Электрофорез — направленное перемещение частиц дисперсной фазы под действием приложенной разности потенциалов. Это явление наблюдается в седиментационно устойчивых дисперсных системах. При наложении на такую систему внешней разности потенциалов происходит разрыв ДЭС по плоскости скольжения, в результате чего частица получает заряд и перемещается к соответствующему электроду.
Приведенные выше уравнения Гельмгольца — Смолуховского справедливы для электрофореза, в частности для электрокинетического потенциала используется уравнение (4.9). Отличие состоит только в системе координат: в одном случае рассматривается скорость жидкости, в другом — скорость движения частиц, которую обычно определяют по смещению цветной границы.
Электрофорез наблюдают в U-образном сосуде (см. лабораторный практикум). В нижнюю часть сосуда наливают золь, сверху — контактную (боковую) жидкость, имеющую одинаковую (или немного большую) с золем электрическую проводимость. Наблюдают за изменением уровня золя в обоих коленах трубки и по скорости перемещения частиц дисперсной фазы определяют линейную скорость электрофореза Wq :
где S — путь, пройденный золем за время г (время электрофореза).
При электрофорезе отношение линейной скорости к напряженности
электрического поля 
называют электрофоретической подвижностью:
Напряженность электрического поля Е зависит от приложенной разности потенциалов на электродах U и расстояния между ними L:
Рассмотренные уравнения справедливы при допущениях: 1) частицы движутся в однородном электрическом поле; 2) частицы могут иметь любую форму и не проводят электрический ток; 3) толщина ДЭС много меньше размеров частиц золя.
Для расчета ^-потенциала частиц, находящихся в разбавленных водных растворах при 293 К, можно использовать простое соотношение:
в котором электрофоретическая подвижность и, выражена в(тогда
^-потенциал будет иметь размерность В). 
Несовпадение экспериментальных и теоретических значений объясняется релаксационным эффектом и электрофоретическим торможением.
Релаксационный эффект проявляется в нарушении симметрии диффузионного слоя вокруг частицы при относительном перемещении фаз в противоположные стороны.
Электрофоретическое торможение обусловлено сопротивлением движению частицы обратным потоком противоионов, которые увлекают за собой жидкость. В некоторых случаях несовпадение можно учесть введением поправок, иногда этим несовпадением можно пренебречь.
Скорость электрофореза зависит нс только от приложенного напряжения, но и от радиуса частиц и других факторов. Это можно учесть введением в уравнение (4.8) поправочного коэффициента к:
Поправочный коэффициент определяется экспериментально в каждом отдельном случае электрофореза.
Для примера рассмотрим данные по электрофорезу в суспензиях глин Трошковского, Никольского и Слюдянского месторождений, микрофотографии которых приведены на рис. 1.1.
Электрокинетический потенциал определяли методом подвижной границы при электрофорезе и рассчитывали по уравнению:
где S — путь; 
L — расстояние между электродами;
U — разность потенциалов между электродами;
г — преимущественный радиус частицы, определяемый обычно по максимуму на кривой распределения частиц но размерам;
/(к г) — поправочная функция, учитывающая эффекты электрофоретического торможения и релаксации (табл. 4.1);
к — параметр Дебая, равный обратной величине плотной части двойного электрического слоя, то есть к = 1/6.
источник
Основный белок
+ NH 3 — белок — COO – + ОН – + NH 3 — белок — COO – + ОН – NH 2 — белок –СОО –
Водный раствор рН = р I pH > pI
Основный белок белок заряженотрицательно
В кислой среде заряжен положительно
+ NH 3 — белок — COO – + Н + + NH 3 — белок – COOН
рН 10 ) белки заряжены отрицательно, нейтральный заряд имеет белок в изоэлектрической точке, которая у каждого белка своя. Наименьшей устойчивостью обладают растворы белков в изоэлектрической точке. Белки, объединяются в более крупные частицы, начинается седиментация( осаждение) под действием собственной силы тяжести.
Значение рН крови равно 7,4, в крови присутствуют, в основном, кислые белки
При наличии заряда белки перемещаются в электрическом поле. Смеси белков можно разделять методом электрофореза – направленного движения белков от одного электрода к другому под действием постоянного электрического тока. Скорость движения зависит от массы белка и величины его заряда.
Метод электрофореза широко применяется в медицине, биохимии, биологии для изучения ферментов, тканевых и плазменных белков , при изготовлении лекарственных препаратов белковой природы.
8.4.2. Денатурация белка
Макроструктура белка является весьма чуткой к изменению условий среды, в которой существует белок.
В белковой молекуле существует постоянное равновесие между силами, формирующими третичную( четвертичную) и силами отталкивания. которые возникают внутри самой молекулы и при взаимодействии с окружающей средой. При нарушении этого равновесия изменяются четвертичная, третичная и даже вторичная структура( кроме первичной! ).
Возникает потеря природных свойств белка- денатурация.
Денатурация может быть обратимой и необратимой.
Часто видимым следствием денатурации белка является осаждение белка из раствора.
Общими факторами денатурации являются :
а) изменение температуры. Повышение температуры приводит к необратимой денатурации, большинство белков организма человека теряют свою активность при температуре выше 50 0 С, а белки крови- даже при 43 – 45 0 С. На этом основаны стерилизация медицинских препаратов и пастеризация пищевых продуктов.
При снижении температуры денатурация является обратимой.
Биологический белковый материал можно сохранять долго при низких температурах
( кровь, образцы тканей, растворы белковых гормонов , защитных γ-глобулинов,
б) изменение рН среды. При изменении рН среды изменяется характер ионизации кислотных и основных групп в радикалах, изменяется характер ионного взаимодействия и количество водородных связей — изменяется пространственное строение белка и организация его активных участков. В организме человека поддерживается кислотно-основный гомеостаз. Значение рН крови равное 7,4 обеспечивает необходимую организму биологическую активность всех белковых молекул.
в) действие окислителей и восстановителей. Изменяется соотношение восстановленных тиольных групп и дисульфидных связей, что вызывает изменение третичной структуры белка. Свободные тиольные группы белков содержатся и в активных участках ферментов, участвуют в химических реакциях( образование тиополуацеталей происходит в процессе окисления биоактивных альдегидов в карбоновые кислоты . См тему «Механизмы реакций. Реакции нуклеофильного присоединения»)
Лекарственные препараты, обладающие свойствами восстановителей. используются в медицине для поддержания структуры белка( аскорбиновая кислота- витамин С, раствор тиосульфата натрия ). Для химической завивки используют препараты, создающие дополнительные дисульфидные связи ; волосы после фиксации на круглой палочке( бигуди) становятся кудрявыми.
г) ионы тяжелых металлов( свинца, меди, ртути , цинка ), которые образуют соли с тиольными группами на поверхности белковой молекулы. Попадание в желудочно-кишечный тракт солей тяжелых металлов и затем всасывание их в кровь вызывает тяжелые последствия. Различают хроническое воздействие и острое отравление. Заболевание « сатурнизм», связанное с накоплением ионов свинца в организме человека, сопровождается тяжелыми патологическими изменениями со стороны центральной нервной и кровеносной системы. Отравление ионами ртути сопровождается ранним старением организма, и приводит быстро к смерти ( в древние времена было характерно для иконописцев, которые использовали красную краску киноварь HgS, а для тонкого точного мазка обязательно брали кисточку в рот, чтобы получился острый кончик кисти).
