В). 
Несовпадение экспериментальных и теоретических значений объясняется релаксационным эффектом и электрофоретическим торможением.
Релаксационный эффект проявляется в нарушении симметрии диффузионного слоя вокруг частицы при относительном перемещении фаз в противоположные стороны.
Электрофоретическое торможение обусловлено сопротивлением движению частицы обратным потоком противоионов, которые увлекают за собой жидкость. В некоторых случаях несовпадение можно учесть введением поправок, иногда этим несовпадением можно пренебречь.
Скорость электрофореза зависит нс только от приложенного напряжения, но и от радиуса частиц и других факторов. Это можно учесть введением в уравнение (4.8) поправочного коэффициента к:
Поправочный коэффициент определяется экспериментально в каждом отдельном случае электрофореза.
Для примера рассмотрим данные по электрофорезу в суспензиях глин Трошковского, Никольского и Слюдянского месторождений, микрофотографии которых приведены на рис. 1.1.
Электрокинетический потенциал определяли методом подвижной границы при электрофорезе и рассчитывали по уравнению:
где S — путь; 
L — расстояние между электродами;
U — разность потенциалов между электродами;
г — преимущественный радиус частицы, определяемый обычно по максимуму на кривой распределения частиц но размерам;
/(к г) — поправочная функция, учитывающая эффекты электрофоретического торможения и релаксации (табл. 4.1);
к — параметр Дебая, равный обратной величине плотной части двойного электрического слоя, то есть к = 1/6.
источник
Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Электрофорез белков в агарозном геле
Электрофорез (от электро- и греч. переносить) — это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.
С помощью электрофореза удаётся покрывать мелкими частицами поверхность, обеспечивая глубокое проникновение в углубления и поры. Различают две разновидности электрофореза: катафорез — когда обрабатываемая поверхность имеет отрицательный электрический заряд (то есть подключена к отрицательному контакту источника тока) и анафорез — когда заряд поверхности положительный.
Электрофорез применяют в физиотерапии, для окраски автомобилей, в химической промышленности, для осаждения дымов и туманов, для изучения состава растворов и др. Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии.
Лечебное вещество наносится на прокладки электродов и под действием электрического поля проникает в организм через кожные покровы (в терапии, неврологии, травматологии и др.) или слизистые оболочки (в стоматологии, ЛОР, гинекологии и др.) и влияет на физиологические и патологические процессы непосредственно в месте введения. Электрический ток также оказывает нервно-рефлекторное и гуморальное действие.
Преимущества лечебного электрофореза:
— введение малых, но достаточно эффективных доз действующего вещества;
— накопление вещества и создание депо, пролонгированность действия;
— введение в наиболее химически активной форме — в виде ионов;
— возможность создания высокой местной концентрации действующего вещества без насыщения им лимфы, крови и других сред организма;
— возможность введения вещества непосредственно в очаги воспаления, блокированные в результате нарушения локальной микроциркуляции;
— лечебное вещество не разрушается, как например, при введении per os;
— слабый электрический ток благоприятно влияет на реактивность и иммунобиологический статус тканей.
Противопоказания к проведению электрофореза: острые гнойные воспалительные заболевания, лихорадка, тяжелая форма бронхиальной астмы, дерматит или нарушение целостности кожи в местах наложения электродов, злокачественные новообразования. Учитываются противопоказания для лечебного вещества. Вещества, используемые при электрофорезе, по способу введения разделяются на:
— отрицательно заряженные, вводимые с отрицательного полюса — катода (бромиды, йодиды, никотиновая кислота и другие);
— положительно заряженные, вводимые с положительного полюса — анода (ионы металлов — магний, калия, кальция);
— вводимые как с анода, так и с катода.
Преимущество бишофита — в биполярном введении, так как эффект оказывают одновременно и положительно, и отрицательно заряженные ионы.
Электрофорез в научных исследованиях
В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул — белков и нуклеиновых кислот. Различают множество разновидностей этого метода. Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул на фракции или индивидуальные вещества и используется в биохимии, молекулярной биологии, клинической диагностике, популяционной биологии (для изучения генетической изменчивости) и др.
Изотахофорез (ИТФ) — метод разделения различных типов ионов по их подвижности в электрическом поле. При ИТФ все виды ионов мигрируют в одном направлении, образуя набор зон, находящихся в равновесном состоянии и перемещающимися с одинаковыми скоростями.
В основе метода ИТФ лежит система, состоящая из трех различных электролитов, объединенных общим противоионом:
— ведущий электролит, содержащий анионы с наиболее высокой электрофоретической подвижностью, располагается в анодной области;
— замыкающий электролит, содержащий анионы с минимальной подвижностью, располагается в катодной области;
— смесь электролитов анализируемой смеси, содержащая анионы с промежуточной подвижностью.
Если через эту систему пропустить электрический ток, то анионы расположатся последовательно в соответствии с их электрофоретической подвижностью, ведущий в области анода, замыкающий в области катода, остальные между ними в виде узких зон с четкими концентрационными границами. Ширина отдельных зон по завершении процесса соответствует абсолютному количеству в смеси того или иного аниона.
