Что такое клинические исследования и зачем они нужны? Это исследования, в которых принимают участие люди (добровольцы) и в ходе которых учёные выясняют, является ли новый препарат, способ лечения или медицинский прибор более эффективным и безопасным для здоровья человека, чем уже существующие.
Главная цель клинического исследования — найти лучший способ профилактики, диагностики и лечения того или иного заболевания. Проводить клинические исследования необходимо, чтобы развивать медицину, повышать качество жизни людей и чтобы новое лечение стало доступным для каждого человека.
У каждого исследования бывает четыре этапа (фазы):
I фаза — исследователи впервые тестируют препарат или метод лечения с участием небольшой группы людей (20—80 человек). Цель этого этапа — узнать, насколько препарат или способ лечения безопасен, и выявить побочные эффекты. На этом этапе могут участвуют как здоровые люди, так и люди с подходящим заболеванием. Чтобы приступить к I фазе клинического исследования, учёные несколько лет проводили сотни других тестов, в том числе на безопасность, с участием лабораторных животных, чей обмен веществ максимально приближен к человеческому;
II фаза — исследователи назначают препарат или метод лечения большей группе людей (100—300 человек), чтобы определить его эффективность и продолжать изучать безопасность. На этом этапе участвуют люди с подходящим заболеванием;
III фаза — исследователи предоставляют препарат или метод лечения значительным группам людей (1000—3000 человек), чтобы подтвердить его эффективность, сравнить с золотым стандартом (или плацебо) и собрать дополнительную информацию, которая позволит его безопасно использовать. Иногда на этом этапе выявляют другие, редко возникающие побочные эффекты. Здесь также участвуют люди с подходящим заболеванием. Если III фаза проходит успешно, препарат регистрируют в Минздраве и врачи получают возможность назначать его;
IV фаза — исследователи продолжают отслеживать информацию о безопасности, эффективности, побочных эффектах и оптимальном использовании препарата после того, как его зарегистрировали и он стал доступен всем пациентам.
Считается, что наиболее точные результаты дает метод исследования, когда ни врач, ни участник не знают, какой препарат — новый или существующий — принимает пациент. Такое исследование называют «двойным слепым». Так делают, чтобы врачи интуитивно не влияли на распределение пациентов. Если о препарате не знает только участник, исследование называется «простым слепым».
Чтобы провести клиническое исследование (особенно это касается «слепого» исследования), врачи могут использовать такой приём, как рандомизация — случайное распределение участников исследования по группам (новый препарат и существующий или плацебо). Такой метод необходим, что минимизировать субъективность при распределении пациентов. Поэтому обычно эту процедуру проводят с помощью специальной компьютерной программы.
- бесплатный доступ к новым методам лечения прежде, чем они начнут широко применяться;
- качественный уход, который, как правило, значительно превосходит тот, что доступен в рутинной практике;
- участие в развитии медицины и поиске новых эффективных методов лечения, что может оказаться полезным не только для вас, но и для других пациентов, среди которых могут оказаться члены семьи;
- иногда врачи продолжают наблюдать и оказывать помощь и после окончания исследования.
- новый препарат или метод лечения не всегда лучше, чем уже существующий;
- даже если новый препарат или метод лечения эффективен для других участников, он может не подойти лично вам;
- новый препарат или метод лечения может иметь неожиданные побочные эффекты.
Главные отличия клинических исследований от некоторых других научных методов: добровольность и безопасность. Люди самостоятельно (в отличие от кроликов) решают вопрос об участии. Каждый потенциальный участник узнаёт о процессе клинического исследования во всех подробностях из информационного листка — документа, который описывает задачи, методологию, процедуры и другие детали исследования. Более того, в любой момент можно отказаться от участия в исследовании, вне зависимости от причин.
Обычно участники клинических исследований защищены лучше, чем обычные пациенты. Побочные эффекты могут проявиться и во время исследования, и во время стандартного лечения. Но в первом случае человек получает дополнительную страховку и, как правило, более качественные процедуры, чем в обычной практике.
Клинические исследования — это далеко не первые тестирования нового препарата или метода лечения. Перед ними идёт этап серьёзных доклинических, лабораторных испытаний. Средства, которые успешно его прошли, то есть показали высокую эффективность и безопасность, идут дальше — на проверку к людям. Но и это не всё.
Сначала компания должна пройти этическую экспертизу и получить разрешение Минздрава РФ на проведение клинических исследований. Комитет по этике — куда входят независимые эксперты — проверяет, соответствует ли протокол исследования этическим нормам, выясняет, достаточно ли защищены участники исследования, оценивает квалификацию врачей, которые будут его проводить. Во время самого исследования состояние здоровья пациентов тщательно контролируют врачи, и если оно ухудшится, человек прекратит своё участие, и ему окажут медицинскую помощь. Несмотря на важность исследований для развития медицины и поиска эффективных средств для лечения заболеваний, для врачей и организаторов состояние и безопасность пациентов — самое важное.
Потому что проверить его эффективность и безопасность по-другому, увы, нельзя. Моделирование и исследования на животных не дают полную информацию: например, препарат может влиять на животное и человека по-разному. Все использующиеся научные методы, доклинические испытания и клинические исследования направлены на то, чтобы выявить самый эффективный и самый безопасный препарат или метод. И почти все лекарства, которыми люди пользуются, особенно в течение последних 20 лет, прошли точно такие же клинические исследования.
Если человек страдает серьёзным, например, онкологическим, заболеванием, он может попасть в группу плацебо только если на момент исследования нет других, уже доказавших свою эффективность препаратов или методов лечения. При этом нет уверенности в том, что новый препарат окажется лучше и безопаснее плацебо.
Согласно Хельсинской декларации, организаторы исследований должны предпринять максимум усилий, чтобы избежать использования плацебо. Несмотря на то что сравнение нового препарата с плацебо считается одним из самых действенных и самых быстрых способов доказать эффективность первого, учёные прибегают к плацебо только в двух случаях, когда: нет другого стандартного препарата или метода лечения с уже доказанной эффективностью; есть научно обоснованные причины применения плацебо. При этом здоровье человека в обеих ситуациях не должно подвергаться риску. И перед стартом клинического исследования каждого участника проинформируют об использовании плацебо.
Обычно оплачивают участие в I фазе исследований — и только здоровым людям. Очевидно, что они не заинтересованы в новом препарате с точки зрения улучшения своего здоровья, поэтому деньги становятся для них неплохой мотивацией. Участие во II и III фазах клинического исследования не оплачивают — так делают, чтобы в этом случае деньги как раз не были мотивацией, чтобы человек смог трезво оценить всю возможную пользу и риски, связанные с участием в клиническом исследовании. Но иногда организаторы клинических исследований покрывают расходы на дорогу.
Если вы решили принять участие в исследовании, обсудите это со своим лечащим врачом. Он может рассказать, как правильно выбрать исследование и на что обратить внимание, или даже подскажет конкретное исследование.
Клинические исследования, одобренные на проведение, можно найти в реестре Минздрава РФ и на международном информационном ресурсе www.clinicaltrials.gov.
Обращайте внимание на международные многоцентровые исследования — это исследования, в ходе которых препарат тестируют не только в России, но и в других странах. Они проводятся в соответствии с международными стандартами и единым для всех протоколом.
