Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов.
В 1970 году Лэммли (англ. Laemmli ) для изучения процесса сборки капсида бактериофага Т4 предложил метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле в зависимости от молекулярной массы [1] . Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд.
При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:
- белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
- количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
- собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.
В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы. Практика подтверждает верность данных предположений в подавляющем большинстве случаев.
Для проведения денатурирующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез (от англ. discontinous — разрывный) то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6,8 и концентрацию полиакриламида от 2 до 8 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8,5-9 и концентрацию полиакриламида от 5 до 20 %. Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6,8 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8,8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся (в переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью). Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода.
В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.
Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание белков в гелях красителем Кумасси (en:Coomassie blue) или серебром. Для проведения вестерн блоттинга белки переносят из геля на нитроцеллюлозную мембрану.
В большинстве случаев результаты электрофоретического разделения достаточно получить путем визуальной оценки геля. Однако, с целью получения достоверных данных и надлежащего документирования результатов гель сканируют на просвет при помощи высокочувствительного денситометра. По сути, денситометр является сканером, который относится к контрольно-измерительным приборам и подлежит поверке с целью определения и подтверждения соответствия характеристик средства измерения установленным требованиям. Подобные требования к денситометру позволяют надежно определять не только положение белков в геле, но и оптическую плотность белкового пятна. Оцифрованное изображение геля обрабатывают при помощи специализированного программного обеспечения, которое позволяет достоверно определить такие параметры как электрофоретическая подвижность белка, его чистота, количество белка в пятне и др.
Определение молекулярной массы исследуемого белка предполагает необходимость калибровки геля по молекулярным массам. Калибруют гель относительно молекулярных масс белков-маркеров, которые разделяют параллельно с исследуемым образцом. Смеси маркерных белков доступны в различном интервале масс. Калибрование предполагает построения зависимости относительной электрофоретической подвижности (Rf) каждого из маркерных белков от десятичного логарифма их молекулярной массы. Обычно зависимость имеет вид сигмообразной кривой. Расчет молекулярной массы исследуемого белка осуществляют относительно его Rf, используя при этом метод регрессионного анализа. Достоверными результаты считаются, в случае если длина пробега белков-маркеров составляет не менее 80% длины разделяющего геля, а зависимость их Rf от логарифма молекулярной массы является линейной (R 2 > 0,95). Т.е. для расчетов используют лишь тот участок калибровочной кривой, который покрывает электрофоретическую подвижность исследуемого белка.
Чувствительность метода SDS-PAGE по Лэммли обратно пропорциональна молекулярной массе белка. Например, в интервале 10-20 кДа удается разделить белки, отличающиеся всего на 0,1 кДа (разница всего в один аминокислотный остаток). Однако, для получения удовлетворительных результатов следует выполнить несколько простых методических рекомендаций. Так, в связи с тем, что высокая электропроводность исследуемых образцов способна значительно исказить электрофоретическую подвижность белка, их ионная сила должна быть по возможности минимальной и приблизительно равной. Еще одним важным условием надежности определения молекулярной массы является оптимальная нагрузка белка на гель. При окраске Coomassie Blue R250 оптимальное содержание белка в пятне должно находиться в пределах 0,1-1 мкг и как минимум на порядок меньше при окраске серебром. В противном случае белки в геле сформируют широкие пятна, что в свою очередь затруднит определение их электрофоретической подвижности. Несмотря на высокую чувствительность и несложность метода молекулярная масса белков, определенная с использованием SDS-PAGE, часто отличается от истинного значения. Разница может составлять от нескольких кДа для низкомолекулярных белков до десятков кДа для высокомолекулярных белков.
Для электрофореза белков в полиакриламидном геле в качестве буферных растворов используют: Трис-HCl, Трис-трицин, TBE, TBE с мочевиной, Bis-Tris.
источник
Электрофореза в полиакриламидном геле ( PAGE ) представляет собой метод широко используется в биохимии , судебно — медицинской химии , генетики , молекулярной биологии и биотехнологии , чтобы отделить биологические макромолекулы , обычно белки или нуклеиновые кислоты , в соответствии с их электрофоретической подвижности . Электрофоретической подвижности является функцией длины, конформации и заряда молекулы. Полиакриламидном гель — электрофорез является мощным инструментом , используемым для анализа образцов РНК. Когда в полиакриламидном геле денатурируют после электрофореза, он содержит информацию о составе образца из видов РНК.
Гидратация из акрилонитрила приводит к образованию акриламида молекул (С 3 Н 5 NO) , с помощью нитрилгидратаза . Акриламид мономер находится в состоянии порошка перед добавлением воды. Акриламид токсичен для нервной системы человека, поэтому все меры предосторожности должны соблюдаться при работе с ним. Акриламид растворим в воде и при добавлении воды он полимеризуется что приводит к образованию полиакриламида. Это полезно , чтобы сделать полиакриламидном геле с помощью acrylmide гидратации , поскольку размер пор можно регулировать. Увеличение концентрации акриламида приводят к снижению размера пор после полимеризации. Полиакриламид гель с мелкими порами помогает исследовать меньшие молекулы лучше , так как малые молекулы могут входить в поры и путешествовать через гель в то время как крупные молекулы попадают в ловушку в порах отверстия.
Как и со всеми формами гель — электрофореза , молекулы могут быть запущены в их нативном состоянии , сохраняя структуру более высокого порядка молекул. Этот метод называется нативным-PAGE. Альтернативно, химическое вещество денатурирующего может быть добавлено , чтобы удалить эту структуру и превратить молекулу в неструктурированную молекулу которого подвижность зависит только от его длины (так как белок-ДСНЫ комплексами все имеют аналогичное отношение массы к заряду). Эта процедура называется SDS-PAGE . Натрий додецил сульфат — электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) представляет собой метод разделения молекул , основанные на различии их молекулярной массы. При рН , при котором гель — электрофорез проводят молекулы SDS заряжены отрицательно и связываются с белками в соотношении множеств, приблизительно одну молекулу SDS на каждые 2 аминокислот. Таким образом, моющее средство обеспечивает все белки с равномерным отношением заряда к массе. Путем связывания с белками детергент разрушает их вторичные, третичные и / или четвертичную структуру их денатурации и превращение их в отрицательно заряженных линейных полипептидных цепей. При воздействии электрического поля в ПААГ, отрицательно заряженные полипептидные цепи путешествовать по направлению к аноду с различной подвижностью. Их мобильность, или расстояние , проходимое молекулами, обратно пропорциональна логарифму их молекулярной массы. Сравнивая относительное отношение расстояния , пройденного каждый белок к длине геля (Rf), можно сделать выводы об относительной молекулярной массе белков, где длина геля определяется расстоянием , пройденного небольшой молекула как отслеживание красителя.