В связи с аналогичным токсическим действие свинца запрещено этилирование бензина.
д) присутствие различных поверхностно-активных веществ, детергентов, которые влияют на гидрофобное взаимодействие в молекуле белка. Гидролиз фосфолипидов в составе мембраны сопровождается образованием солей высших карбоновых кислот- поверхностно-активных веществ, и это вызывает потерю эластических свойств мембраны ( изменение «текучести» мембраны).
е) действие веществ, которые конкурируют за образование водородных связей, например, мочевины. Высокое и низкое содержание мочевины в крови способствует изменению свойств белков крови и внутриклеточных белков, особенно в составе белков мембран нейронов.
ж) действие электролитов, которые разрушают гидратную оболочку белка( процесс «высаливания»). На этом основаны рекомендации полоскать горло солевыми растворами во время заболевания и в профилактических целях. Уже в древние времена знали, что засыпание солью( сильнейшая боль ! ) огнестрельной или резаной раны в условиях боя предотвращает развитие гангрены.
з) физические воздействия ( ультразвук, лазерное воздействие, электрокоагуляция. ). Используется в медицинских целях в косметологии, лечении кожных, стоматологических болезней, в хирургии для остановки кровотечения. В современных медицинских технологиях используют лазерный луч.
8.5.Качественные реакции обнаружения белков в биологических объектах.
Биуретовая реакция – обнаруживает пептидные связи. При добавлении иона Си(+2) в щелочной среде сопровождается развитием цветной фиолетовой окраски. Интенсивность окраски пропорциональна количеству пептидных связей( содержанию белка в биологической жидкости). В биохимической лабораторной диагностике на основе биуретовой реакции используют методики Фолина или Лоури.
Ксантопротеиновая реакция- при действии азотной кислоты и последующем нагревании смеси получается осадок желтого цвета. Обнаруживает ароматические аминокислоты в составе белка ( фенилаланин и тирозин)
Подробно методики приведены в «Практикуме по биоорганической химии»
авторы Каминская Л.А., Перевалов С.Г.
8. 6. Приложение. История развития химии белков
Термин белковый ( albumineise) был впервые применен французским химиком Ф. Кене в 1747 г. Так стали называть все биологические жидкости организма по аналогии с яичным белком. «Энциклопедия» Д. Дидро и Ж. Д ‘ Аламбера в 1751 году именно так объясняла этот термин. В дальнейшем начались систематические исследования белков.В 1759г. А.Кессель-Майер выделил клейковину из растений, в 1762г. А. Халлер изучал процесс образования и свертывания казеина молока, в 1777г. А. Тувенеель, работавший в С-Петербурге, назвал творог белковой частью молока. В тот же период французский химик А. Фуркруа доказал единую химическую природу белков растительного и животного происхождения.
В 1803 г. физик и химик Дж. Дальтон( ему принадлежит формулировка закона кратных отношений, исследование газовых законов и описание дефекта цветового зрения) отнес белки к азотсодержащим соединениям. В 1810г. известный всем школьникам Ж. Гей-Люссак провел химический анализ фибрина крови. Предполагают, что первым провел гидролиз белков А. Браконно в 1820 г. и получил аминокислоты, в том числе глицин и лейцин.
Первая теория строения белков принадлежит химику Г. Мульдеру, он сформулировал ее в 1836г.Он предположил, что существует минимальная структурная единица, из которой простроены все белки , состав ( 2 С8 Н12 N2 + S0) и назвал ее протеином.
Позднее теория была опровергнута, но термин остался и прочно вошел не только в научный язык химиков.
В 1882г. В.Даль в «Толковом словаре русского языка» объясняет слово протеин- вещество, найденное в животных тканях.
В книге Д.И.Меделева( 2-е изд. СанктПетербург, Изд. Товарищества «Общественная польза» 1863г.), упоминаются термины белки и протеиновые вещества :
« Из органическихъ веществъ общи всемъ организмамъ протеновыи или белковыя вещества, отличающиеся сложным составомъ, способностью легко изменяться и даже способствовать измененiю других веществъ. Белковое вещество, производящее эти изменения, называется ферментомъ»( сохранено правописание).
Близок к открытию структуры белка был российский биохимик А.В. Данилевский
( 1838 – 1923), который много занимался изучением ферментов и проблемой питания.
В 1902 г. работы Т. Курциуса по синтезу пептидов привели к созданию пептидной гипотезы : « все белки состоят из аминокислот, соединенных между собой связью
Окончательно «пептидную теорию» сформулировали Э.Фишер и В. Гофмейстер( Нобелевская премия Э. Фишера 1902 г.)
ь Успешное изучение состава белков началось благодаря работам английского биохимика Ф.Сэнгера, который в 1945 разработал метод определения аминокислотной последовательности( лауреат Нобелевских премий 1958, 1980) и С. Мура, который сконструировал в 1958 г. автоматический аминокислотный анализатор.( Нобелевская премия 1972)
Строение пептидной группы стало возможным изучить после открытия метода рентгеноструктурного анализа.
Теорию строения а- спирали — и термин »вторичная структура» белка создал Л.Полинг ( 1951г. совместно с Р. Кори). Л. Полинг- лауреат Нобелевских премий ( по химии 1954, мира 1962).
Структура « складчатый» лист исторически была открыта раньше , У. Астбери в
1941 г. при рентгеноструктурных исследованиях белка кератина
Термин « четвертичная» структура был введен в 1958 г. английским кристаллографом Дж. Берналом в дополнение к принятым понятиям первичной, вторичной, и третичной структуры, а в 1965г. Ж. Моно ввел понятие «протомер» для названия наименьшей структурной единицы сложной белковой молекулы( чаще теперь называют «субъединица»)
Метод рентгеноструктурного анализа долгое время оставался самым точным для расшифровки пространственного строения белка: в 1936г Дороти Ходжкин исследовала и предложила пространственную структуру инсулина, в 1960 –Д.К.Кендрью – пространственное строение миоглобина. Сейчас используются компьютерное моделирование и приборные методы исследования: методы ЯМР
( ядерного магнитного резонанса) , ПМР протонного магнитного резонанса).
Для проверки усвоения темы рекомендуем ответить на вопросы:
1. Анализ дипептида показал, что он состоит из двух различных аминокислот : глицина и аланина. Сколько различных дипептидов можно составить?
2. Трипептид состоит из двух аминокислот: глицина и аланина. Запишите все возможные варианты строения этого трипептида.
3. Последовательность аминокислот в трипептиде: ала – глу — вал. Определите среду его водного раствора и заряд пептида в растворе.
4. Последовательность аминокислот в пептиде гли – лиз – сер. Этот пептид находится в растворе кислоты, рН= 3, 5. Определите величину заряда пептида.