После того как вы нашли подходящее клиническое исследование и связались с его организатором, прочитайте информационный листок и не стесняйтесь задавать вопросы. Например, вы можете спросить, какая цель у исследования, кто является спонсором исследования, какие лекарства или приборы будут задействованы, являются ли какие-либо процедуры болезненными, какие есть возможные риски и побочные эффекты, как это испытание повлияет на вашу повседневную жизнь, как долго будет длиться исследование, кто будет следить за вашим состоянием. По ходу общения вы поймёте, сможете ли довериться этим людям.
Если остались вопросы — спрашивайте в комментариях.
источник
Электрофорез — метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных микрочастиц в жидкой среде под действием внешнего электрического поля.
Существует три различных электрофоретических метода. Под собственно электрофорезом обычно понимают зональный электрофорез (ЗЭ), два других называют методами изоэлектрофокусирования (ИЭФ)и изотахофореза (ИТФ).Электрофорез применяют главным образом для разделения веществ, молекулы которых различаются по электрофоретической подвижности, т. е. отношению скорости электрофореза (скорости перемещения заряженных частиц вещества) к напряженности электрического поля, которое зависит от свойств заряженных частиц окружающей их среды. Путем изменения внешних условий (например, рН среды, температуры, силы тока, состава и концентрации буферного раствора или носителя) создают подходящие условия для разделения. Вследствие того что при разделении на молекулы действуют только электростатические силы, электрофорез считают «мягким» методом и поэтому часто применяют для работы с лабильными веществами.
Электрофорез можно проводить в растворе, но из-за неизбежного выделения теплоты и возникающей в связи с этим тепловой конвекции процесс, как правило, проводят на носителе. Вследствие некоторых сопутствующих явлений (адсорбция, несоизмеримость размеров высокомолекулярных соединений и пор носителя) введение носителя ограничивает область применения метода. Однако свойства носителя иногда используют для повышения эффективности разделения: например, при электрофорезе в градиенте полиакриламидного геля фракционирование осуществляется не столько за счет различной электрофоретической подвижности веществ, сколько за счет различия в их молекулярных массах.
Зональный электрофорез (ЗЭ) — это метод разделения заряженных частиц в электрическом поле, основанный на том, что частицы с разными соотношениями заряд/масса мигрируют с различными скоростями. В зависимости от знака заряда молекулы вещества мигрируют в электрическом поле по направлению к аноду или катоду.
Результаты этого процесса регистрируются на электрофореграфе (по аналогии с хроматографией).
Ранее использовали один и тот же буфер в слое носителя электродных камерах, т. е. разделение вели в непрерывной буферной системе. В настоящее время этот прием еще применяют при электрофорезе на бумаге и пластинках. Приэлектрофорезе в прерывистой буферной системе (различные буферы в слое носите электродных камерах) быстро мигрирующие вещества образую более узкие зоны. Электрофорез в прерывистой буферной системе используют главным образом в гель-электрофорезе. ЗЭ обычно проводят на бумаге, пластинках и в гелях в водных буферных растворах.
При электрофорезе в электродных камерах происходит электролиз раствора и вследствие этого изменяется состав буфера. Поэтому электроды располагают так, чтобы они не касались носителя, а контакт между ними осуществлялся при помощи полосок фильтровальной бумаги. Электродная камера разделена на два отсека, которые соединяются дополнительным мостиком из фильтровальной бумаги. Подбирая соответствующий объем электродных камер или перекачивая буфер насосом от анода к катоду, поддерживают постоянными концентрацию и значение рН буфера в двухкамерной системе. Рекомендуется также проводить деполяризации электродов после каждого электрофоретического разделения.
Материалы-носители подразделяются на две группы:
первая — бумага, целлюлоза, ацетилированная целлюлоза, агароза и материалы для ТСХ(например, силикагель);
вторая — крахмал и полиакриламид.
Эффективность разделения зависит не только от суммарного заряда молекул анализируемых веществ, но и от размеров молекул. Определяющим параметром является соотношение заряд — масса.
Носители первой группы относительно инертны и слабо влияют на эффективность разделения. Материалы второй группы обладают пористой структурой, что существенно влияет на качество разделения. Поскольку размеры пор соизмеримы с размером макромолекул, то можно разделять вещества с одинаковыми суммарными зарядами, но с разными молекулярными массами (например, при ионообменной хроматографии).
Электрофорез на бумаге позволяет экстрагировать вещества из соответствующих зон или пятен и использовать для дальнейшей работы; обнаруживать вещества, используемые в бумажной хроматографии; проводить фракционирование в двух направлениях.
Для электрофореза на бумаге используют специальные сорта бумаги, характеризующиеся следующими свойствами: достаточной механической прочностью; удовлетворительным для удерживания достаточного количества электролита и образца.
Наряду с камерами погружного типа применяют камеры для электрофореза в тонком слое с охлаждаемыми пластинами, в которых лист бумаги помещают между двумя изолирующими пленками.
Электрофорез в тонком слое проводят на стеклянных пластинках, покрытых слоем носителя. По сравнению с полосками бумаги пластины более удобны в обращении. Электрофорез на бумаге и в тонком слое применяют для исследования фракций, полученных при колоночной хроматографии, ферментативных гидролизатов белков, метаболитов, а также для разделения аминов, аминокислот, пептидов и белков, нуклеотидов, фенолов, нафтолов, фенолкарбоновых кислот, красителей, неорганических соединений.
Гель- электрофорез. Вместо целлюлозы и силикагеля можно использовать мягкие гели. Ниже приведены основные рабочие стадии проведения электрофореза в слое геля: приготовление гелей и подготовка образца ® электрофоретическое разделение ® детектирование ® анализ результатов и оформление их в рабочем журнале. Из множества гелей на практике применяют только два — гели агарозы и полиакриламида. В зависимости от способа приготовления геля и типа буферной системы различают несколько вариантов метода:
· электрофорез в геле полиакриламида (ПААГ);
· диск-электрофорез (диск-ПААГ) в прерывистой буферной системе;
· электрофорез в геле полиакриламида в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ);
· электрофорез в градиенте пористого полиакриламидного геля.
Гель окрашивают красителем. Поскольку молекулы красителя заряжены, гель можно обесцвечивать электрофоретически при напряжении 50 В. В местах, не содержащих исследуемое вещество, гель обесцвечивается. Количественную оценку проводят спектрофотометрически при помощи сканирующего денситометра.
После усадки гелей в водном этаноле или ацетоне их высушивают между двумя листами целлофана в вакууме при слабом нагреве.
Гель-электрофорез применяют для разделения всех классов заряженных веществ, например белков, ферментных комплексов, вирусов, олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот; определения молекулярных масс биополимеров; анализа белков на микроуровне (антигенов при количественном иммуноэлектрофорезе).
При электрофорезе в свободном потоке электролит (буфер) перемещается в вертикальном направлении (перпендикулярно направлению электрического поля). Заряженные частицы под действием электрического поля мигрируют в горизонтальном направлении и одновременно увлекаются потоком буфера. В итоге разделенные вещества распределяются в потоке в соответствии с их электрофоретической подвижностью и элюируются из прибора в различных фракциях. Электрофорез в свободном потоке применяют для препаративного разделения заряженных частиц, в том числе коллоидных, субклеточных частиц и клеток.
Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ). С помощью изоэлектрического фокусирования по изоэлектрическим точкам (ИЭТ) разделяют амфотерные вещества, в частности белки. Сущность метода заключается в том, что молекулы белков мигрируют под действием электрического поля в среде с линейным и стабильным градиентом рН до достижения области рН, соответствующей их ИЭТ.
Изоэлектрическое фокусирование отличается от зонального электрофореза тем, что разделение осуществляется не в буфере с постоянным значением рН, а в среде с линейным градиентом рН. Значение рН минимально вблизи анода, максимально — вблизи катода. Главное условие эффективного разделения белков — наличие стабильного градиента рН среды. В связи с тем что белки обладают амфотерными свойствами, необходимо, чтобы амфолиты – носители — вещества, с помощью которых формируется градиент рН, обладали высокой буферной емкостью. Амфолиты — носители представляют собой многокомпонентную смесь изомеров и гомологов алифатических полиаминополикарбоновых кислот, сульфокислот и фосфоновых кислот, изоэлектрические точки которых располагаются в широкой области значений рН.
ИЭФ применяют для аналитического разделения пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов и препаративного разделения белков; накопления следовых количеств веществ из больших объемов пробы; определения электрофоретической подвижности.
Необходимым условием проведения ИЭФ является наличие высокого напряжения при низкой ионной силе раствора. Однако именно в этих условиях усиливается электроосмос. Отрицательное воздействие на эффективность разделения веществ оказывают так же примеси солей, занесенные вместе с реактивами (гели для ИЭФ следует готовить из особо чистых реактивов). Для проведения ИЭФ более всего подходит полиакриламидный гель с низкими электроосмотическими свойствами. Продолжительность эксперимента зависит от напряженность поля и характера изменения рН- градиента.
Препаративное изоэлектрическое фокусирование проводят в вертикальных колонках (в градиенте плотности сахарозы, глицерина, этиленгликоля) или в слое инертного материала. В качестве таких материалов используют гранулированные гели (рН градиент формируют с помощью амфолитов).
источник
Капиллярный электрофорез (КЭ) — интенсивно развивающийся метод разделения сложных смесей, позволяющий анализировать ионные и нейтральные компоненты различной природы с высокой экспрессностью и уникальной эффективностью.
В основе капиллярного электрофореза лежат электрокинетические явления — электромиграция заряженных частиц и электроосмос. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты, так как параметры электромиграции специфичны для каждого сорта заряженных частиц. В то же время, такие возмущающие факторы, как диффузионные, сорбционные, конвекционные, гравитационные и т. п., в капилляре существенно ослаблены, благодаря чему достигаются рекордные эффективности разделений. Скачать книгу (1,7 Mb pdf).
ДОСТОИНСТВА МЕТОДА
Метод капиллярного электрофореза обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами разделения:
- в кварцевом капилляре достигается высокая эффективность разделения компонентов смесей – сотни тысяч теоретических тарелок;
- благодаря многообразию вариантов метода КЭ разделяются ионные, нейтральные, гидрофильные, гидрофобные, хиральные компоненты, от наночастиц до макромолекул;
- быстрота проведения анализа;
- крайне низкий расход реактивов и растворителей (микролитры);
- дозируется минимальный объеманализируемого образца;
- для большинства объектов используется простая подготовка пробы – в основном лишь фильтрование, дегазирование и разбавление;
- отсутствие дорогостоящих колонок с сорбентами и проблем с их старением и заменой;
- низкая стоимость единичного анализа.
- Анализ объектов окружающей среды:
- природные, питьевые, сточные воды (неорганические катионы и анионы, гербициды);
- почвы, грунты, донные отложения (водорастворимые формы неорганических катионов и анионов).
- Контроль качества, подлинности и безопасности напитков (органические кислоты (в том числе индивидуальные формы D- и L- изомеров), сахара, неорганические катионы и анионы, консерванты, подсластители, синтетические красители, витамины, аминокислоты, фурфуролы, ароматические альдегиды, амины, флавоноиды, антоцианы, пестициды, фунгициды);
- Контроль качества и безопасности пищевой продукции, продовольственного сырья и БАД (консерванты, подсластители, кофеин, теобромин, органические кислоты, аминокислоты, амины, белки);
- Ветеринария и контроль качества кормов и комбикормового сырья (аминокислоты, витамины, органические кислоты, неорганические катионы и анионы, антибиотики, кокцидиостатики);
- Фарминдустрия (контроль безопасности и качества синтетических субстанций, природного сырья, активных фармацевтических ингредиентов, вспомогательных веществ и готовых лекарственных средств);
- Криминалистическая экспертиза (наркотические средства, взрывчатые вещества, оптические отбеливатели);
- Клиническая биохимия (ионы, аминокислоты, амины, пептиды в биожидкостях);
- Химическая промышленность (определение основного компонента на фоне примесей, контроль сырья и побочных продуктов).
С 1998 Системы капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ®» являются первым и единственным в России серийно выпускаемым семейством приборов, предназначенных для реализации метода КЭ.
Пройдя долгий путь от создания прибора «КАПЕЛЬ®-103Р» (наиболее простой системы в семействе с полностью ручным управлением и одной рабочей длинной волны) до прибора «КАПЕЛЬ®-105М» (с полным управлением от компьютера и возможностью работы в среднем и ближнем УФ-диапазоне), группа компаний «Люмэкс» продолжает расширять аппаратурные возможности метода с помощью нового прибора «КАПЕЛЬ®-205» (со значительно увеличенным автосемплером и автоматической сменой полярности).
источник
Обычная гальванизация в настоящее время постепенно уступает место методу
лекарственного электрофореза — введению в организм лекарственных веществ с помощью постоянного тока. В этом случае на организм действует два фактора — лекарственный препарат и гальванический ток.
В растворе, как и в тканевой жидкости, многие лекарственные вещества распадаются на ионы и в зависимости от их заряда вводятся при электрофорезе с того или иного электрода.
Проникая при прохождении тока в толщу кожи под электродами, лекарственные вещества образуют так называемые кожные депо, из которых они медленно поступают, в организм.
Лекарственные вещества могут находиться в коже от 1—2 до 15—20 дней. Продолжительность депонирования во многом определяется физико-химическими свойствами веществ и их взаимодействием с белками кожи. Находящиеся в коже лекарственные ионы являются источником длительной нервной импуль-сации, что также способствует более длительному действию лекарственных веществ.
Однако не все лекарственные вещества могут быть использованы для электрофореза.
Некоторые лекарственные средства под действием тока изменяют фармакологические свойства, могут распадаться или образовывать соединения, оказывающие вредное действие.
Поэтому при необходимости использования для лекарственного электрофореза какого-либо вещества следует изучить его способность проникать через кожу под действием гальванического тока, определить оптимальную концентрацию раствора лекарственного вещества для электрофореза, особенности растворителя. Концентрация большинства лекарственных растворов, применяемых для электрофореза, составляет 1—5 %.
