Электрофорез плазмидной днк в агарозном геле

Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК,таккак выделение, рестрикция,полимеразная цепная реакция(ПЦР),молекулярное клонирование, наиболее частоиспользуютэлектрофорез.

Электрофорез — метод разделения макромолекул (в том числе
молекул и фрагментов ДНК) в геле по размеру и заряду в постоянном электрическом поле. Существует два вида электрофореза: горизонтальный и вертикальный.

Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя ДНК, например бромида этидия.

На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов.

Концентрация агарозы в геле.Агарозный гель — пористая струк-
тура, причем увеличение концентрации агарозы в геле приводит к
уменьшению размеров его пор. Это позволяет при помощи геля с
разной концентрацией агарозы разделять линейные молекулы
ДНКв широком диапазоне их размеров, вплоть до 60 тыс. пар
нуклеотидов (п. н.).

Существует зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК
от концентрации агарозы в геле;

Концен- 0,3 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,2 1,5 2,0

Длина 5-60 1-30 1-20 0,8-12 0,6-10 0,5-8 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2

Заряд молекулы.Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы
ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной
среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода (отрицательный электрод) к аноду (положительный электрод). Электрофоретическая подвижность молекулы ДНК существенно снижается с увеличением ее длины.

Напряженность электрического поля.На скорость движения заряженных молекул ДНК в геле влияет напряженность электрического поля, определяемая напряжением постоянного электрического поля, подаваемого на электроды. Данные, приведенные на
рисунке 1, свидетельствуют о наличии обратно пропорциональной зависимости между длиной пробега ДНК в геле и напряженностью электрического поля. Число полученных электрофореграмм различно, поэтому разделение фрагментов ДНК для
аналитических целей (только с целью детекции ДНК) с максимальным разрешением рекомендуют проводить при напряжении 10—15 В/см, а для препаративных (если ДНК будет в дальнейшем выделена из геля и использована, например, для клони-
рования) — при

Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с
одинаковой скоростью. Однако подвижность суперспирализованных и кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера. Таким образом, методом элект-рофореза можно фракционировать три формы молекул ДНК бактерий:

• суперспирализованную (нативная молекула, стабилизированная белками);

•линейную (расщепленная рестриктазой кольцевая молекула).
Разделение трех типов молекул ДНК в одном геле выглядит следующим образом (по подвижности от катода к аноду):

Кольцевая молекула ДНК
Линейная молекула ДНК
Суперспирализованная молекула ДНК

При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в одну из лунок геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с
известными значениями молекулярных масс).

Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза.

Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания
электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 ч, гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254—400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм), при этом
становится видна ДНК.

Внимание! Используемый в качестве красителя бромид этидия является мутагенным веществом. При работе с ним необходимо использовать резиновые или латексные перчатки.

Методы вертикального и горизонтального электрофореза
принципиально сходны, однако в последнем случае вместо агарозного используют полиакриламидный гель (ПААГ) и процесс электрофореза проходит вертикально. Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью.

Кроме того,акриламид является токсичным веществом. Приготовить ПААГ
значительно сложнее, чем агарозный гель. В связи с этим в работе
с ДНК преимущественно используют метод горизонтального
электрофореза в агарозном геле.

Цель работы. Ознакомиться с методом горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле.

Оборудование и материалы.1. Прибор для горизонтального электрофореза.
2. Источник постоянного тока. 3. Электрическая плитка или СВЧ-печь. 4. Гельдокументирующая видеосистема. 5. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 6. Колба мерная вместимостью 1 л. 7. Колба коническая
вместимостью 0,5 л. 8. Цилиндр мерный вместимостью 250 мл. 9. Кристаллизатор.
10. Набор реагентов для электрофореза (например, производимый ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ»)включает: смесь для приготовления электродного буфера;
навеску агарозы; раствор бромида этидия; раствор краски-лидера (бромфеноловый синий). 11. Проба исследуемой плазмидной ДНК. 12. ДНК-маркер молекулярных масс. 13. Перчатки резиновые или латексные неопудренные. 14. Теплоизолирующая рукавица. 15. Вода дистиллированная.

Ходработы.Приготовлениерабочегобуферногораствора для электрофореза. Содержимое пакета «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мерную колбу, раство-ряют в 600—800 мл дистиллированной воды (для более быстрого
растворения следует подогреть раствор до 40—45 «С при постоян-
ном помешивании) и доводят объем полученного раствора до 1 л
дистиллированной водой.

Подготовка прибора для электрофореза к работе. Пользуясь встроенными уровнями и винтовыми ножками,
прибор устанавливают строго горизонтально. В рабочую камеру
наливают буфер для электрофореза. Для формирования гелевой
пластины собирают кювету, в нее помещают аппликатор (гребенку) для формирования лунок в толще геля (рис. 2). Регулируемую

высоту аппликатора выставляют таким образом, чтобы расстояние
от дна кюветы до каждого из зубцов составляло 1—2 мм. В зависимости от числа анализируемых проб одновременно можно установить одну, две или три гребенки.

