Электрофорез рнк агарозном геле

Для предварительной оценки степени деградации РНК можно провести ее электрофорез в агарозном геле в ТБЭ. В препаратах РНК хорошего качества содержание 28S-PHK должно быть примерно в три раза выше, чем 18S-PHK. Если это отношение меньше, значит, РНК частично деградирована. Для более точной оценки качества образцов нужно провести гель-электрофорез денатурированной РНК или электрофорез в денатурирующих гелях. Эти два метода описаны соответственно в протоколах.

Материалы
Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• 6 М глиоксаль: глиоксаль обычно поставляют в виде 40% (6 М) раствора. Поскольку глиоксаль быстро окисляется на воздухе, перед использованием его деионизуют с помошью катионо-обменной и анионообменной смол (например, Bio-Rad AG 501-Х8), перемешивая глиоксаль вместе со смолами на орбитальном шейкере до достижения рН менее 5,0, Деионизован-ный глиоксаль хранят разлитым на аликвоты в плотно закрытых пробирках при —20 °С. Пробирки должны быть заполнены максимально полно и каждую аликвоту можно использовать только один раз
• ДМСО: обычно высококачественный ДМСО можно использовать в том виде, в каком он поступает от фирмы, без какой-либо дополнительной обработки. Тем не менее бутыль со свежим ДМСО лучше разлить на аликвоты и хранить при —20 «С. Каждую аликвоту необходимо использовать только один раз
• 10 х буфер для электрофореза: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,0
• Смесь для денатурации: 3 мл 6 М глиоксаля, 7,5 мл ДМСО и 1,5 мл 10 х буфера для электрофореза. Эту смесь хранят разлитой на аликвоты в плотно закрытых пробирках при —20 СС. Пробирки должны быть заполнены практически полностью и использоваться только один раз
• Буфер для нанесения: 50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий в 1 х буфере для электрофореза
• Агароза (для электрофореза)

Методика
1. Растворяют каждый образец РНК (содержащий примерно 20 мкг РНК) в 3 мкл обработанной ДЭПК воды и добавляют 12 мкл смеси для денатурации.
2. Денатурируют РНК прогреванием при 50 °С в течение 1 ч.
3. Готовят 1,1% (в/о) агарозный гель в 1 х буфере для электрофореза и охлаждают его до 70 С. Для инактивации РНКаз добавляют в гель сухой иодацетат натрия до конечной концентрации 10 мМ.
4. Охлаждают смесь до примерно 50 С, выливают в кювету и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

5. Добавляют к каждому образцу РНК 2,5 мкл буфера для нанесения, осторожно перемешивают и быстро центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g.
6. Вносят образцы в лунки агарозного геля и проводят электрофорез при градиенте напряженности 1—2 В/см в 1 х буфере для электрофореза. Во время электрофореза должна быть обеспечена рециркуляция буфера, чтобы его рН поддерживался на уровне 7,0, поскольку при рН 8,0 комплекс глиоксаль/РНК диссоциирует.
7. Когда бромфеноловый синий дойдет до конца геля, электрофорез останавливают и окрашивают гель бромистым этидием (0,5 мкг/мл в 25 мМ трис-HCl, рН 9,0) в течение 1 ч при осторожном покачивании. При сильном фоновом окрашивании лишний бромистый этидий можно отмыть водой (две смены по 30 мин каждая).
8. Просматривают гель в УФ-трансиллюминаторе и фотографируют его фотоаппаратом «Поляроид».

— Важно полностью денатурировать РНК до электрофореза и поддерживать ее в таком состоянии во время его проведения, поскольку электрофоретическая подвижность РНК изменяется при образовании вторичной структуры. Чтобы электрофорез прошел успешно, необходимы качественные реактивы, использующиеся при приготовлении смеси для денатурации, и постоянная циркуляция буфера во время проведения электрофореза.
— Глиоксаль реагирует с бромистым этидием, поэтому при приготовлении геля и проведении электрофореза данный краситель не используют.
— Для препаратов интактной РНК интенсивность флуоресценции полосы, отвечающей 28S-PHK, должна быть как минимум в два раза выше, чем у полосы 18S-PHK.

источник

Реактивы и оборудование:

— стеклянная коническая колба для приготовления агарозы. В случае электрофореза РНК колбу следует предварительно проавтоклавировать.

— прибор для агарозного гель-электрофореза. В случае электрофореза РНК все составные части прибора следует промыть по следующей технологии: 1) Промыть камеру и крышку от прибора для электрофореза, а также заливочный столик, планшет и гребенку водой в присутствии детергента (например, Fairy), 2) Протереть все спиртом, 3) Протереть все 3% раствором H₂O₂ в воде, 4) Залить камеру, крышку 50 мМ NaOH, смочить заливочный столик, а гребенку и заливочную рамку поместить в камеру. Через 10 минут инкубации слить NaOH и промыть все бидистиллированной водой

— TAE-буфер или TBE буфер. Состав 50-кратного TAE: 242 г триса, 57.1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0.5 М ЭДТА pH 8.0 растворить в 1 л дистиллированной воды. Перед использованием развести до однократного раствора. Состав 10-кратного TBE: 545 г триса, 278 г борной кислоты, 46.5 г ЭДТА растворить в 5 л дистиллированной воды. Перед использованием развести до однократного раствора. В случае проведения электрофореза РНК раствор следует проавтоклавировать и обработать DEPC или тиол-содержащими соединениями.

В случае электрофореза ДНК состав 6-кратного буфера для образцов: 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.15% orange G, 0.03% ксиленцианол, 0.125% бромфеноловый синий, 60% глицерол, 60 mM ЭДТА. В случае электрофореза РНК состав 2-кратного буфера для образцов: 95% формамид, 0.025% SDS, 0.025% бромфеноловый синий, 0.025% ксилен цианол, 0.025% бромистый этидий, 0.5 mM EDTA.

— набор фрагментов ДНК или РНК стандартной длины (например, 1 kb DNA ladder или RNA ladder (Fermentas))

— краситель: бромистый этидий (раствор 10 мг/мл, хранить в темноте) либо SYBR green I (обычно 10000-кратный, хранить при -20°С, также в темноте).

Взвесить необходимое для приготовления геля количество агарозы (в зависимости от процентности геля и количества приготовляемого раствора), перенести ее в стеклянную колбу и добавить необходимый объем ТАЕ- или TBE- буфера. Полученную суспензию прогреть в микроволновой печи до полного расплавления агарозы. Необходимо внимательно следить за процессом, так как агароза быстро выкипает, а также несколько раз останавливать прогрев и перемешивать содержимое колбы. В случае электрофореза РНК необходимо для взвешивания использовать стерильный шпатель.

В случае, если в качестве детектирующего агента используется бромистый этидий, в готовую «расплавленную» агарозу добавить бромистый этидий из расчета 0.5 мкг/мл геля. Если окрашивать гель планируется SYBR green I, то после окончания электрофореза следует погрузить гель в раствор SYBR green I на TAE-буфере (разведение 1: 10000) и инкубировать при перемешивании 1 час при комнатной температуре.

Собрать заливочный столик, и аккуратно залить в него расплавленную агарозу и сразу же вставить гребенку. Объем вносимой агарозы определяется размером лунок и количеством исследуемого образца, который будет внесен. Гель оставить застывать при комнатной температуре Из заливочного столика аккуратно вынуть рамку с гелем и вставить ее в камеру для проведения электрофореза. В камеру залить буфер ТАЕ так, чтобы он покрывал поверхность геля. Осторожно вынуть гребенку под буфером, чтобы не повредить лунки.