5. Пептид состава асп – арг – фен находится в растворе в изоэлектрической точке.
Составьте формулу трипептида и определите область значения изоэлектрической точки ( кислая, нейтральная, щелочная). Какую надо создать среду, чтобы этот трипептид при электрофорезе двигался к катоду ?
6.Трипептид глутатион — антиоксидант крови и тканей – состоит из последовательно соединенных аминокислот : γ –глутамат- цистеин –аланин. Запишите формулу соединения и реакцию окисления этого соединения пероксидом водорода . .
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Увлечёшься девушкой-вырастут хвосты, займёшься учебой-вырастут рога 9790 — 
| 7665 — 
или читать все.
195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ — направленное перемещение электрически заряженных частиц дисперсной фазы в дисперсионной среде (или ионов в электропроводящем растворе) под действием внешнего электрического поля. Метод электрофореза широко используется в биологии и медицине для выделения и анализа индивидуальных белков (см.), нуклеиновых кислот (см.) и других биополимеров, вирусов, надмолекулярных клеточных структур, а также целых клеток. В иммунологии одним из наиболее употребляемых методов исследования является иммуноэлектрофорез (см.) — электрофоретическое разделение смеси антигенов или антител в геле с последующий их преципитацией. Путем микроэлектрофореза(см. Микроионофорез) в клетку можно ввести или к ней подвести любые вещества, способные диссоциировать на ионы (см.). Микроионофорез является одним из основных современных методов в нейрофизиологических, нейрофармакологических, нейрохимических исследованиях. Большое диагностическое значение имеют электрофоретическое разделение ферментов (см.) на коферменты (см.) и их количественная и качественная оценка. Введение лекарственных веществ в организм путем Э. широко применяется в физиотерапии (см.).
Электрофорез наряду с электроосмосом (см.) был открыт в 1807 году профессором Московского университета Рейссом. Электрокинетические явления (см.), к которым относят электрофорез, обусловлены наличием на границе раздела фаз двойного электрического слоя и способностью диффузной части этого слоя смещаться относительно адсорбционно связанной (неподвижной) его части. Электрический потенциал поверхности, разделяющей подвижную и неподвижную части двойного электрического слоя, носит название электрокинетического или ζ (дзета)-потенциала. Частицы дисперсной фазы, находящиеся в буферном растворе (см. Буферные растворы), несут определенный суммарный электрический заряд, величина и знак которого зависят от величины pH среды (см. Водородный показатель). Если через буферный раствор, заключенный в сосуд с электроизолирующими стенками, например, в стеклянную трубку, пропускать электрический ток, то результатом этого будет появление определенного градиента напряжения (см. Градиент), или электрического поля. Под действием этого поля частицы дисперсной фазы в соответствии со знаком суммарного заряда движутся в направлении катода, то есть происходит катафорез, или анода — анафорез. В зависимости от величины заряда и своих размеров частицы в электрическом поле приобретают разные скорости. Смесь разнородных частиц, внесенная в узкую зону, в этих условиях разделяется на зоны, образуемые частицами, движущимися с одинаковой скоростью, то есть обладающими одинаковой электрофоретической подвижностью.
Электрофоретическая подвижность частиц, имеющих сферическую форму (V), выражается формулой Смолуховского: V = ( ζD)/(4πη), где ζ — электрокинетический потенциал двойного электрического слоя, окружающего частицу, D — диэлектрическая проницаемость и η — вязкость среды. В том случае, когда электрофоретическое разделение смеси частиц (или молекул) производят в буферных растворах с не слишком низкими (например, около 0,1) значениями ионной силы раствора (полусуммы произведений концентраций всех находящихся в растворе ионов на квадрат величины их заряда), частицы группируются по фракциям лишь по величине заряда без учета размеров или молекулярных весов (масс), если речь идет о молекулах.
Использование электрофореза в биологии и медицине началось в 30-е годы 20 века, когда А. Тизелиус разработал метод электрофореза в свободной жидкости и сконструировал прибор для электрофоретического разделения и анализа смеси белков так называемым методом подвижных, или свободных, границ. В медико-биологических исследованиях применяют множество вариантов двух главных модификаций электрофоретического метода — электрофореза в свободной жидкости (свободнопроточный электрофорез) и зонального электрофореза (зонный электрофорез, или электрофорез на инертных носителях). Первым был разработан электрофорез в свободной жидкости (метод подвижных границ, электрофорез по Тизелиусу), который позволял измерять электрофоретическую подвижность испытуемого вещества по перемещению подвижной границы между чистым буферным раствором и буферным раствором, содержащим исследуемое вещество. В приборе Тизелиуса используется оптический метод регистрации положения такой границы по определению показателя преломления среды (см. Нефелометрия, Рефрактометрия), а в некоторых случаях — прямое микроскопирование. При разделении смеси веществ с различными изоэлектрическими точками (см. Изоэлектрическая точка) оптические устройства регистрируют несколько движущихся пиков (рис. 1). Основным недостатком электрофореза в свободной жидкости является ее тепловое движение, мешающее четкому разделению фракций и размывающее границы зон. Этот недостаток частично преодолевается созданием градиентов плотности буферных растворов (например, с помощью сахарозы). При фракционировании низкомолекулярных веществ, чтобы избежать чрезмерного размывания зон, применяют высоковольтный электрофорез, иногда в сочетании с хроматографией (см.) — так называемый метод «отпечатков пальцев».
Зональный электрофорез отличается от электрофореза в свободной жидкости главным образом использованием нейтральной поддерживающей среды (инертных носителей) для жидкой фазы (буферного раствора), что сводит к минимуму эффект теплового движения и позволяет при необходимости выделить тот участок носителя, который содержит индивидуальное вещество. В качестве инертных носителей в зональном электрофорезе используют специальную хроматографическую бумагу, полоски ацетата целлюлозы, тонкие слои силикагеля, порошка целлюлозы или гели сефадексов (см. Декстран). Зональный электрофорез на инертных полимерах-носителях позволяет фракционировать вещества не только по величине заряда, но и по молекулярному весу. Особое место среди таких носителей занимают гели полиакриламида (ПААГ) и агарозы. Преимущество полиакриламидных гелей заключается в возможности изменения диаметра их пор при изменении концентрации полимера, а также в отсутствии явлений адсорбции и электроосмоса при электрофорезе.
При электрофоретическом разделении гетерогенной смеси в полиакриламидном геле колонку небольшого сечения (около 1 см 2 ) заполняют буферным раствором, содержащим растворенный мономер (акриламид; CH2—CH— CONH2, небольшое количество вещества-сшивателя (бис-N-метиленметакриламида — НС(СН2)—CONH—CH2-NHCO-(CH2)CH ) и вещество-инициатор полимеризации. Через некоторое время при комнатной температуре в колонке образуется однородный гель (рис. 2). Если с помощью электрофореза в свободной жидкости по Тиэелиусу в сыворотке крови обнаруживают 5 белковых фракций (см. рис. 1), то при электрофоретическом разделении сыворотки крови в полиакриламидном геле их насчитывают не менее 25 (рис. 3).
Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле значительно повышается при использовании в качестве носителя системы гелей (обычно двух — «рабочего» мелкопористого и непосредственно над ним «формирующего» крупнопористого). Кроме степени пористости, эти гели резко различаются по величине pH и молярности буферных растворов, в которых они полимеризуются. Такой электрофорез называют ступенчатым, или дискэлектрофорезом (английский (discontinuous — прерывистый).
Вариантом электрофореза в полиакриламидном геле является электрофорез смеси биополимеров после предварительной обработки денатурирующим агентом с целью изменения конфигурации молекул. Белки в этом случае обрабатывают ионным детергентом (см.) — додецилсульфатом натрия, разрушающим дисульфидные связи в их молекулах и образующим с ними отрицательно заряженные мицеллы, заряд которых пропорционален молекулярному весу белка; нуклеиновые кислоты подвергают электрофорез в присутствии щелочи, мочевины, формамида или других агентов, разрушающих водородные связи в полинуклеотидных цепях нуклеиновых кислот. При этих условиях электрофоретическая подвижность биомолекул начинает строго коррелировать с их молекулярным весом.
Для наблюдения за ходом электрофореза в геле в исследуемую смесь добавляют химически инертный в отношении разделяемых веществ низкомолекулярный краситель (см. Красители), молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и молекулы разделяемых веществ, но обладают электрофоретической подвижностью, которая несколько выше подвижности белковой фракции, продвигающейся первой. Такой краситель называют лидирующим. Чаще всего в щелочных и нейтральных буферных растворах используют бромфеноловый синий, в кислой среде — метиловый зеленый или пиронин. Когда окрашенная зона доходит до конца геля, электрофорез прекращают, после фиксации гель на определенное время погружают в р-р специфического красителя, после чего избыток красителя отмывают (рис. 4) Для выявления на электрофореграмме белков-ферментов иногда пользуются их каталитической активностью в отношении хромогенных субстратов. Широко применяется обнаружение электрофоретических зон по их радиоактивности (см. Авторадиография).
Многие исследователи в качестве инертных носителей предпочитают гели в виде тонких пластин. Электрофорез в гелевой пластине делает более достоверным сравнение отдельных препаратов, позволяет проводить двухмерное разделение и др. Для анализа аминокислот, пептидов и сахаров (в виде их боратных комплексов) используют высоковольтный электрофорез на бумаге, в тонком слое силикагеля, ацетата целлюлозы и других красителей.
Разделение сложной смеси белков не всегда удается осуществить даже при использовании перечисленных выше приемов электрофореза. Поэтому в сложных случаях применяют так называемый двухмерный электрофорез, когда после первого электрофоретического фракционирования смеси белков каждую полосу используют как исходный препарат для электрофореза в перпендикулярном направлении по отношению к направлению первого разделения. В результате на второй пластине появляется большое число зон, соответствующих индивидуальным белкам (иногда их число достигает 2 тысячи).
Существуют методы, объединяющие, например, электрофорез и хроматографию (см.); иногда разделение смеси белков проводят в перпендикулярных направлениях, или в одном направлении белки разделяют электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а в перпендикулярном ему — с помощью изоэлектрического фокусирования (см.). Последний метод позволяет на одной гелевой пластине выявить до 7 тысяч индивидуальных белков. Вариантами электрофореза являются также электрофорез в градиенте значений pH и электрофорез в градиенте пористости геля, иммуноэлектрофорез, аффинный электрофорез, сочетающий в себе преимущества электрофореза и аффинной хроматографии, и др.
С помощью электрофореза белков определяют их первичную структуру, молекулярный вес, патогенность и наличие множественных форм. Для электрофореза клеток используют свободнопроточный электрофорез в его аналитических и препаративных вариантах. Так фракционируют бактериальные клетки, вирусы, а также лизосомы, митохондрии, комплексы Глльджи и другие клеточные органеллы. Молекулы нуклеиновых кислот отличаются от молекул белков сильным отрицательным зарядом. Фракционирование их смесей осуществляют за счет различий мол. веса нативных высокомолекулярных ДНК и РНК. Для электрофоретического фракционирования их низкомолекулярных фрагментов используют крупнопористые гели агарозы или гели полиакриламида с концентрацией от 5 до 20%, а также их смеси. Анализ фрагментов нуклеиновых кислот, полученных при расщеплении молекул ДНК нуклеазами и химическими агентами, дает возможность определить первичную структуру этих биополимеров, то есть структуру генов (см. Ген).
Метод электрофореза позволил обнаружить нормальный наследственный полиморфизм белков человека. Стали известны десятки вариантов гемоглобинов (см. Гемоглобин), глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и других белков. Были получены данные о множественных формах ферментов (см. Изоферменты), последовательно экспрессируемых в ходе онтогенеза и генетически независимых. В результате исследования крови, мочи, цереброспинальной жидкости электрофореза были выявлены изменения нормальной экспрессии генов, кодирующих синтез определенных белков при различных патологических состояниях (рис. 5).
С помощью электрофоретического анализа ферментов (см.) возможна диагностика, в том числе пренатальная, некоторых врожденных заболеваний.
При молекулярной патологии происходит изменение плотности относительного заряда на поверхности клеток, поэтому методом электрофореза можно, например, выявить и разделить субпопуляции B- и Т-лимфоцитов.
Начаты исследования по получению особо чистых препаратов (например, интерферона) методом электрофореза в условиях невесомости при космических полетах.
Лекарственный электрофорез (устаревший ионофорез, ионтофорез, ионотерапия, гальваноионотерапия, ионогальванизация) — метод электролечения, заключающийся в сочетанном воздействии на организм постоянного тока и вводимых с его помощью лекарственных веществ. В лечебную практику лекарственный электрофорез был введен с 1802 году, когда Росси (Rossi) впервые применил для воздействия на организм больного лекарственные вещества в сочетании с постоянным током (см. Гальванизация). Долгое время для лекарственного электрофореза использовали только постоянный непрерывный ток (гальванический). В настоящее время широко применяют диадинамические токи (см. Диадинамоэлектрофорез), синусоидальные модулированные (амплипульсфорез) и флюктуирующие (флюктуофорез) токи в выпрямленном режиме.
Принципиальной основой лекарственного электрофореза является теория электролитической диссоциации (см. Диссоциация в химии, Электролиз). Лекарственные вещества, способные диссоциировать в растворе на положительные (катионы) и отрицательные (анионы) ионы, направленно перемещаются в поле постоянного электрического тока и могут поступать в организм, преодолевая кожный барьер (см. Кожа). При этом с электродной прокладки вводятся лишь те ионы, которые имеют одноименный знак с электродом.
При электрофорезе основными путями проникновения лекарственных веществ в организм через кожу являются выводные протоки потовых и, в меньшей степени, сальных желез. Часть лекарственного вещества проникает в организм через межклеточные пространства и часть — через сами клетки (особенно при электрофоретическом введении лекарственных веществ через слизистую оболочку).
