Электрофорез – это разделение заряженных макромолекул в пространстве при движении их под действием электрического поля. Ключевой характеристикой определяющей возможность разделения является подвижность макромолекулы. В общем случае подвижность зависит от физического размера молекулы, ее заряда и характеристики внешней неподвижной среды, в которой молекула движется. Условно эту характеристику можно назвать «обобщенная вязкость среды» На сегодняшний день при анализе биологических молекул электрофорезом используется поддерживающая пористая среда в виде гидрофильных гелей различного происхождения и пористости. Наиболее популярные используемые гели — полиакриламидные(ПААГ) и агарозные.
Стандартным электрофоретическим методом, наиболее часто используемым в протеомике и для анализа белков, является SDS – электрофорез по Лэмли( Laemli U , 1970) в ПААГ. Этот метод использует ступенчатую буферную систему(состав буфера меняется в пространстве разделения), которая позволяет уменьшить диффузию и тем самым повысить разрешение метода. Благодаря использованию в методе SD ( L ) S ( sodium dodecyl ( lauryl ) sulfate , ДДС-додецил сульфат натрия, ЛСН – лаурил сульфат натрия) – разделение белков происходит только по их размеру. SDS – является анионным ПАВ(поверхностно активное вещество) его молекулы в воде несут отрицательный заряд в широком диапазоне рН. При нагревании белков в растворе с SDS происходит практически полная их денатурация и они в присутствии SDS сорбируют на себе его молекулы так, что на единицу длины полипептидной цепи приходится практически постоянное число молекул SDS . Тем самым белки приобретают отрицательный избыточный постоянный удельный заряд (приходящийся на единицу длины (массы) белка). Собственный заряд белка при такой обработке становится практически не заметным с точки зрения его влияния на подвижность молекулы белка. Как видно из описания действия SDS , белки в методе Лэмли денатурированы и теряют свою нативную конформацию.
ПААГ готовят непосредственно перед проведением эксперимента. Из раствора(ов) акриламида и бисакриалмида. В качестве инициатора полимеризации используют персульфат аммония(ПСА), а катализатора тетраметилэтилендиамин(ТЕМЕД). Смесь для образования геля (состоящую из раствора акриламида, бисакриламида, буфера, SDS , инициатора и катализатора заливают в специально подготовленный блок(чаще всего это пластина). После изготовления (застывания, полимеризации, образования) блока геля его можно использовать для разделения в специально приспособленной для этого камере. Стандартно разделение происходит в вертикальном блоке.
Протокол SDS электрофореза по Лэмли.
- ТРИС(трис(гидроксиметил)аминометан, 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол, CAS N 77-86-1) основание. Для электрофореза по Лэмли требования к Трис достаточно высоки. Использования реактива низких квалификаций типа Ч. или reagent , без дополнительной очистки недопустимо. ВНИМАНИЕ. Использовать солянокислую соль ТРИС – НЕЛЬЗЯ.
- Акриламид. Идеальной является квалификация electrophoresis grade , но часто подходят и более дешевые марки акриламида, определить пригодность можно только экспериментальным путем. Не рекомендуется использование реактива квалификации reagent , for synthesis и тп.
- Бис акриламид, требования к реактиву аналогичны требованиям к акриламиду
- SDS , так же весьма желательно использование реактива квалификации for molecular biology и выше.
- Глицин (аминоуксусная кислота) можно использовать реактив квалификации electrophoresis grade и выше, не рекомендуется использовать реактив квалификации ч. и reagent .
- Соляная кислота квалификации ХЧ и выше.(можно использовать разбавленный до 6М реактив)
- Персульфат аммония допустимо использование реактива ч и чда после тестирования. Так же необходимо тестировать реактив, если он хранился после даты выпуска более года.
- Тетраметилэтилендиамин (TEMED) к нему не предъявляется очень высоких требований, но так как его расход очень небольшой, лучше использовать реактив высокого качества.
- Глицерин можно использовать тоже без очень высоких требований — косметический , ч , чда, вполне подходят.
- 2-Меркаптоэтанол(МЭ) или дитиотриэтол(ДТТ). К меркаптоэтанолу требования не высокие, но некоторые партии МЭ независимо от квалификации могут содержать примесь белков установить это можно только экспериментально. К ДТТ тоже требования не высокие.
- Бромфеноловый синий без высоких требований.
- Дистиллированная вода аналитической или фармацевтической чистоты.
- Фильтровальная бумага.
- Камера для вертикального электрофореза с комплектом для заливки геля (стекла прокладки, устройство для заливки)
- Блок питания постоянного напряжения с максимальным напряжением 300-400 V и мощностью от 50 W . Желательно что бы в блоке была стабилизация по току.
- Автоматические пипетки со сменными наконечниками на варьируемые объемы 1-10мкл(2-20мкл), 20-200мкл, 100-1000мкл. И наконечники к ним
- Полипропиленовые микропробирки 1.5мл(типа eppendorf )
- Цилиндры мерные на 10, 50, 100, 250, 1000мл. Вместо 10мл и 50мл цилиндров можно использовать центрифужные полипропиленовые пробирки на 15 мл и 50мл (типа falcon ) с нанесенными делениями.
- Весы лабораторные с минимальным пределом взвешивания 0.5г и максимальным 500г, с ценой деления 10мг
- рН метр с ценой шкалы 0.01рН
- Пипетки стеклянные, градуированные на слив 5 и 10мл
- Общелабораторная посуда: Стаканы термостойкие, воронки, стеклянные палочки, банки для растворов с пробками и тд.
- Водяная баня со штативом под микропробирки 1,5 мл или твердотельный термостат с гнездами под те же пробирки.
- Магнитная мешалка (можно самого начального уровня) с набором магнитных якорей в полипропиленовой или политетерафторэтиленовой оболочке
Приготовление запасных растворов:
Взвесить 20г SDS , перенести количественно (ополаскивая небольшим 5-10мл количеством воды посуду для взвешивания и собирая промывки в посуде для приготовления. Посуда для приготовления должна содержать надежную метку, указывающую объем 200мл. Поместить в посуду для приготовления чистый якорь для магнитной мешалки и при постоянном перемешивании добавить сначала примерно 100мл воды, а потом при постоянном перемешивании постепенном растворении довести объем раствора водой до метки 200мл и дождаться полного растворения. Извлечь якорь и довести объем до метки 200 мл, размешать раствор стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Хранить при комнатной температуре, в холодильнике выпадает в осадок.
2)30/1 акриламид(АА30/1) 100мл
Взвесить 29г акриламида, перенести количественно в посуду для растворения. Взвесить 1 г бисакриламида и перенести количественно в посуду для растворения. Посуда для растворения должна иметь надежную метку, соответствующую объему 100мл.
Добавить 50 мл воды, нагретой до 50-60 0 С погрузить чистый якорь магнитной мешалки медленно при постоянном перемешивании и растворении добавлять воду до метки 100мл дождаться полного растворения. Извлечь якорь довести объем до метки 100 мл водой и размешать стеклянной палочкой до гомогенного состояния. Перелить раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой хранить на температуре +8-10 0 С (нежелательно хранить при более низкой температуре, может выпасть осадок.)