На фрагменте парафильма или в эппендорфах (в зависимости от объема образцов) смешать исследуемый образец ДНК с 6-кратным буфером для образцов или образец РНК с 2-кратным буфером для образцов и аккуратно нанести в лунку под лампой, не повреждая саму лунку. В случае РНК-электрофореза образец следует прогреть при 70 С в течение 10 минут, чтобы денатурировать вторичную структуру РНК. В качестве контроля сравнения нанести набор фрагментов ДНК или РНК различной длины, уже содержащий красители.

Закрыть камеру крышкой и проводить электрофорез при напряжении 6-8V/см длины геля.

После окончания электрофореза визуализировать фрагменты ДНК или РНК с помощью УФ-трансиллюминатора (ультрафиолетовой лампы) при 300 нм и сфотографировать полученное изображение.

Препаративный электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля.

Препаративный ДНК-электрофорез проводят так же, как и аналитический электрофорез, но с некоторыми модификациями. Для лучшего разделения фрагментов ДНК такой электрофорез проводят при более низком напряжении обычно 5-6 V/см. При этом гель меньше нагревается, что улучшает разрешение каждого фрагмента ДНК и снижает скорость диффузии. При использовании одного геля для препаративного электрофореза и экстракции нескольких различных образцов ДНК, образцы наносят через лунку, чтобы избежать загрязнения одного образца другим. Препаративный электрофорез проводят только в свежем TAE-буфере

После прохождения препаративного электрофореза фрагменты ДНК визуализируют с помощью UV-трансиллюминатора при длине волны 354 нм (слабый ультрафиолет), чтобы минимизировать возникновение мутаций в ДНК, которая будет впоследствии экстрагирована. С помощью скальпеля аккуратно вырезают фрагмент геля, содержащий интересующий фрагмент и переносят его в эппендорф.

Дальнейшая процедура экстракции фрагмента ДНК проходит по протоколу компании на колонках, носитель в которых идентичен колонкам, используемым в выделении плазмидной ДНК. Некоторые растворы, используемые для экстракции фрагментов ДНК из геля, идентичны растворам, используемым в выделении плазмиды. Общий принцип экстракции фрагментов из геля заключается в растворении фрагментов геля вместе с ДНК в специальном буфере и очистке фрагмента ДНК от растворенной агарозы на колонке методом ионообменной хроматографии.

источник

Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») —метод разделения макромолекул, различающихся по размеру, молекулярной массе, пространственной конфигурацией, вторичной структурой или электрическому заряду. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.

Молекулы в буферном растворе обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. При пропускании электрического тока через раствор в нем формируется направленное электрическое поле, напряженность которого измеряется разностью потенциалов по концам емкости, в которой производится электрофорез. Под действием поля молекулы начинают движение в направлении катода или анода. Скорость движения зависит от величины заряда, размеров и трения окружающей среды. С течением времени смесь разделяется на фракции, состоящие из молекул, движущихся с одинаковой скоростью. В современных экспериментах рабочий канал приборов для электрофореза заполняют гелем, имеющим структуру сетки. В этом случае основное влияние на подвижность молекул и их степень разделения оказывают их линейные размеры. В некоторых случаях может возникнуть ситуация, при которой особо крупные молекулы не проходят через поры геля.

Электрофорез в агарозном геле в различных модификациях широко применяется для разделения молекул нуклеиновых кислот, белков и других макромолекул в биологии и медицине. На водяной бане или в лабораторной печи плавят смесь агарозы, буфера и воды. Затем ее охлаждают до 50-60 °C и заливают в форму. Лунки для нанесения делаются при помощи гребенки. Исследуемый образец наносят в лунку при помощи дозатора. Когда краситель, помещаемый в лунки в начале эксперимента, достигает конца геля, электрофорез останавливают. Затем гель окрашивают красителем, который связывается с исследуемыми молекулами. Интенсивность окраски полос красителя дает представление о концентрации молекул в образце. Кроме концентрации, метод электрофореза позволяет определить относительную молекулярную массу исследуемых молекул, для этого в крайнюю лунку помещают набор маркеров молекулярной массы, который должен полностью покрывать диапазон молекулярных масс исследуемой системы.

Бромфеноловый синий и ксиленцианол — могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. Краситель Cresol red совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV. OrangeG наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV. Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле.

Самое широкое применение агарозные гели имеют в исследованиях, связанные с разделением нуклиновых кислот. Последние имеют довольно значительные отрицательный заряд, величина которого слабо зависиот от pH раствора, вследствие чего разделение на фракции происходит в основном за счет различия в линейных размеров молекул. В таких экспериментах используют 0.089М Трис-боратный, 0.05 Трсфосфатный и Трис-ацетатный буфер. Стоит отметить, что при обычном электрофорезе в геле можно разделять фрагменты нуклеиновых кислот, размер которых менее 50 тыс п.н. Также часто из эксперимента нужно получить оценку размеров молекул. Для этого используются наборы молекул известной длины. Например, для регистрации продуктов амплификации ДНК применяется электрофорез в агарозном геле в присутствии бромистого эитидия, который образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением длиной волны 290-330 нм.

источник

Электрофорез как метод фракционирования заряженных молекул (ДНК, РНК, белков) в электрическом поле был представленнами ранее как аналитический метод, спользующийся для визуализации нативной ДНК и ее фрагментов различного происхождения (геномная ДНК, ДНК плазмид, продукты рестрикции, ПЦР-продукты). Во всех указанных случаях нужно было увидеть результат производимых манипуляций с ДНК, охарактеризованной поэлектрофоретической подвижности. Однако имеется и другая область приложения метода электрофореза — очистка определеннойфракции полинуклеотидов, или препаративный электрофорез.

Принципиально препаративный электрофорез не отличается
от аналитического, основное требование к нему — доступность
носителя (геля) для последующего извлечения из него целевого
полинуклеотида. Для наибольшей продуктивности электрофореза
используемая пластина агарозного или полиакриламидного геля
должна быть относительно крупного размера и по своим механическим свойствам удобна для разрезания, измельчения или растворения.

Полиакриламидный гель как носитель для электрофореза нуклеиновых кислот по аналитическим характеристикам значительнопревосходит агарозный, обладая большим разрешением (до одного нуклеотида, у агарозного — 10 и более нуклеотидов) и широким
диапазоном плотностей, используемых для самых разных целей.Однако полиакриламид — химически инертный материал и почтине растворяется ни в одном из известных растворителей. Растворить ПААГ можно в концентрированном пероксиде водорода, однако
при этом неизбежно разрушение ДНК, РНК и белков. Этот прием применим только для очистки стеклянных трубок или пластин от примесей геля; остающегося на их стенках послеокончанияработы.
Извлечение (элюция) ДНК путем простой диффузии из крупного
блока полиакриламидного геля — длительный и малоэффективный процесс, хотя его можно несколько усовершенствовать, например при подключении электрического тока (электродиффузия). Тем не менее полностью извлечь из ПААГ фракционированный целевой фрагмент можно только после механического разрушения геля, а это недопустимо в случае разделения длинных молекул ДНК, так как они также могут быть разрушены.

Фракционирование нуклеиновых кислот методом электрофореза в ПААГ все же применяют:

для разделения и очистки (препаративного разделения) коротких олигонуклеотидов, например химически синтезированных
праймеров и зондов для ПЦР с детекцией продукта в реальном
времени (геа1-time РСR) или гибридизации;для непрерывного фракционирования (в отличие от стационарного), осуществляемого подобно хроматографии, однако в
этом случае продукты детектируют не на выходе, а в толще носителя на определенном участке гелевого блока по ходу электрофореза. При этом гелевая камера чаще всего имеет вид капилляра с отводным каналом, расположенным напротив окошка детектора,
и, как только истечет определенное время электрофореза («время
удержания») для целевого фрагмента в геле, направление движения фрагмента меняют на боковое путем переключения электрических контактов (рис. 8).