Поскольку отдельные зоны располагаются последовательно. они практически соприкасаются, поэтому в исследуемый образец вносят буфер, содержащий анион с промежуточной подвижностью, зона которого встроится в полученную последовательность и раздвинет зоны исследуемых анионов. Эти вспомогательные зоны называются спейсерами — разделителями, функции которых выполняют амфолиты-носители, используемые в методе ИЭФ. особенностью метода ИТФ является то, что процесс сопровождается концентрированием зон, эффект от которого приводит к разрешению, сравнимому и даже превосходящему разделение методом ИЭФ. Результаты разделения смесей методом ИТФ фиксируются на ленте самописца в виде графика измерения трех параметров:
— интегральная кривая тепловыделения: по этой кривой можно определить разницу температур между соседними зонами, что служит мерой градиента напряженности поля, то есть разницы электрофоретических подвижностью двух ионов
— дифференциальная кривая тепловыделения: длина отрезков этой кривой соответствуют ширине зоны вещества, а также служит мерой абсолютного количества вещества в пробе
— кривая поглощения в УФ-свете: длина отрезков этой кривой соответствует значению экстинкции вещества. Зная коэффициент молярной экстинкции вещества, можно определить абсолютное содержание вещества в пробе, а также вычислить его концентрацию в зоне.
Аналитический изотахофорез проводят в капиллярном приборе для изотахофореза, в тефлоновом капилляре с внутренним диаметром 0,5 мм.
Препаративный изотахофорез проводят в колонке с полиакриламидным гелем.
· Аналитическое разделение (мкг) пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов (частично изотопов) с высоким разрешением.
· Препаративное разделение белков (г).
· Накопление в виде узкой зоны следовых количеств веществ (мкг) из больших объемов пробы вследствие эффекта концентрирования.
· Определение электрофоретической подвижности.
электрофорез молекулярный биология капиллярный
Капиллярный электрофорез, известный также как капиллярный зональный электрофорез, используется для разделения ионов по заряду. В случае обычного электрофореза заряженные молекулы перемещаются в проводящей жидкости под действием электрического поля. В 1960х годах была предложена методика капиллярного электрофореза для разделения молекул по заряду и размеру в тонком капилляре, заполненном электролитом.
Для проведения капиллярного электрофореза требуется относительно простое оборудование.
Основные компоненты системы — флакон для нанесения образца, стартовый флакон, конечный флакон, капилляр, электроды, мощный источник питания, детектор и устройство обработки данных. Флакон для нанесения образца, стартовый и конечный флаконы заполнены электролитом, например, водным буферным раствором. Для нанесения образца конец капилляра опускают в флакон с образцом и затем перемещают в стартовый флакон. Перемещение анализируемых веществ осуществляется под действием электрического поля, которые прилагают между стартовым и конечным флаконами. Все ионы передвигаются по капилляру в одном направлении под действием электроосмотического тока. Анализируемые вещества разделяются по электрофоретической мобильности и детектируются около конца капилляра.
Детектирование разделившихся молекул при капиллярном электрофорезе может осуществляться различными устройствами. Наиболее распространенные приборы детектируют изменение поглощения излучения в ультрафиолетовой области или в области видимого света. Обычно в таких системах в качестве ячейки используют участок капилляра. Длина пути проходящего света при капиллярном электрофорезе составляет порядка 50 микрометров, что намного меньше, чем в случае обычных ультрафиолетовых ячеек, в которых длина пути света порядка 1 сантиметра.
В соответствии с законом Бугера -Ламберта-Бера, чувствительность детектора пропорциональна длине пути, по которому свет проходит через ячейку. Для увеличения чувствительности удлиняют путь, по которому проходит свет, однако при увеличении размеров ячейки снижается разрешение. Капиллярная трубка может быть расширена в месте детектирования, такую разновидность называют пузырьковой ячейкой. В другом варианте увеличение пути проходящего света достигается за счёт добавления дополнительного капилляра. Оба этих метода снижают эффективность разделения.
Для того, чтобы отличить сходные образцы, системы разделения капиллярным электрофорезом могут быть напрямую связаны с масс-спектрометрами. В большинстве таких систем конец капилляра помещают в прибор для электроаэрозольной ионизации. Ионизированные частицы далее анализируют масс-спектрометрией.
Электрофорез белков — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле.
Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются в различных областях:
· Электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды)
· Электрофорез с подвижной границей
· Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой
· Электрофорез на фильтровальной бумаге
· Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране
· Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды
· Электрофорез белков в ПААГ
· Электрофроез белков в крахмальном геле
· Электрофорез белков в агарозном геле
Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный (2D-) электрофорез, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков и электрофорез в присутствии детергента. Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез. В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.
Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли.
В 1970 году Лэммли для изучения процесса сборки капсида бактериофага Т4 предложил метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле в зависимости от молекулярной массы. Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд.
При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:
— белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
— количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
— собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.
В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы. Практика подтверждает верность данных предположений в подавляющем большинстве случаев.
Для проведения денатурирующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6,8 и концентрацию полиакриламида от 2 до 8 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8,5-9 и концентрацию полиакриламида от 5 до 20 %. Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6,8 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8,8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся (в переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью). Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода.
В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.
Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов.
Визуализация продуктов разделения
Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание белков в гелях красителем Кумасси или серебром. Для проведения вестерн блоттинга белки переносят из геля на нитроцеллюлозную мембрану.
