Меню Рубрики

Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле проводят в горизонтальном направлении, так как при этом 1) гель с низкой концентрацией агарозы лучше держится, 2) получается меньшее перекашивание (коллапс) в процессе электрофореза и 3) меньше искажаются полосы ДНК. По-видимому, проще всего работать с системой, когда гель полностью покрыт слоем буфера для электрофореза толщиной около 1 мм. Сопротивление агарозы ненамного превышает сопротивление буфера, так что значительная часть тока течет через агарозу.

Во все буферы с нейтральными значениями рН можно добавлять 0,5 мкг/мл бромистого этидия.

В процессе электрофореза буфер у анода защелачивается, а у катода закисляется. Поэтому обычно пользуются буферной системой с высокой емкостью. Буферы не содержат ионов Cl — , так как последние не обладают буферной емкостью, и их присутствие может привести к тому, что ДНК в геле утратит биологическую активность.

  1. Трис-боратный буфер. Обладает высокой буферной емкостью. При его использовании, по-видимому, получаются наиболее узкие полосы. Основной раствор 10 × не зарастает, но при длительном хранении в нем образуется осадок, который растворим в щелочи. В присутствии бората агарозные гели не растворяются при высокой концентрации NaClO4 или KI.
  2. Трис-фосфатный буфер. Тоже обладает высокой емкостью. При его использовании получаются примерно такие же результаты, что и при использовании трис-боратного буфера. Основной раствор, однако, может зарастать. Его преимущество заключается в том, что такие гели можно растворять в концентрированном растворе NaClO4 или KI.
  3. Трис-ацетатный буфер. Обладает относительно низкой буферной емкостью, и при длительном электрофорезе может возникнуть необходимость в рециркуляции буфера в аппарате. Использование при электрофорезе высоких напряжений не вызывает нагрева. Исходные растворы могут зарастать. Гели в трис-ацетатном буфере можно растворять в концентрированном NaClO4 или KI. Этот буфер, по-видимому, используется наиболее широко.
  4. Щелочной буфер. Обладает очень низкой емкостью. Обычно при его использовании необходима рециркуляция буфера в аппарате. Наносимые образцы не должны содержать Mg 2+ , иначе ДНК выпадет в осадок. Ионы Mg 2+ необходимо удалять, добавляя избыточные количества ЭДТА.

Препараты агарозы значительно различаются по твердости, по разрешающей способности при разделении фрагментов ДНК, электрофоретической подвижности ДНК, легкости плавления, прозрачности и наличию вредных примесей. Наиболее вредной примесью являются, по-видимому, сульфонированные агарозы, подавляющие активность многих ферментов, работающих на нуклеиновых кислотах.

Обычно мы пользуемся агарозой фирмы МС/В. Агарозу растворяют в буфере для электрофореза, нагревая до кипения в микроволновой печи. Необходимо убедиться, что раствор стал гомогенным и что в нем не осталось твердых частиц агарозы. Перед тем как залить гель, раствор охлаждают до 50°С. Если заливать гель слишком горячей агарозой, то легко можно повредить аппарат для электрофореза

Лунки для образцов делают с помощью погруженной в расплавленный гель гребенки из оргстекла, полихлорвинила или тефлона. Гребенку устанавливают до заливки геля таким образом, чтобы кончики зубьев находились примерно в 0,5 мм от основания геля. Если лунки достанут дна, то образец может протечь под гель. Когда гель полностью застынет, гребенку вынимают и лунки заполняют буфером для электрофореза.

Г. Нанесение образцов и краски

Наносимые образцы содержат 5-10% глицерола или 5-10% сахарозы и 0,025% красителя, благодаря которому можно проследить за ходом электрофореза. Например, можно добавить в образец 1 /10 объема раствора, содержащего 50% глицерола и 0,25% красителя.

ДНК. Наносите около 10 нг ДНК в расчете на каждую ожидаемую полосу. Гель будет перегружен, если в полосе окажется более чем примерно 100 нг ДНК.

Бромфеноловый синий (распадается в щелочи).

Бромкрезоловый зеленый (обладает одинаковой подвижностью и в нейтральных, и в щелочных растворах). Ксиленцианол FF (распадается в щелочи; подвижность ниже, чем подвижность бромфенолового или бромкрезолового).

Образцы можно наносить, используя автоматическую пипетку и полипропиленовый наконечник или с помощью микрошприца, на который надет тонкий пластиковый шланг.

Подвижность небольших молекул ДНК может быть такой же или даже большей, чем подвижность используемого красителя. Чем ниже концентрация агарозы и (или) выше напряженность, тем больший фрагмент ДНК будет обладать такой же подвижностью, как и краситель. Краситель поглощает флуоресценцию связанного с ДНК бромистого этидия. Это приводит к тому, что в том месте геля, где находится краска, невозможно наблюдать слабые полосы ДНК. Образцы можно наносить и без краски.

источник

Реактивы и оборудование:

— стеклянная коническая колба для приготовления агарозы. В случае электрофореза РНК колбу следует предварительно проавтоклавировать.

— прибор для агарозного гель-электрофореза. В случае электрофореза РНК все составные части прибора следует промыть по следующей технологии: 1) Промыть камеру и крышку от прибора для электрофореза, а также заливочный столик, планшет и гребенку водой в присутствии детергента (например, Fairy), 2) Протереть все спиртом, 3) Протереть все 3% раствором H2O2 в воде, 4) Залить камеру, крышку 50 мМ NaOH, смочить заливочный столик, а гребенку и заливочную рамку поместить в камеру. Через 10 минут инкубации слить NaOH и промыть все бидистиллированной водой

— TAE-буфер или TBE буфер. Состав 50-кратного TAE: 242 г триса, 57.1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0.5 М ЭДТА pH 8.0 растворить в 1 л дистиллированной воды. Перед использованием развести до однократного раствора. Состав 10-кратного TBE: 545 г триса, 278 г борной кислоты, 46.5 г ЭДТА растворить в 5 л дистиллированной воды. Перед использованием развести до однократного раствора. В случае проведения электрофореза РНК раствор следует проавтоклавировать и обработать DEPC или тиол-содержащими соединениями.

В случае электрофореза ДНК состав 6-кратного буфера для образцов: 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.15% orange G, 0.03% ксиленцианол, 0.125% бромфеноловый синий, 60% глицерол, 60 mM ЭДТА. В случае электрофореза РНК состав 2-кратного буфера для образцов: 95% формамид, 0.025% SDS, 0.025% бромфеноловый синий, 0.025% ксилен цианол, 0.025% бромистый этидий, 0.5 mM EDTA.

— набор фрагментов ДНК или РНК стандартной длины (например, 1 kb DNA ladder или RNA ladder (Fermentas))

— краситель: бромистый этидий (раствор 10 мг/мл, хранить в темноте) либо SYBR green I (обычно 10000-кратный, хранить при -20°С, также в темноте).

Взвесить необходимое для приготовления геля количество агарозы (в зависимости от процентности геля и количества приготовляемого раствора), перенести ее в стеклянную колбу и добавить необходимый объем ТАЕ- или TBE- буфера. Полученную суспензию прогреть в микроволновой печи до полного расплавления агарозы. Необходимо внимательно следить за процессом, так как агароза быстро выкипает, а также несколько раз останавливать прогрев и перемешивать содержимое колбы. В случае электрофореза РНК необходимо для взвешивания использовать стерильный шпатель.

В случае, если в качестве детектирующего агента используется бромистый этидий, в готовую «расплавленную» агарозу добавить бромистый этидий из расчета 0.5 мкг/мл геля. Если окрашивать гель планируется SYBR green I, то после окончания электрофореза следует погрузить гель в раствор SYBR green I на TAE-буфере (разведение 1: 10000) и инкубировать при перемешивании 1 час при комнатной температуре.

Собрать заливочный столик, и аккуратно залить в него расплавленную агарозу и сразу же вставить гребенку. Объем вносимой агарозы определяется размером лунок и количеством исследуемого образца, который будет внесен. Гель оставить застывать при комнатной температуре Из заливочного столика аккуратно вынуть рамку с гелем и вставить ее в камеру для проведения электрофореза. В камеру залить буфер ТАЕ так, чтобы он покрывал поверхность геля. Осторожно вынуть гребенку под буфером, чтобы не повредить лунки.

На фрагменте парафильма или в эппендорфах (в зависимости от объема образцов) смешать исследуемый образец ДНК с 6-кратным буфером для образцов или образец РНК с 2-кратным буфером для образцов и аккуратно нанести в лунку под лампой, не повреждая саму лунку. В случае РНК-электрофореза образец следует прогреть при 70 С в течение 10 минут, чтобы денатурировать вторичную структуру РНК. В качестве контроля сравнения нанести набор фрагментов ДНК или РНК различной длины, уже содержащий красители.