Агарозный гель более удобен в качестве носителя для препаративного электрофореза, так как для проведения этого вида электрофореза не требуется специального оборудования (может бытьиспользована камера для горизонтального аналитического электрофореза). Для окрашивания нуклеиновых кислот чаще всего используют интеркалирующие красители, такие как бромистый
эдидий или более чувствительный SYBR Green, которые флуоресцируют в УФ-свете. Наблюдать за ходом электрофореза можно визуально, периодически помещая гель на светофильтр трансиллюминатора и фиксируя таким образом момент, когда целевой фрагмент в достаточной степени отделится от остальных
фракций. Как только это произойдет, участок агарозного геля, содержащий целевой фрагмент, необходимо вырезать из гелевой
пластины. Для элюции целевого фрагмента ДНК вырезанный участок агарозного геля можно расплавить (нуклеиновые кислоты
при этом обычно не разрушаются, кроме того, можно использовать и сорта легкоплавкой агарозы) или растворить, например, в
концентрированном растворе гуанидинтиоцианата, а затем извлечь целевой фрагмент из раствора с помощью одного из методов
выделения ДНК.

Чтобы уменьшить потери на этом этапе, для связывания нуклеиновых кислот используют сорбент на основе оксида кремния
(SiO₂) или в виде водной суспензии (так называемое стеклянное
молоко или glass milk), или нанесенный на поверхность полупроницаемой мембраны. Электрофорез в агарозном геле непригоден
для разделения коротких олигонуклеотидов, а элюция с использованием сорбентов в этом случае малоэффективна и приводит к
значительным потерям.

Таким образом, большинство задач, связанных с очисткой нуклеиновых кислот, можно решить методом препаративного электрофореза, подобрав соответствующие условия, а указанные особенности наиболее доступных носителей дополняют друг друга и расширяют возможности эксперимента.

Препаративный электрофорез очень часто используется для
очистки нуклеиновых кислот, особенно ДНК, поэтому для элюции ДНК из агарозного геля теперь производится целый ряд
коммерческих наборов реагентов. Использование таких наборов
обеспечивает минимальные потери и высокое качество элюированной нуклеиновой кислоты с минимальными затратами времени.

Например, набор реагентов Diatom™ DNA Elution (ООО
«КОМПАНИЯ «БИОКОМ») позволяет очистить ДНК после ее
сорбции на суспендированных частицах SiO₂ (в данном случае —
NucleoS™-сорбент) из раствора, полученного при растворении
агарозного геля в 3,5—4,0 М растворе гуанидинтиоцианата (в данном случае — солюбилизирующий раствор).

Последующую очистку ДНК, связанной с сорбентом, от возможных сопутствующих примесей производят спиртовым раствором ацетата калия (рабочий раствор солевого буфера),и,наконец,отделение фрагментов ДНК от частиц сорбента (растворение,
элюция) наиболее полно обеспечивается суспензией ионообменных смол. ЭкстраГен™Е,который можно заменить стерильной
деионизованной водой или ТЕ-буфером, однако потери ДНК при
элюции будут выше на 15—20 %.

Набор реагентов Diatom™ DNA Elution особенно эффективен
для элюции фрагментов ДНК размером от 200 до 20 000 п.н. и
обеспечивает высокую чистоту выделенной ДНК (А₂₆₀/A₂₈₀=1,6
2). Очищенная ДНК может быть использована для практически
любых генно-инженерных исследований, в том числе для прямого
секвенирования. Потери ДНК составляют не более 20 %.

Цель работы. Произвести очистку ПЦР-фрагмента ДНК методом препаративного электрофореза в агарозном геле с последующей элюцией ДНК на суспендированном сорбенте.

Оборудование и материалы. 1. Термостат твердотельный для микропробирок
вместимостью 1,5 мл. 2. Микроцентрифуга до 5000 g для микропробирок вместимостью 1,5 мл. 3. Микроцентрифуга-вортекс до 2000g для микропробирок.
4. Оборудование для горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле с
трансиллюминатором для детекции. 5. Микропробирки вместимостью 1,5 мл с
крышками. 6. Цилиндр мерный вместимостью 250 мл. 7. Раствор неочищенного
целевого фрагмента ДНК (можно использовать, например, продукт ПЦР, полученный с ДНК растительного или животного происхождения и специфичными
для гена 18S рРНК олигонуклеотидньши праймерами — см. практическую работу
№ 7). 8. Набор реагентов для элюции ДНК из агарозного геля (например,
Diatom™, DNA Elution ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ»). 9. 96%-ный этанол.
10. Бидистиллированная вода.

Ход работы. Электрофорез продуктов ПЦР. Препаративный электрофорез проводят в тех же условиях, что и аналитический (см. практическую работу № 2), только для получения достаточного количества очищенного фрагмента требуется нанести на гелевую пластину 40—50 мкл ПЦР-смеси (использовать для
этого 4—5 лунок и вносить по 10 мкл в каждую). Процесс электрофореза заканчивают, когда пробег фронта краски-лидера составит
3—4 см от линии старта. Периодически можно наблюдать за ходом
фракционирования, останавливая процесс электрофореза и помещая гель на светофильтр трансиллюминатора. В процессе препаративного электрофореза целевой фрагмент ДНК отделяется от. неиспользованных нуклеозидтрифосфатов, балластных белков,
ДНК-матрицы (остается вблизи старта) и оставшихся праймеров
(располагаются вблизи фронта пробега, обозначенного краскойлидером).

Элюция целевого фрагмента ДНК. 1. Помещают
гелевую пластину на светофильтр трансиллюминатора, включают
УФ-облучение и, наблюдая через защитное стекло (или очки), отмечают расположение целевого фрагмента.

2.Вырезают участки геля, содержащие целевой фрагмент, так,
чтобы не захватывать лишний гель и не оставлять ДНК в гелевой
пластине, аккуратно помещают вырезанные участки в две микропробирки вместимостью 1,5 мл.

3.Далее, следуя инструкции к набору реагентов Diatom™ DNA
ЕLution, готовят рабочий раствор солевого буфера. Для этого содержимое флакона с солевым буфером из комплекта набора переносят в мерный цилиндр, доводят бидистиллированной водой до50 мл, а затем 96%-ным этанолом до 200 мл и перемешивают. Готовый рабочий раствор солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 2—8 °С.

4.К фрагменту геля объемом около 100—200 мкл (по маркировке микропробирки) добавляют 500 мкл солюбилизирующего реагента из комплекта набора. Термостатируют пробирку при 65°С в течение 3—5 мин, при этом гель должен полностью раствориться.

5.Добавляют в пробирки по 25 мкл NucleoS + ™ и 100 мкл связывающего реагента из комплекта набора. Количество добавляемого сорбента можно варьировать в зависимости от требуемого количества элюируемой ДНК. Для элюции 10 мкг ДНК следует добавить 20 мкл NucleoS + ™.

6.Содержимое пробирок суспендируют при переворачивании,
выдерживают при комнатной температуре 5—7 мин, переворачивая пробирки несколько раз каждые 1—2 мин. Постоянное переворачивание пробирки на ротаторе способствует максимальной сорбции ДНК с сорбентом Мис1ео§+™ и, следовательно, сводит/V потери ДНК к минимуму.

7.Центрифугируют пробирки 10 с при 5000g, супернатант полностью удаляют.

8.Добавляют к осадку 1 мл рабочего раствора солевого буфера.
Содержимое пробирки встряхивают на вортексе 5—10 с до гомогенного состояния.

Внимание! Если суспендирование осадка затруднено из-за сильного
слипания частиц сорбента (при высоком содержании ДНК), рекомендуется осторожное пипетирование осадка с последующим встряхиванием на вортексе до гомогенного состояния. ‘-»

9.Центрифугируют пробирки 10 с при 5000g, супернатант полностью удаляют, Повторяют пп. 7—9.