Взвесить 18.2г Трис –основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100мл. Добавить примерно 60мл воды погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания от 40 до 90 об/мин. Осторожно (что бы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с помощью медленного, по каплям добавления концентрированной или 6М соляной кислоты до значения 8.8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рН раствора. После того как вы довели рН до величины 8.8, доведите водой объем раствора до отметки 100мл при постоянном перемешивании извлеките якорь и снова добавьте воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенесите раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-10 0 С
4)Раствор 0.625М Трис- HCl рН-6.8(Трис-6.8) 100мл
Взвесить 7.57г Трис основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100мл. Добавить примерно 45-50мл воды погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание. Добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания от 40 до 90 об/мин. Осторожно (что бы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с помощью медленного, по каплям добавления концентрированной или 6М соляной кислоты до значения 6.8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рН раствора. После того как вы довели рН до величины 6.8, доведите водой объем раствора до отметки 100мл при постоянном перемешивании извлеките якорь и снова добавьте воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенесите раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-10 0 С
5)10% раствор персульфата аммония(ПСА) 10мл
Взвесить 1г персульфата аммония в новой или чистой и сухой пробирке из полипропилена типа falcon . Добавить в пробирку воды до отметки 7мл, закрыть герметичной пробкой и интенсивно встряхивая, перемешать. Поставить пробирку вертикально и дать стечь раствору вниз 10 минут. Довести объем раствора водой до отметки 10мл и снова перемешать. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор хранить в холодильнике при температуре 4-10 0 С
6)10х Электродный буфер 1л
Взвесить 144г глицина и 30г Триса-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, имеющую надежную метку объема 1л. Добавить 0.7л дистиллированной воды, погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки поставить раствор в посуде на мешалку и перемешивать до растворения, затем при перемешивании довести объем раствора до 1л водой. Извлечь якорь, проверить объем, при необходимости довести до 1л и перемешать стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-10 0 С
Возьмите мерный цилиндр на 25 мл или полипропиленовую пробирку на 50 мл с делениями (типа falcon )
10 мг БФС(бром феноловый синий) можно примерно на глаз
Доведите объем раствора до 20мл, перемешайте встряхиванием. Хранить при комнатной температуре.
Возьмите полипропиленовую пробирку на 15 мл с градуировкой, типа falcon
Взвесьте и перенесите количественно 750мг SDS в пробирку
Добавьте 15мг БФС (можно приблизительно не глаз)
Доведите раствор горячей водой(50-80 0 С ) до объема 10мл и перемешайте встряхиванием.
Проведение электрофореза по Лэмли
Приготовление разделяющего геля.
Внимание. Все растворы для приготовления перед смешением должны иметь комнатную температуру
Возьмите любой сосуд, вмещающий в себя 10-15 мл раствора.
2.5 мл Трис рН-8.8 и необходимое для нужной концентрации акриламида( см Таблица) количество раствора акриламида АА30/1 и воды.
источник
Метод электрофореза является одним из самых распространенных, мощных и доступных методов исследования белков. Этот метод широко применяется как в научных исследованиях, так и при экспертизе качества продуктов питания и медицинских препаратах, а также в клинических лабораториях.
С помощью метода электрофореза производят:
1) анализ сложных смесей белков (в генетических исследованиях, при выделении и биотехнологической наработке белков)
2) обнаружение определенного белка (при проведении экспертизы, контроле биотехнологических процессов, клинических анализах)
3) определение молекулярной массы белков (в фундаментальных исследованиях)
4) исследование структуры белков (анализ расположения в биологических мембранах, взаимодействия с другими белками, изучение вопросов фолдинга белков)
В основе метода электрофореза лежит тот факт, что молекулы белков в водных растворах заряжены, то есть фактически представляют собой ионы. Как любая частица, несущая электрический заряд, молекулы белков способны перемещаться в электрическом поле. Таким образом, если к раствору белка приложить электрическое поле (опустить в него электроды и подать постоянное напряжение), то все молекулы белков начнут двигаться. Вследствие разницы в аминокислотном составе разные белки заряжены разноименно — положительно или отрицательно. По этой причине различные белки будут двигаться в разных направлениях: положительно заряженные – к катоду (отрицательный электрод), отрицательно заряженные – к аноду (положительный электрод). Кроме того, величина заряда белковых молекул также неодинакова – молекулы одних белков заряжены сильнее, других – меньше. Белки, молекулы которых имеют больший заряд, будут двигаться быстрее, чем те, что несут меньший заряд. Также на разделение белков методом электрофореза большое влияние оказывает размер молекул белков. Более крупные белки движутся медленнее, чем белки небольших размеров, вследствие того, что вода оказывает сопротивление перемещению (является вязкой средой).
По причине того, что аминокислотный состав белков и их масса различаются достаточно сильно, электрофорез позволят анализировать очень сложные смеси белков. Для решения различных исследовательских задач было предложено множество различных вариантов электрофореза.
4.9 Электрофорез по Леммли
Электрофорез по Леммли — один из методов электрофореза в геле, применяемый для анализа сложных белковых смесей. Данный метод позволяет разделять белки по их молекулярной массе. Также электрофорез по Леммли может быть использован для определения молекулярной массы белков.
Белки, подлежащие анализу методом электрофореза по Леммли, предварительно обрабатывают концентрированным 5%-ным раствором додецилсульфата натрия (рис. 15) при 100С в присутствии β-меркаптоэтанола. При этом белковые молекулы приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий её собственный. При последующем разделении в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофоре граммах в соответствие с логарифмом их молекулярной массы
Рис. 15. Додецилсульфата-анион, присутствует в растворах додецилсульфата натрия
В качестве геля для электрофореза по Леммли используются полиакриламидные гели, что позволяет достичь высокой разрешающей способности данного метода. Полиакриламидный гель представляет собой продукт сополимеризации акриламида (рис. 16)
и сшивающего агента N,N- метиленбисакриламда (рис. 17)
Рис. 17. N,N- метиленбисакриламид
В результате процесса сополимеризации образуется прочный, упругий, термостабильный гель, обладающий высокими механическими свойствами и химической инертностью. Пространственная структура геля представляет собой сетку со структурой (рис. 18). Пористость геля зависит от концентрации мономеров и её можно варьировать в значительных пределах от 40 до 0,1 нм (2-30% мономеров). Регулярно чередующиеся амидные группы делают гель гидрофильным. Отсутствие ионизирующихся групп существенно снижает эндосмос, а также взаимодействие белков со структурой геля.
Рис. 18. Структура полиакриламидного геля
В качестве катализатора реакции сополимеризации применяют источник свободных радикалов — персульфат аммония или калия. Катализатором реакции выступает N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин.
Полимеризацию геля ведут в стеклянных трубочках длиной 70-100 мм с внутренним диаметром 5 мм либо плоских пластинах. Для этого в одной трубке последовательно полимеризуют два геля для электрофореза, располагая их один под другим: 1) верхний – крупнопористый гель в котором образец сжимается в узкую полосу (концентрирующий гель), 2) нижний — мелкопористый гель, в котором происходит разделение белковой смеси на компоненты под действием эффекта «молекулярного сита».
Для проведения электрофореза гелевыми столбиками соединяют расположенные друг над другом резервуары с буферами, в которые введены электроды и подают на электроды напряжение 40-800 вольт.
В качестве отчета о проделанной работе:
1. Зарисуйте структурные формулы додецилсульфата натрия, акриламида, N,N- метиленбисакриламида, структуру полиакриламидного геля
2. Зарисуйте расположение белковых полос, полученных в результате электрофореза по Леммли, сделайте вывод о составе выданного вам раствора белка (количество компонентов, примерная доля главных компонентов и их число, примерная доля минорных компонентов и их число)
Подготовить пробу белка для электрофореза. Для этого в эппендорф объемом 2 мл поместить 100 мкл раствора белка с концентрацией 4 мг/мл и добавить 100 мкл буфера пробы. Содержимое перемешать инжектированием.