В большинстве случаев результаты электрофоретического разделения достаточно получить путем визуальной оценки геля. Однако, с целью получения достоверных данных и надлежащего документирования результатов, гель сканируют на просвет при помощи высокочувствительного денситометра. По сути, денситометр является сканером, который относится к контрольно-измерительным приборам и подлежит поверке с целью определения и подтверждения соответствия характеристик средства измерения установленным требованиям. Подобные требования к денситометру позволяют надежно определять не только положение белков в геле, но и оптическую плотность белкового пятна. Оцифрованное изображение геля обрабатывают при помощи специализированного программного обеспечения, которое позволяет достоверно определить такие параметры как электрофоретическая подвижность белка, его чистота, количество белка в пятне и др. Определение молекулярной массы исследуемого белка предполагает необходимость калибровки геля по молекулярным массам. Калибруют гель относительно молекулярных масс белков-маркеров, которые разделяют параллельно с исследуемым образцом. Смеси маркерных белков доступны в различном интервале масс. Калибрование предполагает построения зависимости относительной электрофоретической подвижности (Rf) каждого из маркерных белков от десятичного логарифма их молекулярной массы. Обычно зависимость имеет вид сигмообразной кривой. Расчет молекулярной массы исследуемого белка осуществляют относительно его Rf, используя при этом метод регрессионного анализа. Достоверными результаты считаются, в случае если длина пробега белков-маркеров составляет не менее 80% длины разделяющего геля, а зависимость их Rf от логарифма молекулярной массы является линейной (R2 > 0,95). Т.е. для расчетов используют лишь тот участок калибровочной кривой, который покрывает электрофоретическую подвижность исследуемого белка.
Чувствительность метода SDS-PAGE по Лэммли обратно пропорциональна молекулярной массе белка. Например, в интервале 10-20 кДа удается разделить белки, отличающиеся всего на 0,1 кДа (разница всего в один аминокислотный остаток). Однако, для получения удовлетворительных результатов следует выполнить несколько простых методических рекомендаций. Так, в связи с тем, что высокая электропроводность исследуемых образцов способна значительно исказить электрофоретическую подвижность белка, их ионная сила должна быть по возможности минимальной и приблизительно равной. Еще одним важным условием надежности определения молекулярной массы является оптимальная нагрузка белка на гель. При окраске Coomassie Blue R250 оптимальное содержание белка в пятне должно находиться в пределах 0,1-1 мкг и как минимум на порядок меньше при окраске серебром. В противном случае белки в геле сформируют широкие пятна, что в свою очередь затруднит определение их электрофоретической подвижности. Несмотря на высокую чувствительность и несложность метода молекулярная масса белков, определенная с использованием SDS-PAGE, часто отличается от истинного значения. Разница может составлять от нескольких кДа для низкомолекулярных белков до десятков кДа для высокомолекулярных белков.
Для электрофореза белков в полиакриламидном геле в качестве буферных растворов используют: Трис-HCl, Трис-трицин, TBE, TBE с мочевиной, Bis-Tris.
Электрофорез в агарозном геле
Наиболее просты и удобны в использовании гели агарозы, которая представляет собой линейный полисахарид. Образование геля идёт путём связывания в пространственную сетку пучков нитей, за счёт образования водородных связей между ними. Благодаря механической прочности и достаточно большому размеру пор, агарозные гели нашли широкое применение при разделении крупных макромолекул, таких как ДНК. Варьируя концентрацию агарозы, можно менять средний размер пор в геле, и при концентрации агарозы в геле свыше 2% в нем становится возможным разделять не только НК, но и крупные белковые молекулы. Средний размер пор 2%-ного геля агарозы примерно соответствует размеру биополимера с массой 50 млн. дальтон. Использовать гели более высокой концентрации не целесообразно, т.к. при электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле за счёт трения. Поэтому обычно применяются гели с концентрацией 0.4 — 2%, а наиболее распространены форезы в гелях с концентрацией около 1 %.
Агароза растворяется в воде при нагревании в кипящей водяной бане. Растворять агарозу непосредственно на нагревателе следует при интенсивном помешивании, однако делать этого не рекомендуется, во избежание пригорания агарозы к перегретому дну сосуда. В качестве альтернативного способа, может использоваться нагрев раствора в микроволновой печи, что занимает всего несколько минут. В этом случае, однако, необходимо внимательно следить за тем, чтобы раствор не закипел, иначе он моментально «убежит». Рекомендуется нагревать раствор на малой или средней мощности, перемешивая каждые полминуты. После застывания гель можно плавить повторно, однако делать это нужно только на водяной бане или при аккуратном нагреве в микроволновой печи. Некоторые авторы рекомендуют при первом приготовлении геля выдерживать расплавленную агарозу на водяной бане или в термостате не менее двух часов, для получения истинного раствора полимера.
Процесс плавления/застывания агарозы обладает ярко выраженным гистерезисом. Плавление разных типов агарозы обычно происходит при температурах 85-95°, тогда как застывание наступает при температурах 38-40°. Во избежание значительных тепловых деформаций расплавленную агарозу заливают в форму охлаждённой до 50-55°. При проведении количественного анализа расплавленный гель перед заливкой можно выдерживать в термостате при температуре 50- 55° в течение двух часов. Это рекомендуется делать для того, чтобы после заливки в форму, гель застывал равномерно по всему объёму. Застывший гель чистой агарозы не вполне прозрачный и на вид немного опалесцирует. Со временем он несколько уплотняется, вытесняя из себя жидкость, по этой причине агарозные гели перед использованием рекомендуется выдерживать в буфере в течение 12 и более часов.