10.Подсушивают осадок в пробирке 4—5 мин, поместив ее в
термостат на 65 °С и открыв крышку.

11.Добавляют к осадку 100 мкл ЭкстраГенаЕ™.
Внимание! ЭкстраГен Е™ следует предварительно встряхнуть и

затем отбирать от общего объема при постоянном перемешивании
(пипетировании).

12.Суспендируют содержимое пробирки на вортексе 5—10 с до
получения гомогенной суспензии, термостатируют 4—5 мин при
65°С. На этом этапе работы происходит элюция: ДНК, связанная
с сорбентом, переходит в раствор. Еще раз суспендируют содержимое пробирки на вортексе и центрифугируют 2 мин при
10 000 g.

13.Супернатант (раствор очищенной ДНК) отбирают и переносят в чистую микропробирку.

Хранят образец очищенной ДНК при —18°С, если не предполагается частое размораживание, в противном случае — при 2—8 °С.

Контрольные вопросы. 1. Как происходит разделение фрагментов ДНК в электрическом поле? На каком принципе основан электрофорез нуклеиновых кислот?
2. Каково устройство камеры для горизонтального электрофореза нуклеиновых
кислот? Как следует подключать электроды к источнику постоянного напряжения? 3. Почему агарозный гель малопригоден для фракционирования фрагментов
ДНК размером менее 50 п.н.? 4. Каковы основные этапы процесса очистки ДНК
представленным методом? В чем сущность каждого этапа?

Задания.1. Очистить ПЦР-фрагмент ДНК гена 18S рРНК.
2. Определить концентрацию ДНК в очищенном фрагменте.

Практическая работа № 9
РЕАКЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ

Обратная транскрипция (ОТ) — процесс ферментативного синтеза ДНК на РНК-матрице, который катализирует фермент обратная транскриптаза (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза,КФ 2.7.7.49). Данный фермент является важнейшим фактором репродукции всех ретровирусов и наиболее хорошо изучен у онковирусов. После открытия этого фермента X. Темином и независимо от него Д. Балтимором в 1970 г. стало понятно, каким способом РНК-содержащие вирусы встраиваются в геном хозяина. Таким же способом размножаются ретротранспозоны — мобильные
элементы генома эукариот, постоянно претерпевающие в своем «жизненном» цикле репродукцию путем транскрипции и интеграцию посредством обратной транскрипции.

Обратная транскриптаза всех ретроэлементов обладает тремя
активностями:

1)РНК-зависимая ДНК-полимеразная (обеспечивает синтез
первой цепи ДНК — комплементарной ДНК (кДНК) — на РНК-матрице, формируя гибридную РНК—ДНК молекулу);

2)ДНК-зависимая ДНК-полимеразная (обеспечивает синтез второй цепи ДНК на ДНК-матрице);

3) РНКазная (гидролизует исходную РНК подобно РНКазе Н).

Этот процесс in vitro инициирует комплекс белков, прикрепленных к 3′-концу геномной РНК, откуда и начинается синтез кДНК; in vitro инициировать синтез кДНК можно с помощью олигонуклеотидных праймеров — коротких фрагментов одноцепочечной ДНК, комплементарных:

1)известной последовательности какой-то определенной РНК;

2)поли-А-«хвосту»(олиго(А)-последовательности на 3′-конце)зрелых информационных (матричных) РНК эукариот (мРНК);

3)сразу нескольким случайным последовательностям нуклеотидов в виде смеси (как правило, не менее 10 шестичленных олигонуклеотидов).

Принципиальное различие этих способов инициации состоит в
том, что в первом случае реакции обратной транскрипции подвергают только определенную, охарактеризованную секвенированием РНК (или некоторое количество гомологичныхмолекул), во втором — только мРНК, но не рРНК или тРНК (а также не РНКпрокариот) и в третьем — все разновидности РНК. Но в любом
случае инициации in virto синтез кДНК прерывается, как только
обратная транскриптаза достигнет 5′-конца РНК-матрицы. Синтез второй цепи ДНК (анти-кДНК) осуществим в ходе той же реакции с помощью обратного праймера, комплементарного определенной последовательности кДНК (для варианта 1), случайных праймеров (для варианта 3) или чаще всего уже с помощью последующей ПЦР (для варианта 2 и любого другого), что гораздо удобнее и эффективнее реакции ОТ. Какойпроцесспроисходиттугуона 5′-конце РНК-матрицы, до конца неясно, но очевидно,чтовозможно два пути: либо далее следуют повторные инициации посредством белков, либо синтез ДНК продолжается уже на кДНК-
матрице, не прерываясь и не останавливаясь до тех пор, пока не
образуется двухцепочечная кольцевая (синтезированная «сама на
себе») молекула ДНК — весьма устойчивая форма для интеграции
в геном (в силу ее недоступности для экзонуклеаз).

В качестве инструмента для реакции ОТ in vitro применяют несколько обратных транскриптаз, препараты которых производят в
промышленных масштабах. Чаще других используют М-МLV(или М-МuVL) — обратную транскриптазу вируса лейкоза крыс и
АМV — обратную транскриптазу вируса саркомы птиц. Реже других употребляют обратную транскриптазу теломеров (ДНК-теломераза) эукариот. Этот фермент присутствует у большинства эукариот, в его функции входит восстановление теломерных участков ДНК хромосом, частично утрачиваемых после каждого акта репликации генома, что также происходит путем матричного синтеза
ДНК на РНК. Особенностями этого совершенно уникального
фермента, отличающими его от других обратных транскриптаз,
являются постоянная РНК-матрица, неразрывно связанная с самим ферментом, и, как следствие, отсутствие РНКазной активности.

Реакцию обратной транскрипции широко применяют прежде
всего в создании кДНК-библиотек — препаратов кДНК, полученных после обработки обратной транскриптазой тотальной РНК,
выделенной из определенного организма, органа или ткани на определенной стадии развития, с олиго(дТ)-праймерами (комплементарны поли (А)-хвосту мРНК). В результате получаются одноцепочечные ДНК-копии всех матричных РНК, по качественному составу и количеству которых можно судить об уровне экспрессии
каких-либо генов. В то же время размер и первичная структура
кДНК в сравнении с соответствующей последовательностью в геномной ДНК позволяют выявить в ней некодирующие последовательности (интроны).

Другая область применения метода обратной транскрипции
(прикладная, но очень важная) — диагностика заболеваний, вызываемых РНК-содержащими вирусами (например, вирус иммунодефицита человека, вирус гепатита С, поражающий животных и человека), а также онковирусами. Последнее направление в наступившем XXI в. развивается особенно активно, что обещает если не
полную победу, то, по крайней мере, профилактику и надежный
контроль над этими опасными заболеваниями.

Цель работы. Ознакомиться с методом реакции обратной
транскрипции.