Поместить пробирки в поплавок и поместить в водяную баню. Нагреть до кипения и кипятить 5 минут, затем охладить
Растворить навеску персульфата калия в 2,5 мл ДВ. Для этого внести автоматической пипеткой 2,5 мл ДВ и перемешивать инжектированием до полного растворения соли (растворение идет медленно)
Собрать трубку для электрофореза и поместить её вертикально в штатив
В центрифужной пробирке приготовить смесь для разделяющего геля
Раствор Мономеров 1250 мкл
1,5 М Трис-HCl рН8,8 167 мкл
р-ра Персульфата калия 20 мкл
После внесения раствора персульфата калия , содержимое пробирки перемешивают инжектированием и немедленно вносят в трубку для электрофореза
Смесь для разделяющего геля вносят в трубку для электрофореза тремя порциями по 800 мкл. Раствор вносят осторожно, по стенке трубки не вспенивая его.
После внесения в трубку раствора для разделяющего геля поверх него осторожно наслоить примерно 100 мкл ДВ
Оставить трубку на 15-20 мин для полимеризации. Об окончании полимеризации свидетельствует появление четкой границы между раствором для разделяющего геля и наслоенной водой.
По окончании полимеризации слить воду с геля, остатки жидкости убрать с поверхности геля фильтровальной бумагой, скрученной в трубочку
В центрифужной пробирке приготовить смесь для концентрирующего геля
Раствор Мономеров 340 мкл
0,5 М Трис-HCl рН6,8 125 мкл
р-ра Персульфата калия 20 мкл
После внесения раствора персульфата калия , содержимое пробирки перемешивают инжектированием и немедленно вносят в трубку для электрофореза
250 мкл смеси для концентрирующего геля вносят в трубку для электрофореза. Раствор вносят осторожно, по стенке трубки не вспенивая его.
После внесения в трубку раствора для разделяющего геля поверх него осторожно наслоить примерно 100 мкл ДВ
Оставить трубку на 5-10 мин для полимеризации. Об окончании полимеризации свидетельствует появление четкой границы между раствором для разделяющего геля и наслоенной водой.
По окончании полимеризации геля с трубки снимаю заглушку и устанавливают трубки для электрофореза в катодную камеру прибора (рис. 19) так, чтобы граница концентрирующего и разделяющего геля была видна в верхней (катодной камере)
Рис. 19. Прибор для вертикального гель-электрофореза в трубках.
1- верхняя, анодная камера, 2 – нижняя, катодная камера, 3 – трубки с гелем для электрофореза, 4 – положительный электрод, анод, 5 — отрицательный электрод, катод.
Приготовить 1,2 л анодного буфера. Для этого разбавить исходный анодный буфер в 4 раза ДВ с помощью мерного цилиндра объемом 1 л.
Заполнить анодную камеру анодным буфером. Поместить в камеру анод (красный провод). Поместить катодную камеру над анодной и зафиксировать её винтами. При этом нижние концы трубок должны быть погружены в буфер в нижней камере (анодный буфер).
Приготовить 1,2 л катодного буфера. Для этого разбавить исходный катодный буфер в 4 раза ДВ с помощью мерного цилиндра объемом 1 л. заполнить катодную камеру катодным буфером. При этом концы трубок должны оказаться под слоем электродного буфера.
Промыть нижние и верхние концы трубок для удаления остатков растворов для полимеризации гелей и пузырьков воздуха.
60 мкл подготовленного раствора белка в эппендорфе смешивают со 180 мкл ДВ и перемешивают инжектированием. 200 мкл полученной смеси вносят в трубки для электрофореза, осторожно наслаивая на поверхность геля.
Включают напряжение 250 вольт, через 10 минут поднимают его до 300 вольт, а еще через 10 минут до 400.
Примерно через 40 минут, когда фронт бромфенолового синего пройдет практически всю трубку, напряжение выключают, внимают электрод из катодной камеры. Разбирают прибор и выливают катодный буфер. Затем вынимают трубки для электрофореза и выталкивают столбики геля из трубок стеклянным штоком. Концентрирующий гель отрезают скальпелем.
Разделяющий гель окрашивают коллоидным раствором кумасси бриллиантового голубого в течение 20 мин на кипящей водяной бане. Затем переносят окрашенный гель в кипящую воду и отмываю до проявления белковых полос.
Вопросы для самоподготовки
В чем практическое значение электрофореза?
Что можно установить с помощью электрофореза?
В чем суть метода электрофореза?
От каких параметров зависит скорость перемещения молекулы белка?
В чем особенность электрофореза по Леммли?
По какому параметру разделяются белки при проведении электрофореза по Леммли?
Вопросы к коллоквиуму по теме «Белки»
2. Элементный состав белков
3. Какие органические соединения называют аминокислотами, химические свойства аминокислот
4. Кислотно-основные свойства аминокислот (амфотерность аминокислот, биполярные ионы, кривые титрования)
5. Классификация аминокислот (биологическая, физико-химическая, химическая)
6. Физические свойства аминокислот, стереоконфигурация аминокислот
7. Специфические реакции на аминокислоты
8. Связь аминокислот в белках, пептидная связь – структура и свойства
9. Биуретовая реакция. Определение белка биуретовым методом.
10. Аминокислотный анализ. Методы хроматографии аминокислот.
11. Нингидриновая реакция. Практическое значение
12. Первичная структура белка. Методы установления первичной структуры белка
13. Вторичная структура белка, α-спираль, β-слой
14. Третичная и четвертичная структура белка
15. Химические связи, стабилизирующие структуру белка (первичную, вторичную, третичную и четвертичную)
16. Растворимость и осаждение белков. Силы удерживающие белок в растворе, условия осаждения белков.
17. Реакции обратимого и необратимого осаждения белков, их практическое значение.
18. Белки как носители электрических зарядов, кислотно-основные свойства белков, изоэлектрическая точка
19. Диализ. Электрофорез. Изоэлектрическое фокусирование
21. Выделение белков из тканей. Методы выделения и очистки белков
Использованная литература
The protein protocols handbook, 2 nd edition – edited by Walker J.M. – Humana press, 2002
Петров К.П. – Методы биохимии растительных продуктов – Киев: Вища школа, 1978.
Шапиро Д.К. – Практикум по биологической химии, 2-е изд. перераб. и доп. – Минск: Высшая школа, 1976
Практикум по биохимии: учебное пособие, 2-е изд. пререаб и доп. – под ред. Северина — М.: МГУ, 1989
Р.Досон, Д.Элиот и др. – Справочник биохимика, пер. с англ. – М.: Мир, 1991
Скурихин И.М., Нечаев А.П. – Все о пище с точки зрения химика: справочное издание. — М.: высшая школа, 1991
Степин Б.Д. — Техника лабораторного эксперимента в химии: учеб пособи для ВУЗов – М.: Химия, 1999
Химическая энциклопедия ТТ.1-5., гл. ред. Кнунянц И.Л. – М.: Советская энциклопедия, 1988-1998
studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2019 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.007 с) . 
источник
Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов).
Наиболее распространённым является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (англ. SDS PAGE).
Элетрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов.
При разделении полученных белковых экстрактов по молекулярной массе использовали электрофорез по Лэммли, так как гидрофобины имеют не большую молекулярную массу, а данный метод является наиболее широко используемым и применимым для белков с молекулярной массой 15-200 кДа.
Этот метод позволяет значительно улучшить разделение фракционируемых белков за счет введения дополнительного так называемого «формирующего» крупнопористого геля, в котором белки не фракционируются, а только концентрируются в виде очень узких полос перед переходом в разделяющий гель.
Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд.
При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:
· белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
· количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
· собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.
В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы.
Для проведения денатуририрующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез (от англ. discontinous — разрывный) то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6,5 и концентрацию полиакриламида около 4 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8,5-9 и концентрацию полиакриламида 10-20 %. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6,5 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8,8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся (в переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью). Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода.