Приготовление агарозного геля. Навеску агарозы,
необходимую для приготовления 1%-ного геля, полностью переносят в коническую стеклянную колбу вместимостью 250—500 мл,
добавляют 150 мл рабочего раствора буфера для электрофореза и
перемешивают. Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в
СВЧ-печи или на электроплитке, периодически помешивая (колбу
держать, только надев на руку теплоизолирующую рукавицу). Продолжают нагревание до тех пор, пока содержимое колбы не станет
совершенно прозрачным (обычно еще 1 мин). Расплав охлаждают
до 55—60 °С, добавляют 10 мкл раствора бромида этидия, перемешивают (работу проводят в латексных или резиновых перчатках) и
наливают на столик для заливки геля (см. описание к прибору для
электрофореза), не допуская образования воздушных пузырьков,
так, чтобы толщина слоя была не менее 5 мм, а зубцы гребенок
были погружены в гель не менее чем на 4 мм. Гель полностью застывает через 15—20 мин. Столик с готовым агарозным гелем и гре-
бенками переносят в камеру для электрофореза, в которую нали-
вают рабочий раствор буфера для электрофореза так, чтобы по-
крыть гелевую пластину слоем в 2—3 мм. Извлекают гребенки из
агарозного геля легким и плавным движением вверх, стараясь не
повредить образовавшиеся лунки.

Проведение электрофореза. В лунки застывшего агарозного геля осторожно вносят по 3 мкл раствора исследуемых образцов ДНК. В соседнюю лунку геля вносят 3 мкл маркера молекулярных масс фрагментов ДНК. В одну или
две (по краям пластины геля) свободные лунки вносят 2—3 мкл
краски-лидера. Закрывают крышку прибора для электрофореза и
подключают его к источнику постоянного тока, строго соблюдая
полярность электродов и учитывая, что движение фрагментов
ДНК происходит в направлении от катода к аноду (от «минуса» к
«плюсу»). На вольтметре источника постоянного тока устанавли-
вают напряжение 120—150 В. В таком режиме процесс электрофо-
реза продолжают около 30 мин, ориентируясь на фронт пробега
краски-лидера (приблизительно на 3 см). По окончании электро-
фореза источник напряжения отключают, снимают крышку при-
бора, пластину агарозного геля осторожно переносят на свето-
фильтр (просмотровый столик) УФ-трансиллюминатора для де-
текции Включают трансиллюми-
натор. Зоны ДНК, окрашенные бромидом этидия, светятся при
УФ-облучении.

Внимание! Во избежание повреждения сетчатки глаз ультрафиолетовым излучением наблюдать зоны ДНК следует только через за-щитное стекло из комплекта трансиллюминатора или защитные (стеклянные) очки. Полученные результаты регистрируют визуально или с использованием гель-документирующей видеосистемы,пользуясь инструкцией к ней.

Контрольные вопросы.1. Какой принцип лежит в основе метода электрофоре-
за? 2. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2,5%-ного геля?
3. Какой концентрации агарозный гель нужно использовать для разделения мето-
дом электрофореза фрагментов ДНК размером 350 и 150 п.н.? 4. В каком направ-
лении и почему движутся молекулы ДНК при проведении электрофореза? 5. От
каких факторов зависит скорость движения молекул ДНК в агарозном геле в про-
цессе электрофореза? 6. Почему нужно избегать образования в геле пузырьков
воздуха? 7. За счет чего происходит визуализация ДНК в геле? 8. Каким образом
можно контролировать движение молекул ДНК в геле во время электрофореза?
9. На каких этапах проведения электрофореза необходимо работать в перчатках и
почему?

Задания.1. Поместить схему или фотографию электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Определить и подписать размеры фрагментов ДНК-маркера (согласно описанию к нему). 3. По электрофореграмме определить электрофоретическую подвижность и рассчитать примерную молекулярную массу исследуемой плазмидной ДНК, используя маркеры молекулярных масс. 4. Определить, какой из ДНК нижеперечисленных плазмид соответствует исследуемая ДНК, если ДНК плазмиды РСЕМ-2Гимеет размер 3000 п.н.ДНК плазмиды рВК322 — 4361,а ДНК плазмидыр РСУ002—8560 п.н.

источник

Электрофорез ДНК

Теория электрофореза

Впервые явление электрофореза было открыто П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году. В начале 70-ых годов было показано, что с помощью гель-электрофореза можно определить длину и чистоту молекул ДНК. Этот метод прост, так как каждый нуклеотид в молекуле нуклеиновой кислоты обладает отрицательным зарядом, который заставляет молекулы двигаться к положительному электроду. Были разработаны специальные полиакриламидные гели, с помощью которых удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающиеся даже на один нуклеотид. Поскольку поры в полиакриламидном геле для больших молекул ДНК слишком малы, для их разделения по размеру были разработаны специальные гели на основе агарозы (полисахарид, выделяемый из морских водорослей). Оба эти метода разделения ДНК широко используются для аналитических и препаративных целей.