Миграция ДНК в агарозном геле.
Гели агарозы содержат отрицательно заряженные группы, преимущественно сульфатные, полное количество которых зависит от степени очистки агарозы. Вследствие этого, при электрофорезе положительно заряженных молекул может возникать их неспецифическое взаимодействие с волокнами геля, которое проявляться в виде растягивания зон, при обратимом связывании с отрицательными группами геля, или в виде задержки, если взаимодействие необратимое. Кроме того, присутствие отрицательно заряженных групп приводит к возникновению электроосмоса, который вызывает противоток жидкости внутри геля, что однако затрудняет расчёт их электрофоретической подвижности. По некоторым данным, при использовании различных типов агарозы дня разделения трёх форм плазмидной ДНК (суперспиральной, релаксированной кольцевой и линейной) наблюдаются сильные изменения скорости миграции молекул, и что ещё важнее, изменяется взаимное расположение полос, соответствующих разным формам ДНК, в геле. Для количественного описания величины электроосмоса в агарозных гелях используют коэффициент относительной миграции который равен отношению скоростей миграции незаряженного полимера (только за счёт электроосмоса) и аналогичного по структуре полианиона при электрофорезе в агарозном геле данного тина. Обычно выделяют три типа агарозы: с низкой, средней и высокой степенью электроосмоса.
Помимо учёта эффектов электроосмоса, важно также правильно подобрать размеры пор геля и напряжённость электрического поля, в зависимости от свойств исследуемого образца. Дня оптимального разделения ДНК в агарозном геле необходимо создать условия, при которых молекулы ДНК могут достаточно свободно мигрировать в геле, лишь изредка сталкиваясь с его волокнами. В этом случае подвижность линейных молекул ДНК оказывается обратно пропорциональной логарифму их молекулярной массы, а, следовательно, и размеру.
Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.
К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.
Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.
После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.
Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК, содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.
Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.
Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) — метод исследования антигенного состава биологических материалов, сочетающий электрофорез и иммунодиффузию. Впервые описан Грабаром и Уильямсом в 1953 году, в 1965 году метод был модифицирован Шейдеггером с целью минимизации.
Образец антигенного материала разделяют электрофорезом в геле (обычно агарозном), в результате чего формируются характерные зоны. Далее параллельно зонам электрофореза вносится преципитирующая антисыворотка, антигены и антисыворотка диффундируют навстречу друг к другу, и в месте встречи антисыворотки с антигеном появляются линии преципитации, имеющие форму дуги. После проведения иммунодиффузии и элюирования непреципитировавших молекул из геля гель окрашивают специальными красителями (например амидочёрным 10В, азокармином В и другими красителями, окрашивающими белки в случае белковых антигенов или суданом чёрным в случае липопротеиновых антигенов). Существует также ряд модификаций метода ИЭФ (при помощи чистого антигена, при помощи моноспецифической антисыворотки, метод ИЭФ по Оссерману, метод ИЭФ по Геремансу.
Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.
источник
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ — направленное перемещение электрически заряженных частиц дисперсной фазы в дисперсионной среде (или ионов в электропроводящем растворе) под действием внешнего электрического поля. Метод электрофореза широко используется в биологии и медицине для выделения и анализа индивидуальных белков (см.), нуклеиновых кислот (см.) и других биополимеров, вирусов, надмолекулярных клеточных структур, а также целых клеток. В иммунологии одним из наиболее употребляемых методов исследования является иммуноэлектрофорез (см.) — электрофоретическое разделение смеси антигенов или антител в геле с последующий их преципитацией. Путем микроэлектрофореза(см. Микроионофорез) в клетку можно ввести или к ней подвести любые вещества, способные диссоциировать на ионы (см.). Микроионофорез является одним из основных современных методов в нейрофизиологических, нейрофармакологических, нейрохимических исследованиях. Большое диагностическое значение имеют электрофоретическое разделение ферментов (см.) на коферменты (см.) и их количественная и качественная оценка. Введение лекарственных веществ в организм путем Э. широко применяется в физиотерапии (см.).
Электрофорез наряду с электроосмосом (см.) был открыт в 1807 году профессором Московского университета Рейссом. Электрокинетические явления (см.), к которым относят электрофорез, обусловлены наличием на границе раздела фаз двойного электрического слоя и способностью диффузной части этого слоя смещаться относительно адсорбционно связанной (неподвижной) его части. Электрический потенциал поверхности, разделяющей подвижную и неподвижную части двойного электрического слоя, носит название электрокинетического или ζ (дзета)-потенциала. Частицы дисперсной фазы, находящиеся в буферном растворе (см. Буферные растворы), несут определенный суммарный электрический заряд, величина и знак которого зависят от величины pH среды (см. Водородный показатель). Если через буферный раствор, заключенный в сосуд с электроизолирующими стенками, например, в стеклянную трубку, пропускать электрический ток, то результатом этого будет появление определенного градиента напряжения (см. Градиент), или электрического поля. Под действием этого поля частицы дисперсной фазы в соответствии со знаком суммарного заряда движутся в направлении катода, то есть происходит катафорез, или анода — анафорез. В зависимости от величины заряда и своих размеров частицы в электрическом поле приобретают разные скорости. Смесь разнородных частиц, внесенная в узкую зону, в этих условиях разделяется на зоны, образуемые частицами, движущимися с одинаковой скоростью, то есть обладающими одинаковой электрофоретической подвижностью.