В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.
Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание гелей красителем Кумасси (Coomassie blue) или серебром. Для проведения вестерн блоттинга белки переносят из геля на нитроцеллюлозную мембрану.
Для электрофореза белков в полиакриламидном геле в качестве буферных растворов используют: Трис-HCl, Трис-трицин, TBE, TBE с мочевиной, Bis-Tris.
гриб базидиомицет белок электрофорез
Для удаления экстрагента проводилось выпаривание этанола на ротационной вакуум-выпарной установке при температуре 50?C.
Для определения поверхностной активности выделенных гидрофобинов нам было необходимо проверить воздействие полученных белков на стабильность пены. Известно, что гидрофобины вызывают высокую стабильность пены даже при крайне низких концентрациях.
Для сравнения пенообразования мы использовали один из самых распространенных стабилизаторов пены — казеинат натрия [21]. В качестве загустителя раствора использовали ксантан.
К 20 мл 0,5% раствора ксантана добавляли высушенный белковый препарат, полученный после удаления экстрагента (этилового спирта). В качестве контроля брали 20 мл 0,5% раствора ксантана, содержащего 0,01% казеината натрия. Исследуемый и контрольный образцы вспенивали в течение 20 секунд с помощью роторного вспенивателя. Далее измеряли объем образовавшейся пены непосредственно после вспенивания и каждый день в течение 7 суток.
В статистической литературе пределы варьирования действительного значения произвольной величины при той или иной степени вероятности называется доверительным интервалом.
При малом числе наблюдений (так называемая малая выборка) для оценки достоверности результатов статического исследования прибегают к специальным таблицам, рассчитанным на эти малые числа. Например, таблица вероятности (р) по распределению Стьюдента (t), в которой при данном числе степеней свободы (k = n — 1) определяется для того или иного уровня вероятности (р95, р98, р99) значение величины t (поправочный коэффициент).
Вычисляется средняя величина:
Затем сумма квадратов отклонений:
С = (x1 — x2)2 + (x2 — хср)2 + …+(хn — хср)2 (3)
источник
|
Подготовка форезного аппарата.
10 прогонов);
оценить объем геля:
| ||||||
10′, во время дегазации заняться форезным прибором:
* собрать форезный прибор, отметить фломастером уровень концентрирующего геля (длина зубчиков гребенки + 1сm);
*
5-10ml расплавленной 1.5% агарозы (в GTB-буфере) налить на ровную горизонтальную поверхность. Сразу же установить прибор со стеклами (агароза поднимется между стеклами на
2-10mm).
* «пролить» агарозой внешние края спейсеров;
3-10mm);
10V/cm в концентрирующем геле,
15 µl бактериальной культуры.
Вполне можно пользоваться и промежуточными концентрациями.
Кислород — ингибитор полимеризации. Без дегазации гель, конечно, заполимеризуется, но за большее время (в этом случае стоит увеличить раза в полтора количество PSA и TEMED).
Удобно отлить из остатков гелевого раствора
0.5 -1.0ml в 1.7ml пробирку и использовать ее как индикатор полимеризации.
Можно промакнуть сложенной фильтровалкой.
источник
Для разделения белков сыворотки крови на их составляющие используют метод электрофореза, основанный на различной подвижности белков сыворотки крови в электрическом поле.
Принцип разделения белков сыворотки крови на фракции состоит в том, что в электрическом поле белки сыворотки крови движутся по смоченной буферным раствором хроматографической бумаге (ацетатцеллюлозной пленке, крахмаловому, агаровом гелям) со скоростью, зависящей в основном от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц.
Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются обычно на пять основных фракций: альбумины, альфа-1-глобулины, альфа-2-глобулины, бета-глобулины, гамма-глобулины, содержание которых определяется с помощью фотометрии или денситометрии.
Электрофорез в агаровом, крахмальном и особенно полиакриламидном геле дает лучшие результаты: четкое разделение и большое количество белковых фракций сыворотки. Недостатки метода: сложность процедуры приготовления геля (дороговизна готовых гелевых пластин).
Преимущества электрофореза на ацетатцеллюлозной пленке:
1. Химическая однородность пленки и одинаковый размер пор
2. Требует малый объем пробы (0,2-2 мкл) для разделения
3. Быстрота разделения и окраски белков, легкость отмывания фона
В сыворотке крови здорового человека при электрофорезе можно обнаружить шесть белковых фракций: преальбумины, альбумины, альфа-1-глобулины, альфа-2-глобулины, бета-глобулины и гамма-глобулины.
Это исследование в диагностическом отношении более информативно чем определение только общего белка или альбумина. При многих заболеваниях изменяется процентное соотношение белковых фракций, хотя общее содержание белка в сыворотке крови остается в пределах нормы.
Анализ фореграммы белков позволяет установить, за счет какой фракции происходит увеличение или дефицит белка, а также судить о специфичности изменений, характерных для данной патологии. Исследование белковых фракций, позволяет судить о характерном для какого-либо заболевания избытке или дефиците белка только в самой общей форме.
Белковые фракции сыворотки крови в норме:
| Фракции | Содержание, % |
| Преальбумины | 2-7 |
| Альбумины | 52-65 |
| Альфа-1-глобулины | 2,5-5,0 |
| Альфа-2-глобулины | 7,0-13,0 |
| Бета-глобулины | 8,0-14,0 |
| Гамма-глобулины | 12,0-22,0 |
При анализе результатов исследования сыворотки крови на белковые фракции выявляются три типа нарушений:
1. Диспротеинемия (изменение соотношения белковых фракций)
2. Генетические дефекты синтеза белков
3. Парапротеинемия (аномальные белки в крови)
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: На стипендию можно купить что-нибудь, но не больше. 8986 — 
| 7235 — 
или читать все.
195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
в томском государственном университете
Методы очистки и выделения белков. Часть 3.
Электрофоретические методы разделения протеинов
Электрофорез на полиакриламидном геле (ПААГ, PAGE ).
Суть метода- разделение заряженных соединений на основе их подвижности в электрофоретическом поле. При наложении разности потенциалов в какой-то среде положительно заряженные молекулы движутся к отрицательно заряженному электроду, а отрицательно заряженные- к положительному электроду. В качестве среды разделения используется гель полиакриламида в воде. Если в горячей воде растворить определенное количество полиакриламида и затем раствор охладить образуется студень, называемый гелем. Природа любого геля- структура, в которой молекулы воды удерживаются внутри трехмерной сетки, образованной длинными полимерными молекулами. С увеличением концентрации молекул полимера в геле «ячейки» этой сетки становятся все мельче, а с уменьшением- наоборот, диаметр «ячейки» увеличивается. В основу разделения молекул белков гель-электрофорезом положены эти основные характеристики геля.
Наиболее часто разделение осуществляется на пластинах, покрытых слоем геля толщиной 2-3 мм. Размеры пластины 10 х 14 см или иное, в зависимости от конструкции прибора. В процессе электрофореза пластина с гелем разогревается в результате протекания через нее тока. Степень разогрева пластины зависит от величины напряжения, при котором происходит разделение. Чем выше напряжение, тем выше сила протекающего по пластине тока и сильнее ее разогревание, поэтому применение высоких напряжений должно сопровождаться охлаждением пластины, чтобы не допускать тепловую денатурацию разделяемых белков. Величина продвижения белков в геле зависит (в идеале) только от величины наложенного потенциала и времени. В среднем, основная масса разделений требует около 2000 В.часов. Это означает, что при потенциале 500 В разделение может закончиться за 4 часа, а при потенциале 150 В на это потребуется около 14 часов.
Аппаратура для гель-электрофореза может различаться конструктивно при неизменности принципов разделения.