При электрофорезе лекарственные вещества проникают на небольшую глубину: сразу после процедуры они обнаруживаются в основном в эпидермисе и дерме, в небольшом количестве — в подкожной клетчатке. Отсюда введенные путем электрофореза лекарственные вещества поступают в лимфо- и кровоток и разносятся по всему организму, хотя преимущественно они накапливаются в тканях и органах области воздействия.
Электрофорез лекарственных веществ через кожу и слизистые оболочки количественно не подчиняется законам электролиза, так как живые ткани обладают электрокапиллярной активностью (см. Электроосмос) и барьерными свойствами (см. Барьерные функции). При электрофорезе в организм вводится всего от 1 до 10% вещества, находящегося в растворе (на прокладке). На количество вводимого путем электрофореза вещества существенно влияют физико-химические свойства самих лекарственных средств и свойства их растворов (степень диссоциации вещества, размеры, величина и знак заряда иона, возможность и степень его гидратации, используемый растворитель, концентрация и др.), условия проведения физиотерапевтической процедуры (плотность тока, длительность воздействия возраст пациента и др.), функциональное состояние организма в целом и кожи в особенности.
Лекарственное вещество, вводимое методом электрофореза может действовать на организм рефлекторным путем (так называемый понный рефлекс по Щербаку), гуморальным путем и кроме того, оказывать местное действие. Это зависит от типа и количества лекарственного вещества, методики и условий проведения процедуры, параметров физического фактора и др.
Электрический ток, используемый для электрофореза, вызывает в организме разнообразные физико-химические, метаболические и клеточно-тканевые реакции (см. Гальванизация, Диатермия, Диатермоэлектрофорез), на фоне которых действие вводимых с помощью электрофореза лекарственных веществ приобретает ряд особенностей и преимуществ по сравнению с обычными способами фармакотерапии (см.). Наибольшее практическое значение при лекарственном электрофорезе имеют следующие факторы:
- более длительное действие лекарственного средства и более медленное выведение его из организма благодаря, прежде всего, образованию в коже депо ионов, обладающих фармакологической активностью;
- возможность создания высокой локальной концентрации лекарственного вещества без насыщения им крови и других сред организма;
- меньшая вероятность возникновения побочных реакций;
- введение лекарственного вещества в наиболее фармакологически активной форме — в виде ионов;
- безболезненность введения лекарственных средств и отсутствие деформации тканей, возникающей при других способах фармакотерапии из-за введения растворителя.
Благодаря стимулирующему действию электрического тока отчетливое специфическое и выраженное терапевтическое действие вводимых путем электрофореза лекарственных веществ проявляется при таких концентрациях, которые при обычных способах фармакотерапии оказались бы малодейственными или неэффективными.
Назначение лекарственного электрофореза определяется, с одной стороны, благоприятным лечебным эффектом постоянного непрерывного тока или других видов электрического тока (см. Импульсные токи), а с другой стороны — показаниями к применению соответствующих лекарственных средств.
Лекарственный электрофорез нельзя применить в тех случаях, когда имеются объективные противопоказания к применению электролечения и соответствующих лекарственных средств, а также при их индивидуальной непереносимости.
Техника лекарственного электрофореза сводится к расположению на пути тока (между телом человека и электродами) раствора лекарственного вещества. В зависимости от способа нанесения лекарственного вещества и подведения тока различают несколько вариантов лекарственного электрофореза. Наиболее распространено электрофоретическое введение лекарственных веществ из растворов, которыми смачиваются специальные прокладки между телом пациента и электродом. Техника выполнения лекарственного электрофореза в этой модификации мало отличается от техники гальванизации (см.). Единственное отличие заключается в том, что электродную прокладку смачивают не водопроводной водой, как при гальванизации, а раствором лекарственного вещества. Этот раствор с помощью бюретки или другого дозирующего устройства количественно наносят на гидрофильную прокладку или, чаще, на специальную лекарственную прокладку, располагаемую при процедуре между кожей и защитной прокладкой. Лекарственные прокладки готовят из 1—2 слоев фильтровальной бумаги или 2—4 слоев марли. По форме и площади они должны соответствовать защитной прокладке. Раствором лекарственного вещества смачивают обычно одну прокладку, однако лекарственные вещества, диссоциирующие на ионы с противоположными зарядами, могут наноситься на обе (катодную и анодную) прокладки.
Раствор лекарственного вещества наносят на прокладку электрода (положительно заряженного — анода или отрицательно заряженного — катода), одноименного с подлежащим электрофоретическому введению ионом. При выборе полярности следует учитывать следующее: ионы всех металлов, местноанестезирующие средства, большинство алкалоидов, антибиотиков и сульфаниламидных препаратов имеют положительный заряд, поэтому при электрофорезе они должны вводиться с анода, а ионы всех металлоидов и кислотные радикалы приобретают в растворах отрицательный заряд и, следовательно, должны вводиться в организм с катодного электрода. Суммарный заряд амфотерных соединений (белки, аминокислоты и др.) зависит от их ионного состава и величины pH среды (см. Водородный показатель): при низких значениях pH заряд становится более положительным, при высоких — более отрицательным.
При так называемом ванночковом электрофорезе в ванночку (стеклянную, фаянсовую, пластмассовую) с вмонтированными электродами, заполненную раствором лекарственного вещества, погружают подлежащую воздействию обнаженную часть тела больного.
Полостной лекарственный электрофорез заключается в том, что перед введением электрода, соединенного с соответствующим полюсом аппарата для лекарственного электрофореза, в полость желудка, мочевого пузыря, прямой кишки, влагалища, носа вводят раствор лекарственного вещества.
В медицинской практике, особенно при лечении заболеваний бронхолегочной системы, получает распространение так называемый внутритканевой электрофорез. При этом после введения лекарственного вещества в организм одним из общепринятых способов (внутривенно, подкожно, внутримышечно, ингаляционным путем) проводят гальванизацию области патологического очага при перпендикулярном расположении электродов. Время проведения процедуры должно соответствовать времени достижения максимальной концентрации лекарственного вещества в крови.
При сочетанных способах лечения лекарственный электрофорез можно проводить одновременно с другим физиотерапевтическим воздействием. К таким сочетанным способам относятся ультразвук — электрофорез (электрофонофорез), дозированный вакуум — электрофорез (вакуум-электрофорез), индуктотермия — электрофорез (индуктотермоэлектрофорез), магнитное поле — электрофорез (магнитоэлектрофорез) и др. Сочетание лекарственного электрофореза с другими физиотерапевтическими воздействиями позволяет вводить в организм лекарственное вещество в большем количестве и на большую глубину, чем при одном электрофорезе, и потенцирует его действие.
Для лечебного электрофореза применяют лекарственные средства, относящиеся к самым различным группам. Нам более часто употребляют местноанестезирующие средства, витаминные, ферментные препараты, химиотерапевтические, сосудорасширяющие и сосудосуживающие средства, седативные средства, природные соединения и др. Лекарственные вещества, предназначенные для электрофоретического введения, должны быть чистыми, не содержать наполняющих и связующих соединений, по возможности их растворы надо готовить непосредственно перед применением. В качестве растворителя при приготовлении растворов для лекарственного электрофореза лучше всего использовать дистилированную воду. При плохой растворимости лекарственного вещества в воде в качестве растворителя можно применять спирт, димексид и другие полярные растворители, разрешенные ГФ. Приготовление лекарственных средств на изотоническом растворе натрия хлорида и других растворах электролитов (см.) является нежелательным, так как это резко уменьшает введение в организм лекарственного иона. При электрофорезе ферментов в качестве растворителей используют буферные растворы (см.).