Оборудование и материалы. 1. Термостат твердотельный для микропробирок
вместимостью 0,5—0,6 мл. 2. Микроцентрифуга-вортекс до 2000 g для микропробирок вместимостью 0,5—0,6 мл. 3. Лед. 4. Раствор РНК (препарат РНК, полученный при выделении тотальной РНК — см. практическую работу№4).5.Обратная транскриптаза (например, М-МuLV Reverse Transcriptase производства Рготеga
Со, США, или другая): 200 ед/мкл. 6. 10х ОТ буфер (как правило, поставляется в
комплекте с препаратом соответствующей обратной транскриптазы): 500 мМ
трис-НС1 рН 8,3, 750 мМ КС1, 30 мМ МgС1₂, 100 мМ дитиотреитол. 7. Смесь
дНТФ: 2,5 мМ каждого в стерильной деионизованной воде. 8. Смесь праймеров:
суммарно 40 мкМ, для вовлечения в реакцию всей выделенной РНК используют
смесь случайных нуклеотидных гексамеров (для последующей ПЦР, полученной
кДНК с праймерами на ген 185 рРНК, необходимо использовать именно эту смесь), для ОТ с использованием в качестве матрицы только мРНК — олиго(дТ)_[5
праймер (длиной 15 нуклеотидов). 9. Ингибитор РНКазы (например, RiboLock™
Ribonuclease Inhibitor, «Рromеgа Со» или другой): 10 ед/мкл. 10. ДНКаза: 10 ед/мкл.
11. 10х буфер для ДНКазы (как правило, поставляется в комплекте с препаратом
соответствующей ДНКазы). 12. Стерильная деионизованная вода. 13. Вазелиновое
масло.

Ход работы. Внимание! Если концентрации готовых буферных растворов и ферментов в используемых препаратах отличаются отуказанных в разделе «Материалы и оборудование», необходимо изменить соответствующие объемы в приведенной ниже инструкции.

Подготовка препарата РНК (разведение и очистка
от примеси ДНК). 1. Измеряют оптическую плотность препарата
РНК, полученного при выделении тотальной РНК (см. практическую работу № 4) при 260 нм против растворителя (ΔА₂₆₀), для
получения величин в пределах 0,05—0,5 ед. препарат требуется предварительно разбавить примерно в 50—100 раз.

2. Вычисляют концентрацию РНК, мкг/мкл, в препарате по

С_РНК = ΔА₂₆₀ х 40 х разбавление/1000.

3.Готовят 30—50мкл раствора РНК концентрацией 0,1 —
0,4 мкг/мкл (на стерильной деионизованной воде).

4.Отбирают 17 мкл разбавленного раствора РНК в стерильную
микропробирку вместимостью 0,5—0,6 мл и добавляют последовательно 2 мкл 10х буфера для ДНКазы и 1 мкл препарата ДНКазы
(10 ед/мкл), осторожно перемешивают, добавляют две капли вазе-
линового масла и центрифугируют для сброса капель на дно про-
бирки.

5.Помещают закрытую пробирку в термостат, инкубируют
15 мин при 37 «С, а затем 5 мин при 95 «С, пробирку охлаждают на
воздухе до комнатной температуры.

Реакция обратной транскрипции. 1. В стерильную микропробирку вместимостью 0,5—0,6 мл вносят 5 мкл свежеприготовленного раствора РНК (без примеси ДНК), 2 мкл смеси праймеров, 4 мкл смеси дНТФ и 4 мкл стерильной деионизованной воды.

2.Смесь инкубируют 5 мин при 70 °С, затем охлаждают во льду.

3.Добавляют 2 мкл Юх ОТ буфера, 1 мкл ингибитора РНКаз
(10 ед/мкл) и 2 мкл стерильной деионизованной воды.

4.Смесь инкубируют 5 мин при комнатной температуре (при
использовании смеси случайных гексамеров) или 5 мин при 37 «С
(при использовании олиго(дТ)₁₅).

5.Добавляют 1 мкл обратной транскриптазы (200 ед/мкл), осторожно перемешивают, инкубируют 10 мин при комнатной температуре и еще 60 мин при 37 °С (при использовании смеси случайных гексамеров и олиго(дТ)₁₅)

6. Останавливают реакцию нагреваниемдо70°С,выдерживаютпри этой температуре 10 мин иохлаждаютвольду. Полученнуюсмесь, содержащую кДНК, можно использовать немедленно или хранить при —18 °С.

Проведение ПЦР с кДНК. Постановку ПЦР с кДНК
проводят по инструкции, представленной в практической работе
№ 8. Для проверки качества полученного препарата кДНК (отсутствие геномной ДНК и веществ,ингибирующихПЦР;наличие достаточного количества целевой кДНК) рекомендуется использовать для амплификации праймеры для обнаружения гена 18S
рРНК, а также перечисленные далее образцы:

1)препарат РНК, разбавленный для проведения реакции обратной транскрипции (см. Подготовку препарата РНК, п. 3);

2)препарат РНК, очищенный от ДНК (см. Подготовку препарата РНК, п. 5);

3)препарат кДНК (см. Реакцию обратной транскрипции, п. 6);

4)отрицательный контроль (стерильная деионизованная вода);

5)положительный контроль с любым препаратом ДНК, выделенным из эукариот (см. практические работы № 3, 4).

Детекцию продуктов ПЦР проводят методом электрофореза в
агарозном геле (см. практическую работу № 2).

Контрольные вопросы. 1.Зачем требуется синтезировать кДНК для проведения
ПЦР с РНК? 2.Чем отличается постановка реакции обратной транскрипции для
мРНК и для тотальной РНК? 3. Как получить кДНК только с определенной РНК?
4. Можно ли получить кДНК с использованием олиго(дТ)_|5 на транскриптах про-
кариот? Ответ поясните. 5. Какие этапы следует произвести для молекулярной
диагностики заболевания СПИДом?

Задания. 1. Интерпретировать полученные после ОТ—ПЦР результаты: объяснить наличие или отсутствие продуктов ПЦР на
электрофореграмме для каждого варианта постановки ПЦР.
2. Интерпретировать результаты, представленные на электрофореграмме (рис. 9).

Рис.9.Электрофореграмма продуктовОТ—ПЦР с препаратами нуклеиновых
кислот, выделенных из клубней картофеля, и праймерами, подобранными для
амплификации фрагмента гена пататина(№Х03932 по каталогу N081,

праймеры ограничивают фрагмент между 833и 1832 п.н.):

М — маркер молекулярной массы Сепе Ruler
100 bp DNA Ladder (размер фрагментов —
100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 и
1000 п.н.); 1 — препарат тотальной РНК без
очистки от ДНК (продукт ПЦР без ОТ); 2 —
препарат тотальной РНК после обработки
ДНКазой (продукт ПЦР без ОТ); 3 — препа-
рат кДНК (продукт ОТ-ПЦР); 4 — отрица-
тельный контроль (стерильная деионизован-
ная вода); 5 — положительный контроль
(ДНК, выделенная из клубней картофеля, —
продукт ПЦР)

Практическая работа №10
РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ДНК

Рестриктазы — это ферменты, обладающие эндонуклеазной
активностью, которые специфически гидролизуют молекулы
двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов — сайтов рестрикции. Название этих
ферментов происходит от английского гезгпсИоп (ограничения);
они были выявлены у определенных штаммом бактерий. Крайне
редко помимо эндонуклеазной активности рестриктаза обладает
еще и метилазной (Есо571), производя модификацию (метилирование) определенных нуклеотидов в последовательности, узнаваемой рестриктазой; такие модифицированные последовательности не подвержены ферментативной рестрикции. Но обычно эти фер-менты структурно независимы и работают в комплексе, образуя
так называемую КМ-систему (систему рестрикции—модификации). Одновременное наличие в клетке обеих ферментативных активностей защищает от интеграции в геном чужеродной ДНК (например, вирусов или плазмид) и предотвращает разрушение собственной ДНК.

Известно около 2500 рестриктаз. Название того или иного фермента составляется из первой буквы рода и двух первых букв вида
бактерии, из которой данная рестриктаза выделена, еще одна буква может обозначать тип штамма. Если в определенном штамме
клеток имеется несколько рестриктаз, то к буквенному названию
фермента добавляется числовое обозначение. Например — рестриктаза Hind III выделена изклеток Haemophilus influenzae с серотипом d и относится к III классу RМ-системы.

Рестриктазы могут кодироваться не только геномной ДНК бактерии, но также плазмидами и фагами, в связи с этим к названию
фермента добавляется название внехромосомного элемента (ЕсоRI).