В 80-ых годах была предложена модификация гель-электрофореза в агарозном геле, названная электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или пульс-электрофорез. С ее помощью удается разделять большие молекулы ДНК (от 10 т.п.н. до 10 млн.п.н.), к которым относятся хромосомные ДНК прокариот и низших эукариот. Обычный гельэлектрофорез не позволяет разделить такие молекулы ввиду постоянства электрического поля, которое придает молекулам змеевидную конфигурацию. Обладающие такой конфигурацией молекулы движутся в гелях с постоянной скоростью вне зависимости от длины молекул. Если же направление электрического поля будет часто меняться, скорость движения молекул будет определяться их способностью переориентироваться согласно этому изменению. Такой процесс у больших молекул занимает значительно больше времени, вследствие чего они будут отставать. На гелях после пульс-электрофореза целые хромосомы дрожжей выявляются в виде отдельных полос, и поэтому можно легко определить хромосомные перестройки.

Сейчас электрофорез занимает центральное место среди методов исследования нуклеиновых кислот. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом – сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала.

В современных приборах рабочий канал заполняют гелем. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая (гидрофильная) пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Вместе с тем используемые гели содержат очень много жидкости (80-99,5 %), в которой (т.е. в рабочем буфере) и мигрируют макромолекулы. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится.

В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро.

Для визуализации результатов электрофореза проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют, а гель облучают ультрафиолетом, под действием которого связавшийся с двунитевой ДНК краситель флуоресцирует.

Электрофорез ДНК

Теория электрофореза

Впервые явление электрофореза было открыто П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году. В начале 70-ых годов было показано, что с помощью гель-электрофореза можно определить длину и чистоту молекул ДНК. Этот метод прост, так как каждый нуклеотид в молекуле нуклеиновой кислоты обладает отрицательным зарядом, который заставляет молекулы двигаться к положительному электроду. Были разработаны специальные полиакриламидные гели, с помощью которых удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающиеся даже на один нуклеотид. Поскольку поры в полиакриламидном геле для больших молекул ДНК слишком малы, для их разделения по размеру были разработаны специальные гели на основе агарозы (полисахарид, выделяемый из морских водорослей). Оба эти метода разделения ДНК широко используются для аналитических и препаративных целей.

В 80-ых годах была предложена модификация гель-электрофореза в агарозном геле, названная электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или пульс-электрофорез. С ее помощью удается разделять большие молекулы ДНК (от 10 т.п.н. до 10 млн.п.н.), к которым относятся хромосомные ДНК прокариот и низших эукариот. Обычный гельэлектрофорез не позволяет разделить такие молекулы ввиду постоянства электрического поля, которое придает молекулам змеевидную конфигурацию. Обладающие такой конфигурацией молекулы движутся в гелях с постоянной скоростью вне зависимости от длины молекул. Если же направление электрического поля будет часто меняться, скорость движения молекул будет определяться их способностью переориентироваться согласно этому изменению. Такой процесс у больших молекул занимает значительно больше времени, вследствие чего они будут отставать. На гелях после пульс-электрофореза целые хромосомы дрожжей выявляются в виде отдельных полос, и поэтому можно легко определить хромосомные перестройки.

Сейчас электрофорез занимает центральное место среди методов исследования нуклеиновых кислот. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом – сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала.

В современных приборах рабочий канал заполняют гелем. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая (гидрофильная) пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Вместе с тем используемые гели содержат очень много жидкости (80-99,5 %), в которой (т.е. в рабочем буфере) и мигрируют макромолекулы. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится.

В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро.

Для визуализации результатов электрофореза проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют, а гель облучают ультрафиолетом, под действием которого связавшийся с двунитевой ДНК краситель флуоресцирует.

Разделение ДНК в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле – стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности. Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем – бромистым этидием в низкой концентрации. Просматривая прокрашенный гель в ультрафиолеотовом свете, можно заметить даже 1 нг ДНК.

Сочетание прочности и крупнопористости делает гели агарозы незаменимыми при электрофорезе особенно крупных макромолекул, в частности нуклеиновых кислот. Агароза – это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который извлекают из некоторых видов морских водорослей. Молекулярная масса ее составляет 10 4 –10 5 . Гелеобразование идет, как уже указывалось, путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы образуют прочные гели уже при концентрации 0,3 %.

При температурах от 84 до 96 °С (а у специальных типов – уже при 70 °С) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – «плавится». Растворы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36-42 °С). У легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой – можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают до 50-55 °С уже при этой температуре дозируют и заливают в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных тепловых деформаций.

Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено не наличием примесей, а своего рода «кристаллизацией» геля и свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель представляет собой не вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость. Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом – очень медленно. Тем не менее, гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных гелей агарозы.

Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентрации навеску порошка растворяют в соответствующем буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термостате при 90-95 °С около 2 ч для образования истинного раствора полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обратным холодильником.

Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смешивают с раствором агарозы в горячем виде (при 50-60 °С). Впрочем, надо иметь в виду, что высокая концентрация агентов, диссоциирующих водородные связи, несколько затрудняет образование геля.

Плоские гели для горизонтального электрофореза готовят путем заливки дозированного объема расплавленной агарозы на строго горизонтальную пластинку нужного размера.

Выбор концентрации агарозы, т.е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют агарозные гели с концентрацией 0,4–2 %. Ниже в таблице 8 для ориентировки представлены примерные концентрации гелей агарозы (в процентах) для некоторых распространенных образцов фракционирования:

Перед заливкой в форму или на пластину раствор горячей агарозы охлаждают до 50 °С и выдерживают не менее 1 ч в термостате при данной температуре. Это необходимо для полного выравнивания температуры раствора по всему его объему, чем обеспечивается одновременное застывание всего геля и однородность его структуры.

Гель, полимеризованный на пластинке, помещают на столик открытой поверхностью кверху, поскольку препараты вносят в ряд специальных лунок, образованных опусканием в гель гребёнки и расположенных на некотором расстоянии от его края. Схема прибора для проведения горизонтального электрофореза показана на рисунке 29. Следует быстро вносить препараты в лунки и сразу же начинать электрофорез, так как образцы могут диффундировать в геле.

Рисунок 29 – Электрофорезная ванна, подложка и гребенки для горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле

Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяются пятью главными параметрами, рассмотренными ниже.

Размер молекул ДНК. Молекулы линейной двуцепочечной ДНК перемещаются в геле одним концом вперёд со скоростями, обратно пропорциональными десятичному логарифму их молекулярных масс.

Концентрация агарозы. Фрагменты ДНК данного размера перемещаются в геле, содержащем разные концентрации агарозы, с разными скоростями. Применяя гели разных концентраций, можно разделить большой набор фрагментов ДНК, различающихся по размеру (таблица 10).

Таблица 10 Зависимость разделения линейных молекул ДНК от концентрации агарозного геля

Конформация ДНК. ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформации, например кольцевая неповреждённая (форма I), кольцевая с одноцепочечным разрывом (форма II) и линейная (форма III), движутся в агарозном геле с разными скоростями (рис. 30).Относительная подвижность трёх указанных форм зависит главным образом от концентрации агарозы в геле, а также от таких факторов, как сила тока, ионная сила буфера или плотность сверхспиральных витков в форме I.

I, II, III – конформации плазмидной ДНК (пояснения в тексте).

Рисунок 30 – Изображение электрофоретической подвижности препаратов ДНК: а) высокополимерной линейной ДНК, выделенной из молок лосося (IСN); б) ДНК фага l, расщепленной эндонуклеазой Hind III на линейные фрагменты с фиксированной длиной; в) плазмидной ДНК pUC19

Напряжённость электрического поля. При низких напряжённостях скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. Однако с увеличением напряжённости электрического поля подвижность фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой дифференциально возрастает. Следовательно, с увеличением напряжённости область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается. Максимальное разделение фрагментов происходит при напряжённости, не превышающей 5 В/см.

Состав оснований и температура. Электрофоретическое поведение ДНК в агарозных гелях (в отличие от поведения в полиакриламидных гелях) слабо зависит от состава оснований ДНК или температуры геля. Обычно электрофорез проводят при комнатной температуре, однако следует отметить, что гели, содержащие менее 0,5 % агарозы, очень мягкие, поэтому с ними лучше работать при 4 ˚С.

Последнее изменение этой страницы: 2017-02-05; Нарушение авторского права страницы

источник

Электрофорез ДНК в агарозном геле — аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по длине. Основан на разной скорости движения фрагментов разной длины при движении в геле под действием внешнего электрического поля.

Одно из применений метода — исследование плазмидной ДНК. Она обычно кольцевая и образует вторичные структуры, например, скручивается в суперспираль. Таким образом, чтобы определить размер плазмиды, необходимо разрушить элементы вторичной структуры. Для этого перед нанесением на гель плазмиду «линеаризуют» (делают линейной), то есть обрабатывают одной из рестриктаз (эндонуклеаз). Рестриктазу выбирают так, чтобы она разрезала плазмиду только в одном месте.

Для разделения фрагментов ДНК разной длины используют гель с различной концентрацией агарозы. Чем меньше длина разделяемых фрагментов ДНК, тем больше должна быть концентрация агарозы:

При проведении электрофореза фрагменты ДНК мигрируют в геле под воздействием сил электрического поля. Дело в том, что сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.

Перед началом электрофореза к образцам принято добавлять два разных красителя с кислым значением pH (часто для этих целей используют ксиленовый голубой и бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза и утяжелять образцы глицерином (до 20 % глицерина в образце). Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.

Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис, а также борную или уксусную кислоты. Соответственно, буфер, содержащий борную кислоту, называется TBE (tris-borate-EDTA), а буфер, содержащий уксусную кислоту, — TAE (tris-acetate-EDTA). Концентрации маточных растворов TBE и TAE составляют 6x и 50x соответственно, если сравнивать с их рабочими концентрациями. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.

После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.

Определение размеров производят путём сравнения наборов коммерческих фрагментов ДНК известной длины («DNA ladder», «линейка», «маркеры ДНК») и ДНК в проверяемых образцах. Обычно в коммерческих маркерах указывают и содержание отдельных фрагментов, чтобы можно было, сопоставив интенсивность полос, быстро оценить концентрацию ДНК в проверяемых образцах. При необходимости ДНК маркеры для геля можно изготовить самостоятельно, если обработать плазмиду рестриктазой, которая режет её в нескольких местах. Для этого выбирается эндонуклеаза, при действии которой образуются 5-6 фрагментов различной длины.

Обычно для электрофоретического анализа ДНК используют агарозные гели, но если разделяемые фрагменты ДНК имеют длину всего в несколько десятков нуклеотидных пар, то можно использовать полиакриламидный гель. Полиакриламидный гель также используют для высокого разрешения коротких молекул ДНК, при секвенировании ДНК.

Бромистый этидий (3,8-Диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид, EtBr, Ethidium bromide) — интеркалирующий агент, широко применяемый в молекулярной биологии для выявления нуклеиновых кислот, в частности, в случае электрофореза ДНК в агарозном геле.

При освещении ультрафиолетовым светом EtBr флюоресцирует оранжевым цветом. При связывании с ДНК интенсивность флюоресценции увеличивается примерно в 20 раз.

В 1950-х годах бромистый этидий под названием Homidium использовался для лечения трипаносомоза у рогатого скота.

Из-за возможности связывания с ДНК и, при освещении ультрафиолетом, стимулирования разрывов в ДНК, бромистый этидий может быть сильным мутагеном. Также считается канцерогеном и тератогеном, хотя эти свойства никогда не были тщательно исследованы.

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Трис-ацетатный-ЭДТА буфер (TAE) — буферный раствор, содержащий трис, уксусную кислоту и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту).

Используется в молекулярной биологии в основном для гель-электрофореза при разделении фрагментов нуклеиновых кислот. Имеет меньшую буферную ёмкость, чем TBE, в связи с чем быстрее истощается, однако линейные двухцепочечные фрагменты ДНК перемещаются в TAE быстрее.

Для получения рабочей концентрации 50-кратный буфер разводят в дистиллированной воде в соотношении 1:49.

Электропорация — создание пор в бислойной липидной мембране под действием электрического поля. Это явление используется в биотехнологии для внедрения макромолекул (обычно ДНК или РНК) в клетки млекопитающих, бактерий или растений.

Электрофоре́з (от электро- + др.-греч. φορέω «переношу») — это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.

С помощью электрофореза удаётся покрывать мелкими частицами поверхность, обеспечивая глубокое проникновение в углубления и поры. Различают две разновидности электрофореза: катафорез — когда обрабатываемая поверхность имеет отрицательный электрический заряд (то есть подключена к отрицательному контакту источника тока, являясь катодом) и анафорез — когда заряд поверхности положительный.

Электрофорез применяют в лечебных целях в физиотерапии. В химической промышленности он используется для осаждения дымов и туманов, для изучения состава растворов и др. Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.

Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (англ. SDS PAGE).

Электрофорез в полиакриламидном геле (сокр. электрофорез в ПААГ, ПААГ электрофорез; англ. PAGE, Polyacrylamide Gel Electrophoresis) — метод молекулярной биологии и биохимии, используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, основанный на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также от конфигурации молекул. Разделяют т. н. неденатурирующий, или нативный ПААГ-электрофорез (при котором разделяемые биологические макромолекулы в процессе электрофореза остаются в нативном состоянии) и денатурирующий ПААГ-электрофорез (при котором пробы предварительно денатурируют, в случае нуклеиновых кислот используют непродолжительное нагревание пробы с формамидом либо глиоксалем, для денатурации белков обычно используют кипячение пробы в буфере, содержащем сильный ионный детергент (обычно додецилсульфат натрия) и агент, разрушающий четвертичную структуру белка за счёт разрушения дисульфидных мостиков между глобулами белка и внутри полипептидной цепи — бета-меркаптоэтанолом). В процессе денатурирующего ПААГ-электрофореза молекулы сохраняются в денатурированном состоянии за счёт наличия в геле хаотропных агентов (обычно мочевины) в случае ПААГ-электрофореза нуклеиновых кислот и белков и наличия ионных (например додецилсульфата натрия, цетилтриметиламмоний бромида) и неионных (например tween-20) детергентов.