Существуют две основные разновидности электрофореза – на градиентных гелях и с ионным детергентом (ДСН-ПААГ, SDS — PAGE ).
Электрофорез на градиентном полиакриламидном геле.
В качестве среды разделения используется пластина с гелем с изменяющейся концентрацией (от 4 до 30 %) полиакриламида. Чаще всего используются ТРИС-боратные буферы (рН=8,4) с добавками динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Гель уравновешивается с буфером наложением потенциала 70 В в течение 20 мин (без добавления образца). После этого наносятся полосы анализируемых образцов и маркеров (белков с известной ММ) и накладывается потенциал 150 В, разделение продолжается 16 часов. (Или 3 часа при 500 В- если имеется возможность охлаждения пластины).
Фиксирование полос происходит 30 мин в 10 % растворе сульфосалициловой кислоты, после чего пластина окрашивается красителем Кумасси Голубой (0,02% в 7% уксусной кислоте) в течение ночи. Пластина осветляется электрофорезом при 24 В 45 мин в 7% уксусной кислоте, после чего можно наблюдать окрашенные полосы белков.
Разделение осуществляется в результате задерживания (застревания) белковых молекул во все более мелкопористом (рост содержания полиакриламида) геле. При этом происходит накопление белка, за счет постепенного «подтягивания» отстающих молекул. Метод отличается высокой эффективностью разделения и очень узкими полосами разделения. Количество наносимой пробы зависит от способа окрашивания белка, с красителем Кумасси составляет 5 мкл. (С серебряным прокрашиванием- концентрация белка может быть в 50 раз меньше).
Электрофоретическая картина разделения на градиентном геле коммерческих протеинов (апоферритин- полоса 2, гексокиназа- 3 и инвертаза — 4) с белками-маркерами молекулярной массы (полосы 1 и 5) показана ниже:
Калибровочный график для определения молекулярных масс неизвестных белков представляет собой зависимость:
Электрофорез SDS-PAGE (с додецилсульфонатом натрия).
Наиболее распространенным в последнее время является вариант электрофореза в присутствии детергентов, в частности- додецилсульфоната натрия (SDS). Процесс можно осуществлять как на геле постоянной плотности, так и на градиентных гелях. В основе метода лежит способность детергента реагировать и денатурировать широкий спектр белков одинаковым образом. Нативные белки, имеющие различные форму молекулы, заряд и размеры в процессе взаимодействия с SDS превращаются в комплексы с ним, имеющие постоянное соотношение заряда на единицу массы (так как заряд SDS маскирует заряды протеинов) и идентичную конформацию, которая варьирует в размере прямо пропорционально молекулярной массе субъединицы. При неизменных условиях электрофореза (рН, напряжение, время, концентрация геля и т.д.) электрофоретическая подвижность протеина зависит от его плотности заряда, массы и формы. Поскольку большинство комплексов протеин-SDS имеют постоянные соотношения «заряд-масса» и идентичную форму, их подвижность зависит исключительно от размера. Поэтому определение молекулярной массы неизвестного протеина сводится к сравнению подвижности его комплекса с SDS с подвижностью комплексов «SDS-протеин известной молекулярной массы». Обработка образцов осуществляется добавлением SDS до концентрации 2,5% и бетта-меркаптоэтанола до концентрации 5%, после чего смесь тщательно перемешивается и нагревается при 100 С (в кипящей водяной бане) в течение 5-10 минут. Таким образом достигается полная денатурация и диссоциация четвертичной структуры.
Электрофоретическая картина разделения протеинов на геле постоянной концентрации (12,6%) в присутствии детергента (0,1% SDS) выглядит так:
И ее калибровочная зависимость:
То же разделение, на градиентном геле Pharmacia PAA 4/30 в 0,2% SDS:
и его графическая зависимость для определения молекулярной массы:
Калибровочные (по молекулярной массе) белки:
источник
Содержимое (Table of Contents)
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Электрофорез ОФС.1.2.1.0023.15
в полиакриламидном геле Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также в зависимости от конфигурации молекул. Изменяя концентрацию полимера, можно получать гели с широким диапазоном размеров пор, позволяющих проводить разделение белков и пептидов с молекулярными массами от 2 до 300 тыс. кДа. Можно также изменять электрический заряд макромолекул (путем вариации рН буферного раствора) и их конформацию за счет введения в буферный раствор денатурирующих агентов или детергентов.
Протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима с целью исключения изменений вязкости, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов.
Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними, причем скорость миграции наиболее подвижных макромолекул пробы должна быть несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда фронт красителя достигает противоположной границы геля, электрофорез прекращают.
Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и выдерживают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты фиксируются в том самом месте, где закончилась их миграция. После фиксации или одновременно с ней проводят окрашивание зон путем выдерживания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.
Вместо окрашивания или наряду с ним могут использоваться радиоактивные метки и приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.
Гель полиакриламида имеет ряд преимуществ, определяющих его широкое использование. Он прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей, и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос.
Разделяющие свойства полиакриламидных гелей (ПААГ) определяются трехмерной сетью волокон и пор, которая сформирована за счет бифункциональных бисакриламидных связей между смежными полиакриламидными цепями. Полимеризация катализируется системой, производящей свободные радикалы, составленной из аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина.
С увеличением концентрации акриламида в геле эффективный размер пор уменьшается. Эффективный размер пор геля определяет его разделяющие свойства, то есть сопротивление геля к перемещению макромолекул. Существуют пределы концентраций акриламида, которые могут использоваться. При высоких концентрациях акриламида гели становятся более ломкими и трудны в обращении. С уменьшением размера пор геля уменьшается скорость перемещения белка через гель. Регулируя размер пор геля путем изменения концентрации акриламида, можно оптимизировать разрешающую способность метода для конкретного анализируемого образца. Таким образом, физическое состояние ПААГ характеризуется по составу акриламида и бисакриламида. Обычно используются гели, в которых общая концентрация мономера и сшивающего агента находится в диапазоне от 3 до 30 %, а количество сшивающего агента обычно составляет от одной десятой до одной двадцатой от количества мономера. При этом содержание сшивающего агента тем меньше, чем выше общая концентрация геля.
Электрофорез в полиакриламидных гелях с использованием натрия додецилсульфата (SDS) – наиболее распространенный способ электрофореза, используемый для оценки подлинности и чистоты белковых продуктов. Денатурированные под воздействием высокой температуры полипептиды, связываясь с анионным детергентом SDS, становятся отрицательно заряженными и приобретают конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы независимо от типа белка. Поскольку количество связанного SDS почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от последовательности аминокислот в полипептиде, SDS-полипептидные комплексы мигрируют через полиакриламидные гели с подвижностью, прямо пропорциональной молекулярной массе полипептида.
Молекулярная масса белка может быть оценена по его относительной подвижности на прокалиброванном геле, и обнаружение отдельной полосы в таком геле является критерием чистоты.
Однако, наличие у полипептида радикалов типа N- или O-связанных гликозидов оказывает существенное влияние на оценку молекулярной массы белка, поскольку SDS не связывается с углеводной частью молекулы так же, как с полипептидной. Таким образом, пропорциональность отношения «заряд к массе» не выдерживается и электрофоретическая подвижность белков, подвергшихся посттрансляционным модификациям, не является истинным отражением молекулярной массы полипептидной цепи.
Трехмерная структура белков часто поддерживается за счет дисульфидных связей. Цель анализа SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить эту структуру путем расщепления дисульфидных связей. Денатурация и дезагрегация белков заключается в обработке их 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (DTT), в результате которой происходит разрыв S-S связей, разворачивание полипептидной цепи и последующее связывание с SDS. В этих условиях молекулярная масса полипептидных субъединиц может быть рассчитана методом линейной регрессии при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.