Сучетом основных свойств рестриктазы подразделяют на четыре класса.

Рестриктазы I классадействуют в одном комплексе с метилазами, расщепляют ДНК в произвольных местах на расстоянии от нескольких сот до нескольких тысяч пар нуклеотидов от
несимметричных сайтов узнавания. При этом образуется сплошной спектр рестриктов, не детерминированных по размерам и содержанию информации, поэтому данные рестриктазы в генной инженерии не используют. Примером таких рестриктаз может
служить ЕсоК.

Рестриктазы II класса имеют широкое применение,
поскольку рестриктазы и метилазы этого класса действуют независимо, сайты узнавания совпадают с сайтами расщепления или
находятся рядом с ними на определенном расстоянии, в результате чего получаются фрагменты ДНК воспроизводимого состава и
длины (рис. 10).

Более половины рестриктаз данного класса узнают нуклеотидные последовательности с вращательной симметрией второго порядка (палиндромы). По способу расщепления данные ферменты делятся на два подкласса. Представители первого осуществляют
ступенчатый разрез комплементарных нитей ДНК, в результате
чего образуются фрагменты с выступающими (липкими) концами: либо 5′-концами (рис.10,Б),либоЗ’-концами,как в случае действия рестриктазы PstI(рис. II, А)- Ферменты второго подкласса (например, SmaI) расщепляют совпадающие связи, в результате чего образуются фрагменты с ровными (тупыми) концами (рис. 11, В).

Рестриктазы III класса (например, ЕсоPI) действуют в одном комплексе с метилазами и узнают несимметричные последовательности нуклеотидов, при этом расщепление происходит на определенном расстоянии от сайта узнавания.

R.М-система (комплекс рестриктазы и метилазы) IV класса
представлена пока уникальным ферментом Есо57I, в одной поли-
пептидной цепочке которого и эндонуклеазная, и метилазная ак-
тивность.

Рестриктазы широко используют в работах по генной инжене-
рии, в частности по картированию геномов, клонированию, оп-
ределению нуклеотидных последовательностей (секвенирова-
нию).

За единицу активности рестриктазы принимают количество
фермента, способное за 1 ч в оптимальных для него условиях полностью гидролизовать 1 мкг ДНК фага λ. Для проведения успешной рестрикции необходимо соблюдать ряд условий,которые приведены в таблице 7.

Разделение полученных рестриктазных фрагментов и их визуа-
лизацию проводят методом электрофореза в агарозном геле.

Цель работы. Ознакомиться с методом рестрикционного анали-
за ДНК.

Оборудование и материалы. 1. Микроцентрифуга высокоскоростная до 10 000g.
2. Микроцентрифуга-вортекс до 2000g- 3. Термостат твердотельный для микро-
пробирок вместимостью 0,5—1,5 мл. 4. Автоматические дозаторы переменного
объема с наконечниками. 5. Микропробирки вместимостью 0,5 мл. 6. Термостат
твердотельный с функцией охлаждения для микропробирок вместимостью до
1,5 мл. 7. Рестриктаза ЕсоRIи буферный раствор для нее. 8. Раствор плазмидной
ДНК (рGEM3Z) и ДНК фага λ. 9. Вода стерильная деионизованная. 10. Материа-
лы и оборудование для проведения электрофореза, представленные в практичес-
кой работе № 2.

Ход работы. 1. Смесь для рестрикции (общий объем — 40 мкл)
готовят в микропробирке вместимостью 0,5 мл, поместив ее и все
исходные компоненты в термостат с функцией охлаждения при
4°С:

10х буфер для рестриктазы ЕсоRI! — 6 мкл;

рестриктазаЕсоRI.(10ед.)— 2 мкл;
вода стерильная деионизованная — 32 мкл.

Вышеперечисленные компоненты смешивают в указанных количествах, с помощью автоматического дозатора отбирают по 20 мкл смеси и переносят в две чистые микропробирки вместимостью 0,5 мл.

Внимание! При смешивании необходимо проводить смену наконечников после каждого раствора.

В пробирку 1 (промаркировав ее) добавляют 10 мкл раствора
ДНК фага λв концентрации 0,4 мкг/мкл, а в пробирку 2 (промаркировав ее) — 10 мкл раствора плазмидной ДНК (рGEM3Z) в концентрации 0,4 мкг/мкл.

2.Смеси в двух пробирках очень осторожно перемешивают с
использованием дозатора с наконечником, добавляют 10 мкл минерального масла, центрифугируют 5 с при 2000g и выдерживают
в термостате 1 ч при 37 o С.

3.Через 5, 20, 40 мин и по истечении 1 ч от начала рестрикции
из пробирки 2 отбирают пробы по 5 мкл и переносят в чистые
микропробирки вместимостью 0,5 мл, маркируя их при этом.

4.Каждую из отобранных проб сразу же смешивают с 5 мкл
краски-лидера (из набора для электрофореза), помещают в термостат с функцией охлаждения при 4 °С и оставляют до тех пор, пока
не будет отобрана последняя проба.

5.Четыре содержащие гидролизованную ДНК пробы, отобранные из пробирки 2, а также пробу из пробирки 1 (аналогично смешанную с краской-лидером) вносят в лунки пластины агарозного геля и подвергают электрофорезу для исследования динамики ре-стрикции (см. практическую работу № 2).

6.Полученные результаты регистрируют визуально или с ис-
пользованием видеосистемы.

Контрольные вопросы. 1. Какова функция рестриктаз в клетках бактерий?
2. Каковы принципы деления рестриктаз на классы? 3. Что такое сайт рестрикции?
4. Какие сайты рестрикции узнают рестриктазы II класса? 5. По какому принципу
делят II класс на подклассы? 6. Каковы основные условия проведения рестрик-
ции? 7. Какой показатель принимают за единицу активности рестриктазы?

Задания.1.Поместить схему или фотографию полученной
электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и
сделать подписи к ним. 2. Проанализируйте динамику рестрикции
ДНК рGEM3Z при действии рестриктазы ЕсоRI(по результатам
рестрикции с разными сроками инкубации).

Практическая работа №11
ДНК—ДНК-ГИБРИДИЗАЦИЯ

Методы гибридизации нуклеиновых кислот основаны на способности олиго- и полинуклеотидов образовывать двухцепочечную структуру за счет образования водородных связей между ос татками комплементарных азотистых оснований: аденин + тимин (или урацил) и гуанин + цитозин. При соблюдении определенных
условий, исключающих случайное неканоническое взаимодействие нуклеотидов, методы гибридизации нуклеиновых кислот
позволяют выявить гомологию первичной структуры интересующей нас нуклеиновой кислоты (мишень) и зонда — олигонуклеотида с известной первичной структурой. Мишенью может служить, например, нативная ДНК (дот-гибридизация от англ. скл —
точка, точечный), а также рестрикционные фрагменты ДНК (Сау-
зерн-гибридизация) или фракционированные с помощью электрофореза молекулы РНК (Нозерн-гибридизация, рис. 12), а зондом — чаще всего ПЦР-продукт или рестрикционный фрагмент,меченный радиоактивным изотопом (чаще 32 Р или 33 Р) или флуоресцентным красителем для его последующей детекции. Использование радиоактивных изотопов становится все менее популярным из-за невозможности длительного хранения меток, трудностей детекции продуктов ядерного распада и определенного вреда,наносимого здоровью систематической работой с ними. Однако
флуоресцентное мечение также имеет свои недостатки, это прежде всего высокая термолабильность как самой молекулы флуорофора, так и химической связи флуорофора с зондом, которая нарушается при нагреве—охлаждении, детекции коротковолновым или УФ-светом, а также в ходе длительного хранения.

