Электрофорез в присутствии дсн

Движение частиц в жидкой фазе под действием электрического поля называется, электрофорезом. Скорость движения макромолекул в электрическом поле можно использовать для определения молекулярной массы белков, для идентификации макромолекул по заряду, по форме, для определения изменений в первичной структуре, а также для количественного разделения различных видов макромолекул.

Рассмотрим коротко теоретические основы электрофореза. На макромолекулы с суммарным зарядом q в электрическом поле с напряженностью Е действует электрическая сила

Под действием этой силы происходит ускоренное движение макромолекул. В результате такого движения возникает сопротивление вязкой среды с силой трения Fc = fv, где v – скорость движения макромолекул. Через определенное время, когда силы уравновешиваются (Fэ = Fc), наступает стационарное состояние, и макромолекулы движутся с постоянной скоростью v . Тогда

Отношение скорости v к напряженности электрического поля Е называется электрофоретической подвижностью u. Из (3.45)

Электрофоретическая подвижность измеряется в м 2 •В -1 •с -1 . Для сферических макромолекул f = 6πηr, тогда

где η– вязкость среды; г–радиус макромолекулы.

Как видно, коэффициент электрофоретической подвижности, дает информацию о радиусе макромолекулы, соответственно, и о ее размерах. Однако среда, в которой происходит движение заряженных частиц, является не изолятором, а электролитом, состоящим из различных ионов. Это обстоятельство вносит большие затруднения для теоретического описания движения заряженной частицы в электрическом поле. Макромолекула в растворе электролита окружена ионной оболочкой, экранирующей ее от приложенного электрического поля. Ионная оболочка частично нарушается как действием электрического поля, так и при движении частицы. Существующая теория электрофореза пока не в состоянии точно описать эти ( ряд других) процессов, и поэтому данные электрофореза не могут трактоваться с точки зрения информации о макромолекулярной структуре. Но, тем не менее, различные варианты электрофореза широко применяются для аналитических и препаративных целей. Методы препаративного электрофореза разработаны для получения относительно больших количеств чистого (гомогенного) материала. Аналитический электрофорез используется для контроля чистоты препаратов, определения количества компонентов в смеси, оценки их соотношения и т. д. На практике оптимальные условия для электрофореза тех или иных препаратов подбираются в большинстве случаев эмпирическим путем.

Для разделения макромолекул электрофорезом используют специальные приборы. Существуют три основных типа электрофореза: с подвижной границей, зональный и непрерывный.

При электрофорезе с подвижной границей макромолекулы присутствуют во всем обьеме раствора и положение молекул с течением времени можно определять оптическими методами.

В зональном электрофорезе раствор препарата наносят в виде пятна или полосы, и частицы мигрируют через растворитель. Растворитель обычно содержится в гомогенной инертной среде ( бумага, гель).

В непрерывном электрофорезе образец также наносят в виде зоны, но раствор наносится не однократно, а прибавляется постоянно по мере проведения электрофореза.

Наибольшее применение на практике нашли различные модификации зонального электрофореза с различными носителями: на бумаге, на ацетате целлюлозы, на геле. Два остальных типа электрофореза используются сравнительно редко. Рассмотрим более подробно один из методов зонального электрофореза – гель-электрофорез, нашедший наиболее широкое применение в исследовании макромолекул.