С прокладки положительного электрода (анода) в ткани организма вводятся ионы металлов, а также положительно заряженные частицы более сложных веществ, например кальций, магний, натрий, новокаин, хинин, витамин Biz,. лидаза, дикаин, димедрол и др. С прокладки отрицатель- \ ного электрода (катода) вводят кислотные радикалы и отрицательно заряженные частицы сложных соединений, например хлор, бром, йод, пенициллин, салицилат, эуфиллйн, гидрокортизон, никотиновую кислоту. При применении сложных. химических соединений, содержащих несколько ионов разноименного заряда (минеральная вода, лечебная грязь и грязевой раствор), активными являются оба электрода, т. е. ионы этих соединений вводятся одновременно с двух полюсов. Введение лекарственных веществ методом электрофореза имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными способами их использования:
1) лекарственное вещество действует на фоне измененного под влиянием гальванического тока электрохимического режима клеток и тканей;
2) лекарственное вещество поступает в виде ионов, что повышает его фармакологическую активность;
3) образование «кожного депо» увеличивает продолжительность действия лекарственного средства;
4) высокая концентрация лекарственного вещества. создается непосредственно в патологическом очаге;
5) не раздражается слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта;
6) обеспечивается возможность одновременного введения нескольких (с разных полюсов) лекарственных веществ.
Благодаря этим преимуществам лекарственный электрофорез находит все большее применение, в том числепри лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы, в онкологической практике, при лечении туберкулеза. Возникают новые перспективные разработки этого лечебного метода, например электрофорез лекарственных веществ из растворов, предварительно введенных в полостные органы.
Однако имеются и ограничения для использования электрофореза, обусловленные прежде всего особенностями самих лекарственных веществ. Многие из них являются электрически нейтральными, имеют низкую электро-форетическую подвижность либо теряют свою активность под действием электрического тока.
Показания к применению лекарственного электрофореза складываются из показаний к гальванизации и переносимости назначенных препаратов. Противопоказания аналогичны таковым: для гальванизации с учетом индивидуальной переносимости лекарственного вещества.
Интенсивность воздействия при гальванизации и лекарственном электрофорезе
определяются используемой силой тока, выражаемой в миллиамперах (мА). Расчет максимально допустимой силы тока производят по показателю плотности тока, т. е. силе тока, приходящейся на 1 см2 площади активного электрода (мА/см2). Чтобы рассчитать максимальную силу тока, следует значение его плотности умножить на площадь электрода, т.е. величину поверхности прокладки. Выбор значения плотности тока зависит от площади
активного электрода, места воздействия, индивидуальной чувствительности к току, возраста и пола больного. Чем больше площадь электрода, тем меньше должна быть плотность тока.
Если используются электроды разной площади, то для расчета силы тока учитывают площадь меньшего электрода. В случаях, когда катод или анод представлены сдвоенным электродом, для расчета берут сумму площадей этих электродов. Плотность тока при общих и сегментарных воздействиях не должна превышать 0,01—0,05 мА/см2, а при местных процедурах — 0,05—0,1 мА/см2, для детей дошкольного возраста — 0,03 мА/см2, школьного — 0,05 мА/см2.
При дозировании постоянного тока необходимо учитывать ощущения больного. Во время процедуры больной должен испытывать легкое покалывание в области наложения электродов. Продолжительность процедуры может быть различной: 10—15 мин при общих и рефлекторно-сегментарных методиках воздействия и 30—40 мин — при местных. Курс лечения 10—20 процедур, ежедневно или через день.
Источником постоянного тока при гальванизации служат аппараты, в которых
переменный ток промышленно-осветительной сети выпрямляется и сглаживается, затем по гибким изолированным проводам, на концах которых закреплены зажимы, соединенные с электродами, подводится к больному. Сила тока контролируется миллиамперметром, предусматривающим переключение используемой силы тока до 5 или 50 мА.
Правила эксплуатации аппаратов для гальванизации одинаковы. В качестве примера приводим описание одного из аппаратов «Поток-1». Портативный аппарат «Поток-1» работает от сети переменного тока частотой 50 Гц при напряжении 127 иди 220 В. Аппарат изготовлен по II классу защиты и не требует заземления. К аппарату может прилагаться приставка, позволяющая использовать его для гальванизации конечностей с помощью камерных ванн. При назначении врачом процедуры гальванизации или лекарственного электрофореза должны быть указаны название метода, наименование препарата, концентрация раствора, полюс введения, место воздействия, методика, сила тока (мА), продолжительность (мин), интервалы (ежедневно или через день), число процедур на курс лечения.
Ознакомившись с назначением врача-физиотерапевта, медицинская сестра должна подготовить больного к процедуре.
Гальванизацию и лекарственный электрофорез проводят в положении больного лежа или сидя в зависимости от назначения. Медицинской сестре необходимо осмотреть поверхность кожи в месте наложения электродов. На коже не должно быть ссадин, царапин и других повреждений. Загрязненную сальную кожу перед процедурой необходимо обмыть теплой водой с мылом или очистить и обезжирить ватой, смоченной спиртом. На соответствующем участке тела больного размещают электроды, состоящие из металлической пластинки, обычно свинцовой, и влажной матерчатой гидрофильной прокладки.
Свинцовые пластинки должны быть ровными и гладкими (для этого их разглаживают металлическим валиком), края должны быть закруглены, толщина пластинок должна составлять 0,3—1 мм. Со временем пластины покрываются налетом оксида свинца, что ухудшает электропроводность, в связи с чем их следует периодически чистить наждачной бумагой. В настоящее время все большее распространение получают электроды из токопроводящей (графитизированной) ткани разной формы и размеров. Чаще используют прямоугольные электроды, а также электроды в виде полумаски, воротника или специальные для полостных процедур (вагинальные, ректальные и др.). Гидрофильные прокладки должны соответствовать форме пластин и выступать за их края на 1—2 см со всех сторон. Они предохраняют кожу от повреждающего влияния продуктов электролиза, повышают ее электропроводность, обеспечивают хороший контакт электродов с телом больного. Прокладки изготавливают из белой фланели, байки, бязи и другой гидрофильной ткани. Они имеют вид тетради, составленной из 8—16 слоев ткани.
Для проведения процедуры прокладки смачивают теплой водой, отжимают, вкладывают в них электроды, помещают на соответствующие участки кожи и фиксируют с помощью резиновых бинтов, мешочков с песком либо тяжестью тела больного. После наложения электродов больного, лежащего на кушетке, накрывают простыней или легким одеялом. При этом электропровода, идущие от больного к аппарату, не должны провисать и натягиваться.
Электрические провода, соединенные с электродами, подсоединяют к аппарату соответственно полярности, указанной в назначении врача.
Перед включением аппарата переключатель напряжения следует установить в положение, соответствующее напряжению в сети (127 или 220 В), ручку регулятора силы тока — в положение «О», переключатель шунта миллиамперметра — в положение «5» или «50» соответственно силе тока, указанной в назначении врача. Для включения аппарата необходимо вставить штепсельную вилку в сетевую розетку, повернуть выключатель в положение «Вкл.», после чего на панели аппарата загорается сигнальная лампочка. Затем,
медленно и плавно поворачивая ручку регулятора силы тока, наблюдая за показаниями миллиамперметра и ориентируясь на ощущения больного, устанавливают необходимую для процедуры силу тока. Во время процедуры больной должен ощущать в области наложения электродов легкое жжение, покалывание, о чем он должен быть предупрежден. При появлении сильного жжения, болезненного ощущения под электродами силу тока следует уменьшить, а если эти явления не исчезают, то следует прервать процедуру и-вызвать врача или направить к нему больного. В зависимости от места наложения электродов различают поперечную и продольную методики. При поперечной методике электроды располагаются друг против друга на противоположных участках тела, при этом ток воздействует на глубоколежащие ткани, при продольной — электроды находятся на одной стороне тела, воздействию подвергаются поверхностно расположенные ткани.