К отдельной категории методов гибридизации следует отнести
гибридизацию in situ, проводимую непосредственно на живом
объекте, точнее, внутри прозрачных для детекции клеток, тканей,
органов. Основное предназначение этого метода — определение
клеточной и тканевой локализации РНК- или ДНК-мишени с уже
известной первичной структурой или распределения определенных последовательностей ДНК в хромосомах. Метод позволяет установить, например, тканеспецифичность вирусов и бактерий (пораспределению их наследственного материала по клеткам и тканям организма-хозяина), экспрессии определенных генов (по наличию мРНК) и т. д. (рис. 13).

Рис. 12. Радиоавтограф мембраны после Нозерн-гибридизации, мишень — мРНК из
растений разных фенотипов Arabidopsis Thaliana, зонд 32 Р-меченый олигонуклеотид

Дот-гибридизация — самая простая разновидность ДНК—
ДНК-гибридизации (мишень и зонд являются молекулами ДНК).
ДНК-мишень не подвергают каким-либо модификациям, а только плавят (денатурируют) при 65 °С в 0,1-0,5 М растворе щелочи
и закрепляют на специальной подложке — нитроцеллюлозой
или нейлоновой мембране, реже

источник

Электрофорез в агарозном геле является методом гель — электрофореза , используемого в биохимии , молекулярной биологии , генетики и клинической химии , чтобы отделить смешанную популяцию макромолекул , таких как ДНК или белков в матрице из агарозы , один из двух основных компонентов агара . Белки могут быть разделены с помощью заряда и / или размером ( изоэлектрофокусирование электрофореза в агарозном, по существу , не зависит размер), а также ДНК и РНК — фрагменты длиной. Биомолекулы разделены путем применения электрического поля для перемещения заряженных молекул через матрицу агарозы, и биомолекулы отделены друг от друга размером в матрице агарозном геле.

Гель агарозов легко отливать, имеет относительно меньшее количество заряженных групп, и особенно подходит для разделения ДНК диапазона размеров наиболее часто встречающегося в лабораториях, на долю которого приходится популярности ее использование. Разделены ДНК может быть просмотрен с красителем, чаще всего под действием УФ-света, и фрагменты ДНК могут быть извлечены из геля с относительной легкостью. Большинство гели агарозы используются между 0.7-2%, растворенного в подходящем буфере для электрофореза.

Агарозном гель является трехмерный матрицей , составленной из спиральных молекул в агарозных суперспиральных пучках , которые объединяются в трехмерный структуры с каналами и порами , через которые могут проходить биомолекулы. Структура 3-D проводится совместно с водородными связями и , следовательно , может быть разрушена путем нагрева обратно в жидкое состояние. Температура плавления отличается от температуры желатинизации, в зависимости от источников, агарозный гель имеет температуру гелеобразования 35-42 ° C и температуру плавления 85-95 ° С. Низкое плавление и низкие желирующие агарозы , сделанные с помощью химических модификаций, также доступны.

Агарозном гель имеет большой размер пор и хорошую прочность геля, что делает его пригодным в качестве антиконвекции среды для электрофореза ДНК и крупных белковых молекул. Размер пор 1% геле была оценена от 100 нм до 200-500 нм, а его прочность геля позволяет гели в виде разбавленных в 0,15% с образованием сляба для гель — электрофореза. Низкая концентрация-гели (0,1-0,2%) , однако являются хрупкими и , следовательно , трудно управлять. Гель агарозы имеет более низкую разрешающую способность , чем полиакриламидный гель для ДНК , но имеет больший диапазон разделения, и поэтому используется для фрагментов ДНК обычно 50-20,000 п.н. в размере. Предел разрешения для стандартного электрофореза в агарозном геле составляет около 750 кб, но разрешение более 6 Мб возможны с электрофорезом геля импульсным поля (PFGE). Он также может быть использован для разделения больших белков, и это является предпочтительным матрица для гель — электрофореза частиц с эффективным радиусом больше 5-10 нм. 0,9% агарозный гель имеет поры достаточно большой для ввода бактериофага Т4 .

Агарозном полимер содержит заряженные группы, в частности пирувата и сульфата . Эти отрицательно заряженные группы создают поток воды в направлении, противоположном направлению движения ДНК в процессе , называемом electroendosmosis (РВЗ), и , следовательно , может замедлить движение ДНК и вызывает размывание полос. Более высокие концентрации гели будут иметь более высокий электроосмотический поток. Низкая РВЗ агарозу поэтому обычно предпочтительным для использования в агарозном гель — электрофореза нуклеиновых кислот , но высокая РВЗ агарозы может быть использована для других целей. Ниже , содержание сульфатов низкой РВЗ агарозы, в частности , низкой температурой плавления (LMP) агарозы, также полезно в тех случаях , когда ДНК экстрагировали из геля , которые будут использоваться для дальнейших манипуляций в присутствии загрязняющих сульфаты может влиять на некоторые последующие процедуры, такие , в качестве лигирования и ПЦР . Нулевые РВЗЫ агарозы однако являются нежелательными для некоторых применений , так как они могут быть сделаны путем добавления положительно заряженных групп и такие группы могут повлиять на последующие реакции фермента. Electroendosmosis является причиной агарозном используется в предпочтении к агар как агаропектин компонент в агар содержит значительное количество отрицательно заряженных сульфатов и карбоксильных групп. Удаление агаропектина в агарозе существенно снижает РВЗ, а также уменьшения неспецифической адсорбции биомолекул на гелевой матрице. Тем не менее, для некоторых приложений , таких как электрофорез белков сыворотки, высокая РВЗ может быть желательной, и агаропектин может быть добавлен в геле используется.

Ряд факторов может повлиять на миграции нуклеиновых кислот: размерность поры геля (концентрация геля), размер ДНК будучи электрофорез, напряжение используется, ионная сила буфера, а концентрация интеркалирования красителя, такие как бромид этидий если используется во время электрофореза.

Более мелкие молекулы движутся быстрее , чем более крупные молекулы в геле, и движется двухцепочечной ДНК со скоростью, обратно пропорциональна логарифму числа пар оснований. Это соотношение , однако ломается при очень больших фрагментах ДНК, и разделение очень больших фрагментов ДНК требует использования электрофореза импульсного геля — поля (PFGE), который применяет переменный ток с двух разных направлений и большие ДНК — фрагменты разделены , как они переориентироваться с изменение тока.

Для стандартного электрофореза в агарозном геле, более крупные молекулы разрешаются лучше, используя низкую концентрацию геля в то время как меньшие молекулы отделить лучше при высокой концентрации геля. Высокие концентрации геля, однако, требует больше времени запуска (иногда дней).

Движение ДНК может влиять на конформации молекулы ДНК, например, суперспирализовано ДНК , как правило , двигается быстрее , чем расслабленный ДНК , поскольку она плотно спиральная и , следовательно , более компактным. В нормальной подготовке плазмидной ДНК, множественные формы ДНК могут присутствовать. Гель — электрофорез плазмид обычно показывает отрицательно суперспиральную форму как основная полоса, в то время как зазубрины ДНК (открытая круговая форма) и расслаблена закрыт круглая форма появляются как незначительные полосы. Скорость , с которой различными формами перемещения , однако , может изменяться с использованием различных условий электрофореза, а подвижность большой кольцевой ДНК могут быть более сильно , чем влияние линейной ДНК размера пор гель.

Этидий бромид, который интеркалирует в кольцевую ДНК может изменить заряд, длину, а также superhelicity молекулы ДНК, поэтому его присутствие в геле при электрофорезе может повлиять на его движение. Например, положительный заряд бромистого этидия может уменьшить движение ДНК на 15%. Электрофорез в агарозном геле может быть использован для решения круговой ДНК с различной топологией суперспирализации.