Для нуклеиновых кислот, мочевины являются наиболее часто используемым денатурирующей. Для белков, додецилсульфат натрия (SDS) представляет собой анионный детергент применяется для образцов белка для белков оболочки для придания два отрицательных зарядов (от каждой молекулы SDS) для каждых двух аминокислот денатурированного белка. 2-меркаптоэтанол также может быть использован для разрушения дисульфидных связей , найденных между белковыми комплексами, что способствует дальнейшему денатурации белка. В большинстве белков, связывание с ДСН полипептидных цепей придают равномерное распределение заряда на единицу массы, что приводит к фракционированию путем приблизительного размера во время электрофореза. Белки , которые имеют большое гидрофобное содержание — например, многие мембранные белки, а также те , которые взаимодействуют с поверхностно -активными веществами в их родной среде — по своей природе труднее лечить точно с помощью этого метода, в связи с большей изменчивостью в соотношении связанного SDS. В процедурном, с использованием как родной и ДСН-ПААГ вместе могут быть использованы для очистки и для разделения различных субъединиц белка. Родной-ПААГ держит олигомерные формы нетронутым и покажет полосу на геле , который является представителем уровня активности. SDS-PAGE будет денатурация и отделить олигомерные формы в его мономеры, показывающие полосы , которые являются репрезентативными их молекулярными весами. Эти полосы могут быть использованы для идентификации и оценки чистоты белка.
Образцы могут представлять собой любой материал , содержащий белки или нуклеиновые кислоты. Они могут быть биологически получены, например , из прокариотических или эукариотических клеток, тканей, вирусов, проб окружающей среды, или очищенных белков. В случае твердых тканей или клеток, они часто первым разбиты механически с использованием блендера (для больших объемов образцов), с использованием гомогенизатора (меньшие объемы), с помощью обработки ультразвуком , или при помощи велосипедного высокого давления, а также сочетание биохимических и механические методы — в том числе различных видов фильтрации и центрифугирования — может быть использованы для разделения различных отсеков и клеточных органелл до электрофореза. Синтетические биомолекулы , такие как олигонуклеотиды могут также быть использованы в качестве аналитов.
Образец для анализа необязательно смешивают с химическим денатурирующего , если это желательно, как правило , SDS для белков или мочевины для нуклеиновых кислот. SDS представляет собой анионный детергент , который денатурирует вторичные и не дисульфидные связи третичных структуры, и дополнительно применяет отрицательный заряд каждого белок в пропорции к его массе. Мочевина разрывает водородные связи между парами оснований нуклеиновой кислоты, в результате чего составные нитей к отжигу. Нагрев образцов , по меньшей мере , 60 ° С дополнительно способствует денатурации.
В дополнение к SDS, белки могут быть необязательно кратковременно нагревают до почти до кипения в присутствии восстанавливающего агента, такого как дитиотреитол (DTT) или 2-меркаптоэтанола (бета-меркаптоэтанол / BME) , что еще больше денатурирует белки за счет снижения дисульфидных связей, Таким образом , преодолевая некоторые формы третичного сворачивания белка, и разбивая четвертичную структуру белка (олигомерные субъединиц). Это известно как сокращение SDS-PAGE.
Отслеживание краситель может быть добавлен к раствору. Это, как правило, имеет более высокую, чем электрофоретическую подвижность аналиты, чтобы позволить экспериментатору отслеживать ход раствора через гель во время электрофоретической перспективы.
Гели , как правило , состоят из акриламида , бисакриламида , дополнительных денатурирующих (SDS или мочевины), и буфера с отрегулированным рНом. Раствор может быть дегазированным под вакуумом , чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в процессе полимеризации. В качестве альтернативы, бутанол может быть добавлен к разрешающему гелю (для белков) после того, как он наливается, как бутанол удаляет пузыри и делает поверхность гладкой. Источник свободных радикалов и стабилизатора, такие как персульфат аммония и TEMED добавляет для инициирования полимеризации. Реакция полимеризации создает гель из-за добавленным бисакриламид , которые могут образовывать поперечные связи между двумя молекулами акриламида. Отношение бисакриламида в акриламид может изменяться для специальных целей, но , как правило , около 1 части в 35. концентрацию акриламида в геле , также можно варьировать, как правило , в диапазоне от 5% до 25%. Более низкие процентные гели лучше для разрешения молекулы очень высокой молекулярной массы, в то время как гораздо более высокий процент акриламида , необходимы для решения небольших белков. Средний диаметр пор полиакриламидных гелей определяется общей концентрации акриламида (% Т с Т = общая концентрация акриламида и бисакриламида) и концентрации сшивающего агента бис — акриламид (% C с C = бисакриламида концентрации). Размер пор совмещенный сводятся к% T. Относительно% С, концентрацией 5% производит самые мелкие поры, так как влияние бисакриламида от размера пор имеет параболу — SHAPE с вершиной на 5%.
Гели, как правило, полимеризуют между двумя стеклянными пластинами в геле МНЛЗ, с гребнем, вставленным в верхней части, чтобы создать образцы скважин. После того, как гель полимеризуется гребень может быть удален, и гель готов для электрофореза.
Различные буферные системы используются в ПААГЕ в зависимости от природы пробы и экспериментальной цели. Буферы, используемые на аноде и катоде могут быть одинаковыми или различными.
Электрическое поле прикладывается через гель, в результате чего отрицательно заряженные белки или нуклеиновые кислоты , мигрировать через гель от отрицательного электрода (который является катодом в том , что это электролитическое , а не гальванического элемента) и в направлении положительного электрода ( анод). В зависимости от их размера, каждый биомолекулы движется по- разному через гелевую матрицу: небольшие молекулы более легко помещается через поры в геле, а более крупные из них имеют больше трудностей. Гель , как правило , работать в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения , приложенного через гель; миграция происходит более быстро при более высоких напряжениях, но эти результаты , как правило , менее точны , чем у тех , при более низких напряжениях. После заданного промежутка времени, биомолекулы мигрировали различные расстояния в зависимости от их размера. Меньшие биомолекулы путешествовать дальше вниз геля, в то время как более крупные остаются ближе к точке происхождения. Таким образом , биомолекулы могут быть разделены примерно в зависимости от размера, который зависит главным образом от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но и зависит от конформации высшего порядка в нативных условиях. Подвижность геля определяются как скорость миграции путешествовала с градиентом напряжения 1V / см и имеет единицу см 2 / с / V. Для аналитических целей, относительная подвижность биомолекул, R F , отношение расстояния молекулы пройденной на гель на общее расстояние отслеживания красителя путешествия строило графики зависимости от молекулярной массы молекулы (или иногда логарифм МВт, или , вернее , М г , молекулярный радиус). Такие , как правило , линейные участки представляют собой стандартные маркеры или калибровочные кривые, которые широко используются для количественной оценки различных биомолекул размеров.