Дозируют лекарственный электрофорез так же, как и гальванизацию: по длительности процедуры от 10 до 30 минут и плотности тока 0,03—0,08 ма/см 2 . Для детей и пожилых людей дозиметрические параметры уменьшают в зависимости от возраста на 25— 30%. На курс лечения назначают от 10—12 до 15—20 процедур, которые проводят ежедневно или через день.
Для лекарственного электрофореза применяют различные аппараты. Источниками гальванического тока (см. Гальванизация) и импульсных диадинамических токов являются аппарат Поток-1, АГН-32, АГП-33, СНИМ-1 Модель-717, Тонус-1 и Тонус-2, синусоидальных модулированных токов — аппараты Амплипульс-ЗТ. Амплипульс-4, флюктуирующих токов — аппарат АСБ-2.
Библиогр.: Бабский В. Г., Жуков М. Ю. и Юдович В. И. Математическая теория электрофореза, Применение к методам фракционирования биополимеров, Киев, 1983; Гааль Э., Медьеши Г. и Верецкси X. Электрофорез в разделении биологических макромолекул, пер. с англ., М., 198* Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот, Электрофорез и ультрацентрифугирование, 1981; Парфенов А. П. Элестрофорез лекарственных веществ, Л., 1973, ; Улащик В. С. Теория и практика лекарственного электрофореза, Минск, 1976, библиогр.; он же, Физикофармакологические методы лечения и профилактики, Минск, 1979; Cell electroptoresis in cancer and other clinical reearch, ed. by A. W. Preece a. P. Light, Amsterdam, 1981; Dunn M. Affinity electrophoresis, Lab. Pract., 33, p. 13, 1984; Electrophoresis’83, Advanced methods biochemical and clinical applications, ed. by H. Hlrai, B.— N. Y., 1984.
E. В. Раменский; В. С. Улащик (физиотер.).
источник
Для подведения постоянного тока к пациенту используют электроды из металлических пластин (свинца, станиоля) или токопроводящей графитизированной ткани и гидрофильных матерчатых прокладок.
Последние имеют толщину 1-1,5 см и выступают за края металлической пластаны или токопроводящей ткани на 1,5-2 см.
Существуют другие виды электродов: стеклянные ванночки для глаз, полостные — в гинекологии, урологии. Гидрофильные прокладки предназначены для исключения возможности контакта продуктов электролиза (кислоты, щелочи) с кожей и изготавливаются из белой ткани (фланели, байки, бумазеи).
Нельзя пользоваться прокладками из шерстяной или окрашенной ткани. Гидрофильные прокладки сшивают из 5-6 слоев материн (для удобства прополаскивания в воде, кипячения и сушки), пришивают карман из одного слоя фланели, в который вкладывают свинцовую пластинку, соединенную с токонесущим проводом, металлическим зажимом или припаянную непосредственно к проводу.
В кабинете целесообразно иметь набор свинцовых пластин различной площади от 4 до 800-1200 см2 или такой же площади углеграфитовых. В последние годы выпускают одноразовые электроды. Используют электроды специальной формы (в виде полумаски для лица, «воротника» для верхней части спины и надплечий, двухлопастные, круглые на область глаз и др.).
Следует знать, что ионы свинца вредно действуют на организм, поэтому медицинские сестры, постоянно работающие в этом кабинете, должны получать пектин или мармелад. Свинцовые пластины периодически необходимо чистить наждачной бумагой и протирать спиртом для снятия налета окиси свинца, а также тщательно разглаживать металлическим валиком перед процедурой. Электроды фиксируют с помощью эластичных бинтов, мешочков с песком или тяжестью тела больного.
Перед процедурой медицинская сестра должна ознакомить больного с характером ощущений под электродами: равномерное покалывание и легкое жжение. При появлении неприятных болезненных ощущений или неравномерного жжения на определенном участке кожи больной, не двигаясь и не меняя положения, должен вызвать сестру. Не рекомендуется во время процедуры читать, разговаривать, спать. После процедуры необходим отдых в течение 20-30 мин.
Перед процедурой следует убедиться в отсутствии царапин, ссадин, мацерации, сыпи на коже. Гидрофильные матерчатые прокладки хорошо смачивают теплой водопроводной водой и располагают на коже пациента, свинцовая пластина с токонесущим проводом находится при этом в кармашке. Желательно под матерчатый электрод положить на кожу фильтровальную бумагу, чтобы предохранить прокладку от загрязнения.
Расположение электродов на теле больного определяется локализацией, остротой и характером патологического процесса. Различают поперечную, продольную и поперечно-диагональную методики. При поперечном расположении электроды помещают на противоположных поверхностях тела — один против другого (живот и спина, наружная и внутренняя поверхности коленного сустава и т. д.), что обеспечивает более глубокое воздействие. При продольной методике электроды лежат на одной поверхности тела: один — более проксимально, другой — дистально (продольно по позвоночнику, по ходу нерва, мышцы).
В этом случае оказывается влияние на более поверхностные ткани. Для поперечно-диагональной методики характерно расположение электродов на разных поверхностях тела, но один -в проксимальных его отделах, другой — в дистальных. При близком расположении расстояние между электродами должно быть не меньше половины их диаметра.
Методом электрофореза в организм чаще всего вводят лекарства-электролиты, диссоциирующие в растворах на ионы. Положительно заряженные ионы (+) вводят с положительного полюса (анода), отрицательно заряженные (-) — с отрицательного полюса (катода). При лекарственном электрофорезе можно использовать различные растворители, универсальным и лучшим из них является дистиллированная вода. При плохой растворимости лекарства в воде в качестве растворителя применяют димексид, который также оказывает и противовоспалительное действие.
Для электрофореза сложных органических соединений (белки, аминокислоты, сульфаниламиды) используют буферные растворы. Лекарственные вещества, например, лидаза или ронидаза, растворенные в кислом (ацетатном) буферном растворе с рН = 5,2, вводят с положительного полюса. Пропись его: ацетат (или цитрат) натрия И,4 г, ледяной уксусной кислоты 0,91 мл, дистиллированной воды 1000 мл, 64 единицы лидазы (0,1 г сухого вещества). 0,5-1 г ронидазы растворяют в 15 или 30 мл ацетатного буфера.
Для электрофореза трипсина и химотрипсина используют боратный буфер с рН = 8,0-9,0 (щелочная среда), который вводят с отрицательного полюса. Его состав: борной кислоты 6,2 г, калия хлорида 7,4 г, натрия (или калия) гидроксида 3 г, дистиллированной воды 500 мл. 10 мг трипсина или химотрипсина растворяют в 15-20 мл боратного буфера. Учитывая сложность приготовления указанных буферов, B.C. Улащик и Д.К. Данусевич (1975) предложили пользоваться дистиллированной водой, подкисляемой 5-10% раствором соляной кислоты до рН = 5,2 (для введения с анода) или подщелачиваемой 5-10% раствором едкой щелочи до рН = 8,0 (для введения с катода).