В случае электрофореза белков в полиакриламидном геле метод обычно используют в модификации Леммли (Laemmli)

Также электрофорез в полиакриламидном геле применяют для разделения коротких фрагментов нуклеиновых кислот, например, ДНК-электрофорез, например, при секвенировании по Сэнгеру. Кроме этого, ПААГ-электрофорез применяют для визуализации в методах ПДРФ и ПЦР.

Различают также т. н. диск-электрофорез (от англ. discontinuous), при котором в геле в процессе электрофоретического разделения белков на границе между концентрирующим и разделяющим гелями создаётся градиент pH, за счёт чего достигается лучшее разделение белковых молекул.

This page is based on a Wikipedia article written by authors (here).
Text is available under the CC BY-SA 3.0 license; additional terms may apply.
Images, videos and audio are available under their respective licenses.

источник

Тема занятия 2: АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.

Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот и их фрагментов в полиакриламидных и агарозных гелях отличается от разделения белков рядом особенностей, обусловленных структурой этих биополимеров. В нейтральной и щелочной средах молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, поскольку их заряд определяется диссоциацией фосфатных групп. Величина этого заряда мало зависит от рН окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот. Таким образом, фракционирование идет за счет размеров и формы молекул. Для электрофоретического разделения полинуклеотидов используют эффект молекулярного сита, присущий полиакриламидным и агарозным гелям. Для фракционирования фрагментов ДНК размером меньше 100 пар нуклеотидов обычно используют полиакриламидные гели с разными концентрациями полиакриламида (3,5% – 20%). Более крупные молекулы ДНК разделяют в агарозном геле.

Рис.1 Зависимость пробега фрагмента ДНК от его размера при электрофорезе в агарозном геле

Скорость миграции нуклеиновых кислот через агарозный гель зависит от ряда факторов. Скорость миграции в целом уменьшается при увеличении размеров фрагментов линейной ДНК (но лишь до определенного предела). Молекулы больше 30 т.п.н. не могут быть разделены обычным электрофорезом в агарозном геле, так как такие фрагменты ДНК мигрируют практически с одинаковой скоростью независимо от их молекулярной массы. В области же эффективного разделения пройденное расстояние в геле (пробег) линейных двуцепочечных молекул ДНК обратно пропорционально десятичному логарифму их молекулярных масс. Фрагменты ДНК определенного размера перемещаются в геле, содержащем разные концентрации агарозы, с разной скоростью. Чем выше концентрация агарозы, тем эффективнее разделение фрагментов меньшего размера, и наоборот.

Зависимость эффективного разделения фрагментов ДНК разных размеров от концентрации агарозы в геле

Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется также конформацией молекул. В суперспирализованной форме молекула ДНК наиболее компактна и обладает наибольшей подвижностью. Релаксированная форма (образующаяся при наличии хотя бы одного разрыва сахарофосфатной цепи в одной из цепей ДНК) имеет значительно меньшую электрофоретическую подвижность. При низких и средних концентрациях агарозы линейная ДНК той же молекулярной массы обладает промежуточной подвижностью между суперспирализованной и релаксированной формами. Скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению только при низких значениях напряженности электрического поля. При увеличении напряженности подвижность высокомолекулярных фрагментов дифференциально возрастает. При этом снижается область эффективного разделения ДНК в агарозном геле. Максимальное разделение фрагментов достигается при напряженности электрического поля, не превышающей 5 В/см.

Для электрофореза ДНК обычно применяют буферы, содержащие трис-ацетат, трис-борат и трис-фосфат. Все три буферные системы обеспечивают хорошее разделение фрагментов в равной степени. Буферы для электрофореза ДНК обычно содержат хелатирующий агент ЭДТА для связывания двувалентных катионов Ca 2+ и Mg 2+ , что предотвращает распад ДНК под действием эндо- и экзонуклеаз, активность которых зависит от присутствия в среде этих катионов.

Для наблюдения за ходом электрофореза в пробу добавляют лидирующие красители (бромфеноловый синий и ксиленцианол) до конечной концентрации примерно 0,04%. Для удобства нанесения образцов (для «утяжеления» проб) в них добавляют глицерин до конечной концентрации 5%.

Наиболее удобным методом визуализации ДНК в агарозных гелях является окрашивание ее флуоресцирующим красителем бромистым этидием, который специфически интеркалирует между азотистыми основаниями в ДНК. Ультрафиолетовое излучение, поглощаемое ДНК в области 260 нм, передаваемое на краситель, а также излучение, поглощаемое самим красителем при 300 нм, испускается затем в красно-оранжевой области видимого спектра.

Задание 1. Электрофорез плазмидной ДНК в агарозном геле

1. 1%-й агарозный гель остудить до температуры 50ºС. Перед заливкой геля тщательно проверить горизонтальность поверхности заливочного столика с помощью уровня; установить гребенку на подложку. Необходимо, чтобы между концом гребенки и подложкой оставался просвет 0,5 – 1 мм для формирования дна кармана. Во время процедуры заливки необходимо следить, чтобы в геле не было пузырьков воздуха. Толщина геля должна составлять 0,3 — 0,5 см. После того, как гель полностью застынет, осторожно вынуть гребенку и поместить гель в электрофорезную камеру (рис.2).