Некоторые гликопротеины , однако, аномальное поведение на SDS гелях. Кроме того, анализ крупных белков в пределах от 250000 до 600000 Да Сообщается также проблематичным в связи с тем , что такие полипептиды движутся ненадлежащим образом в обычно используемых системах геля.
После электрофореза гель может быть окрашены (для белков, наиболее часто с кумасси бриллиантовым голубым R-250 или авторадиографии, нуклеиновых кислот, этидий бромид , или для любой, серебряные пятна ), позволяя визуализации разделенных белков или дальнейшей обработке ( например , Вестерн — блот ). После окрашивания, различные виды биомолекул появляются в виде отдельных полос в геле. Оно является общим для запуска маркеры молекулярной массы размером с известной молекулярной массой в отдельной полосе в геле , чтобы калибровать гель и определить приблизительную молекулярную массу неизвестных биомолекул путем сравнения расстояния , пройденного по отношению к маркеру.
Для белков, SDS-PAGE, как правило , первый выбор в качестве анализа чистоты из — за его надежность и легкость. Наличие SDS и стадия денатурации белки делают отдельно, примерно в зависимости от размера, но может произойти аберрантная миграция некоторых белков. Различные белки могут также окрасить по- разному, что препятствует квантификации путем окрашивания. СТР также может быть использована в качестве препаративной методики очистки белков. Так , например, количественный препаративный родной непрерывный электрофорез в полиакриламидный геле ( QPNC-PAGE ) представляет собой метод для разделения нативных металлопротеидов в сложных биологических матрицах.
Полиакриламидный гель (ПАГ) был известен как потенциальное средство для вложения секционирования тканей уже в 1964 году, и две независимых группы использовали PAG при электрофорезе в 1959 году Он обладает несколько электрофоретический желательными характеристикамикоторые делают его универсальной средой. Это синтетический, термо-стабильный, прозрачный, сильный, химически относительно инертен гель, и может быть получено с широким диапазоном средних размеров пор. Размер пор геля и воспроизводимость размера геля пор определяются тремя факторами, общее количество акриламида настоящее(% T) (T = общая концентрация акриламида и бисакриламида мономера), количество сшивающего агента (% С ) (с = бисакриламида концентрация), и время полимеризации акриламида (см QPNC-ПААГ). Размер пор уменьшается с увеличением Т%; с сшиванием, 5% С дает наименьший размер пор. Любое увеличение или уменьшение% C от 5% увеличивает размер пор, как размер пор по отношению к% С является параболической функцией с вершиной в 5% C. Этовидимому, изза неоднородного пакетирования полимерных нитей внутри геля. Этот гель материал может также выдерживать высокие напряжения градиентов, поддаются различные процедуры окрашивания и депигментации, и может быть переварен для извлечения разделенных фракций или сушиттечение авторадиографии и постоянная записи.
Полиакриламидные гели состоят из концентрирующий гель и разделяющего геля. Штабелировании гели имеют более высокую пористость по отношению к разделяющему гелю, и позволяют белки мигрировать в концентрированной области. Кроме того, штабелирование гелей обычно имеют рН 6,8, так как нейтральные молекулы глицина позволяют для более быстрой подвижности белка. Разделительные гели имеют рН 8,8, где анионный глицина замедляет подвижность белков. Разделительные гели позволяют для разделения белков и имеют относительно низкую пористость. Здесь, белки разделяются в зависимости от размера (в SDS-PAGE) и размер / заряда (родной СТР).
Химический буфер стабилизирует значение рН до требуемого значения в пределах самого геля и в буфере для электрофореза. Выбор буфера также влияет на электрофоретической подвижности буфера противоионов и тем самым разрешением геля. Буфер должен быть также инертен и не модифицировать или реагировать с большинством белков. Различные буфера могут быть использованы в качестве катода и анода буферов, соответственно, в зависимости от применения. Несколько значений рН могут быть использованы в пределах одного геля, например , в DISC электрофореза. Обычные буферы в ПААГ включают Трис , бис-Трис, или имидазола .
Противоион сбалансировать внутреннюю заряд иона буфера , а также влияет на напряженность электрического поля во время электрофореза. Высоко заряженные и подвижные ионы часто избегают в SDS-PAGE катодных буферов, но могут быть включены в самом геле, где он мигрирует впереди белка. В приложениях , таких как DISC SDS-PAGE значения рН в пределах геля может изменяться , чтобы изменить средний заряд противоионов во время бега , чтобы улучшить качество изображения. Популярные противоионы глицин и трицин . Глицин был использован в качестве источника завершающего иона или медленного ион , потому что его рКа 9,69 и подвижность глицината такова , что эффективная подвижность может быть установлена на значение ниже , что из самых медленных известных белков чистого отрицательного заряда в диапазоне рНа. Минимальное значение рН этого диапазона составляет приблизительно 8,0.
Акриламид (С 3 Н 5 NO; мВт: 71,08) при растворении в воде, медленно, спонтанная автоматическая полимеризация акриламида происходит, соединяя молекулу вместе с головой на хвост моде с образованием длинных одноцепочечных полимеров. Наличие свободных радикалов системы -generating значительно ускоряет полимеризацию. Этот вид реакции известен как винил — аддитивной полимеризации . Решение этих полимерных цепей становится вязким , но не образует гель, так как цепи просто скользить друг над другим. Образование геля требует увязки различных цепей вместе. Акриламид является канцерогеном , нейротоксин , и репродуктивный токсин. Важно также , чтобы сохранить акриламид в темном прохладном и сухом месте , чтобы уменьшить autopolymerisation и гидролиз .
Бисакриламида ( N , N ‘метиленбисакриламид ) (С 7 Н 10 N 2 О 2 ; мВт: 154,17) является наиболее часто используемым сшивающим агентом для полиакриламидный гелей. Химически это можно рассматривать как две молекулы акриламида в сочетании головы к голове на их нереакционноспособных концах. Бисакриламид может сшивать две цепи полиакриламида друг с другом, в результате чего геля.
Додецилсульфата натрия (SDS) (С 12 Н 25 NaO 4 S; мВт: 288,38) (используется только в денатурирующих белковых гелей) является сильным детергентом агент , используемый для денатурации нативных белков для отдельных полипептидов . Эта денатурации, которая называется реконструктивной денатурация, не достигается путем общего линеаризации белка, но вместо этого, через конформационные изменения в комбинацию случайной катушки и α спиральных вторичных структур. Когда белок , смесь нагревают до 100 ° С в присутствии SDS, в моющем обтекает полипептидную цепь. Он связывается с полипептидами в постоянном массовом соотношении 1,4 г ДСН / г полипептида. В этом процессе, внутренние заряды полипептидов становятся пренебрежимо малыми по сравнению с отрицательными зарядами , внесенных SDS. Таким образом , полипептиды , после обработки стали стержнеобразными структур , обладающих однородной плотность заряда, то есть того же отрицательный заряд на единицу веса. Электрофоретическая подвижность этих белков является линейной функцией от логарифмов их молекулярных масс. Без SDS, различные белки с похожими молекулярными массами бы мигрируют по- разному из — за различия в соотношении масс-заряде, так как каждый белок имеет изоэлектрическую точку и молекулярный вес конкретную его первичную структуру . Это известно как нативный ПААГ . Добавление ДСНО решает эту проблему, так как он связывается и разворачивает белку, что дает почти равномерный отрицательный заряд по всей длине полипептида.