Специальную методику представляет воздействие гальваническим током в камерных ваннах. В этом случае больной помещает конечности в фаянсовые ванночки, которые заполняют водой. В офтальмологической практике для гальванизации и электрофореза используют глазные ванночки.
После окончания процедуры ручку регулятора силы тока медленно и плавно
поворачивают против часовой стрелки до нулевого положения стрелки потенциометра, переводят переключатель в положение «Выкл.», снимают с больного электроды. У детей под влиянием гальванического тока на месте расположения электродов кожа грубеет и становится сухой, могут образоваться трещины, поэтому после каждой процедуры ее следует смазывать питательным кремом или глицерином, разведенным наполовину водой. После каждой процедуры гидрофильные прокладки необходимо промыть под струёй воды, в конце дня стерилизовать кипячением. Причем прокладки для гальванизации и лекарственного электрофореза в зависимости от заряда иона стерилизуют раздельно.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Только сон приблежает студента к концу лекции. А чужой храп его отдаляет. 8806 — 
| 7522 — 
или читать все.
195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
Капиллярный электрофорез
Цель работы
Изучение возможностей метода капиллярного электрофореза при определении неорганических анионов в водопроводной воде.
Основные сведения о методе капиллярного электрофореза
Метод капиллярного электрофореза основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (
2 нл) вводят в кварцевый капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером — электролитом. После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей, в первую очередь, от заряда и массы (точнее, величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой; качественной характеристикой вещества является время миграции, а количественной — высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества.
Для того чтобы получить более подробное представление о методе, необходимо рассмотреть ряд процессов, происходящих в капилляре, заполненном электролитом и помещенном в продольное электрическое поле.
Находящиеся на поверхности плавленного кварца силоксановые группы при контакте с водой или водными растворами гидролизуются с образованием удвоенного количества силанольных групп, которые затем гидратируются.
Скорость и степень гидролиза зависят от температуры и pH водных растворов и, в меньшей степени, от концентрации солевого фона раствора. В водном растворе силанольные группы способны к кислотной диссоциации. Константа первой ступени имеет величину Ка1 = 2,5×10 3 . Это означает, что при pH водного раствора больше 2,5 поверхность кварца приобретает некоторый отрицательный заряд, который возрастает при увеличении pH раствора. Наоборот, при pH
2 и меньше диссоциация сила- нольных групп практически полностью подавлена, и поверхность кварца становится нейтральной.
Диссоциация силанольных групп вызывает на границе раздела кварц—водный раствор электролита образование двойного электрического слоя (ДЭС), рис. 1. Первую его обкладку составляют неподвижные отрицательно заряженные силанольные группы. Вторую обкладку двойного слоя составляют положительно заряженные катионы, существующие в растворе. Диэлектриком, разделяющим обкладки этого конденсатора, являются молекулы воды, гидратирующие как силанольные группы, так и катионы.
Положительная часть ДЭС, в свою очередь, делится на две части: первую (или неподвижную), непосредственно примыкающую к поверхности кварца, и вторую (или диффузную), располагающуюся на некотором удалении от поверхности. В неподвижной части количество положительных зарядов меньше, чем отрицательных зарядов на поверхности кварца из-за увеличения размеров катионов вследствие гидратации. В результате в диффузной части ДЭС образуется некоторая избыточная концентрация катионов. Между этими двумя слоями проходит т. н. граница скольжения — при наложении вдоль капилляра электрического поля неподвижная часть остается на месте, в то время как диффузная часть начинает мигрировать к катоду, увлекая за собой в силу межмолекулярного сцепления всю массу жидкости в капилляре. Возникает электроосмотический поток (ЭОП), который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра. Скорость ЭОП в сильной степени зависит от pH раствора: в сильнокислых растворах ЭОП отсутствует, в слабокислых — его скорость незначительна, а при переходе в нейтральную и щелочную область pH скорость ЭОП возрастает до максимально возможной. С другой стороны, эта величина зависит от концентрации электролита в ведущем буфере: чем она больше, тем выше становится доля катионов в неподвижной части ДЭС, а толщина диффузной части уменьшается и, соответственно, уменьшается скорость электроосмотического потока.
Рис. 1. Строение двойного электрического слоя.
В приборах для капиллярного электрофореза капилляр, заполненный раствором электролита, своими концами опущен в два содержащих тот же электролит сосуда, в которые введены электроды. Электролит должен обладать буферными свойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изменению состава раствора в приэлектродных пространствах, а с другой — стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа. При подаче на электроды высокого напряжения в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через капилляр протекает постоянный электроосмотический поток, на который накладывается взаимно противоположная электромиграция катионов и анионов.
Если в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить эту зону к катоду (в область детектирования), и зона некоторое время сможет находиться в капилляре под воздействием электрического поля высокого напряжения. В течение этого времени заряженные компоненты пробы будут перемещаться в соответствии с их электрофоретическими подвижностями.
Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток (рис. 2). Скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионы появляются первыми и тем раньше, чем больше их электрофоретическая подвижность.
Нейтральные компоненты пробы способны перемещаться только под действием электроосмотического потока, тогда как анионные будут перемещаться к аноду со скоростями меньшими, чем скорость ЭОП. Медленно мигрирующие анионы появятся на выходе после ЭОП, а те, чья скорость электромиграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, будут выходить из капилляра в прианодное пространство.
Рис. 2. Электрофоретическая миграция ионов в присутствии электроосмотического потока.
Если время нахождения пробы в капилляре (которое можно регулировать изменением напряжения, величины pH и концентрации ведущего электролита) достаточно, чтобы проявились различия в подвижности ионов, то на выходе капилляра вблизи катода можно наблюдать зоны раствора, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы.
Ведущий электролит (его называют также рабочим буферным раствором) должен иметь такую концентрацию, при которой электрическое сопротивление раствора в капилляре будет достаточно велико. Это требование связано с тем, что при прохождении электрического тока в проводнике выделяется тепло. Если ток достаточно велик, то жидкость в капилляре может даже закипеть.
Основные варианты капиллярного электрофореза
Наиболее распространенными вариантами метода капиллярного электрофореза являются капиллярный зонный электрофорез и мицеллярная электрокинетическая хроматография.
Самым простым вариантом КЭ является капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ). Компоненты сложной смеси движутся в среде электролита с разными скоростями, образуя дискретные зоны. Отличительная особенность КЗЭ состоит в том, что он пригоден для разделения только ионогенных компонентов пробы, тогда как нейтральные соединения, не обладающие собственной электрофоретической подвижностью, движутся со скоростью ЭОП и выходят в зоне нейтральных компонентов, зоне маркера ЭОП.