Без обработки восстанавливающими агентами типа 2-меркаптоэтанола или DTT дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Невосстановленные белки не могут полностью насыщаться SDS и, следовательно, не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Это делает определение молекулярных масс этих молекул методом SDS-ПААГ менее стандартизованным, чем исследование полностью денатурированных полипептидов. Однако, выявление одной полосы в таком геле (т.е. отсутствие любых компонентов, отличных от основного компонента) является показателем чистоты белка.
Электрофорез белков в полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом (SDS-PAGE), как правило, проводится в неоднородной буферной системе, которая описывается ниже.
Электрофорез в геле с неоднородной буферной системой (диск—электрофорез)
Метод диск-электрофореза, благодаря своей высокой разрешающей способности, рекомендуется для характеристики смесей белков и для обнаружения примесей, которые могут иметь подвижность, близкую к подвижности главного компонента.
Метод подразумевает использование прерывистой системы, состоящей из двух отличных гелей: разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего) геля. Эти два геля имеют различную пористость (верхний – крупнопористый, нижний – мелкопористый). Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. Пористость, длина и тип буфера для нижнего геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза.
Отличительной особенностью данного вида электрофореза является обязательное использование в составе электродного буферного раствора подвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки; например, применение иона Cl — для щелочных буферных растворов или иона K + – для кислых. В этом буферном растворе подвижность иона, мигрирующего в том же направлении, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для этого удобно использовать цвиттерионы: например, простые аминокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки лежат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97).
Под действием электрического поля ионы глицина, входящие в состав электродного буферного раствора, следуют за белками в концентрирующий гель. Область перемещающихся границ быстро формируется под действием высоко подвижных хлорид-ионов во фронте и относительно медленных замыкающих ионов глицина. Хлорид-ион из-за его небольшого размера мигрирует быстрее, чем любой из белков, присутствующих в образце. Величина рH образца и концентрирующих слоев выбирается так, чтобы быть приблизительно на 3 единицы ниже, чем верхнее значение pKa глицина. Поэтому, на пересечении этих слоев только около 0,1% глициновых молекул имеют отрицательный заряд. Таким образом, быстродвижущиеся хлорид-ионы постепенно замещаются ионами глицина, которые при рН 6,8 в концентрирующем геле нейтрализуются и перестают участвовать в проведении тока. Сопротивление верхней части концентрирующего геля резко возрастает, а вместе с ним возрастает и напряженность поля. Локализованные зоны высоковольтового градиента между передним и задним ионными фронтами вызывают относительно высокую скорость миграции белков в концентрирующем геле, которая не ограничивается благодаря крупнопористой структуре этого геля.
На границе концентрирующего и разделяющего гелей белки достигают высокоплотных слоев геля и замедляются из-за уменьшающегося размера пор разделяющего геля. Более высокое значение pH, с которым фронт электродного буферного раствора встречается в разделяющем геле, также заставляет глицинат мигрировать быстрее, и напряженность поля падает, что также снижает скорость движения белков. Таким образом, происходит концентрирование пробы и все компоненты образца, независимо от первоначальной высоты столбика пробы в лунке, входят в нижний гель практически одновременно в виде узкой зоны с высокой концентрацией белка.
В мелкопористом разделяющем геле начинается процесс медленной миграции белков и их фракционирования в зависимости от молекулярных масс, а то обстоятельство, что процесс разделения начинается с узкой исходной зоны, обеспечивает высокую разрешающую способность системы вцелом.
Прибор для электрофореза состоит из:
1) источника постоянного тока с регулируемым напряжением и со стабилизатором напряжения;
2) камеры для электрофореза, служащей для размещения пластинки или трубки геля и поддержания постоянных условий проведения анализа. Камера обычно имеет прямоугольную форму, изготовлена из стекла или твердой пластмассы с двумя изолированными буферными резервуарами (анодным и катодным), содержащими раствор электролита. В каждый резервуар погружен электрод (например, платиновый), подключенный к соответствующему полюсу источника тока. Должен поддерживаться одинаковый уровень электролитов в резервуарах, чтобы предотвратить поток жидкости и гидростатическое давление на гель. Камера для электрофореза оснащена крышкой, которая предотвращает испарение растворителей и обеспечивает равномерно насыщенную влагой атмосферу во время всего процесса. Предпочтительно использование предохранителя для отключения электропитания, когда крышка камеры снята. Если мощность тока, приложенного к электрофоретической пластинке, превышает 10 Вт, то рекомендуется применять охлаждение камеры.
3) устройства для заливки геля, представляющего собой стеклянную трубку, стеклянную пластину или пару прямоугольных пластин (ячейку), служащих для формирования поддерживающей среды, в которой непосредственно проводится процесс электрофоретического разделения. Пластины могут быть расположены в камере вертикально или горизонтально (вариант горизонтального электрофореза обычно применяется для агарозных гелей) и должны быть погружены или иметь контакт посредством фитилей с катодным и анодным изолированными буферными резервуарами, содержащими раствор электролита. Преимуществом пластин для проведения процесса является возможность сравнения образцов в одной общей ячейке геля, что более информативно по сравнению с набором гелей из ряда трубок. Преимущество горизонтальных пластин по сравнению с вертикальными заключается в отсутствии проблемы герметизации швов, а недостаток – в большой поверхности контакта с воздухом и, соответственно, риске испарения жидкости.
Сборку прибора и его очистку после использования проводят в соответствии с инструкцией производителя.
Перед заливкой геля основание и боковые стороны ячейки закрывают подходящими прокладками, толщина которых определяет толщину рабочего геля (при этом после полимеризации геля прокладку в основании убирают). Ячейку заполняют раствором мономера с поперечно-сшивающим агентом и катализатором. Растворы должны быть дегазированы перед полимеризацией и гели должны использоваться свежеприготовленными. Заливку растворов проводят таким образом, чтобы исключить попадание внутрь ячейки пузырьков воздуха.
Гребенку, имеющую зубцы соответствующего размера (в зависимости от объемов наносимого образца), устанавливают в верхнюю часть ячейки на разделяющий гель и оставляют там до окончания полимеризации геля. Формирование геля обычно занимает не менее 30 мин и может считаться законченным, когда между гелем и водным слоем появляется четкая граница. После удаления гребенки из геля, прошедшего полимеризацию, остается ряд лунок.
Заполняют нижний и верхний резервуары камеры предписанным электродным буферным раствором. Готовят испытуемый и стандартный растворы, содержащие краситель и сахарозу или другой плотный и вязкий растворитель. Наносят образцы шприцем или микропипеткой в основания лунок, сразу включают электрический ток и начинают электрофорез, соблюдая предписанные условия (температуру и величину напряжения).
После окончания процесса (когда краситель достигает нижней границы пластины) ток выключают, пластину удаляют из камеры, зоны фиксируют, окрашивают и при необходимости пластину высушивают.
Подготовка полиакриламидного геля для вертикального электрофореза с SDS в неоднородной буферной системе
Сначала готовят и заливают в подготовленную ячейку нижний разделяющий гель, а затем сверху наслаивают концентрирующий гель.
В конической колбе готовят рассчитанное в зависимости от объема ячейки количество раствора для разделяющего геля, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в Таблице 1. Смешивают компоненты в указанном порядке. В тех случаях, где требуется, перед добавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (TEMED) раствор фильтруют, и, если необходимо, дегазируют раствор через мембрану из ацетата целлюлозы (с диаметром пор
0,45 мкм) под вакуумом при перемешивании. Добавляют соответствующие количества раствора аммония персульфата и TEMED как указано в табл. 1, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки. Оставляют достаточное место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя суженную стеклянную пипетку, тщательно наслаивают на гель сверху воду или изобутанол. Оставляют гель в вертикальном положении при комнатной температуре до завершения полимеризации.