Мочевина (CO (NH 2 ) 2 ; мВт: 60,06) является хаотропным агентом , что увеличивает энтропию системы путем вмешательства внутримолекулярных взаимодействий , опосредованных не- ковалентных сил , таких как водородные связи и ван — дер — ваальсовых сил . Макромолекулярная структура зависит от чистого эффекта этих сил, поэтому следует , что увеличение хаотропных растворенных веществ денатурирует макромолекулы,
Персульфат аммония (APS) , (N 2 H 8 S 2 O 8 ; мВт: 228,2) является источником свободных радикалов и часто используется в качестве инициатора для образования геля. Альтернативный источник свободных радикалов рибофлавин , который генерировал свободные радикалы в фотохимической реакции.
TEMED ( N , N , N ‘, N ‘ тетраметилэтилендиамина) (С 6 Н 16 N 2 ; мВт: 116.21) стабилизирует свободные радикалы и улучшает полимеризацию. Скорость полимеризации и свойства полученного геля зависит от концентрации свободных радикалов. Увеличение количества свободных радикалов приводит к уменьшению средней длины цепи полимера, увеличение мутности геля и уменьшению эластичности геля. Уменьшение количества показывает обратный эффект. Самые низкие каталитические концентрации , которые позволяют полимеризацию в течение разумного периода времени должны быть использованы. АПС и TEMED обычно используются при приблизительно эквимолярных концентрациях в диапазоне от 1 до 10 мМ.
Следующие химические вещества и процедуры используются для обработки геля и образцов белка визуализированных в нем.
Отслеживание красителя; в качестве белков и нуклеиновых кислот, в основном бесцветные, их прогресс через гель — электрофореза в процессе не может быть легко следовать. Анионные красители известной электрофоретической подвижности, таким образом , как правило , включены в буфере PAGE образца. Очень часто трекинг краситель бромфеноловая синий (ВРВ, 3′ , 3″ , 5′ , 5″ tetrabromophenolsulfonphthalein). Этот краситель окрашивается в щелочи и нейтральный рН и небольшие отрицательно заряженные молекулы , которая двигается по направлению к аноду . Будучи очень мобильны молекула движется впереди большинства белков. Как он достигает анодный конец электрофореза среды электрофореза прекращаются. Он может слабо связывается с некоторыми белками и придавать голубой цвет. Другие красители общей отслеживаний являются ксиленцианолом , который имеет более низкую подвижность, а также Оранжевый G , который имеет более высокую мобильность.
Загрузка пособия; большинство систем PAGE загружаются из верхней в лунки в геле. Для того, чтобы гарантировать , что образец опускается на дно геля, буфер образца с добавлением присадок , которые повышают плотность образца. Эти добавки должны быть неионным и не реакционноспособные по отношению к белкам , чтобы избежать вмешательства электрофореза. Обычные добавки глицерин и сахароза .
Кумасся бриллиантовый голубой R-250 (С) (С 45 Н 44 N 3 NaO 7 S 2 ; мВт: 825,97) является наиболее популярным белком пятна. Это представляет собой анионный краситель, который неспецифически связывается с белками. Структура С преимущественно неполярная, и она, как правило , используется в метанольном растворе , подкисленный уксусной кислотой. Белки в геле фиксируются с помощью уксусной кислоты и одновременно окрашивали. Избыток краситель включен в гель может быть удален путем депигментации с тем же раствором без красителя. Белки обнаруживаются в виде синих полос на чистом фоне. В ДСН также анионные, это может помешать процессу окрашивания. Таким образом, большой объем окрашивающего раствора рекомендуется, по крайней мере , в десять раз превышает объем геля.
Этидий бромид (EtBr) является популярным пятном нуклеиновой кислоты. EtBr позволяет легко визуализировать ДНК или РНК на геле , как EtBr флуоресцирует оранжевый цвет под ультрафиолетовым светом. Этидий бромид связывает цепь нуклеиновой кислот посредством процесса интеркаляции. Хотя этидий бромид является популярным пятном, важно проявлять осторожность при использовании EtBr , как это известно канцероген . Из — за этот факт, многие исследователи предпочитают использовать пятно , такие как SYBR Green и SYBR Safe , которые являются более безопасными альтернативами EtBr. EtBr используется просто добавляя его к смеси геля. После того , как гель запуска, гель можно просмотреть с помощью использования системы фото-документации.
Окрашивание серебра используются , когда более чувствительный метод обнаружения необходимо, как классические окраски кумасся бриллиантового синима обычно может обнаружить полосу белка 50 нг, Окрашивание серебра повышает чувствительность обычно в 10-100 раз больше. Это основано на химии фотографических развития. Белки прикреплены к гелю с разбавленным раствором метанола, затем инкубировали с кислотным раствором нитрата серебра. Ионы серебра восстанавливают до их металлической формы с помощью формальдегида при щелочном рН. Кислотный раствор, такие как уксусная кислота останавливает развитие. Окрашивание серебра было введено Керением и Gallyas в качестве чувствительных процедур для обнаружения следовых количеств белков в геле . Методика была распространена на изучение других биологических макромолекул , которые были разделены в различном опоре. Многие переменные могут влиять на цвет интенсивность и каждый белок имеет свои особенности окраски; чистая посуда, чистые реагенты и вода высокой чистоты являются ключевыми моментами к успешному окрашиванию. Окрашивание серебра было разработано в 14 — м века для окрашивания поверхности стекла. Он широко используется для этой цели , так как 16 — го века. Цвет производства ранних серебряных пятен колебались от светло — желтого и оранжевого-красного цвета. Камилло Гольджи усовершенствовал окрашивание серебра для изучения нервной системы . Метод Гольджи пятно ограниченного количества клеток случайным образом во всех их полноте.
Авторадиография, также используется для электрофореза полосы белка после обнаружения геля, использует радиоактивные изотопы, чтобы маркировать белки, которые затем обнаруженные с помощью рентгеновской пленки.