Приводим табл. 1, где указывается необходимое количество едкой щелочи или соляной кислоты в различных разведениях для подщелачивания и подкисления. Например: берем 10 мл 0,5 раствора глютаминовой кислоты и добавляем 0,16 мл едкой щелочи, получаем раствор с рН — 8,0 и вводим с отрицательного полюса. При добавлении соляной кислоты создается рН = 5,0.
Концентрация растворов лекарственных веществ, применяемых для электрофореза, колеблется чаще всего в пределах от 0,5 до 5,0%, так как доказано, что большие количества вводить не следует. Расход лекарства на каждые 100 см2 площади прокладки составляет ориентировочно от 10-15 до 30 мл раствора. Сильнодействующие средства (адреналин, атропин, платифиллин и др.) вводятся из растворов в концентрации 1:1000 или наносятся на прокладку в количестве, равном высшей разовой дозе.
Лекарственные вещества готовятся не более, чем на неделю, сильнодействующие — непосредственно перед введением. С целью экономии лекарственные препараты наносятся на фильтровальную бумагу, которую располагают на коже пациента, а сверху располагают матерчатую прокладку, смоченную теплой водой. Лекарственные вещества, используемые для электрофореза, приведены в табл. 2.
При электрофорезе одного лекарственного препарата его раствором смачивают одну гидрофильную прокладку соответствующей полярности. При одновременном введении двух веществ различной полярности («биполярный» электрофорез) ими смачивают обе прокладки (анод и катод). При необходимости введения двух лекарств одинаковой полярности используют две прокладки, соединенные сдвоенным проводом с одним полюсом тока. При этом одну прокладку смачивают одним, вторую — другим лекарством.
Для электрофореза антибиотиков и ферментов, чтобы избегать инактивации их продуктами электролиза, применяют специальные многослойные прокладки, в середине которых помещают 3-4 слоя фильтровальной бумаги, смоченной «предохранительным» раствором глюкозы (5%) или гликоколя (1%). Можно пользоваться и обычными гидрофильными прокладками, но толщина их должна составлять не менее 3 см.
После каждой процедуры необходимо тщательно промывать прокладки проточной водой из расчета 8-10 л на одну, для удаления из них лекарственных веществ. В «кухне» должно быть 2 раковины: одна для индифферентных прокладок, другая — для активных, т. е. смоченных лекарственным веществом. Для сильнодействующих препаратов целесообразнее иметь отдельные прокладки, на которых можно вышить название лекарства.
Промывать и кипятить прокладки, смоченные различными лекарственными веществами следует раздельно, чтобы избежать загрязнения их вредными для организма ионами. В конце рабочего дня гидрофильные прокладки кипятят, отжимают и оставляют в сушильном шкафу.
Введение лекарственных веществ на димексидс с помощью тока называется суперэлектрофорезом. Диметилсульфоксиду (ДМСО) присуща способность усиливать действие многих лекарств и повышать устойчивость организма к повреждающему действию низких температур и радиации. ДМСО обладает выраженным транспортирующим свойством. ДМСО считается биполярным, однако более выражен перенос в сторону катода.
Можно применять димсксид в виде аппликаций на кожу, так как при этом он обнаруживается в крови уже через 5 мин. Максимальная концентрация наблюдается через 4-6 час, удерживается препарат в организме не более 36-72 часов. Выраженное действие оказывают 70-90% растворы, однако они редко применяются из-за выраженной аллергической реакции. Чистый димсксид лучше применять в виде компрессов, а при электрофорезе использовать как растворитель.
Труднорастворимыс лекарственные вещества, приготовленные на ДМСО, проникают в большем количестве и на большую глубину (дерма и подкожножировая клетчатка). При этом они быстрее поступают в кровь, а их фармакологический эффект значительно возрастает.
Для электрофореза водорастворимых лекарств рекомендуется использовать 20-25% водные растворы димексида, а для трудно- и водонерастворимых препаратов — 30-50% водные растворы. Для приготовления последних лекарство сначала растворяют в концентрированном растворе ДМСО, а затем при постоянном взбалтывании добавляют до нужной концентрации дистиллированную воду.
Для электрофореза из среды ДМСО используют 5-10% раствор аспирина в 50% ДМСО, 5-10% раствор анальгина в 25% ДМСО, 1-2% раствор трипсина в 25% ДМСО, 32-64 ЕД лидазы в 25% растворе ДМСО, 2-5% раствор адебита в 25% ДМСО. Все перечисленные препараты вводятся биполярно. Димсксид у некоторых пациентов вызывает аллергическую реакцию, поэтому перед первой процедурой следует нанести на небольшой участок кожи 25% раствор препарата и посмотреть реакцию через 30-40 мин. Если на коже появилась отечность, краснота, зуд, то ДМСО применять не следует.
Порядок назначения. В назначении указывают название метода (гальванизация или электрофорез с обозначением концентрации раствора и полярности иона), место воздействия, применяемую методику (продольная, поперечная и др.), силу тока в миллиамперах, продолжительность в мин, последовательность (ежедневно или через день), число процедур на курс лечения.
Боголюбов В.М., Васильева М.Ф., Воробьев М.Г.
источник
Электрофорез — метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных микрочастиц в жидкой среде под действием внешнего электрического поля.
Существует три различных электрофоретических метода. Под собственно электрофорезом обычно понимают зональный электрофорез (ЗЭ), два других называют методами изоэлектрофокусирования (ИЭФ)и изотахофореза (ИТФ).Электрофорез применяют главным образом для разделения веществ, молекулы которых различаются по электрофоретической подвижности, т. е. отношению скорости электрофореза (скорости перемещения заряженных частиц вещества) к напряженности электрического поля, которое зависит от свойств заряженных частиц окружающей их среды. Путем изменения внешних условий (например, рН среды, температуры, силы тока, состава и концентрации буферного раствора или носителя) создают подходящие условия для разделения. Вследствие того что при разделении на молекулы действуют только электростатические силы, электрофорез считают «мягким» методом и поэтому часто применяют для работы с лабильными веществами.
Электрофорез можно проводить в растворе, но из-за неизбежного выделения теплоты и возникающей в связи с этим тепловой конвекции процесс, как правило, проводят на носителе. Вследствие некоторых сопутствующих явлений (адсорбция, несоизмеримость размеров высокомолекулярных соединений и пор носителя) введение носителя ограничивает область применения метода. Однако свойства носителя иногда используют для повышения эффективности разделения: например, при электрофорезе в градиенте полиакриламидного геля фракционирование осуществляется не столько за счет различной электрофоретической подвижности веществ, сколько за счет различия в их молекулярных массах.
Зональный электрофорез (ЗЭ) — это метод разделения заряженных частиц в электрическом поле, основанный на том, что частицы с разными соотношениями заряд/масса мигрируют с различными скоростями. В зависимости от знака заряда молекулы вещества мигрируют в электрическом поле по направлению к аноду или катоду.