Лучшие результаты при электрофоретическом разделении белков и нуклеиновых кислот достигаются при использовании в качестве носителя гелей из крахмала, полиакриламида, агарозы и комбинированных гелей из этих веществ. Качественное разделение макромолекул при использовании этих носителей достигается тем, что эффект электрофоретического разделения дополняется разделяющим действием гель-проникающей хромотаграфии (эффект «молекулярного сита»). Первоначально для гель-электрофореза применяли крахмальный гель, однако, в настоящее время его заменили полиакриламидные и агарозные гели. Полиакриламид оказался наиболее эффективным носителем для электрофореза белков и небольших молекул РНК, например т-РНК. Это связано с тем, что в полиакриламидном геле можно контролировать эффект молекулярного сита ( размер пор в геле ) с помощью изменения концентрации геля. Для нуклеиновых кислот, размер молекул которых больше размеров пор полиакриламида, используются агарозные или агарозно-полиакриламидные гели. Полиакриламидный гель получается при сшивании акриламида с метилен-бис-акриламидом. Такой гель готовят непосредственно перед экспериментом в контейнере ( стеклянная трубка, пластина) для проведения электрофореза (Рис. 9). После окончания электрофоретического разделения, зоны распределения макромолекул в геле обнаруживают путем окрашивания специфическими красителями и или другими способами. Например, для обнаружения белков используются красители амид черный, бромфеноловый синий, Кумасси бриллиантовый голубой. Если разделяются биологически активные молекулы, положение молекулы можно идентифицировать по измерению активности, например, по измерению ферментативной активности. Локализацию нуклеиновых кислот в гелях определяют после обработки флоуресцентными красителями (например, бромид этидия) или по радиоактивности разделенных фрагментов.

Рис.. 9. Устройство для электрофореза на горизонтальных пластинах геля ( Фрайфельдер, с.229)

1. Пластина геля; 2. охлаждающая подложка; 3. отсек для буферного раствора; 4. бумажный электрод между гелем и буфером; 5. циркуляционный термостат с охлаждающей жидкостью; 6. электроды; 7. источник электрического тока

Электрофорез в полиакриламидном геле проводят или в колонках (трубках) с гелем или на пластинах с гелем. Рассмотрим один из вариантов этого метода, наиболее широко используемых для разделения белков .

ДСН-гель-электрофорез. Для определения молекулярной массы белков используют электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле. Этот метод предложили в 1969 году Клаус Вебер и Мери Осборн.

До проведения электрофореза белок обрабатывают 1 % раствором додецилсульфата натрия (ДСН) с 0,1 М β-меркаптоэтанолом при нейтральном рН. В таком растворе большинство многоцепочечных белков связываются с ДСН и диссоциируют, дисульфидные связи разрываются, вторичная структура белка исчезает.

Додецилсульфат натрия совершенно одинаково связывается с молекулами различных белков: 1,4 кг ДСН связывается с 1 кг белка. Каждая молекула ДСН несет один отрицательный заряд и, таким образом, общая плотность заряда примерно одинаковая для разных белков. Таким образом, поверхностная шуба из молекул ДСН устраняет зарядовые различия, существующие в нативных белках. После обработки ДСН, полипептидная цепь представляет вытянутый цилиндр с диаметром 1,8 нм. Длина таких стержней коррелирует с молекулярной массой белков: чем длиннее цилиндр, тем больше молекулярная масса (рис. 1, а). Обработанные таким образом белки имеют одну и ту же форму и одинаковое отношение заряд/масса. Электрофоретическая подвижность таких молекул будет зависеть только от молекулярной массы вследствие движения в молекулярном сите.

В качестве носителя при электрофорезе используют полиакриламидный гель в концентрации от 5 до 15 %. Экспериментально установлена линейная связь между электрофоретической подвижностью и логарифмом молекулярной массы:

где а и b – постоянные величины, зависящие от свойств полиакриламидного геля.

Определение молекулярной массы исследуемого белка проводят по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой в идентичных условиях проводится электрофорез маркерных белков с известной молекулярной массой и строится зависимость u = f (lgM) (рис. 1, б). По значению электрофоретической подвижности на калибровочной кривой с высокой точностью (до 5 %) находят молекулярную массу исследуемого белка.

Кроме измерения молекулярной массы, ДСН-гель- электрофорез позволяет определить и идентифицировать субъединичное строение сложных белков, имеющих четвертичную структуру.

Изоэлектрическое фокусирование белков.