Вестерн — блоттинг представляет собой процесс , с помощью которого белки , отделенные в геле акриламида электрофоретически переносили на стабильную, манипулируемо мембраны , такие как нитроцеллюлоза , нейлон , или PVDF мембрану. В этом случае можно применить иммунохимические методы для визуализации переданных белков, а также точно определить относительное увеличение или сокращение белка , представляющего интереса.
источник
Содержимое (Table of Contents)
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Электрофорез ОФС.1.2.1.0023.15
в полиакриламидном геле Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также в зависимости от конфигурации молекул. Изменяя концентрацию полимера, можно получать гели с широким диапазоном размеров пор, позволяющих проводить разделение белков и пептидов с молекулярными массами от 2 до 300 тыс. кДа. Можно также изменять электрический заряд макромолекул (путем вариации рН буферного раствора) и их конформацию за счет введения в буферный раствор денатурирующих агентов или детергентов.
Протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима с целью исключения изменений вязкости, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов.
Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними, причем скорость миграции наиболее подвижных макромолекул пробы должна быть несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда фронт красителя достигает противоположной границы геля, электрофорез прекращают.
Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и выдерживают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты фиксируются в том самом месте, где закончилась их миграция. После фиксации или одновременно с ней проводят окрашивание зон путем выдерживания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.
Вместо окрашивания или наряду с ним могут использоваться радиоактивные метки и приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.
Гель полиакриламида имеет ряд преимуществ, определяющих его широкое использование. Он прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей, и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос.
Разделяющие свойства полиакриламидных гелей (ПААГ) определяются трехмерной сетью волокон и пор, которая сформирована за счет бифункциональных бисакриламидных связей между смежными полиакриламидными цепями. Полимеризация катализируется системой, производящей свободные радикалы, составленной из аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина.
С увеличением концентрации акриламида в геле эффективный размер пор уменьшается. Эффективный размер пор геля определяет его разделяющие свойства, то есть сопротивление геля к перемещению макромолекул. Существуют пределы концентраций акриламида, которые могут использоваться. При высоких концентрациях акриламида гели становятся более ломкими и трудны в обращении. С уменьшением размера пор геля уменьшается скорость перемещения белка через гель. Регулируя размер пор геля путем изменения концентрации акриламида, можно оптимизировать разрешающую способность метода для конкретного анализируемого образца. Таким образом, физическое состояние ПААГ характеризуется по составу акриламида и бисакриламида. Обычно используются гели, в которых общая концентрация мономера и сшивающего агента находится в диапазоне от 3 до 30 %, а количество сшивающего агента обычно составляет от одной десятой до одной двадцатой от количества мономера. При этом содержание сшивающего агента тем меньше, чем выше общая концентрация геля.
Электрофорез в полиакриламидных гелях с использованием натрия додецилсульфата (SDS) – наиболее распространенный способ электрофореза, используемый для оценки подлинности и чистоты белковых продуктов. Денатурированные под воздействием высокой температуры полипептиды, связываясь с анионным детергентом SDS, становятся отрицательно заряженными и приобретают конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы независимо от типа белка. Поскольку количество связанного SDS почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от последовательности аминокислот в полипептиде, SDS-полипептидные комплексы мигрируют через полиакриламидные гели с подвижностью, прямо пропорциональной молекулярной массе полипептида.
Молекулярная масса белка может быть оценена по его относительной подвижности на прокалиброванном геле, и обнаружение отдельной полосы в таком геле является критерием чистоты.
Однако, наличие у полипептида радикалов типа N- или O-связанных гликозидов оказывает существенное влияние на оценку молекулярной массы белка, поскольку SDS не связывается с углеводной частью молекулы так же, как с полипептидной. Таким образом, пропорциональность отношения «заряд к массе» не выдерживается и электрофоретическая подвижность белков, подвергшихся посттрансляционным модификациям, не является истинным отражением молекулярной массы полипептидной цепи.
Трехмерная структура белков часто поддерживается за счет дисульфидных связей. Цель анализа SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить эту структуру путем расщепления дисульфидных связей. Денатурация и дезагрегация белков заключается в обработке их 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (DTT), в результате которой происходит разрыв S-S связей, разворачивание полипептидной цепи и последующее связывание с SDS. В этих условиях молекулярная масса полипептидных субъединиц может быть рассчитана методом линейной регрессии при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.
Без обработки восстанавливающими агентами типа 2-меркаптоэтанола или DTT дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Невосстановленные белки не могут полностью насыщаться SDS и, следовательно, не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Это делает определение молекулярных масс этих молекул методом SDS-ПААГ менее стандартизованным, чем исследование полностью денатурированных полипептидов. Однако, выявление одной полосы в таком геле (т.е. отсутствие любых компонентов, отличных от основного компонента) является показателем чистоты белка.
Электрофорез белков в полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом (SDS-PAGE), как правило, проводится в неоднородной буферной системе, которая описывается ниже.
Электрофорез в геле с неоднородной буферной системой (диск—электрофорез)
Метод диск-электрофореза, благодаря своей высокой разрешающей способности, рекомендуется для характеристики смесей белков и для обнаружения примесей, которые могут иметь подвижность, близкую к подвижности главного компонента.
Метод подразумевает использование прерывистой системы, состоящей из двух отличных гелей: разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего) геля. Эти два геля имеют различную пористость (верхний – крупнопористый, нижний – мелкопористый). Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. Пористость, длина и тип буфера для нижнего геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза.
Отличительной особенностью данного вида электрофореза является обязательное использование в составе электродного буферного раствора подвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки; например, применение иона Cl — для щелочных буферных растворов или иона K + – для кислых. В этом буферном растворе подвижность иона, мигрирующего в том же направлении, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для этого удобно использовать цвиттерионы: например, простые аминокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки лежат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97).
Под действием электрического поля ионы глицина, входящие в состав электродного буферного раствора, следуют за белками в концентрирующий гель. Область перемещающихся границ быстро формируется под действием высоко подвижных хлорид-ионов во фронте и относительно медленных замыкающих ионов глицина. Хлорид-ион из-за его небольшого размера мигрирует быстрее, чем любой из белков, присутствующих в образце. Величина рH образца и концентрирующих слоев выбирается так, чтобы быть приблизительно на 3 единицы ниже, чем верхнее значение pKa глицина. Поэтому, на пересечении этих слоев только около 0,1% глициновых молекул имеют отрицательный заряд. Таким образом, быстродвижущиеся хлорид-ионы постепенно замещаются ионами глицина, которые при рН 6,8 в концентрирующем геле нейтрализуются и перестают участвовать в проведении тока. Сопротивление верхней части концентрирующего геля резко возрастает, а вместе с ним возрастает и напряженность поля. Локализованные зоны высоковольтового градиента между передним и задним ионными фронтами вызывают относительно высокую скорость миграции белков в концентрирующем геле, которая не ограничивается благодаря крупнопористой структуре этого геля.