Результаты этого процесса регистрируются на электрофореграфе (по аналогии с хроматографией).
Ранее использовали один и тот же буфер в слое носителя электродных камерах, т. е. разделение вели в непрерывной буферной системе. В настоящее время этот прием еще применяют при электрофорезе на бумаге и пластинках. Приэлектрофорезе в прерывистой буферной системе (различные буферы в слое носите электродных камерах) быстро мигрирующие вещества образую более узкие зоны. Электрофорез в прерывистой буферной системе используют главным образом в гель-электрофорезе. ЗЭ обычно проводят на бумаге, пластинках и в гелях в водных буферных растворах.
При электрофорезе в электродных камерах происходит электролиз раствора и вследствие этого изменяется состав буфера. Поэтому электроды располагают так, чтобы они не касались носителя, а контакт между ними осуществлялся при помощи полосок фильтровальной бумаги. Электродная камера разделена на два отсека, которые соединяются дополнительным мостиком из фильтровальной бумаги. Подбирая соответствующий объем электродных камер или перекачивая буфер насосом от анода к катоду, поддерживают постоянными концентрацию и значение рН буфера в двухкамерной системе. Рекомендуется также проводить деполяризации электродов после каждого электрофоретического разделения.
Материалы-носители подразделяются на две группы:
первая — бумага, целлюлоза, ацетилированная целлюлоза, агароза и материалы для ТСХ(например, силикагель);
вторая — крахмал и полиакриламид.
Эффективность разделения зависит не только от суммарного заряда молекул анализируемых веществ, но и от размеров молекул. Определяющим параметром является соотношение заряд — масса.
Носители первой группы относительно инертны и слабо влияют на эффективность разделения. Материалы второй группы обладают пористой структурой, что существенно влияет на качество разделения. Поскольку размеры пор соизмеримы с размером макромолекул, то можно разделять вещества с одинаковыми суммарными зарядами, но с разными молекулярными массами (например, при ионообменной хроматографии).
Электрофорез на бумаге позволяет экстрагировать вещества из соответствующих зон или пятен и использовать для дальнейшей работы; обнаруживать вещества, используемые в бумажной хроматографии; проводить фракционирование в двух направлениях.
Для электрофореза на бумаге используют специальные сорта бумаги, характеризующиеся следующими свойствами: достаточной механической прочностью; удовлетворительным для удерживания достаточного количества электролита и образца.
Наряду с камерами погружного типа применяют камеры для электрофореза в тонком слое с охлаждаемыми пластинами, в которых лист бумаги помещают между двумя изолирующими пленками.
Электрофорез в тонком слое проводят на стеклянных пластинках, покрытых слоем носителя. По сравнению с полосками бумаги пластины более удобны в обращении. Электрофорез на бумаге и в тонком слое применяют для исследования фракций, полученных при колоночной хроматографии, ферментативных гидролизатов белков, метаболитов, а также для разделения аминов, аминокислот, пептидов и белков, нуклеотидов, фенолов, нафтолов, фенолкарбоновых кислот, красителей, неорганических соединений.
Гель- электрофорез. Вместо целлюлозы и силикагеля можно использовать мягкие гели. Ниже приведены основные рабочие стадии проведения электрофореза в слое геля: приготовление гелей и подготовка образца ® электрофоретическое разделение ® детектирование ® анализ результатов и оформление их в рабочем журнале. Из множества гелей на практике применяют только два — гели агарозы и полиакриламида. В зависимости от способа приготовления геля и типа буферной системы различают несколько вариантов метода:
· электрофорез в геле полиакриламида (ПААГ);
· диск-электрофорез (диск-ПААГ) в прерывистой буферной системе;
· электрофорез в геле полиакриламида в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ);
· электрофорез в градиенте пористого полиакриламидного геля.
Гель окрашивают красителем. Поскольку молекулы красителя заряжены, гель можно обесцвечивать электрофоретически при напряжении 50 В. В местах, не содержащих исследуемое вещество, гель обесцвечивается. Количественную оценку проводят спектрофотометрически при помощи сканирующего денситометра.
После усадки гелей в водном этаноле или ацетоне их высушивают между двумя листами целлофана в вакууме при слабом нагреве.
Гель-электрофорез применяют для разделения всех классов заряженных веществ, например белков, ферментных комплексов, вирусов, олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот; определения молекулярных масс биополимеров; анализа белков на микроуровне (антигенов при количественном иммуноэлектрофорезе).
При электрофорезе в свободном потоке электролит (буфер) перемещается в вертикальном направлении (перпендикулярно направлению электрического поля). Заряженные частицы под действием электрического поля мигрируют в горизонтальном направлении и одновременно увлекаются потоком буфера. В итоге разделенные вещества распределяются в потоке в соответствии с их электрофоретической подвижностью и элюируются из прибора в различных фракциях. Электрофорез в свободном потоке применяют для препаративного разделения заряженных частиц, в том числе коллоидных, субклеточных частиц и клеток.
Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ). С помощью изоэлектрического фокусирования по изоэлектрическим точкам (ИЭТ) разделяют амфотерные вещества, в частности белки. Сущность метода заключается в том, что молекулы белков мигрируют под действием электрического поля в среде с линейным и стабильным градиентом рН до достижения области рН, соответствующей их ИЭТ.
Изоэлектрическое фокусирование отличается от зонального электрофореза тем, что разделение осуществляется не в буфере с постоянным значением рН, а в среде с линейным градиентом рН. Значение рН минимально вблизи анода, максимально — вблизи катода. Главное условие эффективного разделения белков — наличие стабильного градиента рН среды. В связи с тем что белки обладают амфотерными свойствами, необходимо, чтобы амфолиты – носители — вещества, с помощью которых формируется градиент рН, обладали высокой буферной емкостью. Амфолиты — носители представляют собой многокомпонентную смесь изомеров и гомологов алифатических полиаминополикарбоновых кислот, сульфокислот и фосфоновых кислот, изоэлектрические точки которых располагаются в широкой области значений рН.
ИЭФ применяют для аналитического разделения пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов и препаративного разделения белков; накопления следовых количеств веществ из больших объемов пробы; определения электрофоретической подвижности.
Необходимым условием проведения ИЭФ является наличие высокого напряжения при низкой ионной силе раствора. Однако именно в этих условиях усиливается электроосмос. Отрицательное воздействие на эффективность разделения веществ оказывают так же примеси солей, занесенные вместе с реактивами (гели для ИЭФ следует готовить из особо чистых реактивов). Для проведения ИЭФ более всего подходит полиакриламидный гель с низкими электроосмотическими свойствами. Продолжительность эксперимента зависит от напряженность поля и характера изменения рН- градиента.
Препаративное изоэлектрическое фокусирование проводят в вертикальных колонках (в градиенте плотности сахарозы, глицерина, этиленгликоля) или в слое инертного материала. В качестве таких материалов используют гранулированные гели (рН градиент формируют с помощью амфолитов).
источник