В приборах капиллярного электрофореза, в которых используется кварцевый капилляр, полярность входного конца чаще всего положительная (анод), и ЭОП переносит зону пробы к катоду. Вблизи катодного выхода установлен детектор. При этих условиях катионные компоненты пробы, тоже мигрируя к катоду, обгоняют ЭОП и первыми достигают детектора в виде отдельных зон, которые на электрофореграмме регистрируются индивидуальными пиками. Через некоторое время детектора достигает и зона исходного раствора, в которой остались нейтральные компоненты пробы. В зависимости от того, поглощают они или нет, на электрофореграмме регистрируется прямой (в некоторых случаях обратный) пик, который часто называют системным. Иногда для идентификации системного пика в пробу добавляют специальные вещества — маркеры ЭОП, например, бензиловый спирт. Что касается анионных компонентов пробы, то их поведение зависит от соотношения скоростей ЭОП и электромиграции анионов. Если скорость миграции аниона превышает скорость ЭОП, то такой анион рано или поздно выйдет из капилляра в прианодное пространство (это нежелательно, т. к. некоторые анионы, например хлорид, попадая в рабочий буферный раствор, будут, разряжаясь на аноде, вызывать коррозию платинового электрода). Если же скорость электромиграции аниона меньше скорости ЭОП, то такой анион может быть зарегистрирован на той же электрофореграмме после выхода системного пика. В этом варианте КЗЭ с положительной полярностью могут определяться катионные компоненты проб и большинство органических анионов.
Чтобы методом КЗЭ можно было определять анионные компоненты проб (в основном, неорганического происхождения) необходимо изменить полярность прикладываемого напряжения. Однако в этом случае изменится не только направление миграции анионов, но также направление ЭОП. Для преодоления этого противоречия необходимо модифицировать поверхность кварцевого капилляра так, чтобы знаки зарядов двойного электрического слоя поменялись на обратные. Это достигается введением в рабочий буферный раствор катионного поверхностно-активного вещества, например, бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ). Катион ЦТА + активно сорбируется на кварцевой поверхности, занимая при достаточной его концентрации все вакансии в ближайшем к поверхности слое. Поверхность как бы «ощетинивается» длинными цетильными (С16Н33—) цепочками. Ставшая гидрофобной поверхность при дальнейшей промывке рабочим буферным раствором сорбирует еще один слой поверхностно-активного катиона, ориентированного аммонийным концом наружу (сорбция «щетка в щетку»). В результате первый слой двойного электрического слоя становится положительным, а второй, в том числе и диффузная его часть, — отрицательным, и ЭОП снова движется от входного конца к детектору, несколько отставая от мигрирующих быстрее анионов.
Основным достоинством КЗЭ является высокая эффективность (сотни тысяч теоретических тарелок), при этом селективность, определяемая механизмом разделения внутри одной фазы, в КЗЭ недостаточна. Повышение селективности может быть достигнуто за счет изменения pH ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок: поверхностно-активных веществ, макроциклов, органических растворителей и т. д.
Мицеллярная электрокинетическая хроматография объединяет электрофорез и хроматографию. МЭКХ получила наиболее широкое распространение среди других вариантов капиллярного электрофореза, в первую очередь, за счет способности разделять как ионогенные, так и незаряженные компоненты пробы. Разделение нейтральных соединений стало возможным благодаря введению в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ (ПАВ) — мицеллообразователей. Чаще всего используют анионные ПАВ (например, додецилсульфат натрия — ДДСН, англ. SDS) в концентрациях, превышающих критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ), которая, например, для ДДСН в водном растворе составляет 8 мМ. В этом случае в растворе электролита находятся преимущественно мицеллы и небольшая доля мономерной формы ПАВ. Мономеры состоят из гидрофобного «хвоста» и гидрофильной (в случае анионного по- верхностно-активного вещества отрицательно заряженной) «головы». При формировании прямых мицелл мономерные фрагменты агрегируются неполярными концами внутрь, а внешняя сферическая поверхность мицеллы становится отрицательно заряженной. Каждая мицелла окружена собственным двойным электрическим слоем, внешнюю диффузную часть которого формируют катионы, присутствующие в растворе ведущего электролита. Число мономеров, образующих мицеллу, может колебаться от 60 до 100 молекул, однако общий заряд мицеллы существенно меньше из-за наличия в неподвижной части второго слоя ДЭС гидратированных катионов. Ни мицеллярная, ни мономерная форма АПАВ не взаимодействуют со стенкой кварцевого капилляра, но при подаче на капилляр высокого напряжения обе формы мигрируют к аноду, в то время как ЭОП направлен к катоду. Если в капилляр на анодной стороне ввести пробу, содержащую нейтральные и заряженные компоненты, то ЭОП будет переносить их к катоду, а навстречу будет двигаться поток отрицательно заряженных мицелл АПАВ. Нейтральные компоненты пробы могут распределяться между фазой раствора и мицеллярной фазой, причем константа этого распределения специфична для каждого сорта молекул пробы. В результате на выходе капилляра регистрируется электрофореграмма нейтральных компонентов, а также медленно мигрирующих анионов пробы.
Общее устройство систем КЭ
Минимальный состав системы, реализующей метод капиллярного электрофореза, должен включать следующие узлы: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и систему сбора, обработки и вывода информации (рис. 3).
Дополнительными устройствами в системах капиллярного электрофореза являются, например, автосемплер и блок жидкостного охлаждения капилляра, которые позволяют:
► автоматизировать подачу образцов,
► осуществить эффективный отвод тепла от капилляра.
Рис. 3. Устройство системы капиллярного электрофореза.
В системах капиллярного электрофореза используют, как правило, капилляры из высокочистого плавленого кварца, прозрачного в УФ-области спектра, с внешним полимерным, чаще полиимидным, защитным покрытием. В случае детектирования внутри капилляра (on-line) полиимидное покрытие в зоне детектирования снимают, оставляя для прохождения света зону чистого кварца. Внутренний диаметр капилляров может варьироваться от 20 до 100 мкм, но чаще всего используют 50 и 75 мкм. Внешний диаметр составляет 365 мкм, длина капилляров 20—100 см.
Доминирующее число разделений в КЭ ведут на непокрытых изнутри капиллярах, так называемых немодифицированных. Их подготовка к анализу начинается, как правило, с промывки раствором щелочи для обеспечения диссоциации силанольных групп кварца и возникновения ЭОП.
Анализ методом КЭ можно проводить только тогда, когда капилляр находится в кондиционном состоянии. С точки зрения анализа кондиционное состояние капилляра следует понимать так, что выполняемые последовательно анализы должны быть воспроизводимы как по временам миграции пиков, так и по площадям пиков. При подготовке к работе капилляр обычно промывают раствором кислоты, водой и раствором щелочи. Цель первой операции заключается в удалении с поверхности примесей, в частности, многовалентных катионов, и первичном гидролизе силокса- новых групп. Промывка водой способствует удалению кислоты и дальнейшему гидролизу поверхности. Наконец, щелочная промывка предназначена для удаления примесей, не реагирующих с кислотой, и максимальной диссоциации образовавшихся силанольных групп. Финишная промывка водой имеет целью удалить из капилляра щелочь.
Источники высокого напряжения
В первую очередь, источники напряжения должны обеспечивать регулируемую подачу напряжения в диапазоне от —25 до +25 кВ и при заданной величине напряжения поддерживать постоянство этого значения. Максимально допустимый ток в капилляре при этом не должен превышать 200 мкА.
Как правило, переключение полярности происходит в ручном режиме, что сопровождается сменой высоковольтных блоков.
Типичный объем вводимой пробы в капиллярном электрофорезе составляет 1—20 нл. Общепринято заполнять пробой не более 2 % объема капилляра с тем, чтобы изначально, до анализа, не создавать широкую зону компонентов и обеспечить достаточное время нахождения зоны пробы в капилляре для установления значимых различий в электрофоретических подвижностях.