На границе концентрирующего и разделяющего гелей белки достигают высокоплотных слоев геля и замедляются из-за уменьшающегося размера пор разделяющего геля. Более высокое значение pH, с которым фронт электродного буферного раствора встречается в разделяющем геле, также заставляет глицинат мигрировать быстрее, и напряженность поля падает, что также снижает скорость движения белков. Таким образом, происходит концентрирование пробы и все компоненты образца, независимо от первоначальной высоты столбика пробы в лунке, входят в нижний гель практически одновременно в виде узкой зоны с высокой концентрацией белка.
В мелкопористом разделяющем геле начинается процесс медленной миграции белков и их фракционирования в зависимости от молекулярных масс, а то обстоятельство, что процесс разделения начинается с узкой исходной зоны, обеспечивает высокую разрешающую способность системы вцелом.
Прибор для электрофореза состоит из:
1) источника постоянного тока с регулируемым напряжением и со стабилизатором напряжения;
2) камеры для электрофореза, служащей для размещения пластинки или трубки геля и поддержания постоянных условий проведения анализа. Камера обычно имеет прямоугольную форму, изготовлена из стекла или твердой пластмассы с двумя изолированными буферными резервуарами (анодным и катодным), содержащими раствор электролита. В каждый резервуар погружен электрод (например, платиновый), подключенный к соответствующему полюсу источника тока. Должен поддерживаться одинаковый уровень электролитов в резервуарах, чтобы предотвратить поток жидкости и гидростатическое давление на гель. Камера для электрофореза оснащена крышкой, которая предотвращает испарение растворителей и обеспечивает равномерно насыщенную влагой атмосферу во время всего процесса. Предпочтительно использование предохранителя для отключения электропитания, когда крышка камеры снята. Если мощность тока, приложенного к электрофоретической пластинке, превышает 10 Вт, то рекомендуется применять охлаждение камеры.
3) устройства для заливки геля, представляющего собой стеклянную трубку, стеклянную пластину или пару прямоугольных пластин (ячейку), служащих для формирования поддерживающей среды, в которой непосредственно проводится процесс электрофоретического разделения. Пластины могут быть расположены в камере вертикально или горизонтально (вариант горизонтального электрофореза обычно применяется для агарозных гелей) и должны быть погружены или иметь контакт посредством фитилей с катодным и анодным изолированными буферными резервуарами, содержащими раствор электролита. Преимуществом пластин для проведения процесса является возможность сравнения образцов в одной общей ячейке геля, что более информативно по сравнению с набором гелей из ряда трубок. Преимущество горизонтальных пластин по сравнению с вертикальными заключается в отсутствии проблемы герметизации швов, а недостаток – в большой поверхности контакта с воздухом и, соответственно, риске испарения жидкости.
Сборку прибора и его очистку после использования проводят в соответствии с инструкцией производителя.
Перед заливкой геля основание и боковые стороны ячейки закрывают подходящими прокладками, толщина которых определяет толщину рабочего геля (при этом после полимеризации геля прокладку в основании убирают). Ячейку заполняют раствором мономера с поперечно-сшивающим агентом и катализатором. Растворы должны быть дегазированы перед полимеризацией и гели должны использоваться свежеприготовленными. Заливку растворов проводят таким образом, чтобы исключить попадание внутрь ячейки пузырьков воздуха.
Гребенку, имеющую зубцы соответствующего размера (в зависимости от объемов наносимого образца), устанавливают в верхнюю часть ячейки на разделяющий гель и оставляют там до окончания полимеризации геля. Формирование геля обычно занимает не менее 30 мин и может считаться законченным, когда между гелем и водным слоем появляется четкая граница. После удаления гребенки из геля, прошедшего полимеризацию, остается ряд лунок.
Заполняют нижний и верхний резервуары камеры предписанным электродным буферным раствором. Готовят испытуемый и стандартный растворы, содержащие краситель и сахарозу или другой плотный и вязкий растворитель. Наносят образцы шприцем или микропипеткой в основания лунок, сразу включают электрический ток и начинают электрофорез, соблюдая предписанные условия (температуру и величину напряжения).
После окончания процесса (когда краситель достигает нижней границы пластины) ток выключают, пластину удаляют из камеры, зоны фиксируют, окрашивают и при необходимости пластину высушивают.
Подготовка полиакриламидного геля для вертикального электрофореза с SDS в неоднородной буферной системе
Сначала готовят и заливают в подготовленную ячейку нижний разделяющий гель, а затем сверху наслаивают концентрирующий гель.
В конической колбе готовят рассчитанное в зависимости от объема ячейки количество раствора для разделяющего геля, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в Таблице 1. Смешивают компоненты в указанном порядке. В тех случаях, где требуется, перед добавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (TEMED) раствор фильтруют, и, если необходимо, дегазируют раствор через мембрану из ацетата целлюлозы (с диаметром пор
0,45 мкм) под вакуумом при перемешивании. Добавляют соответствующие количества раствора аммония персульфата и TEMED как указано в табл. 1, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки. Оставляют достаточное место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя суженную стеклянную пипетку, тщательно наслаивают на гель сверху воду или изобутанол. Оставляют гель в вертикальном положении при комнатной температуре до завершения полимеризации.
После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.
В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл.2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 5 мл | 10 мл | 15 мл | 20 мл | 25 мл | 30 мл | 40 мл | 50 мл | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 4% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 2,6 | 5,3 | 7,9 | 10,6 | 13,2 | 15,9 | 21,2 | 26,6 |
| Раствор акриламида 1) | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | 8,0 | 10,0 |
| 1,5М Трис | ||||||||
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 1 мл | 2 мл | 3 мл | 4 мл | 5 мл | 6 мл | 8 мл | 10 мл | |
| Вода очищенная | 0,68 | 1,4 | 2,1 | 2,7 | 3,4 | 4,1 | 5,5 | 6,8 |
| Раствор акриламида 1) | 0,17 | 0,33 | 0,5 | 0,67 | 0,83 | 1,0 | 1,3 | 1,7 |
| 1,0М Трис | ||||||||
(рН 6,8) 6)
1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1)
2) 1,5М Трис (рН 8,8): 1,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 8,8
3) 100 г/л SDS: раствор натрия додецилсульфата 100 г/л
4) 100 г/л APS: раствор аммония персульфата 100 г/л. Аммония персульфат является источником свободных радикалов, которые управляют полимеризацией акриламида и бисакриламида. Таким образом, раствор аммония персульфата должен добавляться медленно.
5) TEMED: тетраметилэтилендиамин.
6) 1,0М Трис (рН 6,8): 1 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 6,8
Гель со вставленной гребенкой оставляют в вертикальном положении при комнатной температуре до окончания полимеризации.