Электрофоретическая подвижность частиц, имеющих сферическую форму (V), выражается формулой Смолуховского: V = ( ζD)/(4πη), где ζ — электрокинетический потенциал двойного электрического слоя, окружающего частицу, D — диэлектрическая проницаемость и η — вязкость среды. В том случае, когда электрофоретическое разделение смеси частиц (или молекул) производят в буферных растворах с не слишком низкими (например, около 0,1) значениями ионной силы раствора (полусуммы произведений концентраций всех находящихся в растворе ионов на квадрат величины их заряда), частицы группируются по фракциям лишь по величине заряда без учета размеров или молекулярных весов (масс), если речь идет о молекулах.
Использование электрофореза в биологии и медицине началось в 30-е годы 20 века, когда А. Тизелиус разработал метод электрофореза в свободной жидкости и сконструировал прибор для электрофоретического разделения и анализа смеси белков так называемым методом подвижных, или свободных, границ. В медико-биологических исследованиях применяют множество вариантов двух главных модификаций электрофоретического метода — электрофореза в свободной жидкости (свободнопроточный электрофорез) и зонального электрофореза (зонный электрофорез, или электрофорез на инертных носителях). Первым был разработан электрофорез в свободной жидкости (метод подвижных границ, электрофорез по Тизелиусу), который позволял измерять электрофоретическую подвижность испытуемого вещества по перемещению подвижной границы между чистым буферным раствором и буферным раствором, содержащим исследуемое вещество. В приборе Тизелиуса используется оптический метод регистрации положения такой границы по определению показателя преломления среды (см. Нефелометрия, Рефрактометрия), а в некоторых случаях — прямое микроскопирование. При разделении смеси веществ с различными изоэлектрическими точками (см. Изоэлектрическая точка) оптические устройства регистрируют несколько движущихся пиков (рис. 1). Основным недостатком электрофореза в свободной жидкости является ее тепловое движение, мешающее четкому разделению фракций и размывающее границы зон. Этот недостаток частично преодолевается созданием градиентов плотности буферных растворов (например, с помощью сахарозы). При фракционировании низкомолекулярных веществ, чтобы избежать чрезмерного размывания зон, применяют высоковольтный электрофорез, иногда в сочетании с хроматографией (см.) — так называемый метод «отпечатков пальцев».
Зональный электрофорез отличается от электрофореза в свободной жидкости главным образом использованием нейтральной поддерживающей среды (инертных носителей) для жидкой фазы (буферного раствора), что сводит к минимуму эффект теплового движения и позволяет при необходимости выделить тот участок носителя, который содержит индивидуальное вещество. В качестве инертных носителей в зональном электрофорезе используют специальную хроматографическую бумагу, полоски ацетата целлюлозы, тонкие слои силикагеля, порошка целлюлозы или гели сефадексов (см. Декстран). Зональный электрофорез на инертных полимерах-носителях позволяет фракционировать вещества не только по величине заряда, но и по молекулярному весу. Особое место среди таких носителей занимают гели полиакриламида (ПААГ) и агарозы. Преимущество полиакриламидных гелей заключается в возможности изменения диаметра их пор при изменении концентрации полимера, а также в отсутствии явлений адсорбции и электроосмоса при электрофорезе.
При электрофоретическом разделении гетерогенной смеси в полиакриламидном геле колонку небольшого сечения (около 1 см 2 ) заполняют буферным раствором, содержащим растворенный мономер (акриламид; CH2—CH— CONH2, небольшое количество вещества-сшивателя (бис-N-метиленметакриламида — НС(СН2)—CONH—CH2-NHCO-(CH2)CH ) и вещество-инициатор полимеризации. Через некоторое время при комнатной температуре в колонке образуется однородный гель (рис. 2). Если с помощью электрофореза в свободной жидкости по Тиэелиусу в сыворотке крови обнаруживают 5 белковых фракций (см. рис. 1), то при электрофоретическом разделении сыворотки крови в полиакриламидном геле их насчитывают не менее 25 (рис. 3).
Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле значительно повышается при использовании в качестве носителя системы гелей (обычно двух — «рабочего» мелкопористого и непосредственно над ним «формирующего» крупнопористого). Кроме степени пористости, эти гели резко различаются по величине pH и молярности буферных растворов, в которых они полимеризуются. Такой электрофорез называют ступенчатым, или дискэлектрофорезом (английский (discontinuous — прерывистый).
Вариантом электрофореза в полиакриламидном геле является электрофорез смеси биополимеров после предварительной обработки денатурирующим агентом с целью изменения конфигурации молекул. Белки в этом случае обрабатывают ионным детергентом (см.) — додецилсульфатом натрия, разрушающим дисульфидные связи в их молекулах и образующим с ними отрицательно заряженные мицеллы, заряд которых пропорционален молекулярному весу белка; нуклеиновые кислоты подвергают электрофорез в присутствии щелочи, мочевины, формамида или других агентов, разрушающих водородные связи в полинуклеотидных цепях нуклеиновых кислот. При этих условиях электрофоретическая подвижность биомолекул начинает строго коррелировать с их молекулярным весом.