Закрыть камеру крышкой и проводить электрофорез при напряжении 6-8V/см длины геля.

После окончания электрофореза визуализировать фрагменты ДНК или РНК с помощью УФ-трансиллюминатора (ультрафиолетовой лампы) при 300 нм и сфотографировать полученное изображение.

Препаративный электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля.

Препаративный ДНК-электрофорез проводят так же, как и аналитический электрофорез, но с некоторыми модификациями. Для лучшего разделения фрагментов ДНК такой электрофорез проводят при более низком напряжении обычно 5-6 V/см. При этом гель меньше нагревается, что улучшает разрешение каждого фрагмента ДНК и снижает скорость диффузии. При использовании одного геля для препаративного электрофореза и экстракции нескольких различных образцов ДНК, образцы наносят через лунку, чтобы избежать загрязнения одного образца другим. Препаративный электрофорез проводят только в свежем TAE-буфере

После прохождения препаративного электрофореза фрагменты ДНК визуализируют с помощью UV-трансиллюминатора при длине волны 354 нм (слабый ультрафиолет), чтобы минимизировать возникновение мутаций в ДНК, которая будет впоследствии экстрагирована. С помощью скальпеля аккуратно вырезают фрагмент геля, содержащий интересующий фрагмент и переносят его в эппендорф.

Дальнейшая процедура экстракции фрагмента ДНК проходит по протоколу компании на колонках, носитель в которых идентичен колонкам, используемым в выделении плазмидной ДНК. Некоторые растворы, используемые для экстракции фрагментов ДНК из геля, идентичны растворам, используемым в выделении плазмиды. Общий принцип экстракции фрагментов из геля заключается в растворении фрагментов геля вместе с ДНК в специальном буфере и очистке фрагмента ДНК от растворенной агарозы на колонке методом ионообменной хроматографии.

источник

Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») —метод разделения макромолекул, различающихся по размеру, молекулярной массе, пространственной конфигурацией, вторичной структурой или электрическому заряду. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.

Молекулы в буферном растворе обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. При пропускании электрического тока через раствор в нем формируется направленное электрическое поле, напряженность которого измеряется разностью потенциалов по концам емкости, в которой производится электрофорез. Под действием поля молекулы начинают движение в направлении катода или анода. Скорость движения зависит от величины заряда, размеров и трения окружающей среды. С течением времени смесь разделяется на фракции, состоящие из молекул, движущихся с одинаковой скоростью. В современных экспериментах рабочий канал приборов для электрофореза заполняют гелем, имеющим структуру сетки. В этом случае основное влияние на подвижность молекул и их степень разделения оказывают их линейные размеры. В некоторых случаях может возникнуть ситуация, при которой особо крупные молекулы не проходят через поры геля.

Электрофорез в агарозном геле в различных модификациях широко применяется для разделения молекул нуклеиновых кислот, белков и других макромолекул в биологии и медицине. На водяной бане или в лабораторной печи плавят смесь агарозы, буфера и воды. Затем ее охлаждают до 50-60 °C и заливают в форму. Лунки для нанесения делаются при помощи гребенки. Исследуемый образец наносят в лунку при помощи дозатора. Когда краситель, помещаемый в лунки в начале эксперимента, достигает конца геля, электрофорез останавливают. Затем гель окрашивают красителем, который связывается с исследуемыми молекулами. Интенсивность окраски полос красителя дает представление о концентрации молекул в образце. Кроме концентрации, метод электрофореза позволяет определить относительную молекулярную массу исследуемых молекул, для этого в крайнюю лунку помещают набор маркеров молекулярной массы, который должен полностью покрывать диапазон молекулярных масс исследуемой системы.

Бромфеноловый синий и ксиленцианол — могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. Краситель Cresol red совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV. OrangeG наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV. Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле.

Самое широкое применение агарозные гели имеют в исследованиях, связанные с разделением нуклиновых кислот. Последние имеют довольно значительные отрицательный заряд, величина которого слабо зависиот от pH раствора, вследствие чего разделение на фракции происходит в основном за счет различия в линейных размеров молекул. В таких экспериментах используют 0.089М Трис-боратный, 0.05 Трсфосфатный и Трис-ацетатный буфер. Стоит отметить, что при обычном электрофорезе в геле можно разделять фрагменты нуклеиновых кислот, размер которых менее 50 тыс п.н. Также часто из эксперимента нужно получить оценку размеров молекул. Для этого используются наборы молекул известной длины. Например, для регистрации продуктов амплификации ДНК применяется электрофорез в агарозном геле в присутствии бромистого эитидия, который образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением длиной волны 290-330 нм.

источник

Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями.


    в плашку для электрофореза залить «подложку» — слой агарозы 1.5-2.0% толщиной

2-3 mm, дать застыть;

  • на этой подложке закрепить гребенку так, чтобы между зубцами и подложкой было расстояние 1-2mm;
  • залить 0.3% агарозу (лучше в холодной комнате);
  • гребенку удалять только под слоем буфера, иначе ячейки слипнутся.

    • ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля. Низкопроцентные гели особенно чувствительны к перегрузке по количеству DNA на дорожку.

    Разделение линейных молекул

    Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с различной концентрацией агарозы:

    % агарозы 0.3 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.2 1.5 2.0
    Размер DNA [kbp] 5-60 1-30 1-20 0.8-12 0.6-10 0.5-8 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2

    Меньший предел определяется (в основном) диффузией полосы в геле. Т.е. в гелях с низкой концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы не четкие.

    Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более длинные молекулы можно эффективно разделить.

    Разделение суперскрученных и кольцевых молекул

    К сожалению относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий фореза: % геля, скорость фореза (в частности, это означает, что нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул).

    Приведенная таблица дает некоторое представление о соотношении подвижностей при умеренной (

    6V/cm) скорости фореза (в скобках — при более быстром разгоне):

    Размер суперскруч. DNA [kbp] Размер линейной DNA [kbp] для различных % агарозного геля
    0.7% 1% 1.5% 2%
    2 1.2 1.3 1.3 (1.6) 1.5 (1.0)
    3 1.7 1.8 2 (2.4) 2.9 (1.8)
    4 2.2 2.3 2.7 (3.7) —
    5 2.7 2.9 3.5 (5.5) —
    6 3.2 3.5 5 (8.5) —
    7 3.9 4.2 8.5 (>12) —
    8 4.4 5.0 >12 —
    9 5.1 5.9 — —
    10 5.8 6.8 — —
    12 7 8.7 — —

    В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию EtBr.

    На 1% агарозном форезе ssDNA бежит чуть быстрее (

    10%), чем dsDNA того же размера. ssDNA окрашивается EtBr заметно слабее, чем ds (разница в

    4-5 раз). Tо есть, чтобы полосы имели одинаковую интенсивность окраски, требуется взять

    Чтобы разделить цепи, нужно либо непосредственно перед форезом прогреть

    1′ 100 o C, либо добавить к образцу NaOH до 0.1 М, 5-10′ (NT или 37 o C);

    При оценке напряженности поля для горизонтального фореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.

    На рисунке показана схема форезов, при разном напряжении. Форезы проводились разное время, так, чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля.

    Читайте также:  Чем помогает электрофорез с лидазой

    Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для высококачественных или препаративных форезов:

    2V/cm(можно меньше для ON форезов). Для аналитических форезов приемлемое качество сохраняется до

    DNA особенно легко теряет EtBr при повышенной температуре (что обычно случается, если гонять форезы при высоком напряжении).

    EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.

    Количество DNA, которое можно наносить на дорожку

    Нижний предел определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то не стоит надеяться увидеть 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере

    0.005-0.02%) могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. По нашему опыту, элюция фрагмента в РEG вместе с любым из этих красителей не оказывает заметного влияния на меченье, лигирование и трансформацию.
    Cresol red (Na соль) — (стоковый раствор 50mM в H 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере

    0.1mM) совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV.
    OrangeG — (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере

    0.01-0.05%) наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV.

    Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле. Обычно приводимые в методиках

    0.025% для бромфенолового синего и ксиленцианола (в 1х буфере) по нашему мнению слишком большое количество.