Если в фармакопейной статье нет других указаний, то определение молекулярных масс проводят при нагрузке на лунку 10 мкг общего белка, а определение чистоты – при нагрузке 40 мкг при окрашивании Кумасси бриллиантовым R250, а при окрашивании нитратом серебра достаточно 2–5 мкг белка на лунку.
Толщина гребенки выбирается точно в соответствии с толщиной используемых прокладок, а размер зубцов – в соответствии с предполагаемым объемом образцов. Необходимый и достаточный объем формируемой лунки определяется как произведение длины, ширины и высоты (в микрометрах) одного зубца гребенки: V = L ∙ D ∙ H.
Объем наносимого образца вычисляют следующим образом:
где: k – коэффициент разбавления пробы буферным раствором для образца;
Х – требуемое для нанесения на гель количество белка в зависимости от целей анализа, в мкг;
С – концентрация общего белка, определяемая по методу Лоури, в мкг/мл.
После окончания полимеризации аккуратно удаляют гребенку, немедленно ополаскивают лунку водой, чтобы удалить любые остатки неполимеризованного акриламида. Если необходимо, выправляют зубцы концентрирующего геля при помощи тупой подкожной иглы, насаженной на шприц.
Устанавливают гель в прибор для электрофореза согласно инструкциям изготовителя оборудования. Добавляют электродный буферный раствор в верхнюю и нижнюю буферные емкости. Обычно, если нет других указаний в фармакопейной статье, в качестве электродного буферного раствора используется трис-глициновый буферный раствор с рН 8,3-8,4.
Удаляют любые пузыри, которые могут появиться у основания геля между стеклянными пластинами. Не следует включать электрический ток до внесения образцов, так как это уничтожит неоднородность буферных систем.
Готовят испытуемый раствор и раствор сравнения в рекомендованном буферном растворе для образцов в соотношении, указанном в фармакопейной статье или нормативной документации.
Обычно для обеспечения полной денатурации образец в смеси с буферным раствором подвергают дополнительно температурной обработке, режим которой должен быть указан в фармакопейной статье или нормативной документации.
Наносят соответствующие объемы каждого из растворов в лунки концентрирующего геля. Начинают электрофорез, используя условия, рекомендуемые изготовителем оборудования.
Изготовители оборудования для SDS-ПААГ могут обеспечивать применение гелей различной площади и толщины. Соответственно продолжительность электрофореза и сила тока (или напряжение) могут быть изменены, как описано изготовителем прибора, чтобы достичь оптимального разделения, что проверяют по скорости перемещения фронта индикатора в разделяющем геле.
Когда индикатор достигает основания геля, электрофорез останавливают. Удаляют ячейку с гелем из прибора и отделяют стеклянные пластины. Удаляют прокладки, отрезают и удаляют концентрирующий гель и немедленно проводят процедуру окрашивания. Для того, чтобы можно было выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель рекомендуется обрезать не полностью, оставляя 2–3 мм.
Так называемые, «готовые к использованию» коммерческие гели и наборы реактивов к ним могут быть применены при условии, что они дают результаты, отвечающие валидационным критериям, приведенным ниже в разделе «Оценка пригодности системы».
Окрашивание Кумасси бриллиантовым R250 – наиболее распространенный метод окрашивания белков с пределом обнаружения порядка от 1 до 10 мкг белка в полосе. Окрашивание нитратом серебра – более чувствительный метод окрашивания белков в гелях, позволяющий выявлять до 1 нг белка.
Для селективного окрашивания гликозилированных белков или липопротеидов иногда применяют другие красители или их смеси, о чем должно быть сделано дополнительное указание в фармакопейной статье или нормативной документации.
Все процедуры окрашивания геля проводят, как правило, при комнатной температуре и при слабом перемешивании в любом удобном контейнере. При окрашивании геля следует использовать одноразовые перчатки, иначе на геле могут быть прокрашены отпечатки пальцев.
Погружают гель в большой избыток красящего раствора Кумасси раствора и выдерживают, по крайней мере, 1 ч. Поскольку кислотно-спиртовой состав окрашивающего раствора не позволяет полностью фиксировать белки на геле, это может приводить к потерям некоторых низкомолекулярных белков во время окрашивания и обесцвечивания тонких гелей. Полная фиксация возможна при выдерживании геля в 10 % растворе трихлоруксусной кислоты в течение 1 ч перед погружением в окрашивающий Кумасси раствор.
Для ускорения процедуры окрашивания допускается подогрев геля в окрашивающем растворе в микроволновой печи. Режим подогрева должен быть описан в фармакопейной статье или нормативной документации. Затем окрашивающий раствор удаляют и гель промывают водой.
Обесцвечивают гель избытком обесцвечивающего раствора. Заменяют порции обесцвечивающего раствора несколько раз до тех пор, пока окрашенные полосы белка не станут ясно различимы на прозрачном фоне. Чем более полно обесцвечен гель, тем меньшие количества белка могут быть обнаружены этим методом. Обесцвечивание может быть ускорено при добавлении в обесцвечивающий раствор нескольких граммов анионобменной смолы или маленького кусочка пористого материала.
После обесцвечивания гель промывают водой и либо высушивают, либо оставляют в воде для хранения при температуре от 2 до 8 °С.
Погружают гель в большой избыток фиксирующего раствора и выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий раствор сливают, добавляют новую порцию того же раствора и инкубируют, по крайней мере 1 ч или оставляют на ночь. Сливают фиксирующий раствор и промывают гель в большом избытке воды в течение 1 ч. После этого пропитывают гель в течение 15 мин в 1 % растворе глутарового альдегида. Промывают гель дважды по 15 мин большим количеством воды. Выдерживают гель в темноте в свежеприготовленном 2 % растворе серебра нитрата в течение 15 мин. Промывают гель три раза по 5 мин в большом количестве воды. Погружают гель приблизительно на 1 мин в проявляющий раствор, пока не будет достигнуто удовлетворительное окрашивание. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в треке с минимальным количеством препарата (например, 0,001 мкг). Останавливают развитие окраски погружением в стоп-раствор на 15 мин. Ополаскивают гель водой.
Целесообразно использовать готовые наборы реактивов для окрашивания гелей серебра нитратом.
В зависимости от используемого метода окрашивания подготовку геля к высушиванию проводят различными способами:
– при окраске Кумасси после процедуры обесцвечивания гель выдерживают в смеси 10,0 г глицерина и 92 мл воды очищенной не менее 2 ч (возможна инкубация «на ночь»);
– при окраске нитратом серебра гель после заключительной процедуры ополаскивания выдерживают в течение 5 мин в смеси 2,0 г глицерина и 98 мл воды очищенной.