После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.
В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл.2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 5 мл | 10 мл | 15 мл | 20 мл | 25 мл | 30 мл | 40 мл | 50 мл | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 4% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 2,6 | 5,3 | 7,9 | 10,6 | 13,2 | 15,9 | 21,2 | 26,6 |
| Раствор акриламида 1) | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | 8,0 | 10,0 |
| 1,5М Трис | ||||||||
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 1 мл | 2 мл | 3 мл | 4 мл | 5 мл | 6 мл | 8 мл | 10 мл | |
| Вода очищенная | 0,68 | 1,4 | 2,1 | 2,7 | 3,4 | 4,1 | 5,5 | 6,8 |
| Раствор акриламида 1) | 0,17 | 0,33 | 0,5 | 0,67 | 0,83 | 1,0 | 1,3 | 1,7 |
| 1,0М Трис | ||||||||
(рН 6,8) 6)
1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1)
2) 1,5М Трис (рН 8,8): 1,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 8,8
3) 100 г/л SDS: раствор натрия додецилсульфата 100 г/л
4) 100 г/л APS: раствор аммония персульфата 100 г/л. Аммония персульфат является источником свободных радикалов, которые управляют полимеризацией акриламида и бисакриламида. Таким образом, раствор аммония персульфата должен добавляться медленно.
5) TEMED: тетраметилэтилендиамин.
6) 1,0М Трис (рН 6,8): 1 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 6,8
Гель со вставленной гребенкой оставляют в вертикальном положении при комнатной температуре до окончания полимеризации.
Если в фармакопейной статье нет других указаний, то определение молекулярных масс проводят при нагрузке на лунку 10 мкг общего белка, а определение чистоты – при нагрузке 40 мкг при окрашивании Кумасси бриллиантовым R250, а при окрашивании нитратом серебра достаточно 2–5 мкг белка на лунку.
Толщина гребенки выбирается точно в соответствии с толщиной используемых прокладок, а размер зубцов – в соответствии с предполагаемым объемом образцов. Необходимый и достаточный объем формируемой лунки определяется как произведение длины, ширины и высоты (в микрометрах) одного зубца гребенки: V = L ∙ D ∙ H.
Объем наносимого образца вычисляют следующим образом:
где: k – коэффициент разбавления пробы буферным раствором для образца;
Х – требуемое для нанесения на гель количество белка в зависимости от целей анализа, в мкг;
С – концентрация общего белка, определяемая по методу Лоури, в мкг/мл.
После окончания полимеризации аккуратно удаляют гребенку, немедленно ополаскивают лунку водой, чтобы удалить любые остатки неполимеризованного акриламида. Если необходимо, выправляют зубцы концентрирующего геля при помощи тупой подкожной иглы, насаженной на шприц.
Устанавливают гель в прибор для электрофореза согласно инструкциям изготовителя оборудования. Добавляют электродный буферный раствор в верхнюю и нижнюю буферные емкости. Обычно, если нет других указаний в фармакопейной статье, в качестве электродного буферного раствора используется трис-глициновый буферный раствор с рН 8,3-8,4.
Удаляют любые пузыри, которые могут появиться у основания геля между стеклянными пластинами. Не следует включать электрический ток до внесения образцов, так как это уничтожит неоднородность буферных систем.
Готовят испытуемый раствор и раствор сравнения в рекомендованном буферном растворе для образцов в соотношении, указанном в фармакопейной статье или нормативной документации.
Обычно для обеспечения полной денатурации образец в смеси с буферным раствором подвергают дополнительно температурной обработке, режим которой должен быть указан в фармакопейной статье или нормативной документации.
Наносят соответствующие объемы каждого из растворов в лунки концентрирующего геля. Начинают электрофорез, используя условия, рекомендуемые изготовителем оборудования.
Изготовители оборудования для SDS-ПААГ могут обеспечивать применение гелей различной площади и толщины. Соответственно продолжительность электрофореза и сила тока (или напряжение) могут быть изменены, как описано изготовителем прибора, чтобы достичь оптимального разделения, что проверяют по скорости перемещения фронта индикатора в разделяющем геле.
Когда индикатор достигает основания геля, электрофорез останавливают. Удаляют ячейку с гелем из прибора и отделяют стеклянные пластины. Удаляют прокладки, отрезают и удаляют концентрирующий гель и немедленно проводят процедуру окрашивания. Для того, чтобы можно было выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель рекомендуется обрезать не полностью, оставляя 2–3 мм.
Так называемые, «готовые к использованию» коммерческие гели и наборы реактивов к ним могут быть применены при условии, что они дают результаты, отвечающие валидационным критериям, приведенным ниже в разделе «Оценка пригодности системы».
Окрашивание Кумасси бриллиантовым R250 – наиболее распространенный метод окрашивания белков с пределом обнаружения порядка от 1 до 10 мкг белка в полосе. Окрашивание нитратом серебра – более чувствительный метод окрашивания белков в гелях, позволяющий выявлять до 1 нг белка.
Для селективного окрашивания гликозилированных белков или липопротеидов иногда применяют другие красители или их смеси, о чем должно быть сделано дополнительное указание в фармакопейной статье или нормативной документации.
Все процедуры окрашивания геля проводят, как правило, при комнатной температуре и при слабом перемешивании в любом удобном контейнере. При окрашивании геля следует использовать одноразовые перчатки, иначе на геле могут быть прокрашены отпечатки пальцев.
Погружают гель в большой избыток красящего раствора Кумасси раствора и выдерживают, по крайней мере, 1 ч. Поскольку кислотно-спиртовой состав окрашивающего раствора не позволяет полностью фиксировать белки на геле, это может приводить к потерям некоторых низкомолекулярных белков во время окрашивания и обесцвечивания тонких гелей. Полная фиксация возможна при выдерживании геля в 10 % растворе трихлоруксусной кислоты в течение 1 ч перед погружением в окрашивающий Кумасси раствор.
Для ускорения процедуры окрашивания допускается подогрев геля в окрашивающем растворе в микроволновой печи. Режим подогрева должен быть описан в фармакопейной статье или нормативной документации. Затем окрашивающий раствор удаляют и гель промывают водой.
Обесцвечивают гель избытком обесцвечивающего раствора. Заменяют порции обесцвечивающего раствора несколько раз до тех пор, пока окрашенные полосы белка не станут ясно различимы на прозрачном фоне. Чем более полно обесцвечен гель, тем меньшие количества белка могут быть обнаружены этим методом. Обесцвечивание может быть ускорено при добавлении в обесцвечивающий раствор нескольких граммов анионобменной смолы или маленького кусочка пористого материала.
После обесцвечивания гель промывают водой и либо высушивают, либо оставляют в воде для хранения при температуре от 2 до 8 °С.
Погружают гель в большой избыток фиксирующего раствора и выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий раствор сливают, добавляют новую порцию того же раствора и инкубируют, по крайней мере 1 ч или оставляют на ночь. Сливают фиксирующий раствор и промывают гель в большом избытке воды в течение 1 ч. После этого пропитывают гель в течение 15 мин в 1 % растворе глутарового альдегида. Промывают гель дважды по 15 мин большим количеством воды. Выдерживают гель в темноте в свежеприготовленном 2 % растворе серебра нитрата в течение 15 мин. Промывают гель три раза по 5 мин в большом количестве воды. Погружают гель приблизительно на 1 мин в проявляющий раствор, пока не будет достигнуто удовлетворительное окрашивание. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в треке с минимальным количеством препарата (например, 0,001 мкг). Останавливают развитие окраски погружением в стоп-раствор на 15 мин. Ополаскивают гель водой.