Для наблюдения за ходом электрофореза в геле в исследуемую смесь добавляют химически инертный в отношении разделяемых веществ низкомолекулярный краситель (см. Красители), молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и молекулы разделяемых веществ, но обладают электрофоретической подвижностью, которая несколько выше подвижности белковой фракции, продвигающейся первой. Такой краситель называют лидирующим. Чаще всего в щелочных и нейтральных буферных растворах используют бромфеноловый синий, в кислой среде — метиловый зеленый или пиронин. Когда окрашенная зона доходит до конца геля, электрофорез прекращают, после фиксации гель на определенное время погружают в р-р специфического красителя, после чего избыток красителя отмывают (рис. 4) Для выявления на электрофореграмме белков-ферментов иногда пользуются их каталитической активностью в отношении хромогенных субстратов. Широко применяется обнаружение электрофоретических зон по их радиоактивности (см. Авторадиография).
Многие исследователи в качестве инертных носителей предпочитают гели в виде тонких пластин. Электрофорез в гелевой пластине делает более достоверным сравнение отдельных препаратов, позволяет проводить двухмерное разделение и др. Для анализа аминокислот, пептидов и сахаров (в виде их боратных комплексов) используют высоковольтный электрофорез на бумаге, в тонком слое силикагеля, ацетата целлюлозы и других красителей.
Разделение сложной смеси белков не всегда удается осуществить даже при использовании перечисленных выше приемов электрофореза. Поэтому в сложных случаях применяют так называемый двухмерный электрофорез, когда после первого электрофоретического фракционирования смеси белков каждую полосу используют как исходный препарат для электрофореза в перпендикулярном направлении по отношению к направлению первого разделения. В результате на второй пластине появляется большое число зон, соответствующих индивидуальным белкам (иногда их число достигает 2 тысячи).
Существуют методы, объединяющие, например, электрофорез и хроматографию (см.); иногда разделение смеси белков проводят в перпендикулярных направлениях, или в одном направлении белки разделяют электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а в перпендикулярном ему — с помощью изоэлектрического фокусирования (см.). Последний метод позволяет на одной гелевой пластине выявить до 7 тысяч индивидуальных белков. Вариантами электрофореза являются также электрофорез в градиенте значений pH и электрофорез в градиенте пористости геля, иммуноэлектрофорез, аффинный электрофорез, сочетающий в себе преимущества электрофореза и аффинной хроматографии, и др.
С помощью электрофореза белков определяют их первичную структуру, молекулярный вес, патогенность и наличие множественных форм. Для электрофореза клеток используют свободнопроточный электрофорез в его аналитических и препаративных вариантах. Так фракционируют бактериальные клетки, вирусы, а также лизосомы, митохондрии, комплексы Глльджи и другие клеточные органеллы. Молекулы нуклеиновых кислот отличаются от молекул белков сильным отрицательным зарядом. Фракционирование их смесей осуществляют за счет различий мол. веса нативных высокомолекулярных ДНК и РНК. Для электрофоретического фракционирования их низкомолекулярных фрагментов используют крупнопористые гели агарозы или гели полиакриламида с концентрацией от 5 до 20%, а также их смеси. Анализ фрагментов нуклеиновых кислот, полученных при расщеплении молекул ДНК нуклеазами и химическими агентами, дает возможность определить первичную структуру этих биополимеров, то есть структуру генов (см. Ген).
Метод электрофореза позволил обнаружить нормальный наследственный полиморфизм белков человека. Стали известны десятки вариантов гемоглобинов (см. Гемоглобин), глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и других белков. Были получены данные о множественных формах ферментов (см. Изоферменты), последовательно экспрессируемых в ходе онтогенеза и генетически независимых. В результате исследования крови, мочи, цереброспинальной жидкости электрофореза были выявлены изменения нормальной экспрессии генов, кодирующих синтез определенных белков при различных патологических состояниях (рис. 5).
С помощью электрофоретического анализа ферментов (см.) возможна диагностика, в том числе пренатальная, некоторых врожденных заболеваний.
При молекулярной патологии происходит изменение плотности относительного заряда на поверхности клеток, поэтому методом электрофореза можно, например, выявить и разделить субпопуляции B- и Т-лимфоцитов.
Начаты исследования по получению особо чистых препаратов (например, интерферона) методом электрофореза в условиях невесомости при космических полетах.
Лекарственный электрофорез (устаревший ионофорез, ионтофорез, ионотерапия, гальваноионотерапия, ионогальванизация) — метод электролечения, заключающийся в сочетанном воздействии на организм постоянного тока и вводимых с его помощью лекарственных веществ. В лечебную практику лекарственный электрофорез был введен с 1802 году, когда Росси (Rossi) впервые применил для воздействия на организм больного лекарственные вещества в сочетании с постоянным током (см. Гальванизация). Долгое время для лекарственного электрофореза использовали только постоянный непрерывный ток (гальванический). В настоящее время широко применяют диадинамические токи (см. Диадинамоэлектрофорез), синусоидальные модулированные (амплипульсфорез) и флюктуирующие (флюктуофорез) токи в выпрямленном режиме.