Белковые молекулы являются амфолитами, т.е. содержат положительно и отрицательно заряженные группировки. Для таких молекул характерна зависимость их заряда от рН . При низких значениях рН отрицательные заряженные группировки молекулы нейтрализуются ионами Н + и в целом она имеет положительный заряд. При высоких значениях рН такие молекулы заряжены отрицательно, т.к. положительно заряженные группировки молекулы нейтрализуются ионами гидроксила. Для каждого амфолита существует такое значение рН, при котором заряд молекулы равен нулю. Это значение рН называется изоэлектрической точкой рI молекулы. При электрофорезе в градиенте рН молекулы белков будут двигаться до тех пор, пока не достигнут области геля, где рН геля будет равен значению рI молекулы. В этой точке заряд молекулы будет равен нулю, т.е. она станет незаряженной и перестанет двигаться. В случае разгонки смеси белков, каждый белок остановится в той области градиента рН, которая соответствует значению изоэлектрической точки соответствующей молекулы (рис 11). Такой метод разделения белков в градиенте рН, основанный на различиях значений изоэлектрических точек, называется изоэлектрическим фокусированием. Для создания стабильного градиента рН в состав геля добавляют синтетические низкомолекулярные полиамфолиты (многозарядные молекулы с м.м. 300-600). Полиамфолиты представляют собой смесь полимеров алифатических амино- и карбоновых кислот, например, амфолины фирмы LKB. Меняя соотношение различных амфолитов, можно приготовить гель с соответствующим, для определенных белковых молекул, интервалом градиента рН. При приложении на гель электрического поля начинается движение полиамфолитов и через определенное время устанавливается градиент рН

Изоэлектрическое фокусирование по сравнению с электрофорезом характеризуется более высокой разрешающей способностью разделения и возможностью концентрации разделяемых фракций. В последние годы появились методы, комбинирующие оба способа разделения белковых молекул. На гелевых пластинах в одном направлении проводят разделение электрофорезом, в другом, перпендикулярном направлении – изоэлектрическим фокусированием. За счет такого двумерного разделения, разрешающая способность метода резко возрастает, что делает возможным разделение компонентов, которое нельзя осуществить другими методами.

Рис. 11. Принцип электрофоретического разделения заряженных молекул в градиенте рН ( метод изоэлектрического фокусирования ) . (Фрайфельдер,240с)

Дата добавления: 2014-01-11 ; Просмотров: 1464 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Электрофорез — метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных микрочастиц в жидкой среде под действием внешнего электрического поля.

Существует три различных электрофоретических метода. Под собственно электрофорезом обычно понимают зональный электрофорез (ЗЭ), два других называют методами изоэлектрофокусирования (ИЭФ)и изотахофореза (ИТФ).Электрофорез применяют главным образом для разделения веществ, молекулы которых различаются по электрофоретической подвижности, т. е. отношению скорости электрофореза (скорости перемещения заряженных частиц вещества) к напряженности электрического поля, которое зависит от свойств заряженных частиц окружающей их среды. Путем изменения внешних условий (например, рН среды, температуры, силы тока, состава и концентрации буферного раствора или носителя) создают подходящие условия для разделения. Вследствие того что при разделении на молекулы действуют только электростатические силы, электрофорез считают «мягким» методом и поэтому часто применяют для работы с лабильными веществами.

Электрофорез можно проводить в растворе, но из-за неизбежного выделения теплоты и возникающей в связи с этим тепловой конвекции процесс, как правило, проводят на носителе. Вследствие некоторых сопутствующих явлений (адсорбция, несоизмеримость размеров высокомолекулярных соединений и пор носителя) введение носителя ограничивает область применения метода. Однако свойства носителя иногда используют для повышения эффективности разделения: например, при электрофорезе в градиенте полиакриламидного геля фракционирование осуществляется не столько за счет различной электрофоретической подвижности веществ, сколько за счет различия в их молекулярных массах.