1. Добавить в камеру трис-ацетатный буфер (1х ТАЕ: 0,04 М трис-ацетат, рН 7,6, 0,002 М ЭДТА) так, чтобы гель был полностью покрыт буфером.
2. Разморозить пробы, приготовленные на прошлом занятии. Перемешать пробы и собрать капли на микроцентрифуге.

4. Нанести пробы в карманы геля под буфер с помощью автоматической пипетки. Кроме опытных проб на две крайние дорожки нанести маркер молекулярных масс.

Пробы для нанесения на гель:

5. Закрыть электрофоретическую камеру и включить напряжение. ДНК движется в электрическом поле от катода (-) к аноду (+). Напряженность электрического поля должна составить 2 В/см в течение первых 15 мин для вхождения проб в гель (30 – 40 В) и затем 3 – 5 В/см (60 – 70 В) в течение примерно 1 – 1,5 ч.

6. После того, как бромфеноловый синий пройдет примерно ¾ геля, выключить напряжение, гель поместить в кювету с раствором бромистого этидия (1 мкг/мл на 0,001 М ЭДТА).

Дата добавления: 2017-04-14 ; просмотров: 859 | Нарушение авторских прав

источник

Электрофорез в агарозном геле проводят в горизонтальном направлении, так как при этом 1) гель с низкой концентрацией агарозы лучше держится, 2) получается меньшее перекашивание (коллапс) в процессе электрофореза и 3) меньше искажаются полосы ДНК. По-видимому, проще всего работать с системой, когда гель полностью покрыт слоем буфера для электрофореза толщиной около 1 мм. Сопротивление агарозы ненамного превышает сопротивление буфера, так что значительная часть тока течет через агарозу.

Во все буферы с нейтральными значениями рН можно добавлять 0,5 мкг/мл бромистого этидия.

В процессе электрофореза буфер у анода защелачивается, а у катода закисляется. Поэтому обычно пользуются буферной системой с высокой емкостью. Буферы не содержат ионов Cl — , так как последние не обладают буферной емкостью, и их присутствие может привести к тому, что ДНК в геле утратит биологическую активность.

1. Трис-боратный буфер. Обладает высокой буферной емкостью. При его использовании, по-видимому, получаются наиболее узкие полосы. Основной раствор 10 × не зарастает, но при длительном хранении в нем образуется осадок, который растворим в щелочи. В присутствии бората агарозные гели не растворяются при высокой концентрации NaClO₄ или KI.
2. Трис-фосфатный буфер. Тоже обладает высокой емкостью. При его использовании получаются примерно такие же результаты, что и при использовании трис-боратного буфера. Основной раствор, однако, может зарастать. Его преимущество заключается в том, что такие гели можно растворять в концентрированном растворе NaClO₄ или KI.
3. Трис-ацетатный буфер. Обладает относительно низкой буферной емкостью, и при длительном электрофорезе может возникнуть необходимость в рециркуляции буфера в аппарате. Использование при электрофорезе высоких напряжений не вызывает нагрева. Исходные растворы могут зарастать. Гели в трис-ацетатном буфере можно растворять в концентрированном NaClO₄ или KI. Этот буфер, по-видимому, используется наиболее широко.
4. Щелочной буфер. Обладает очень низкой емкостью. Обычно при его использовании необходима рециркуляция буфера в аппарате. Наносимые образцы не должны содержать Mg 2+ , иначе ДНК выпадет в осадок. Ионы Mg 2+ необходимо удалять, добавляя избыточные количества ЭДТА.

Препараты агарозы значительно различаются по твердости, по разрешающей способности при разделении фрагментов ДНК, электрофоретической подвижности ДНК, легкости плавления, прозрачности и наличию вредных примесей. Наиболее вредной примесью являются, по-видимому, сульфонированные агарозы, подавляющие активность многих ферментов, работающих на нуклеиновых кислотах.

Обычно мы пользуемся агарозой фирмы МС/В. Агарозу растворяют в буфере для электрофореза, нагревая до кипения в микроволновой печи. Необходимо убедиться, что раствор стал гомогенным и что в нем не осталось твердых частиц агарозы. Перед тем как залить гель, раствор охлаждают до 50°С. Если заливать гель слишком горячей агарозой, то легко можно повредить аппарат для электрофореза

Лунки для образцов делают с помощью погруженной в расплавленный гель гребенки из оргстекла, полихлорвинила или тефлона. Гребенку устанавливают до заливки геля таким образом, чтобы кончики зубьев находились примерно в 0,5 мм от основания геля. Если лунки достанут дна, то образец может протечь под гель. Когда гель полностью застынет, гребенку вынимают и лунки заполняют буфером для электрофореза.