Принципиальной основой лекарственного электрофореза является теория электролитической диссоциации (см. Диссоциация в химии, Электролиз). Лекарственные вещества, способные диссоциировать в растворе на положительные (катионы) и отрицательные (анионы) ионы, направленно перемещаются в поле постоянного электрического тока и могут поступать в организм, преодолевая кожный барьер (см. Кожа). При этом с электродной прокладки вводятся лишь те ионы, которые имеют одноименный знак с электродом.
При электрофорезе основными путями проникновения лекарственных веществ в организм через кожу являются выводные протоки потовых и, в меньшей степени, сальных желез. Часть лекарственного вещества проникает в организм через межклеточные пространства и часть — через сами клетки (особенно при электрофоретическом введении лекарственных веществ через слизистую оболочку).
При электрофорезе лекарственные вещества проникают на небольшую глубину: сразу после процедуры они обнаруживаются в основном в эпидермисе и дерме, в небольшом количестве — в подкожной клетчатке. Отсюда введенные путем электрофореза лекарственные вещества поступают в лимфо- и кровоток и разносятся по всему организму, хотя преимущественно они накапливаются в тканях и органах области воздействия.
Электрофорез лекарственных веществ через кожу и слизистые оболочки количественно не подчиняется законам электролиза, так как живые ткани обладают электрокапиллярной активностью (см. Электроосмос) и барьерными свойствами (см. Барьерные функции). При электрофорезе в организм вводится всего от 1 до 10% вещества, находящегося в растворе (на прокладке). На количество вводимого путем электрофореза вещества существенно влияют физико-химические свойства самих лекарственных средств и свойства их растворов (степень диссоциации вещества, размеры, величина и знак заряда иона, возможность и степень его гидратации, используемый растворитель, концентрация и др.), условия проведения физиотерапевтической процедуры (плотность тока, длительность воздействия возраст пациента и др.), функциональное состояние организма в целом и кожи в особенности.
Лекарственное вещество, вводимое методом электрофореза может действовать на организм рефлекторным путем (так называемый понный рефлекс по Щербаку), гуморальным путем и кроме того, оказывать местное действие. Это зависит от типа и количества лекарственного вещества, методики и условий проведения процедуры, параметров физического фактора и др.
Электрический ток, используемый для электрофореза, вызывает в организме разнообразные физико-химические, метаболические и клеточно-тканевые реакции (см. Гальванизация, Диатермия, Диатермоэлектрофорез), на фоне которых действие вводимых с помощью электрофореза лекарственных веществ приобретает ряд особенностей и преимуществ по сравнению с обычными способами фармакотерапии (см.). Наибольшее практическое значение при лекарственном электрофорезе имеют следующие факторы:
- более длительное действие лекарственного средства и более медленное выведение его из организма благодаря, прежде всего, образованию в коже депо ионов, обладающих фармакологической активностью;
- возможность создания высокой локальной концентрации лекарственного вещества без насыщения им крови и других сред организма;
- меньшая вероятность возникновения побочных реакций;
- введение лекарственного вещества в наиболее фармакологически активной форме — в виде ионов;
- безболезненность введения лекарственных средств и отсутствие деформации тканей, возникающей при других способах фармакотерапии из-за введения растворителя.
Благодаря стимулирующему действию электрического тока отчетливое специфическое и выраженное терапевтическое действие вводимых путем электрофореза лекарственных веществ проявляется при таких концентрациях, которые при обычных способах фармакотерапии оказались бы малодейственными или неэффективными.
Назначение лекарственного электрофореза определяется, с одной стороны, благоприятным лечебным эффектом постоянного непрерывного тока или других видов электрического тока (см. Импульсные токи), а с другой стороны — показаниями к применению соответствующих лекарственных средств.
Лекарственный электрофорез нельзя применить в тех случаях, когда имеются объективные противопоказания к применению электролечения и соответствующих лекарственных средств, а также при их индивидуальной непереносимости.
Техника лекарственного электрофореза сводится к расположению на пути тока (между телом человека и электродами) раствора лекарственного вещества. В зависимости от способа нанесения лекарственного вещества и подведения тока различают несколько вариантов лекарственного электрофореза. Наиболее распространено электрофоретическое введение лекарственных веществ из растворов, которыми смачиваются специальные прокладки между телом пациента и электродом. Техника выполнения лекарственного электрофореза в этой модификации мало отличается от техники гальванизации (см.). Единственное отличие заключается в том, что электродную прокладку смачивают не водопроводной водой, как при гальванизации, а раствором лекарственного вещества. Этот раствор с помощью бюретки или другого дозирующего устройства количественно наносят на гидрофильную прокладку или, чаще, на специальную лекарственную прокладку, располагаемую при процедуре между кожей и защитной прокладкой. Лекарственные прокладки готовят из 1—2 слоев фильтровальной бумаги или 2—4 слоев марли. По форме и площади они должны соответствовать защитной прокладке. Раствором лекарственного вещества смачивают обычно одну прокладку, однако лекарственные вещества, диссоциирующие на ионы с противоположными зарядами, могут наноситься на обе (катодную и анодную) прокладки.