    * буфера с различными красителями.
    * различные разведения буфера для внесения (10х, 2х, 1х). При этом образец любого объема собирается из двух компонентов (буфер+образец), а не из трех (буфер+ вода + образец).
    1x если объем образца 25-75%;
    10x ==> 75%

    Смотри также:
    /ссылки на сетевые ресурсы/

      Дополнения, комментарии, вопросы

      Для оптимального разделения не очень больших фрагментов, можно пользоваться буфером для внесения по рецепту, указанному в каталоге MBI Fermentas:

      6x Orange Loading Dye Solution (#R0631)
      0.2% orange G
      0.05% xylene cyanol FF
      60% glycerol
      60 mM EDTA

      При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. Такой подход позволяет оптимизировать рабочее напряжение, а, соответственно, и разделение.

      И еще — я человек в мол.биологии непросвещенный, а потому да простят меня профессионалы, если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки.

      Люди, хелп! Если кто-нибудь знает что-то про технологию внесения биополимеров в гель под названием Shark Teeth, напишите, пожалуйста!

      А почему бы заодно не добавить в текст, что рабочая концентрация бромистого этидия, например, 0,5 мкг/мл и что его можно добавлять прямо в гель, что гель с добавленным в него EthBr спокойно стоит ночь под электродным буфером без заметного вымывания из него краски? Полезные, вобшем-то факты, хоть и мелкие, но, с моей точки зрения, вполне не лишние.

      Акульи зубы — не гель. а гребенка в виде этих самых зубок. Втыкается в гель, и не вынимается, а образец наносится тонким-тонким носом в дырки между зубами. См. инструкцию к Макрофору. Только это не про агарозный форез.

      2Re: что это гребенка такая, я знаю. Только сейчас вижу, что по формулировке моего вопроса кажется, будто это гель так называется:) Все, спасибо, уже поздно:) Только по моим данным, это имено про форез. Не знаю уж, про агарозный или ПААГ, по-моему, в данном случае не суть важно

      Народ, а какова длина волны для визуализации ПЦР-фрагментов?
      Я так понял, если окрашивают этидиум бромидом — то и Агарозный или ПААГ гель-электрофорез — всё равно?

      народ, а как точно называется маркер мол веса (лестница)? и куда, как ее наносить?

      а почему в гел Этьбромид а не GelStar ? GelGreen ? GelRed ? SYBRSafe ?

      а почему ТБЕ ТАЕ а не SB (sodium borate) ?

      а почему UV а не Blue ( Safe Imager , Dark Reader , FlashGel)

      А ПОКОЧАНУ ))))

      ответ от радио Molbiol — Не выпендрюйся Василий Иваныч-слушай свои «Валенки»

      1: Biotechniques. 2004 Feb;36(2):214-6. Links

      Erratum in:
      Biotechniques. 2005 Jan;38(1):60.
      Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.

      Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA.

      PMID: 14989083 [PubMed — indexed for MEDLINE]

      All: 1
      Review: 1
      [Click to change filter selection through My NCBI.]

      1: Electrophoresis. 2001 Mar;22(5):814-28.Click here to read Links
      A whole new way of looking at things: the use of Dark Reader technology to detect fluorophors.

      Clare Chemical Research, Inc, Denver, CO 80206, USA. mseville@clarechemical.com

      The Dark Reader optical system (Clare Chemical Research, Denver, CO, USA) uses relatively low intensity broad-band visible blue light in combination with broad-band optical filters to detect fluorescence with a level of sensitivity that often surpasses that of UV transilluminators and can rival that of laser-based scanners. Applications of DR (Clare Chemical Research) devices include the detection of DNA and SYBR-stained protein samples following, and also during, electrophoresis. Unlike laser-based imaging systems, the fluorescence is directly visible to the user as well as being fully compatible with charge-coupled device (CCD) and Polaroid camera-based detection and imaging. Additionally, the DR optical system functions well in multicolor fluorophor environments. Because the Dark Reader does not emit any UV light, the extent of DNA damage incurred when visualizing DNA samples is drastically reduced compared to the damage produced by a UV device and this can have a significant benefit on downstream cloning protocols. Furthermore, dye photobleaching is minimal, extending the length of time that a fluorescent sample is visible. The inherent flexibility of the DR optical system allows many different configurations of the Dark Reader to be constructed such as transilluminators, hand lamps and integrated transilluminator-electrophoresis units.

      PMID: 11332748 [PubMed — indexed for MEDLINE]

      Today’s Featured Review
      Biotium GelRed

      Until recently Sybr green had been our labs nucleic stain of choice. We have, however, recently migrated to Biotium’s GelRed. GelRed is a newer nucleic acid gel stain that is safer and more temperature stable than other dyes. GelRed is safer because it is non mutagenic and is diluted in water. It is more thermostable than Sybr dyes because it does not degrade with repeated freeze-thaws or long storage (couple months at RT) and can be stored at room temperature, and sensitivity seems to at least equal if not exceed Sybr green when visualized with UV transilluminator.

      The dye is used similarly to Sybr dyes with staining (available at 10,000X ) or direct sample additions. The technology is not particularly ground breaking or new but the safety profile of this product makes it a viable alternative to potentially more dangerous dyes.

      Review by Vitelli
      Join Today
      Scientific & Medical Experts Needed!

      Using GelGreen ‘In-Gel’
      GelGreen DNA used in-agarose and viewed on a Dark Reader transilluminator Save Time.
      GelGreen can be added to the agarose just before pouring a gel. DNA bands are stained almost immediately and there is no need to incubate in a bath of stain after electrophoresis.

      Save even more Time.
      Because GelGreen is very stable in aqueous solution, it is possible to make up and store agarose containing GelGreen for immediate use at a later date. Left; DNA samples separated using agarose containing GelGreen and viewed on a Dark Reader transilluminator.

      GelGreen Safety
      GelGreen is among the safest of the nucleic acid stains. Based on the Ames test, GelGreen shows no mutagenic effects on bacterial strains TA98 and TA1537 both with and without metabolic activation. Download the Biotium safety report here.
      GelGreen versus SYBR Safe
      GelGreen is more sensitive than SYBR Safe GelGreen is 2 — 3 times more sensitive than SYBR Safe. Using GelGreen in-agarose, it is possible to detect about 0.5 ng of dsDNA by eye and about 0.2 ng using a CCD camera.

      FlashGel™ DNA System
      Home > Research Products > Electrophoresis > Nucleic Acid Electrophoresis > FlashGel™

      The FlashGel System is the fastest way to separate DNA and the only way to watch DNA migration as it happens. This revolutionary new tool separates DNA in 2 – 7 minutes. Monitor gel runs right at the bench, without UV light. The highly sensitive system allows a 5X reduction in DNA levels – saving both time and money.

      * Get results in 5 minutes or less.
      * Watch DNA migrate at your bench, in real-time without UV light.
      * Enjoy outstanding resolution and exquisite sensitivity.

      The FlashGel System consists of enclosed, disposable, precast agarose gel cassettes and a combination electrophoresis and transilluminator unit.

      * FlashGel Cassettes contain precast, prestained agarose gels and buffer – no need for gel preparation, buffer addition or gel staining.
      * The FlashGel Dock is an electrophoresis apparatus with a built-in transilluminator that provides both separation and detection.

      это все называется «ДНК технология» — не путайте с одноименной фирмой

      всем привет.
      вопрос: какие установки нужны для источника питания Эльф кроме вольтажа на см ванночки. Т.е. какие цифры в Амперах и Ваттах надо устанавливать.
      спасибо

      Здравствуйте!
      Есть ли у кого-нибудь что-то по типу таблицы, выражающей зависимость подвижности красителей(бромфеноловый синий и ксилен цианол) от процентности агарозного геля? Какому размеру фрагментов они соответствуют при разделении в 0,7%, 0,8%, 1%, 2% и 3% геле? Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно

      «. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. «

      а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит

      Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации. Скорее всего малая концентрация? Спасибо

      —Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно

      —. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. «

      —а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит.

      Вроде красители в агарозе мигрируют на одно и тоже Rf не зависимо от процентности.

      А вот фрагменты сильно зависимо от процентности.

      Берете 2 маркера 100b и 1000b и в разных процентностях агарозы гоните с красителями и очень хорошо определяете, что с чем бежит.

      3 процентный агароз вам уже трудно будет растворить. Я так дУмаю-у

      Мне кажется это лишняя работа элюировать ДНК из геля для последующей амплификации. Срез геля в воду, заморозить-разморозить и 1-2 мкл на ПЦР. Вы реамплифицируете кг.