Зональный электрофорез (ЗЭ) — это метод разделения заряженных частиц в электрическом поле, основанный на том, что частицы с разными соотношениями заряд/масса мигрируют с различными скоростями. В зависимости от знака заряда молекулы вещества мигрируют в электрическом поле по направлению к аноду или катоду.

Результаты этого процесса регистрируются на электрофореграфе (по аналогии с хроматографией).

Ранее использовали один и тот же буфер в слое носителя электродных камерах, т. е. разделение вели в непрерывной буферной системе. В настоящее время этот прием еще применяют при электрофорезе на бумаге и пластинках. Приэлектрофорезе в прерывистой буферной системе (различные буферы в слое носите электродных камерах) быстро мигрирующие вещества образую более узкие зоны. Электрофорез в прерывистой буферной системе используют главным образом в гель-электрофорезе. ЗЭ обычно проводят на бумаге, пластинках и в гелях в водных буферных растворах.

При электрофорезе в электродных камерах происходит электролиз раствора и вследствие этого изменяется состав буфера. Поэтому электроды располагают так, чтобы они не касались носителя, а контакт между ними осуществлялся при помощи полосок фильтровальной бумаги. Электродная камера разделена на два отсека, которые соединяются дополнительным мостиком из фильтровальной бумаги. Подбирая соответствующий объем электродных камер или перекачивая буфер насосом от анода к катоду, поддерживают постоянными концентрацию и значение рН буфера в двухкамерной системе. Рекомендуется также проводить деполяризации электродов после каждого электрофоретического разделения.

Материалы-носители подразделяются на две группы:

первая — бумага, целлюлоза, ацетилированная целлюлоза, агароза и материалы для ТСХ(например, силикагель);

вторая — крахмал и полиакриламид.

Эффективность разделения зависит не только от суммарного заряда молекул анализируемых веществ, но и от размеров молекул. Определяющим параметром является соотношение заряд — масса.

Носители первой группы относительно инертны и слабо влияют на эффективность разделения. Материалы второй группы обладают пористой структурой, что существенно влияет на качество разделения. Поскольку размеры пор соизмеримы с размером макромолекул, то можно разделять вещества с одинаковыми суммарными зарядами, но с разными молекулярными массами (например, при ионообменной хроматографии).

Электрофорез на бумаге позволяет экстрагировать вещества из соответствующих зон или пятен и использовать для дальнейшей работы; обнаруживать вещества, используемые в бумажной хроматографии; проводить фракционирование в двух направлениях.

Для электрофореза на бумаге используют специальные сорта бумаги, характеризующиеся следующими свойствами: достаточной механической прочностью; удовлетворительным для удерживания достаточного количества электролита и образца.

Наряду с камерами погружного типа применяют камеры для электрофореза в тонком слое с охлаждаемыми пластинами, в которых лист бумаги помещают между двумя изолирующими пленками.

Электрофорез в тонком слое проводят на стеклянных пластинках, покрытых слоем носителя. По сравнению с полосками бумаги пластины более удобны в обращении. Электрофорез на бумаге и в тонком слое применяют для исследования фракций, полученных при колоночной хроматографии, ферментативных гидролизатов белков, метаболитов, а также для разделения аминов, аминокислот, пептидов и белков, нуклеотидов, фенолов, нафтолов, фенолкарбоновых кислот, красителей, неорганических соединений.

Гель- электрофорез. Вместо целлюлозы и силикагеля можно использовать мягкие гели. Ниже приведены основные рабочие стадии проведения электрофореза в слое геля: приготовление гелей и подготовка образца ® электрофоретическое разделение ® детектирование ® анализ результатов и оформление их в рабочем журнале. Из множества гелей на практике применяют только два — гели агарозы и полиакриламида. В зависимости от способа приготовления геля и типа буферной системы различают несколько вариантов метода:

· электрофорез в геле полиакриламида (ПААГ);

· диск-электрофорез (диск-ПААГ) в прерывистой буферной системе;

· электрофорез в геле полиакриламида в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ);

· электрофорез в градиенте пористого полиакриламидного геля.