Раствор лекарственного вещества наносят на прокладку электрода (положительно заряженного — анода или отрицательно заряженного — катода), одноименного с подлежащим электрофоретическому введению ионом. При выборе полярности следует учитывать следующее: ионы всех металлов, местноанестезирующие средства, большинство алкалоидов, антибиотиков и сульфаниламидных препаратов имеют положительный заряд, поэтому при электрофорезе они должны вводиться с анода, а ионы всех металлоидов и кислотные радикалы приобретают в растворах отрицательный заряд и, следовательно, должны вводиться в организм с катодного электрода. Суммарный заряд амфотерных соединений (белки, аминокислоты и др.) зависит от их ионного состава и величины pH среды (см. Водородный показатель): при низких значениях pH заряд становится более положительным, при высоких — более отрицательным.
При так называемом ванночковом электрофорезе в ванночку (стеклянную, фаянсовую, пластмассовую) с вмонтированными электродами, заполненную раствором лекарственного вещества, погружают подлежащую воздействию обнаженную часть тела больного.
Полостной лекарственный электрофорез заключается в том, что перед введением электрода, соединенного с соответствующим полюсом аппарата для лекарственного электрофореза, в полость желудка, мочевого пузыря, прямой кишки, влагалища, носа вводят раствор лекарственного вещества.
В медицинской практике, особенно при лечении заболеваний бронхолегочной системы, получает распространение так называемый внутритканевой электрофорез. При этом после введения лекарственного вещества в организм одним из общепринятых способов (внутривенно, подкожно, внутримышечно, ингаляционным путем) проводят гальванизацию области патологического очага при перпендикулярном расположении электродов. Время проведения процедуры должно соответствовать времени достижения максимальной концентрации лекарственного вещества в крови.
При сочетанных способах лечения лекарственный электрофорез можно проводить одновременно с другим физиотерапевтическим воздействием. К таким сочетанным способам относятся ультразвук — электрофорез (электрофонофорез), дозированный вакуум — электрофорез (вакуум-электрофорез), индуктотермия — электрофорез (индуктотермоэлектрофорез), магнитное поле — электрофорез (магнитоэлектрофорез) и др. Сочетание лекарственного электрофореза с другими физиотерапевтическими воздействиями позволяет вводить в организм лекарственное вещество в большем количестве и на большую глубину, чем при одном электрофорезе, и потенцирует его действие.
Для лечебного электрофореза применяют лекарственные средства, относящиеся к самым различным группам. Нам более часто употребляют местноанестезирующие средства, витаминные, ферментные препараты, химиотерапевтические, сосудорасширяющие и сосудосуживающие средства, седативные средства, природные соединения и др. Лекарственные вещества, предназначенные для электрофоретического введения, должны быть чистыми, не содержать наполняющих и связующих соединений, по возможности их растворы надо готовить непосредственно перед применением. В качестве растворителя при приготовлении растворов для лекарственного электрофореза лучше всего использовать дистилированную воду. При плохой растворимости лекарственного вещества в воде в качестве растворителя можно применять спирт, димексид и другие полярные растворители, разрешенные ГФ. Приготовление лекарственных средств на изотоническом растворе натрия хлорида и других растворах электролитов (см.) является нежелательным, так как это резко уменьшает введение в организм лекарственного иона. При электрофорезе ферментов в качестве растворителей используют буферные растворы (см.).
Дозируют лекарственный электрофорез так же, как и гальванизацию: по длительности процедуры от 10 до 30 минут и плотности тока 0,03—0,08 ма/см 2 . Для детей и пожилых людей дозиметрические параметры уменьшают в зависимости от возраста на 25— 30%. На курс лечения назначают от 10—12 до 15—20 процедур, которые проводят ежедневно или через день.
Для лекарственного электрофореза применяют различные аппараты. Источниками гальванического тока (см. Гальванизация) и импульсных диадинамических токов являются аппарат Поток-1, АГН-32, АГП-33, СНИМ-1 Модель-717, Тонус-1 и Тонус-2, синусоидальных модулированных токов — аппараты Амплипульс-ЗТ. Амплипульс-4, флюктуирующих токов — аппарат АСБ-2.
Библиогр.: Бабский В. Г., Жуков М. Ю. и Юдович В. И. Математическая теория электрофореза, Применение к методам фракционирования биополимеров, Киев, 1983; Гааль Э., Медьеши Г. и Верецкси X. Электрофорез в разделении биологических макромолекул, пер. с англ., М., 198* Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот, Электрофорез и ультрацентрифугирование, 1981; Парфенов А. П. Элестрофорез лекарственных веществ, Л., 1973, ; Улащик В. С. Теория и практика лекарственного электрофореза, Минск, 1976, библиогр.; он же, Физикофармакологические методы лечения и профилактики, Минск, 1979; Cell electroptoresis in cancer and other clinical reearch, ed. by A. W. Preece a. P. Light, Amsterdam, 1981; Dunn M. Affinity electrophoresis, Lab. Pract., 33, p. 13, 1984; Electrophoresis’83, Advanced methods biochemical and clinical applications, ed. by H. Hlrai, B.— N. Y., 1984.
E. В. Раменский; В. С. Улащик (физиотер.).
источник