      Спасибо, попробую на следующей неделе. А что если уже выделил из геля с помощью QG и при исходнике с приблизительной количеством 50 нг получил 40 мкг в 40 мкл. На форезе 1,2% в 10 мкл пробы ясен перец ничего не видно, агароза супер. Поставил на ПЦР, отправил 20 мкл в смесь, жду результатов. Сколько приблизительно может быть продукта? Спасибо

      Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка??
      Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода. ), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу. и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов. и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества. Спасибо

      1% агарозу (в 2% линейная ДНК идет очень близко к суперскрученной, в 0.7% — близко к релаксированной).

      Если требуется проконтролировать циклизацию 3kbp фрагмента, то надо использовать 2% агарозу.

      если у Вас не нарабатывается большое кол-во продукта (20 нг в мкл и выше), дело уж конечно не в пирофосфатах- откуда бы им взяться, коли буквы не включились в амплификат (его мало)? Скорее всего проблемы с праймерами- посмотрите, нет ли «бомбы» (димер праймеров) внизу, или полимераза дохнет, что вря ли. Если проблема не лечится «в лоб», то просто замешайте исходно большой объем смеси, грубо говоря, накопите продукт экстенсивным путем, и всех делов.

      Я наверное перегрелся на солнцепёке (отпуск все-таки) — не понимаю в чем проблема плазмида или вставка, одна пара праймеров. По классике в ПЦР сильнее амплифицмруется всегда более короткий фрагмент. Без бутылки не разберешься, дождусь вечера.

      Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? И на какой стадии (до или после фиксирования в кислоте). Обязательно ли сушить?
      Спасибо

      -Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза?

      Бромий этидием или сибирским зеленым и иже с ними

      -до или после фиксирования в кислоте.
      После нейтрализации
      -Обязательно ли сушить?
      нет

      «если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки»

      Чем тогда думали в Сигма, если сделали столик в камере для фореза из белого пластика, к тому же скользкого

      в первом случае можно наклеить синей изоленты под место, где карманы)) Но от скольжения избавиться сложно — гель частенько уплывает от любых дуновений во время фореза. хоть гвоздями прибивай

      Можно ли заменить ТВЕ-буфер на Трис-СІ+EDTA для фореза ДНК, и какой молярности?

      За Трис.НСI в форезном буфере ставлю кол.

      Борная кислота испорчена у нас.
      Мож трис-ацетат тогда приготовить? Только порошок все равно 2в1 — Трис-СІ, других Трисов нет.

      Похоже, это ко мне . Поставляем наборы готовых гелей для электрофореза ДНК, рассчитанные на использование в ПЦРных лабораториях. В каждый комплект входит пузырёк ТАЭх20 (50 мл) для приготовления литра электрофоретического буферного раствора (EtBr 0,5 мкг/мл). Если нужно, то эти пузырёчки можно продавать и без гелей . Если интересно, то пишите. Ели реклама здесь неуместна, то удалите.

      &nbspГОТОВЫЕ_ГЕЛИ_05.pdf
      Размер:: 19.19к
      кол-во скачиваний: 1724

      Ну как может испортиться борная кислота? Купите тогда в аптеке.
      Только ТРИС.ОН. Никаких CI- и Na+ в буфере для фореза.
      5 mM борат тоже годится в качестве буфера для агарозного фореза. Читайте выше или поищите по форуму.

      Борная кислота старая и «Ч.» по квалификации чистоты. Надо заказывать новые реактивы.

      Могу отсыпать сухой (белый порошок) ТВЕ. И дам пропись как самому готовить. Но про Трис.НСI для фореза — забудь. Лучше водопроводную воду.

      Забудьте и про Трис-HCl, и про все прочие буферы на основе Триса. Наиболее продвинутые пользователи за бугром переходят на Li-борат и Li-ацетат. Давно хотел попробовать карбонатный буфер, но всё руки не доходили. Недавно дошли. Приготовили Li-карбонатный буфер. Форезы получаются отлично! При 10V/см ни перегрева, ни закисления или защелачивания. Очень рекомендую!

      * ubMed will retrieve 2 records.

      J Virol Methods. 2010 May 13. [Epub ahead of print]Fast short-fragment PCR for rapid and sensitive detection of shrimp viruses.

      Mrotzek G, Haryanti, Koesharyani I, Tretyakov AN, Sugama K, Saluz HP.

      Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute, Beutenbergstrasse 11a, 07745 Jena, Germany; Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany.
      Abstract

      This article describes a fast short-fragment PCR method for the detection of white spot syndrome virus (WSSV), infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and monodon baculovirus (MBV). Fast two-temperature (95 degrees C denaturation and 60 degrees C annealing/extension) PCRs were performed in 5-10mul volume samples in miniaturized microplates using a fast Peltier thermal cycler. 40 cycles were completed in 25-30min. Rapid high-resolution agarose gel electrophoresis of 70-150bp PCR fragments was performed in 10min. High sensitivity of PCR product detection (50-100pg) was obtained using ultra sensitive dyes such as GelStar(®) and a gel documentation system equipped with a blue-light transilluminator. This novel method is faster and more sensitive than its TaqMan(®) real-time PCR counterparts. Copyright © 2010. Published by Elsevier B.V.

      да уж сам себя не похвались как оплеванный ходишь. ©
      Такие времена. ©

      источник

      Электрофорез как метод фракционирования заряженных молекул (ДНК, РНК, белков) в электрическом поле был представленнами ранее как аналитический метод, спользующийся для визуализации нативной ДНК и ее фрагментов различного происхождения (геномная ДНК, ДНК плазмид, продукты рестрикции, ПЦР-продукты). Во всех указанных случаях нужно было увидеть результат производимых манипуляций с ДНК, охарактеризованной поэлектрофоретической подвижности. Однако имеется и другая область приложения метода электрофореза — очистка определеннойфракции полинуклеотидов, или препаративный электрофорез.

      Принципиально препаративный электрофорез не отличается
      от аналитического, основное требование к нему — доступность
      носителя (геля) для последующего извлечения из него целевого
      полинуклеотида. Для наибольшей продуктивности электрофореза
      используемая пластина агарозного или полиакриламидного геля
      должна быть относительно крупного размера и по своим механическим свойствам удобна для разрезания, измельчения или растворения.

      Полиакриламидный гель как носитель для электрофореза нуклеиновых кислот по аналитическим характеристикам значительнопревосходит агарозный, обладая большим разрешением (до одного нуклеотида, у агарозного — 10 и более нуклеотидов) и широким
      диапазоном плотностей, используемых для самых разных целей.Однако полиакриламид — химически инертный материал и почтине растворяется ни в одном из известных растворителей. Растворить ПААГ можно в концентрированном пероксиде водорода, однако
      при этом неизбежно разрушение ДНК, РНК и белков. Этот прием применим только для очистки стеклянных трубок или пластин от примесей геля; остающегося на их стенках послеокончанияработы.
      Извлечение (элюция) ДНК путем простой диффузии из крупного
      блока полиакриламидного геля — длительный и малоэффективный процесс, хотя его можно несколько усовершенствовать, например при подключении электрического тока (электродиффузия). Тем не менее полностью извлечь из ПААГ фракционированный целевой фрагмент можно только после механического разрушения геля, а это недопустимо в случае разделения длинных молекул ДНК, так как они также могут быть разрушены.

      Фракционирование нуклеиновых кислот методом электрофореза в ПААГ все же применяют:

      для разделения и очистки (препаративного разделения) коротких олигонуклеотидов, например химически синтезированных
      праймеров и зондов для ПЦР с детекцией продукта в реальном
      времени (геа1-time РСR) или гибридизации;для непрерывного фракционирования (в отличие от стационарного), осуществляемого подобно хроматографии, однако в
      этом случае продукты детектируют не на выходе, а в толще носителя на определенном участке гелевого блока по ходу электрофореза. При этом гелевая камера чаще всего имеет вид капилляра с отводным каналом, расположенным напротив окошка детектора,
      и, как только истечет определенное время электрофореза («время
      удержания») для целевого фрагмента в геле, направление движения фрагмента меняют на боковое путем переключения электрических контактов (рис. 8).