Г. Нанесение образцов и краски

Наносимые образцы содержат 5-10% глицерола или 5-10% сахарозы и 0,025% красителя, благодаря которому можно проследить за ходом электрофореза. Например, можно добавить в образец 1 /₁₀ объема раствора, содержащего 50% глицерола и 0,25% красителя.

ДНК. Наносите около 10 нг ДНК в расчете на каждую ожидаемую полосу. Гель будет перегружен, если в полосе окажется более чем примерно 100 нг ДНК.

Бромфеноловый синий (распадается в щелочи).

Бромкрезоловый зеленый (обладает одинаковой подвижностью и в нейтральных, и в щелочных растворах). Ксиленцианол FF (распадается в щелочи; подвижность ниже, чем подвижность бромфенолового или бромкрезолового).

Образцы можно наносить, используя автоматическую пипетку и полипропиленовый наконечник или с помощью микрошприца, на который надет тонкий пластиковый шланг.

Подвижность небольших молекул ДНК может быть такой же или даже большей, чем подвижность используемого красителя. Чем ниже концентрация агарозы и (или) выше напряженность, тем больший фрагмент ДНК будет обладать такой же подвижностью, как и краситель. Краситель поглощает флуоресценцию связанного с ДНК бромистого этидия. Это приводит к тому, что в том месте геля, где находится краска, невозможно наблюдать слабые полосы ДНК. Образцы можно наносить и без краски.

источник

Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями.

в плашку для электрофореза залить «подложку» — слой агарозы 1.5-2.0% толщиной

2-3 mm, дать застыть;

на этой подложке закрепить гребенку так, чтобы между зубцами и подложкой было расстояние 1-2mm;

залить 0.3% агарозу (лучше в холодной комнате);

гребенку удалять только под слоем буфера, иначе ячейки слипнутся.

ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля. Низкопроцентные гели особенно чувствительны к перегрузке по количеству DNA на дорожку.

Разделение линейных молекул

Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с различной концентрацией агарозы:

% агарозы 0.3 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.2 1.5 2.0 Размер DNA [kbp] 5-60 1-30 1-20 0.8-12 0.6-10 0.5-8 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2

Меньший предел определяется (в основном) диффузией полосы в геле. Т.е. в гелях с низкой концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы не четкие.

Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более длинные молекулы можно эффективно разделить.

Разделение суперскрученных и кольцевых молекул

К сожалению относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий фореза: % геля, скорость фореза (в частности, это означает, что нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул).

Приведенная таблица дает некоторое представление о соотношении подвижностей при умеренной (

6V/cm) скорости фореза (в скобках — при более быстром разгоне):

Размер суперскруч. DNA [kbp] Размер линейной DNA [kbp] для различных % агарозного геля 0.7% 1% 1.5% 2% 2 1.2 1.3 1.3 (1.6) 1.5 (1.0) 3 1.7 1.8 2 (2.4) 2.9 (1.8) 4 2.2 2.3 2.7 (3.7) — 5 2.7 2.9 3.5 (5.5) — 6 3.2 3.5 5 (8.5) — 7 3.9 4.2 8.5 (>12) — 8 4.4 5.0 >12 — 9 5.1 5.9 — — 10 5.8 6.8 — — 12 7 8.7 — —

В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию EtBr.

На 1% агарозном форезе ssDNA бежит чуть быстрее (

10%), чем dsDNA того же размера. ssDNA окрашивается EtBr заметно слабее, чем ds (разница в

4-5 раз). Tо есть, чтобы полосы имели одинаковую интенсивность окраски, требуется взять

Чтобы разделить цепи, нужно либо непосредственно перед форезом прогреть

1′ 100 o C, либо добавить к образцу NaOH до 0.1 М, 5-10′ (NT или 37 o C);

При оценке напряженности поля для горизонтального фореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.

На рисунке показана схема форезов, при разном напряжении. Форезы проводились разное время, так, чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля.

Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для высококачественных или препаративных форезов:

2V/cm(можно меньше для ON форезов). Для аналитических форезов приемлемое качество сохраняется до

DNA особенно легко теряет EtBr при повышенной температуре (что обычно случается, если гонять форезы при высоком напряжении).

EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.

Количество DNA, которое можно наносить на дорожку

Нижний предел определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то не стоит надеяться увидеть 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере

0.005-0.02%) могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. По нашему опыту, элюция фрагмента в РEG вместе с любым из этих красителей не оказывает заметного влияния на меченье, лигирование и трансформацию.
Cresol red (Na соль) — (стоковый раствор 50mM в H 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере

0.1mM) совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV.
OrangeG — (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере

0.01-0.05%) наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV.

Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле. Обычно приводимые в методиках

0.025% для бромфенолового синего и ксиленцианола (в 1х буфере) по нашему мнению слишком большое количество.

* буфера с различными красителями.
* различные разведения буфера для внесения (10х, 2х, 1х). При этом образец любого объема собирается из двух компонентов (буфер+образец), а не из трех (буфер+ вода + образец).
1x если объем образца 25-75%;
10x ==> 75%

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/