Непосредственно перед вводом пробы капилляр промывают рабочим буферным раствором, удаляя остатки пробы от предыдущего ввода.
Различают три способа ввода пробы:
Первые два способа реализованы во всех коммерческих системах капиллярного электрофореза, гидростатический, напротив, не нашел широкого применения.
Ввод пробы давлением (гидродинамический, пневматический) обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для пробы и выходным концом капилляра, при этом давление либо повышается в сосуде для пробы, либо снижается на конце капилляра.
Электрокинетический ввод пробы. При этом способе ввод пробы осуществляется путем подачи высокого напряжения на электроды, когда на входе установлена пробирка с раствором пробы, а на выходе — с рабочим буфером. За счет возникающего при этом ЭОП компоненты пробы перемещаются в капилляр. Количество введенной пробы при этом способе зависит от величины приложенного напряжения, времени, в течение которого приложено напряжение, и подвижности компонентов пробы.
Гидростатический ввод пробы. В этом способе для ввода пробы используют разницу в высоте между буферным сосудом и сосудом для проб.
Детектирование в системах капиллярного электрофореза может осуществляться различными способами:
► непосредственно в капилляре в части, близкой к выходному концу, в режиме реального времени (on-capillary). В зоне детектирования с внешней стенки капилляра снимают защитное полиимидное покрытие. Этот способ характерен для большинства коммерческих систем капиллярного электрофореза;
► непосредственно на выходном конце капилляра (end-capillary)’,
► вне системы КЭ (off-capfflary, при этом, как правило, детектор представляет собой отдельный самостоятельный прибор (например, масс-спектрометр) и соединен с системой капиллярного электрофореза специальным интерфейсом).
Основными принципами детектирования в КЭ являются:
► фотометрическое в УФ-видимой области спектра (прямое и косвенное),
► флуориметрическое (прямое и косвенное),
► амперометрическое (прямое и косвенное),
Наиболее распространенным вариантом детектирования продолжает оставаться фотометрическое, основанное на поглощении веществом УФ или видимого света. Фотометрические детекторы в КЭ, подразделяют на:
► Детекторы с фиксированной длиной волны: источники света с линейчатым спектром (ртутная лампа (254 нм), кадмиевая лампа (229 нм) и цинковая лампа (214 нм). В приборах «Капель-104» фотометрический детектор работает на длине волны 254 нм (строго 253,7 нм), поэтому отклик детектора будет наблюдаться только в том случае, если определяемый компонент имеет заметное поглощение на указанной длине волны
► Детекторы с изменяемой длиной волны: источниками света служат дейтериевые и вольфрамовые лампы (рабочий диапазон длин волн 190—350 нм и 340—850 нм, соответственно). Необходимая спектральная селекция достигается применением монохроматоров или узкополосных светофильтров.
► Детекторы на диодной матрице (ДМД). В таких детекторах световой поток, прошедший через капилляр, разлагается в спектр с помощью высококачественного светосильного монохроматора, а матрица фотодиодов постоянно регистрирует сигналы в ультрафиолетовой и видимой частях спектра (УФ-В-детекторы), обеспечивая запись в режиме сканирования. Данные, полученные одновременно на различных длинах волн (до 5), обрабатываются с помощью компьютеров, выделяющих сигнал на оптимальной длине волны и вычитающих фон. Применение детекторов на диодной матрице обеспечивает получение аналитических данных с гораздо большей степенью достоверности.
Для соединений, анализируемых с помощью КЭ и не поглощающих в УФ-диапазоне, существует возможность регистрации методом косвенного УФ-детектирования. В этом случае в состав ведущего электролита вводят небольшое количество хромофора — вещества, поглощающего на требуемой длине волны. Так, в случае определения анионов поглощающий ион тоже должен быть анионом, например, хромат-ион, фталат-ион, а при определении катионов чаще всего используют катионы ароматических аминов или гетероциклов, в частности, ион протонированного бензимидазола. Так как ионная сила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне, где находится непоглощающий ион, уменьшается концентрация поглощающего иона. Обмен происходит строго эквивалентно, на электрофореграмме наблюдаются обратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациям определяемых ионов. Косвенное УФ-детектирование является универсальным вариантом детектирования, т. к. позволяет регистрировать все присутствующие в анализируемом растворе компоненты.
Капиллярный электрофорез относится к группе комбинированных методов анализа, в которых объединены два основных процесса: предварительное разделение компонентов сложной смеси и их определение/детектирование. Важными характеристиками разделения являются разрешение, эффективность и селективность. Для конечного определения наиболее актуален параметр чувствительности, в первую очередь зависящий от типа используемого детектора.
Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью.
Несмотря на высокую эффективность, достигаемую в капиллярном электрофорезе, селективность разделения, особенно в зонном варианте может быть недостаточна, в первую очередь, из-за осуществления процесса разделения внутри одной фазы. Задача повышения селективности разделения в том или ином варианте КЭ требует знания факторов, ее определяющих, и может быть решена за счет изменения pH ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок, например, ПАВ, макроциклов, органических. Следует иметь в виду, что все эти факторы будут сказываться также на скорости ЭОП, однако, сам по себе электроосмотический поток не ответственен за изменение селективности разделения и определяет лишь изменение времени миграции (на равную величину для всех компонентов пробы).
Выбор ведущего электролита является чрезвычайно важной задачей для успешного разделения в любом варианте КЭ. Величина pH ведущего электролита определяет как скорость течения жидкости в капилляре (величину ЭОП), так и форму нахождения компонента в растворе (заряд). Чувствительность ЭОП к изменению pH раствора заставляет использовать ведущие электролиты с высокой буферной емкостью, при этом диапазон pH, как правило, имеет значения рКа±1. Благодаря высокой стабильности кварцевого капилляра при электрофоретическом разделении можно использовать буферные системы с pH от 2 до 12.
Идеальный буфер для капиллярного электрофореза должен обладать следующими свойствами:
► достаточная буферная емкость в выбранном диапазоне pH,
► малое поглощение на длине волны детектирования,
► низкая подвижность ведущего иона.
Список так называемых «подходящих» буферов возглавляют боратный буфер и TRIS, так как они могут использоваться в широком диапазоне концентраций без существенного увеличения тока, что позволяет, в свою очередь, применять максимально высокие напряжения в ходе анализа.
Среди используемых в капиллярном электрофорезе добавок наиболее популярны поверхностно-активные вещества. Их введение в состав буферных растворов позволяет в разной степени влиять на селективность, причем определяющими факторами являются тип ПАВ и его концентрация. В КЭ могут быть использованы как ионогенные (катионные (КПАВ) и анионные (АПАВ), а также цвиттер-ионные), так и нейтральные поверхностно-активные вещества.
При концентрации ниже ККМ мономерные формы ионогенных ПАВ могут выступать как ион-парные добавки (различные АПАВ, КПАВ), а также влиять на растворимость гидрофобных компонентов смеси и модифицировать стенки капилляра (например, ЦТАБ). Возможные при этом механизмы взаимодействий поверхностноактивного вещества и пробы — ионные и/или гидрофобные. Добавки ПАВ в ведущий электролит влияют не только на поведение зоны пробы в капилляре, но и на стенки самого капилляра, модифицируя ЭОП (уменьшая, увеличивая или обращая).