      Агарозный гель более удобен в качестве носителя для препаративного электрофореза, так как для проведения этого вида электрофореза не требуется специального оборудования (может бытьиспользована камера для горизонтального аналитического электрофореза). Для окрашивания нуклеиновых кислот чаще всего используют интеркалирующие красители, такие как бромистый
      эдидий или более чувствительный SYBR Green, которые флуоресцируют в УФ-свете. Наблюдать за ходом электрофореза можно визуально, периодически помещая гель на светофильтр трансиллюминатора и фиксируя таким образом момент, когда целевой фрагмент в достаточной степени отделится от остальных
      фракций. Как только это произойдет, участок агарозного геля, содержащий целевой фрагмент, необходимо вырезать из гелевой
      пластины. Для элюции целевого фрагмента ДНК вырезанный участок агарозного геля можно расплавить (нуклеиновые кислоты
      при этом обычно не разрушаются, кроме того, можно использовать и сорта легкоплавкой агарозы) или растворить, например, в
      концентрированном растворе гуанидинтиоцианата, а затем извлечь целевой фрагмент из раствора с помощью одного из методов
      выделения ДНК.

      Чтобы уменьшить потери на этом этапе, для связывания нуклеиновых кислот используют сорбент на основе оксида кремния
      (SiO2) или в виде водной суспензии (так называемое стеклянное
      молоко или glass milk), или нанесенный на поверхность полупроницаемой мембраны. Электрофорез в агарозном геле непригоден
      для разделения коротких олигонуклеотидов, а элюция с использованием сорбентов в этом случае малоэффективна и приводит к
      значительным потерям.

      Таким образом, большинство задач, связанных с очисткой нуклеиновых кислот, можно решить методом препаративного электрофореза, подобрав соответствующие условия, а указанные особенности наиболее доступных носителей дополняют друг друга и расширяют возможности эксперимента.

      Препаративный электрофорез очень часто используется для
      очистки нуклеиновых кислот, особенно ДНК, поэтому для элюции ДНК из агарозного геля теперь производится целый ряд
      коммерческих наборов реагентов. Использование таких наборов
      обеспечивает минимальные потери и высокое качество элюированной нуклеиновой кислоты с минимальными затратами времени.

      Например, набор реагентов Diatom™ DNA Elution (ООО
      «КОМПАНИЯ «БИОКОМ») позволяет очистить ДНК после ее
      сорбции на суспендированных частицах SiO2 (в данном случае —
      NucleoS™-сорбент) из раствора, полученного при растворении
      агарозного геля в 3,5—4,0 М растворе гуанидинтиоцианата (в данном случае — солюбилизирующий раствор).

      Последующую очистку ДНК, связанной с сорбентом, от возможных сопутствующих примесей производят спиртовым раствором ацетата калия (рабочий раствор солевого буфера),и,наконец,отделение фрагментов ДНК от частиц сорбента (растворение,
      элюция) наиболее полно обеспечивается суспензией ионообменных смол. ЭкстраГен™Е,который можно заменить стерильной
      деионизованной водой или ТЕ-буфером, однако потери ДНК при
      элюции будут выше на 15—20 %.

      Набор реагентов Diatom™ DNA Elution особенно эффективен
      для элюции фрагментов ДНК размером от 200 до 20 000 п.н. и
      обеспечивает высокую чистоту выделенной ДНК (А260/A280=1,6
      2). Очищенная ДНК может быть использована для практически
      любых генно-инженерных исследований, в том числе для прямого
      секвенирования. Потери ДНК составляют не более 20 %.

      Цель работы. Произвести очистку ПЦР-фрагмента ДНК методом препаративного электрофореза в агарозном геле с последующей элюцией ДНК на суспендированном сорбенте.

      Оборудование и материалы. 1. Термостат твердотельный для микропробирок
      вместимостью 1,5 мл. 2. Микроцентрифуга до 5000 g для микропробирок вместимостью 1,5 мл. 3. Микроцентрифуга-вортекс до 2000g для микропробирок.
      4. Оборудование для горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле с
      трансиллюминатором для детекции. 5. Микропробирки вместимостью 1,5 мл с
      крышками. 6. Цилиндр мерный вместимостью 250 мл. 7. Раствор неочищенного
      целевого фрагмента ДНК (можно использовать, например, продукт ПЦР, полученный с ДНК растительного или животного происхождения и специфичными
      для гена 18S рРНК олигонуклеотидньши праймерами — см. практическую работу
      № 7). 8. Набор реагентов для элюции ДНК из агарозного геля (например,
      Diatom™, DNA Elution ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ»). 9. 96%-ный этанол.
      10. Бидистиллированная вода.

      Ход работы. Электрофорез продуктов ПЦР. Препаративный электрофорез проводят в тех же условиях, что и аналитический (см. практическую работу № 2), только для получения достаточного количества очищенного фрагмента требуется нанести на гелевую пластину 40—50 мкл ПЦР-смеси (использовать для
      этого 4—5 лунок и вносить по 10 мкл в каждую). Процесс электрофореза заканчивают, когда пробег фронта краски-лидера составит
      3—4 см от линии старта. Периодически можно наблюдать за ходом
      фракционирования, останавливая процесс электрофореза и помещая гель на светофильтр трансиллюминатора. В процессе препаративного электрофореза целевой фрагмент ДНК отделяется от. неиспользованных нуклеозидтрифосфатов, балластных белков,
      ДНК-матрицы (остается вблизи старта) и оставшихся праймеров
      (располагаются вблизи фронта пробега, обозначенного краскойлидером).

      Элюция целевого фрагмента ДНК. 1. Помещают
      гелевую пластину на светофильтр трансиллюминатора, включают
      УФ-облучение и, наблюдая через защитное стекло (или очки), отмечают расположение целевого фрагмента.

      2.Вырезают участки геля, содержащие целевой фрагмент, так,
      чтобы не захватывать лишний гель и не оставлять ДНК в гелевой
      пластине, аккуратно помещают вырезанные участки в две микропробирки вместимостью 1,5 мл.

      3.Далее, следуя инструкции к набору реагентов Diatom™ DNA
      ЕLution, готовят рабочий раствор солевого буфера. Для этого содержимое флакона с солевым буфером из комплекта набора переносят в мерный цилиндр, доводят бидистиллированной водой до50 мл, а затем 96%-ным этанолом до 200 мл и перемешивают. Готовый рабочий раствор солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 2—8 °С.

      4.К фрагменту геля объемом около 100—200 мкл (по маркировке микропробирки) добавляют 500 мкл солюбилизирующего реагента из комплекта набора. Термостатируют пробирку при 65°С в течение 3—5 мин, при этом гель должен полностью раствориться.

      5.Добавляют в пробирки по 25 мкл NucleoS + ™ и 100 мкл связывающего реагента из комплекта набора. Количество добавляемого сорбента можно варьировать в зависимости от требуемого количества элюируемой ДНК. Для элюции 10 мкг ДНК следует добавить 20 мкл NucleoS + ™.

      6.Содержимое пробирок суспендируют при переворачивании,
      выдерживают при комнатной температуре 5—7 мин, переворачивая пробирки несколько раз каждые 1—2 мин. Постоянное переворачивание пробирки на ротаторе способствует максимальной сорбции ДНК с сорбентом Мис1ео§+™ и, следовательно, сводит/V потери ДНК к минимуму.

      7.Центрифугируют пробирки 10 с при 5000g, супернатант полностью удаляют.

      8.Добавляют к осадку 1 мл рабочего раствора солевого буфера.
      Содержимое пробирки встряхивают на вортексе 5—10 с до гомогенного состояния.

      Внимание! Если суспендирование осадка затруднено из-за сильного
      слипания частиц сорбента (при высоком содержании ДНК), рекомендуется осторожное пипетирование осадка с последующим встряхиванием на вортексе до гомогенного состояния.       ‘-»

      9.Центрифугируют пробирки 10 с при 5000g, супернатант полностью удаляют, Повторяют пп. 7—9.

      10.Подсушивают осадок в пробирке 4—5 мин, поместив ее в
      термостат на 65 °С и открыв крышку.

      11.Добавляют к осадку 100 мкл ЭкстраГенаЕ™.
      Внимание! ЭкстраГен Е™ следует предварительно встряхнуть и

      затем отбирать от общего объема при постоянном перемешивании
      (пипетировании).

      12.Суспендируют содержимое пробирки на вортексе 5—10 с до
      получения гомогенной суспензии, термостатируют 4—5 мин при
      65°С. На этом этапе работы происходит элюция: ДНК, связанная
      с сорбентом, переходит в раствор. Еще раз суспендируют содержимое пробирки на вортексе и центрифугируют 2 мин при
      10 000 g.

      13.Супернатант (раствор очищенной ДНК) отбирают и переносят в чистую микропробирку.

      Хранят образец очищенной ДНК при —18°С, если не предполагается частое размораживание, в противном случае — при 2—8 °С.