Целесообразно использовать готовые наборы реактивов для окрашивания гелей серебра нитратом.
В зависимости от используемого метода окрашивания подготовку геля к высушиванию проводят различными способами:
– при окраске Кумасси после процедуры обесцвечивания гель выдерживают в смеси 10,0 г глицерина и 92 мл воды очищенной не менее 2 ч (возможна инкубация «на ночь»);
– при окраске нитратом серебра гель после заключительной процедуры ополаскивания выдерживают в течение 5 мин в смеси 2,0 г глицерина и 98 мл воды очищенной.
Погружают два листа пористой целлюлозной пленки в воду и выдерживают в течение 5–10 мин. Растягивают один из листов на рамке для высушивания. Аккуратно помещают пропитанный в глицериновом растворе гель на натянутую целлюлозную пленку. Удаляют все случайно попавшие воздушные пузыри, и заливают вокруг граней геля несколько миллилитров воды. Помещают второй лист пленки сверху и снова удаляют все воздушные пузыри. Заканчивают сборку рамки для сушки геля и помещают ее в сушильный шкаф или оставляют при комнатной температуре до полного высыхания.
Молекулярные массы белков определяют по сравнению их подвижностей с подвижностью нескольких белков-маркеров известной молекулярной массы. Готовые смеси белков с точно известными молекулярными массами (маркеры) для калибрования гелей предлагаются производителями материалов и оборудования для электрофореза в различных диапазонах молекулярных масс. Концентрированные исходные растворы полипептидов известной молекулярной массы готовят в соответствующем буферном растворе для образцов и наносят на гель одновременно с образцом испытуемого белка.
Сразу после того, как электрофорез завершен, следует отметить положение полосы красителя бромфенолового синего, которая соответствует электрофоретическому ионному фронту. Это может быть сделано при помощи меток-надрезов в геле или путем прокола геля в зоне окрашенного фронта иглой, предварительно обмакнутой в черную тушь или другой подходящий контрастный краситель.
После окрашивания геля измеряют расстояния пробега для каждой полосы белка (маркеров и испытуемого образца) от вершины разделяющего геля. Вычисляют отношение расстояния пробега каждого белка к расстоянию пробега фронта красителя. Нормализованные расстояния пробега, вычисленные таким образом, называются относительными подвижностями белков (относительно фронта красителя) и обозначаются как Rf.
где: R – расстояние пробега белка;
RS – расстояние пробега красителя
Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс стандартов белка (Мr) от значения Rf. Неизвестные молекулярные массы могут быть оценены методом линейной регрессии или интерполяцией кривых зависимости logMr от Rf в том случае, если значения, полученные для испытуемых образцов, находятся в линейной части графика.
В тех случаях, когда в фармакопейной статье указан предел примесей, то перед анализом должен быть приготовлен раствор сравнения, соответствующий этому уровню примеси, путем разбавления испытуемого раствора. Например, в случае 5 % предела, раствор сравнения должен быть приготовлен разведением испытуемого раствора в соотношении 1:20. При этом примесь (полоса, отличная от главной полосы) на электрофореграмме с испытуемым препаратом не должны быть интенсивнее, чем полоса, полученная с раствором сравнения. При наличии нескольких полос примесей должно быть предусмотрено требованию к содержанию каждой из них и к содержанию суммы примесей.
Приемлемым условием определения примесей может считаться метод количественной нормализации с использованием денситометрического интегрирования. В этом случае предварительно должна быть показана линейность отклика прибора.
Результаты анализа считаются достоверными только в том случае, если:
- белки маркера молекулярных масс распределены приблизительно на 80 % длины геля и охватывают весь требуемый диапазон разделения (например, диапазон молекулярных масс продукта и его димера или продукта и родственных примесей);
- зависимость логарифма молекулярной массы белков-маркеров и Rf – линейна в необходимом диапазоне.
Дополнительные требования приемлемости результатов анализа должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
1) Приготовление 30% раствора акриламида/бисакриламида. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 29,2 г акриламида и 0,8 г N,N’-метиленбисакриламида, растворяют в воде очищенной при перемешивании, доводят объем раствора водой до 100 мл и вновь перемешивают (при необходимости раствор фильтруют, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации). Раствор хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
2) Приготовление раствора натрия додецилсульфата. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде очищенной при аккуратном перемешивании, избегая вспенивания, доводят объем раствора до 100 мл и вновь перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре.
3) Приготовление раствора аммония персульфата. Растворяют 100,0 мг аммония персульфата в 1,0 мл воды очищенной. Раствор используют свежеприготовленным.
4) Приготовление 1,5М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 8,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 90,8 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 8,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
5) Приготовление 1,0 М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 60,6 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 6,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
6) Приготовление электродного буферного раствора (10×) (рН 8,3). В мерный стакан, вместимостью 1000 мл помещают 30,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 144,0 г глицина и 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Фильтруют и измеряют рН раствора, который должен быть 8,3 — 8,4. Доводить рН раствора кислотой или щелочью до необходимого значения не допускается.
Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.
Непосредственно перед анализом 1 часть приготовленного раствора смешивают с 9 частями воды очищенной.
7) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанавливающих условиях с 2-меркаптоэтанолом. В химическом стакане смешивают 4,7 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,4 мл 2-меркаптоэтанола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
8) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанвливающих условиях с дитиотреитолом. В химическом стакане тщательно перемешивают 5,0 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,06 г 1,4-дитиотреитола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор используют свежеприготовленным.
9) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в невосстанвливающих условиях. В химическом стакане тщательно смешивают 5,1 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 3 мес.
10) Приготовление красящего раствора Кумасси. Раствор готовят по одному из способов приготовления (№ 1 или № 2):
Раствор № 1. Растворяют 0,3 г Кумасси бриллиантового R250 в смеси 100 мл спирта метилового или этилового и 100 мл воды очищенной. Перемешивают до полного растворения (в течение 1 ч). Добавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 250 мл и перемешивают. Хранят окрашивающий раствор в темной бутыли при комнатной температуре. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.
Раствор № 2. 1,0 г Кумасси ярко-голубого R-250 помещают в химический стакан, доводят до объема 250,0 мл этиловым спиртом, перемешивают не менее 3,5 часов до полного растворения красителя, добавляют 100,0 мл кислоты ледяной уксусной и доводят объем деионизованной водой до 1000,0 мл. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.
11) Приготовление обесцвечивающего раствора. К 400 мл спирта метилового или этилового добавляют 100 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора до 1000 мл и перемешивают.
12) Приготовление фиксирующего раствора. К 250 мл спирта метилового или этилового добавляют 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.
13) Приготовление 1 % раствора глутарового альдегида. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 4 мл 25 % глутарового альдегида или 2 мл 50 % глутарового альдегида, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают.
14) Приготовление раствора серебра нитрата. Смешивают 2,75 мл 25 % раствора аммиака и 40 мл 1 М раствора натрия гидроксида, прибавляют по каплям при постоянном перемешивании 8 мл 20 % раствора серебра нитрата, доводят объем раствора водой очищенной до 200 мл и перемешивают.
15) Приготовление 20 % раствора серебра нитрата. Растворяют в воде очищенной 2,0 г (точная навеска) серебра нитрата, доводят объем раствора водой до 10 мл и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
16) Приготовление проявляющего раствора. Смешивают 2,5 мл 2,0 % раствора лимонной кислоты и 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.
17) Приготовление стоп-раствора. К 50 мл воды прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 100 мл и перемешивают.
В случае использования других реактивов и растворов они должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
источник