Органические растворители (метанол, ацетонитрил, изопропанол и др.), которые вводят в буферный раствор в концентрации от нескольких долей процента до 30 % (об.) могут, с одной стороны, повышать растворимость анализируемых соединений, делая капиллярный электрофорез пригодным для анализа веществ с ограниченной растворимостью в водных средах. С другой стороны, органические добавки могут уменьшать гидрофобные взаимодействия между анализируемым компонентом и мицеллой в МЭКХ, а также влиять на подвижность ЭОП и собственную электрофоретическую подвижность аналита. Макроциклические реагенты как компоненты ведущих электролитов широко распространены в КЭ.
Обработка результатов в капиллярном электрофорезе. Качественный и количественный анализ
Целью любого анализа является получение ответов на вопросы: какие компоненты присутствуют в анализируемом образце и какова величина их концентраций? Первый из вопросов есть задача качественного анализа, второй — количественного. Для решения обеих задач в КЭ перед анализом пробы обязательно проводят процедуру градуировки системы путем измерения одной или нескольких смесей с известным качественным и количественным составом. Результатом градуировки являются формирование таблицы компонентов (содержит времена миграции и имена определяемых компонентов) и построение градуировочной зависимости (показывает зависимость сигнала детектора от концентрации/содержания вещества).
В капиллярном электрофорезе используют те же принципы интегрирования пиков, методы градуировки, способы формирования отчетов, как в газовой хроматографии и ВЭЖХ. По аналогии с ВЭЖХ большинство детекторов в капиллярном электрофорезе являются концентрационными, для которых высота или площадь пика прямо пропорциональны концентрации вещества, образующего пик.
Качественный анализ. Характеристики миграции/удерживания
Качественный анализ обычно состоит в сравнении времен миграции (в случае капиллярного зонного электрофореза) или времен удерживания (в случае мицеллярной электрокинетической хроматографии), полученных для стандарта и пробы, измеренных в одинаковых условиях. Если эти времена совпадают с заданной точностью (обычно окно идентификации не превышает 5 %), то считают, что искомое вещество в пробе найдено и переходят к количественному анализу. Тем не менее, такой способ идентификации вещества не всегда надежен, особенно в случае анализа проб со сложной матрицей.
Несмотря на высокую разделительную способность капиллярного электрофореза, качественный анализ близкорасположенных пиков может вызывать некоторые трудности. В этом случае можно рекомендовать использование метода добавок. В пробу, для которой затруднена идентификация анализируемого вещества, вносят это вещество и проводят повторный анализ. Если на электрофореграмме появляется новый пик, это означает, что анализируемый компонент ранее в пробе отсутствовал. Если же один из бывших пиков увеличился по высоте (площади), то можно утверждать, что это и есть анализируемый компонент. Величину добавки обычно выбирают так, чтобы высота (площадь) интересующего нас пика увеличилась не более чем в 2—3 раза.
Зачастую приходится сталкиваться с ситуацией, когда время миграции компонента не стабильно от анализа к анализу, что связано, в том числе, с нестабильностью электроосмотического потока. Причин этому несколько, от недостаточно кондиционного состояния капилляра, использования модификации внутренней поверхности капилляра или введения добавок в состав буферного электролита до температурных эффектов и влияния матричных и сопутствующих компонентов. Использование в таких ситуациях маркера ЭОП (например, ацетона) как в растворе стандарта, так и в пробе, позволит вычислить исправленные времена миграции, представляющие собой разность времен миграции анализируемого вещества и метки ЭОП.
Еще одним из вариантов повышения достоверности идентификации анализируемого компонента является введение в стандартный раствор и раствор пробы маркера — внутреннего стандарта. Это должно быть вещество, заведомо отсутствующее в анализируемых пробах, но имеющее схожие с определяемым веществом физико-химические свойства. Для стандарта и пробы вычисляют относительные времена миграции (можно арифметически поделить время миграции компонента на время миграции ЭОП и, наоборот, но для пробы и для стандарта это должно быть сделано одинаково) и находят в пробе близкие по численному значению результаты.
Наиболее полную и достоверную идентификацию вещества на сегодняшний день можно получить при использовании диодно-матричного детектора, который по результату одного анализа может предоставить информацию:
по сопоставлению времени миграции вещества и его спектра в пробе и стандартном растворе (при этом дополнительно будет дана оценка чистоты пика пробы, например, по наложению спектров, снятых в трех точках пика: на обоих склонах и в максимуме);
по отношению откликов пика (например, площади) на двух разных длинах волн, полученных для стандарта и пробы. Для одного и того же вещества на двух разных длинах волн при неизменном времени миграции отношение площадей в стандартном растворе и растворе пробы должно быть постоянным. Длины волн выбирают так, чтобы компонент имел при этом разное поглощение, т. е. высота или площадь пика при двух разных длинах волн были бы различными.
Количественная обработка результатов анализа
В основе количественного анализа лежит прямо пропорциональная зависимость высоты (площади) пика от концентрации вещества при использовании концентрационных детекторов, какими являются, например, фотометрические и флуориметрические детекторы.
Суть количественного определения сводится к следующему: сначала выбирают метод градуировки (внешнего стандарта (абсолютной градуировки), внутреннего стандарта, метод добавок и т. д.); определяют какую величину отклика детектора — высоту пика или площадь пика — будут использовать; затем анализируют стандартные растворы с известными концентрациями веществ и для каждого компонента строят градуировочную зависимость отклика детектора от концентрации вещества; после чего анализируют пробу неизвестного состава и по градуировочному графику находят концентрацию определяемых веществ.
Основным методом градуировки является метод внешнего стандарта (абсолютной градуировки), для которого необходимо иметь ГСО или химически чистые стандарты всех определяемых компонентов. Градуировка может быть одноточечной и многоточечной. Одноточечная означает, что для градуировки компонента используется только один градуировочный раствор, зависимость носит строго линейный характер и, как правило, выходит из начала координат. Это частный случай многоточечной градуировки, для построения которой анализируют несколько специально подобранных по концентрациям градуировочных растворов, после чего с помощью метода наименьших квадратов рассчитывают коэффициенты прямой, наилучшим образом описывающей экспериментальные данные. Правильное и тщательное проведение градуировки является необходимым условием точности получаемых количественных результатов анализа.
Основными областями применения метода КЭ являются:
· Анализ объектов окружающей среды: природные, питьевые, сточные воды и почвы (анионы, катионы, гербициды).
· Контроль качества пищевой продукции и продовольственного сырья: (неорганические катионы и анионы, консерванты, органические кислоты, подсластители, синтетические красители, антиоксиданты, аминокислоты, витамины, углеводы, белки).
· Анализ показателей качества кормов, комбикормов и сырья для их производства: (аминокислоты, белки, витамины).
· Фармация: технологический контроль и анализ готовых лекарственных форм, разделение оптических изомеров.
· Клиническая биохимия: определение неорганических катионов и анионов, аминокислот, белков в биологических жидкостях, определение фармакокинетики лекарственных препаратов.
· Криминалистическая экспертиза: обнаружение остаточных количеств взрывчатых веществ, анализ наркотических средств.
· Химическая промышленность: технологический контроль, определение состава сырья и полупродуктов.
источник