      Контрольные вопросы. 1. Как происходит разделение фрагментов ДНК в электрическом поле? На каком принципе основан электрофорез нуклеиновых кислот?
      2. Каково устройство камеры для горизонтального электрофореза нуклеиновых
      кислот? Как следует подключать электроды к источнику постоянного напряжения? 3. Почему агарозный гель малопригоден для фракционирования фрагментов
      ДНК размером менее 50 п.н.? 4. Каковы основные этапы процесса очистки ДНК
      представленным методом? В чем сущность каждого этапа?

      Задания.1. Очистить ПЦР-фрагмент ДНК гена 18S рРНК.
      2. Определить концентрацию ДНК в очищенном фрагменте.

      Практическая работа № 9
      РЕАКЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ

      Обратная транскрипция (ОТ) — процесс ферментативного синтеза ДНК на РНК-матрице, который катализирует фермент обратная транскриптаза (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза,КФ 2.7.7.49). Данный фермент является важнейшим фактором репродукции всех ретровирусов и наиболее хорошо изучен у онковирусов. После открытия этого фермента X. Темином и независимо от него Д. Балтимором в 1970 г. стало понятно, каким способом РНК-содержащие вирусы встраиваются в геном хозяина. Таким же способом размножаются ретротранспозоны — мобильные
      элементы генома эукариот, постоянно претерпевающие в своем «жизненном» цикле репродукцию путем транскрипции и интеграцию посредством обратной транскрипции.

      Обратная транскриптаза всех ретроэлементов обладает тремя
      активностями:

      1)РНК-зависимая ДНК-полимеразная (обеспечивает синтез
      первой цепи ДНК — комплементарной ДНК (кДНК) — на РНК-матрице, формируя гибридную РНК—ДНК молекулу);

      2)ДНК-зависимая ДНК-полимеразная (обеспечивает синтез второй цепи ДНК на ДНК-матрице);

      3) РНКазная (гидролизует исходную РНК подобно РНКазе Н).

      Этот процесс in vitro инициирует комплекс белков, прикрепленных к 3′-концу геномной РНК, откуда и начинается синтез кДНК; in vitro инициировать синтез кДНК можно с помощью олигонуклеотидных праймеров — коротких фрагментов одноцепочечной ДНК, комплементарных:

      1)известной последовательности какой-то определенной РНК;

      2)поли-А-«хвосту»(олиго(А)-последовательности на 3′-конце)зрелых информационных (матричных) РНК эукариот (мРНК);

      3)сразу нескольким случайным последовательностям нуклеотидов в виде смеси (как правило, не менее 10 шестичленных олигонуклеотидов).

      Принципиальное различие этих способов инициации состоит в
      том, что в первом случае реакции обратной транскрипции подвергают только определенную, охарактеризованную секвенированием РНК (или некоторое количество гомологичныхмолекул), во втором — только мРНК, но не рРНК или тРНК (а также не РНКпрокариот) и в третьем — все разновидности РНК. Но в любом
      случае инициации in virto синтез кДНК прерывается, как только
      обратная транскриптаза достигнет 5′-конца РНК-матрицы. Синтез второй цепи ДНК (анти-кДНК) осуществим в ходе той же реакции с помощью обратного праймера, комплементарного определенной последовательности кДНК (для варианта 1), случайных праймеров (для варианта 3) или чаще всего уже с помощью последующей ПЦР (для варианта 2 и любого другого), что гораздо удобнее и эффективнее реакции ОТ. Какойпроцесспроисходиттугуона 5′-конце РНК-матрицы, до конца неясно, но очевидно,чтовозможно два пути: либо далее следуют повторные инициации посредством белков, либо синтез ДНК продолжается уже на кДНК-
      матрице, не прерываясь и не останавливаясь до тех пор, пока не
      образуется двухцепочечная кольцевая (синтезированная «сама на
      себе») молекула ДНК — весьма устойчивая форма для интеграции
      в геном (в силу ее недоступности для экзонуклеаз).

      В качестве инструмента для реакции ОТ in vitro применяют несколько обратных транскриптаз, препараты которых производят в
      промышленных масштабах. Чаще других используют М-МLV(или М-МuVL) — обратную транскриптазу вируса лейкоза крыс и
      АМV — обратную транскриптазу вируса саркомы птиц. Реже других употребляют обратную транскриптазу теломеров (ДНК-теломераза) эукариот. Этот фермент присутствует у большинства эукариот, в его функции входит восстановление теломерных участков ДНК хромосом, частично утрачиваемых после каждого акта репликации генома, что также происходит путем матричного синтеза
      ДНК на РНК. Особенностями этого совершенно уникального
      фермента, отличающими его от других обратных транскриптаз,
      являются постоянная РНК-матрица, неразрывно связанная с самим ферментом, и, как следствие, отсутствие РНКазной активности.

      Реакцию обратной транскрипции широко применяют прежде
      всего в создании кДНК-библиотек — препаратов кДНК, полученных после обработки обратной транскриптазой тотальной РНК,
      выделенной из определенного организма, органа или ткани на определенной стадии развития, с олиго(дТ)-праймерами (комплементарны поли (А)-хвосту мРНК). В результате получаются одноцепочечные ДНК-копии всех матричных РНК, по качественному составу и количеству которых можно судить об уровне экспрессии
      каких-либо генов. В то же время размер и первичная структура
      кДНК в сравнении с соответствующей последовательностью в геномной ДНК позволяют выявить в ней некодирующие последовательности (интроны).

      Другая область применения метода обратной транскрипции
      (прикладная, но очень важная) — диагностика заболеваний, вызываемых РНК-содержащими вирусами (например, вирус иммунодефицита человека, вирус гепатита С, поражающий животных и человека), а также онковирусами. Последнее направление в наступившем XXI в. развивается особенно активно, что обещает если не
      полную победу, то, по крайней мере, профилактику и надежный
      контроль над этими опасными заболеваниями.

      Цель работы. Ознакомиться с методом реакции обратной
      транскрипции.

      Оборудование и материалы. 1. Термостат твердотельный для микропробирок
      вместимостью 0,5—0,6 мл. 2. Микроцентрифуга-вортекс до 2000 g для микропробирок вместимостью 0,5—0,6 мл. 3. Лед. 4. Раствор РНК (препарат РНК, полученный при выделении тотальной РНК — см. практическую работу№4).5.Обратная транскриптаза (например, М-МuLV Reverse Transcriptase производства Рготеga
      Со, США, или другая): 200 ед/мкл. 6. 10х ОТ буфер (как правило, поставляется в
      комплекте с препаратом соответствующей обратной транскриптазы):       500 мМ
      трис-НС1 рН 8,3, 750 мМ КС1, 30 мМ МgС12, 100 мМ дитиотреитол. 7. Смесь
      дНТФ: 2,5 мМ каждого в стерильной деионизованной воде. 8. Смесь праймеров:
      суммарно 40 мкМ, для вовлечения в реакцию всей выделенной РНК используют
      смесь случайных нуклеотидных гексамеров (для последующей ПЦР, полученной
      кДНК с праймерами на ген 185 рРНК, необходимо использовать именно эту смесь), для ОТ с использованием в качестве матрицы только мРНК — олиго(дТ)[5
      праймер (длиной 15 нуклеотидов). 9. Ингибитор РНКазы (например, RiboLock™
      Ribonuclease Inhibitor, «Рromеgа Со» или другой): 10 ед/мкл. 10. ДНКаза: 10 ед/мкл.
      11. 10х буфер для ДНКазы (как правило, поставляется в комплекте с препаратом
      соответствующей ДНКазы). 12. Стерильная деионизованная вода. 13. Вазелиновое
      масло.

      Ход работы. Внимание! Если концентрации готовых буферных растворов и ферментов в используемых препаратах отличаются отуказанных в разделе «Материалы и оборудование», необходимо изменить соответствующие объемы в приведенной ниже инструкции.

      Подготовка препарата РНК (разведение и очистка
      от примеси ДНК). 1. Измеряют оптическую плотность препарата
      РНК, полученного при выделении тотальной РНК (см. практическую работу № 4) при 260 нм против растворителя (ΔА260), для
      получения величин в пределах 0,05—0,5 ед. препарат требуется предварительно разбавить примерно в 50—100 раз.

      2. Вычисляют концентрацию РНК, мкг/мкл, в препарате по

      СРНК = ΔА260 х 40 х разбавление/1000.

      3.Готовят 30—50мкл раствора РНК концентрацией 0,1 —
      0,4 мкг/мкл (на стерильной деионизованной воде).