Повреждение ДНК из — за увеличенное поперечное сшивание также приведет к уменьшению электрофоретической миграции ДНК в зависимости от дозы.

Скорость миграции ДНК пропорциональна приложенного напряжения, т.е. чем выше напряжение, тем быстрее движется ДНК. Разрешение больших фрагментов ДНК, однако ниже, при высоком напряжении. Подвижность ДНК может также изменяться в нестационарном поле — в поле, которое периодически обращено, подвижность ДНК определенного размера может значительно снижаться при определенной частоте езды на велосипеде. Это явление может привести к инверсии зоны в поле электрофореза гель инверсии (ФИГЕ), в результате чего более крупные фрагменты ДНК движутся быстрее, чем более мелкие.

• «смайлик» гели — это краевой эффект возникает, когда напряжение, приложенное слишком высоко для концентрации геля, используемой.
• Перегрузки ДНК — перегружать ДНК замедляет миграцию фрагментов ДНК.
• Загрязнение — наличие примесей, такие как соль или белки может влиять на движение ДНК.

Отрицательный заряд его остова ДНК перемещает в сторону положительно заряженного анода при электрофорезе. Тем не менее, миграция молекул ДНК в растворе, в отсутствии гелевой матрицы, не зависит от молекулярной массы при электрофорезе. Гелевая матрица, следовательно , отвечает за разделение ДНК по размерам в процессе электрофореза, а также ряд моделей существует , чтобы объяснить механизм разделения биомолекул в гелевой матрице. Широко принято одна модель Ogston , которая рассматривает матрицу полимера в виде сита. Шаровые белки или случайная катушка ДНК перемещается через взаимосвязанные поры, и движение больших молекул, более вероятно, будет затруднено и замедлены столкновениями с гелевой матрицей, и , следовательно , молекулы различных размеров могут быть отделенны в этом процессе просеивания ,

Модель Ogston однако ломается при больших молекул в результате чего поры значительно меньше , чем размер молекулы. Для молекул ДНК размера более 1 кб, А рептации модель (или его варианта) наиболее часто используется. Эта модель предполагает , что ДНК может сканировать в моде «змеиной» (отсюда «рептации») через пору в виде удлиненной молекулы. Необъективное модель рептаций применяется при более высокой напряженности электрического поля, в результате чего передний конец молекулы становится сильно предвзятым в прямом направлении и тянет остальную часть молекулы вместе. В режиме реального времени флуоресцентной микроскопии окрашенных молекул, однако, показали более тонкие динамики во время электрофореза с ДНК показывает значительную эластичность , как она попеременно растяжения в направлении приложенного поля , а затем договаривающуюся в шарик, или становится замкнув в U-образную форму когда он попадает на полимерных волокон.

Детали электрофорезом на агарозном геле эксперимента могут варьироваться в зависимости от методов, но большинство следовать общей процедуре.

источник

Электрофорез в агарозном геле проводят в горизонтальном направлении, так как при этом 1) гель с низкой концентрацией агарозы лучше держится, 2) получается меньшее перекашивание (коллапс) в процессе электрофореза и 3) меньше искажаются полосы ДНК. По-видимому, проще всего работать с системой, когда гель полностью покрыт слоем буфера для электрофореза толщиной около 1 мм. Сопротивление агарозы ненамного превышает сопротивление буфера, так что значительная часть тока течет через агарозу.

Во все буферы с нейтральными значениями рН можно добавлять 0,5 мкг/мл бромистого этидия.

В процессе электрофореза буфер у анода защелачивается, а у катода закисляется. Поэтому обычно пользуются буферной системой с высокой емкостью. Буферы не содержат ионов Cl — , так как последние не обладают буферной емкостью, и их присутствие может привести к тому, что ДНК в геле утратит биологическую активность.

1. Трис-боратный буфер. Обладает высокой буферной емкостью. При его использовании, по-видимому, получаются наиболее узкие полосы. Основной раствор 10 × не зарастает, но при длительном хранении в нем образуется осадок, который растворим в щелочи. В присутствии бората агарозные гели не растворяются при высокой концентрации NaClO₄ или KI.
2. Трис-фосфатный буфер. Тоже обладает высокой емкостью. При его использовании получаются примерно такие же результаты, что и при использовании трис-боратного буфера. Основной раствор, однако, может зарастать. Его преимущество заключается в том, что такие гели можно растворять в концентрированном растворе NaClO₄ или KI.
3. Трис-ацетатный буфер. Обладает относительно низкой буферной емкостью, и при длительном электрофорезе может возникнуть необходимость в рециркуляции буфера в аппарате. Использование при электрофорезе высоких напряжений не вызывает нагрева. Исходные растворы могут зарастать. Гели в трис-ацетатном буфере можно растворять в концентрированном NaClO₄ или KI. Этот буфер, по-видимому, используется наиболее широко.
4. Щелочной буфер. Обладает очень низкой емкостью. Обычно при его использовании необходима рециркуляция буфера в аппарате. Наносимые образцы не должны содержать Mg 2+ , иначе ДНК выпадет в осадок. Ионы Mg 2+ необходимо удалять, добавляя избыточные количества ЭДТА.

Препараты агарозы значительно различаются по твердости, по разрешающей способности при разделении фрагментов ДНК, электрофоретической подвижности ДНК, легкости плавления, прозрачности и наличию вредных примесей. Наиболее вредной примесью являются, по-видимому, сульфонированные агарозы, подавляющие активность многих ферментов, работающих на нуклеиновых кислотах.

Обычно мы пользуемся агарозой фирмы МС/В. Агарозу растворяют в буфере для электрофореза, нагревая до кипения в микроволновой печи. Необходимо убедиться, что раствор стал гомогенным и что в нем не осталось твердых частиц агарозы. Перед тем как залить гель, раствор охлаждают до 50°С. Если заливать гель слишком горячей агарозой, то легко можно повредить аппарат для электрофореза

Лунки для образцов делают с помощью погруженной в расплавленный гель гребенки из оргстекла, полихлорвинила или тефлона. Гребенку устанавливают до заливки геля таким образом, чтобы кончики зубьев находились примерно в 0,5 мм от основания геля. Если лунки достанут дна, то образец может протечь под гель. Когда гель полностью застынет, гребенку вынимают и лунки заполняют буфером для электрофореза.

Г. Нанесение образцов и краски

Наносимые образцы содержат 5-10% глицерола или 5-10% сахарозы и 0,025% красителя, благодаря которому можно проследить за ходом электрофореза. Например, можно добавить в образец 1 /₁₀ объема раствора, содержащего 50% глицерола и 0,25% красителя.

ДНК. Наносите около 10 нг ДНК в расчете на каждую ожидаемую полосу. Гель будет перегружен, если в полосе окажется более чем примерно 100 нг ДНК.

Бромфеноловый синий (распадается в щелочи).

Бромкрезоловый зеленый (обладает одинаковой подвижностью и в нейтральных, и в щелочных растворах). Ксиленцианол FF (распадается в щелочи; подвижность ниже, чем подвижность бромфенолового или бромкрезолового).

Образцы можно наносить, используя автоматическую пипетку и полипропиленовый наконечник или с помощью микрошприца, на который надет тонкий пластиковый шланг.

Подвижность небольших молекул ДНК может быть такой же или даже большей, чем подвижность используемого красителя. Чем ниже концентрация агарозы и (или) выше напряженность, тем больший фрагмент ДНК будет обладать такой же подвижностью, как и краситель. Краситель поглощает флуоресценцию связанного с ДНК бромистого этидия. Это приводит к тому, что в том месте геля, где находится краска, невозможно наблюдать слабые полосы ДНК. Образцы можно наносить и без краски.

источник