Погружают два листа пористой целлюлозной пленки в воду и выдерживают в течение 5–10 мин. Растягивают один из листов на рамке для высушивания. Аккуратно помещают пропитанный в глицериновом растворе гель на натянутую целлюлозную пленку. Удаляют все случайно попавшие воздушные пузыри, и заливают вокруг граней геля несколько миллилитров воды. Помещают второй лист пленки сверху и снова удаляют все воздушные пузыри. Заканчивают сборку рамки для сушки геля и помещают ее в сушильный шкаф или оставляют при комнатной температуре до полного высыхания.
Молекулярные массы белков определяют по сравнению их подвижностей с подвижностью нескольких белков-маркеров известной молекулярной массы. Готовые смеси белков с точно известными молекулярными массами (маркеры) для калибрования гелей предлагаются производителями материалов и оборудования для электрофореза в различных диапазонах молекулярных масс. Концентрированные исходные растворы полипептидов известной молекулярной массы готовят в соответствующем буферном растворе для образцов и наносят на гель одновременно с образцом испытуемого белка.
Сразу после того, как электрофорез завершен, следует отметить положение полосы красителя бромфенолового синего, которая соответствует электрофоретическому ионному фронту. Это может быть сделано при помощи меток-надрезов в геле или путем прокола геля в зоне окрашенного фронта иглой, предварительно обмакнутой в черную тушь или другой подходящий контрастный краситель.
После окрашивания геля измеряют расстояния пробега для каждой полосы белка (маркеров и испытуемого образца) от вершины разделяющего геля. Вычисляют отношение расстояния пробега каждого белка к расстоянию пробега фронта красителя. Нормализованные расстояния пробега, вычисленные таким образом, называются относительными подвижностями белков (относительно фронта красителя) и обозначаются как Rf.
где: R – расстояние пробега белка;
RS – расстояние пробега красителя
Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс стандартов белка (Мr) от значения Rf. Неизвестные молекулярные массы могут быть оценены методом линейной регрессии или интерполяцией кривых зависимости logMr от Rf в том случае, если значения, полученные для испытуемых образцов, находятся в линейной части графика.
В тех случаях, когда в фармакопейной статье указан предел примесей, то перед анализом должен быть приготовлен раствор сравнения, соответствующий этому уровню примеси, путем разбавления испытуемого раствора. Например, в случае 5 % предела, раствор сравнения должен быть приготовлен разведением испытуемого раствора в соотношении 1:20. При этом примесь (полоса, отличная от главной полосы) на электрофореграмме с испытуемым препаратом не должны быть интенсивнее, чем полоса, полученная с раствором сравнения. При наличии нескольких полос примесей должно быть предусмотрено требованию к содержанию каждой из них и к содержанию суммы примесей.
Приемлемым условием определения примесей может считаться метод количественной нормализации с использованием денситометрического интегрирования. В этом случае предварительно должна быть показана линейность отклика прибора.
Результаты анализа считаются достоверными только в том случае, если:
- белки маркера молекулярных масс распределены приблизительно на 80 % длины геля и охватывают весь требуемый диапазон разделения (например, диапазон молекулярных масс продукта и его димера или продукта и родственных примесей);
- зависимость логарифма молекулярной массы белков-маркеров и Rf – линейна в необходимом диапазоне.
Дополнительные требования приемлемости результатов анализа должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
1) Приготовление 30% раствора акриламида/бисакриламида. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 29,2 г акриламида и 0,8 г N,N’-метиленбисакриламида, растворяют в воде очищенной при перемешивании, доводят объем раствора водой до 100 мл и вновь перемешивают (при необходимости раствор фильтруют, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации). Раствор хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
2) Приготовление раствора натрия додецилсульфата. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде очищенной при аккуратном перемешивании, избегая вспенивания, доводят объем раствора до 100 мл и вновь перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре.
3) Приготовление раствора аммония персульфата. Растворяют 100,0 мг аммония персульфата в 1,0 мл воды очищенной. Раствор используют свежеприготовленным.
4) Приготовление 1,5М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 8,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 90,8 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 8,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
5) Приготовление 1,0 М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 60,6 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 6,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
6) Приготовление электродного буферного раствора (10×) (рН 8,3). В мерный стакан, вместимостью 1000 мл помещают 30,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 144,0 г глицина и 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Фильтруют и измеряют рН раствора, который должен быть 8,3 — 8,4. Доводить рН раствора кислотой или щелочью до необходимого значения не допускается.
Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.
Непосредственно перед анализом 1 часть приготовленного раствора смешивают с 9 частями воды очищенной.
7) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанавливающих условиях с 2-меркаптоэтанолом. В химическом стакане смешивают 4,7 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,4 мл 2-меркаптоэтанола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
8) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанвливающих условиях с дитиотреитолом. В химическом стакане тщательно перемешивают 5,0 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,06 г 1,4-дитиотреитола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор используют свежеприготовленным.
9) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в невосстанвливающих условиях. В химическом стакане тщательно смешивают 5,1 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 3 мес.
10) Приготовление красящего раствора Кумасси. Раствор готовят по одному из способов приготовления (№ 1 или № 2):
Раствор № 1. Растворяют 0,3 г Кумасси бриллиантового R250 в смеси 100 мл спирта метилового или этилового и 100 мл воды очищенной. Перемешивают до полного растворения (в течение 1 ч). Добавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 250 мл и перемешивают. Хранят окрашивающий раствор в темной бутыли при комнатной температуре. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.
Раствор № 2. 1,0 г Кумасси ярко-голубого R-250 помещают в химический стакан, доводят до объема 250,0 мл этиловым спиртом, перемешивают не менее 3,5 часов до полного растворения красителя, добавляют 100,0 мл кислоты ледяной уксусной и доводят объем деионизованной водой до 1000,0 мл. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.
11) Приготовление обесцвечивающего раствора. К 400 мл спирта метилового или этилового добавляют 100 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора до 1000 мл и перемешивают.
12) Приготовление фиксирующего раствора. К 250 мл спирта метилового или этилового добавляют 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.
13) Приготовление 1 % раствора глутарового альдегида. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 4 мл 25 % глутарового альдегида или 2 мл 50 % глутарового альдегида, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают.
14) Приготовление раствора серебра нитрата. Смешивают 2,75 мл 25 % раствора аммиака и 40 мл 1 М раствора натрия гидроксида, прибавляют по каплям при постоянном перемешивании 8 мл 20 % раствора серебра нитрата, доводят объем раствора водой очищенной до 200 мл и перемешивают.
15) Приготовление 20 % раствора серебра нитрата. Растворяют в воде очищенной 2,0 г (точная навеска) серебра нитрата, доводят объем раствора водой до 10 мл и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
16) Приготовление проявляющего раствора. Смешивают 2,5 мл 2,0 % раствора лимонной кислоты и 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.
17) Приготовление стоп-раствора. К 50 мл воды прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 100 мл и перемешивают.
В случае использования других реактивов и растворов они должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
источник