      4.Отбирают 17 мкл разбавленного раствора РНК в стерильную
      микропробирку вместимостью 0,5—0,6 мл и добавляют последовательно 2 мкл 10х буфера для ДНКазы и 1 мкл препарата ДНКазы
      (10 ед/мкл), осторожно перемешивают, добавляют две капли вазе-
      линового масла и центрифугируют для сброса капель на дно про-
      бирки.

      5.Помещают закрытую пробирку в термостат, инкубируют
      15 мин при 37 «С, а затем 5 мин при 95 «С, пробирку охлаждают на
      воздухе до комнатной температуры.

      Реакция обратной транскрипции. 1. В стерильную микропробирку вместимостью 0,5—0,6 мл вносят 5 мкл свежеприготовленного раствора РНК (без примеси ДНК), 2 мкл смеси праймеров, 4 мкл смеси дНТФ и 4 мкл стерильной деионизованной воды.

      2.Смесь инкубируют 5 мин при 70 °С, затем охлаждают во льду.

      3.Добавляют 2 мкл Юх ОТ буфера, 1 мкл ингибитора РНКаз
      (10 ед/мкл) и 2 мкл стерильной деионизованной воды.

      4.Смесь инкубируют 5 мин при комнатной температуре (при
      использовании смеси случайных гексамеров) или 5 мин при 37 «С
      (при использовании олиго(дТ)15).

      5.Добавляют 1 мкл обратной транскриптазы (200 ед/мкл), осторожно перемешивают, инкубируют 10 мин при комнатной температуре и еще 60 мин при 37 °С (при использовании смеси случайных гексамеров и олиго(дТ)15)

      6. Останавливают реакцию нагреваниемдо70°С,выдерживаютпри этой температуре 10 мин иохлаждаютвольду. Полученнуюсмесь, содержащую кДНК, можно использовать немедленно или хранить при —18 °С.

      Проведение ПЦР с кДНК. Постановку ПЦР с кДНК
      проводят по инструкции, представленной в практической работе
      № 8. Для проверки качества полученного препарата кДНК (отсутствие геномной ДНК и веществ,ингибирующихПЦР;наличие достаточного количества целевой кДНК) рекомендуется использовать для амплификации праймеры для обнаружения гена 18S
      рРНК, а также перечисленные далее образцы:

      1)препарат РНК, разбавленный для проведения реакции обратной транскрипции (см. Подготовку препарата РНК, п. 3);

      2)препарат РНК, очищенный от ДНК (см. Подготовку препарата РНК, п. 5);

      3)препарат кДНК (см. Реакцию обратной транскрипции, п. 6);

      4)отрицательный контроль (стерильная деионизованная вода);

      5)положительный контроль с любым препаратом ДНК, выделенным из эукариот (см. практические работы № 3, 4).

      Детекцию продуктов ПЦР проводят методом электрофореза в
      агарозном геле (см. практическую работу № 2).

      Контрольные вопросы. 1.Зачем требуется синтезировать кДНК для проведения
      ПЦР с РНК? 2.Чем отличается постановка реакции обратной транскрипции для
      мРНК и для тотальной РНК? 3. Как получить кДНК только с определенной РНК?
      4. Можно ли получить кДНК с использованием олиго(дТ)|5 на транскриптах про-
      кариот? Ответ поясните. 5. Какие этапы следует произвести для молекулярной
      диагностики заболевания СПИДом?

      Задания. 1. Интерпретировать полученные после ОТ—ПЦР результаты: объяснить наличие или отсутствие продуктов ПЦР на
      электрофореграмме для каждого варианта постановки ПЦР.
      2. Интерпретировать результаты, представленные на электрофореграмме (рис. 9).

      Рис.9.Электрофореграмма продуктовОТ—ПЦР с препаратами нуклеиновых
      кислот, выделенных из клубней картофеля, и праймерами, подобранными для
      амплификации фрагмента гена пататина(№Х03932 по каталогу N081,

      праймеры ограничивают фрагмент между 833и 1832 п.н.):

      М — маркер молекулярной массы Сепе Ruler
      100 bp DNA Ladder       (размер фрагментов —
      100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 и
      1000 п.н.); 1 — препарат тотальной РНК без
      очистки от ДНК (продукт ПЦР без ОТ); 2 —
      препарат тотальной РНК после обработки
      ДНКазой (продукт ПЦР без ОТ); 3 — препа-
      рат кДНК (продукт ОТ-ПЦР); 4 — отрица-
      тельный контроль (стерильная деионизован-
      ная вода); 5 — положительный контроль
      (ДНК, выделенная из клубней картофеля, —
      продукт ПЦР)

      Практическая работа №10
      РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ДНК

      Рестриктазы — это ферменты, обладающие эндонуклеазной
      активностью, которые специфически гидролизуют молекулы
      двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов — сайтов рестрикции. Название этих
      ферментов происходит от английского гезгпсИоп (ограничения);
      они были выявлены у определенных штаммом бактерий. Крайне
      редко помимо эндонуклеазной активности рестриктаза обладает
      еще и метилазной (Есо571), производя модификацию (метилирование) определенных нуклеотидов в последовательности, узнаваемой рестриктазой; такие модифицированные последовательности не подвержены ферментативной рестрикции. Но обычно эти фер-менты структурно независимы и работают в комплексе, образуя
      так называемую КМ-систему (систему рестрикции—модификации). Одновременное наличие в клетке обеих ферментативных активностей защищает от интеграции в геном чужеродной ДНК (например, вирусов или плазмид) и предотвращает разрушение собственной ДНК.

      Известно около 2500 рестриктаз. Название того или иного фермента составляется из первой буквы рода и двух первых букв вида
      бактерии, из которой данная рестриктаза выделена, еще одна буква может обозначать тип штамма. Если в определенном штамме
      клеток имеется несколько рестриктаз, то к буквенному названию
      фермента добавляется числовое обозначение. Например — рестриктаза Hind III выделена изклеток Haemophilus influenzae с серотипом d и относится к III классу RМ-системы.

      Рестриктазы могут кодироваться не только геномной ДНК бактерии, но также плазмидами и фагами, в связи с этим к названию
      фермента добавляется название внехромосомного элемента (ЕсоRI).

      Сучетом основных свойств рестриктазы подразделяют на четыре класса.

      Рестриктазы I классадействуют в одном комплексе с метилазами, расщепляют ДНК в произвольных местах на расстоянии от нескольких сот до нескольких тысяч пар нуклеотидов от
      несимметричных сайтов узнавания. При этом образуется сплошной спектр рестриктов, не детерминированных по размерам и содержанию информации, поэтому данные рестриктазы в генной инженерии не используют. Примером таких рестриктаз может
      служить ЕсоК.

      Рестриктазы II класса имеют широкое применение,
      поскольку рестриктазы и метилазы этого класса действуют независимо, сайты узнавания совпадают с сайтами расщепления или
      находятся рядом с ними на определенном расстоянии, в результате чего получаются фрагменты ДНК воспроизводимого состава и
      длины (рис. 10).

      Более половины рестриктаз данного класса узнают нуклеотидные последовательности с вращательной симметрией второго порядка (палиндромы). По способу расщепления данные ферменты делятся на два подкласса. Представители первого осуществляют
      ступенчатый разрез комплементарных нитей ДНК, в результате
      чего образуются фрагменты с выступающими (липкими) концами: либо 5′-концами (рис.10,Б),либоЗ’-концами,как в случае действия рестриктазы PstI(рис. II, А)- Ферменты второго подкласса (например, SmaI) расщепляют совпадающие связи, в результате чего образуются фрагменты с ровными (тупыми) концами (рис. 11, В).

      Рестриктазы III класса (например, ЕсоPI) действуют в одном комплексе с метилазами и узнают несимметричные последовательности нуклеотидов, при этом расщепление происходит на определенном расстоянии от сайта узнавания.

      R.М-система (комплекс рестриктазы и метилазы) IV класса
      представлена пока уникальным ферментом Есо57I, в одной поли-
      пептидной цепочке которого и эндонуклеазная, и метилазная ак-
      тивность.

      Рестриктазы широко используют в работах по генной инжене-
      рии, в частности по картированию геномов, клонированию, оп-
      ределению нуклеотидных последовательностей (секвенирова-
      нию).

      За единицу активности рестриктазы принимают количество
      фермента, способное за 1 ч в оптимальных для него условиях полностью гидролизовать 1 мкг ДНК фага λ. Для проведения успешной рестрикции необходимо соблюдать ряд условий,которые приведены в таблице 7.

      Фактор Требование Дополнительная информация
      Рестриктаза 1. Тип — в зависимости от цели работы. Для выявления сайтов использу- ют генетические карты или сек- венированные последовательно- сти ДНК
      При выборе необходимо знать,есть ли в используемой ДНКсайт или сайты узнавания для данной рестриктазы Большой избыток активности рестриктазы или объема ее ра- створа, взятого на реакцию (бо- лее 1/10 конечного объема), мо- жет привести к уменьшению специфичности работы фермента
      2.Количество—в зависимости отколичества ДНК (1 ед.акт. фермента на 1 мкг ДНК). Длябольшей эффективности лучше использовать двух- или трехкратный избыток фермента
      Буферный раствор Состав: 1)трис-НС1 буферный раствор для поддержания рН (около 7,5); 2)МgС12 (ионы магния являются единственным кофактором рестриктаз класса II); 3)дитиотрейтол или 2-меркапто-этанол для стабилизации фер- мента с добавлением бычьего сывороточного альбумина (БСА)как стабилизатора; 4) NaCI (или КС1) для создания необходимой ионной силы реак- ционной смеси Для различных рестриктаз требу- ются определенные концентра- ции компонентов. Однако для удобства работы большинство ферментов было объединено в 4—5 групп и для каждой из них был унифицирован состав реак- ционного буфера (как правило, переменной величиной является концентрация ионов Na + )
      ДНК От 1 до 10 мкг, поскольку большие количества ДНК увеличивают вязкость раствора, что приво- дит к ингибированию реакции ДНК должна быть очищена от реагентов, используемых полиса- харидов и РНК
      Объем смеси От 10 до 50 мкл Для уменьшения испарения и поддержания постоянного объ- ема реакционной смеси добавля- ют вазелиновое масло
      Температура 37°С для большинства рестриктаз 25 °С (для SmaI), 65 °С (для ре- стриктаз из термофильных бак- терий — ВstBI, Таg1и др.)
      Время От 1 до 5 ч Реакцию можно остановить с по- мощью ЭДТА—Na

      Разделение полученных рестриктазных фрагментов и их визуа-
      лизацию проводят методом электрофореза в агарозном геле.

      Цель работы. Ознакомиться с методом рестрикционного анали-
      за ДНК.

      Оборудование и материалы. 1. Микроцентрифуга высокоскоростная до 10 000g.
      2. Микроцентрифуга-вортекс до 2000g- 3. Термостат твердотельный для микро-
      пробирок вместимостью 0,5—1,5 мл. 4. Автоматические дозаторы переменного
      объема с наконечниками. 5. Микропробирки вместимостью 0,5 мл. 6. Термостат
      твердотельный с функцией охлаждения для микропробирок вместимостью до
      1,5 мл. 7. Рестриктаза ЕсоRIи буферный раствор для нее. 8. Раствор плазмидной
      ДНК (рGEM3Z) и ДНК фага λ. 9. Вода стерильная деионизованная. 10. Материа-
      лы и оборудование для проведения электрофореза, представленные в практичес-
      кой работе № 2.

      Ход работы. 1. Смесь для рестрикции (общий объем — 40 мкл)
      готовят в микропробирке вместимостью 0,5 мл, поместив ее и все
      исходные компоненты в термостат с функцией охлаждения при
      4°С:

      10х буфер для рестриктазы ЕсоRI! — 6 мкл;

      рестриктазаЕсоRI.(10ед.)— 2 мкл;
      вода стерильная деионизованная — 32 мкл.

      Вышеперечисленные компоненты смешивают в указанных количествах, с помощью автоматического дозатора отбирают по 20 мкл смеси и переносят в две чистые микропробирки вместимостью 0,5 мл.

      Внимание! При смешивании необходимо проводить смену наконечников после каждого раствора.

      В пробирку 1 (промаркировав ее) добавляют 10 мкл раствора
      ДНК фага λв концентрации 0,4 мкг/мкл, а в пробирку 2 (промаркировав ее) — 10 мкл раствора плазмидной ДНК (рGEM3Z) в концентрации 0,4 мкг/мкл.

      2.Смеси в двух пробирках очень осторожно перемешивают с
      использованием дозатора с наконечником, добавляют 10 мкл минерального масла, центрифугируют 5 с при 2000g и выдерживают
      в термостате 1 ч при 37 o С.

      3.Через 5, 20, 40 мин и по истечении 1 ч от начала рестрикции
      из пробирки 2 отбирают пробы по 5 мкл и переносят в чистые
      микропробирки вместимостью 0,5 мл, маркируя их при этом.

      4.Каждую из отобранных проб сразу же смешивают с 5 мкл
      краски-лидера (из набора для электрофореза), помещают в термостат с функцией охлаждения при 4 °С и оставляют до тех пор, пока
      не будет отобрана последняя проба.

      5.Четыре содержащие гидролизованную ДНК пробы, отобранные из пробирки 2, а также пробу из пробирки 1 (аналогично смешанную с краской-лидером) вносят в лунки пластины агарозного геля и подвергают электрофорезу для исследования динамики ре-стрикции (см. практическую работу № 2).

      6.Полученные результаты регистрируют визуально или с ис-
      пользованием видеосистемы.

      Контрольные вопросы. 1. Какова функция рестриктаз в клетках бактерий?
      2. Каковы принципы деления рестриктаз на классы? 3. Что такое сайт рестрикции?
      4. Какие сайты рестрикции узнают рестриктазы II класса? 5. По какому принципу
      делят II класс на подклассы? 6. Каковы основные условия проведения рестрик-
      ции? 7. Какой показатель принимают за единицу активности рестриктазы?

      Задания.1.Поместить схему или фотографию полученной
      электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и
      сделать подписи к ним. 2. Проанализируйте динамику рестрикции
      ДНК рGEM3Z при действии рестриктазы ЕсоRI(по результатам
      рестрикции с разными сроками инкубации).

      Практическая работа №11
      ДНК—ДНК-ГИБРИДИЗАЦИЯ

      Методы гибридизации нуклеиновых кислот основаны на способности олиго- и полинуклеотидов образовывать двухцепочечную структуру за счет образования водородных связей между ос татками комплементарных азотистых оснований: аденин + тимин (или урацил) и гуанин + цитозин. При соблюдении определенных
      условий, исключающих случайное неканоническое взаимодействие нуклеотидов, методы гибридизации нуклеиновых кислот
      позволяют выявить гомологию первичной структуры интересующей нас нуклеиновой кислоты (мишень) и зонда — олигонуклеотида с известной первичной структурой. Мишенью может служить, например, нативная ДНК (дот-гибридизация от англ. скл —
      точка, точечный), а также рестрикционные фрагменты ДНК (Сау-
      зерн-гибридизация) или фракционированные с помощью электрофореза молекулы РНК (Нозерн-гибридизация, рис. 12), а зондом — чаще всего ПЦР-продукт или рестрикционный фрагмент,меченный радиоактивным изотопом (чаще 32 Р или 33 Р) или флуоресцентным красителем для его последующей детекции. Использование радиоактивных изотопов становится все менее популярным из-за невозможности длительного хранения меток, трудностей детекции продуктов ядерного распада и определенного вреда,наносимого здоровью систематической работой с ними. Однако
      флуоресцентное мечение также имеет свои недостатки, это прежде всего высокая термолабильность как самой молекулы флуорофора, так и химической связи флуорофора с зондом, которая нарушается при нагреве—охлаждении, детекции коротковолновым или УФ-светом, а также в ходе длительного хранения.

      К отдельной категории методов гибридизации следует отнести
      гибридизацию in situ, проводимую непосредственно на живом
      объекте, точнее, внутри прозрачных для детекции клеток, тканей,
      органов. Основное предназначение этого метода — определение
      клеточной и тканевой локализации РНК- или ДНК-мишени с уже
      известной первичной структурой или распределения определенных последовательностей ДНК в хромосомах. Метод позволяет установить, например, тканеспецифичность вирусов и бактерий (пораспределению их наследственного материала по клеткам и тканям организма-хозяина), экспрессии определенных генов (по наличию мРНК) и т. д. (рис. 13).

      Рис. 12. Радиоавтограф мембраны после Нозерн-гибридизации, мишень — мРНК из
      растений разных фенотипов Arabidopsis Thaliana, зонд 32 Р-меченый олигонуклеотид

      Дот-гибридизация — самая простая разновидность ДНК—
      ДНК-гибридизации (мишень и зонд являются молекулами ДНК).
      ДНК-мишень не подвергают каким-либо модификациям, а только плавят (денатурируют) при 65 °С в 0,1-0,5 М растворе щелочи
      и закрепляют на специальной подложке — нитроцеллюлозой
      или нейлоновой мембране, реже

      источник