Гель окрашивают красителем. Поскольку молекулы красителя заряжены, гель можно обесцвечивать электрофоретически при напряжении 50 В. В местах, не содержащих исследуемое вещество, гель обесцвечивается. Количественную оценку проводят спектрофотометрически при помощи сканирующего денситометра.

После усадки гелей в водном этаноле или ацетоне их высушивают между двумя листами целлофана в вакууме при слабом нагреве.

Гель-электрофорез применяют для разделения всех классов заряженных веществ, например белков, ферментных комплексов, вирусов, олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот; определения молекулярных масс биополимеров; анализа белков на микроуровне (антигенов при количественном иммуноэлектрофорезе).

При электрофорезе в свободном потоке электролит (буфер) перемещается в вертикальном направлении (перпендикулярно направлению электрического поля). Заряженные частицы под действием электрического поля мигрируют в горизонтальном направлении и одновременно увлекаются потоком буфера. В итоге разделенные вещества распределяются в потоке в соответствии с их электрофоретической подвижностью и элюируются из прибора в различных фракциях. Электрофорез в свободном потоке применяют для препаративного разделения заряженных частиц, в том числе коллоидных, субклеточных частиц и клеток.

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ). С помощью изоэлектрического фокусирования по изоэлектрическим точкам (ИЭТ) разделяют амфотерные вещества, в частности белки. Сущность метода заключается в том, что молекулы белков мигрируют под действием электрического поля в среде с линейным и стабильным градиентом рН до достижения области рН, соответствующей их ИЭТ.

Изоэлектрическое фокусирование отличается от зонального электрофореза тем, что разделение осуществляется не в буфере с постоянным значением рН, а в среде с линейным градиентом рН. Значение рН минимально вблизи анода, максимально — вблизи катода. Главное условие эффективного разделения белков — наличие стабильного градиента рН среды. В связи с тем что белки обладают амфотерными свойствами, необходимо, чтобы амфолиты – носители — вещества, с помощью которых формируется градиент рН, обладали высокой буферной емкостью. Амфолиты — носители представляют собой многокомпонентную смесь изомеров и гомологов алифатических полиаминополикарбоновых кислот, сульфокислот и фосфоновых кислот, изоэлектрические точки которых располагаются в широкой области значений рН.

ИЭФ применяют для аналитического разделения пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов и препаративного разделения белков; накопления следовых количеств веществ из больших объемов пробы; определения электрофоретической подвижности.

Необходимым условием проведения ИЭФ является наличие высокого напряжения при низкой ионной силе раствора. Однако именно в этих условиях усиливается электроосмос. Отрицательное воздействие на эффективность разделения веществ оказывают так же примеси солей, занесенные вместе с реактивами (гели для ИЭФ следует готовить из особо чистых реактивов). Для проведения ИЭФ более всего подходит полиакриламидный гель с низкими электроосмотическими свойствами. Продолжительность эксперимента зависит от напряженность поля и характера изменения рН- градиента.

Препаративное изоэлектрическое фокусирование проводят в вертикальных колонках (в градиенте плотности сахарозы, глицерина, этиленгликоля) или в слое инертного материала. В качестве таких материалов используют гранулированные гели (рН градиент формируют с помощью амфолитов).

источник

21. Электрофорез. Наиболее существенные открытия в развитии методов электрофореза. Теория электрофореза. Скорость и электрофоретическая подвижность. Типы электрофореза.

э-форез — движение заряженых частиц в растворителе под действием электромагнитного поля.

разделение молекул по массе, заряду, конфигурации

определение молекулярной массы, с использованием шкалы

выявление изменений в составе белков и нк

молекула, имеющая заряженные частицы, способна двигаться в электромагнитном поле.

белки бывают + или -, зависти от рН и изоэлектрической точки белка; нк всегда —

белки с разной изоэлектрической точкой в одинаковой рН будут двигаться с разной скоростью. метод позволяет разделять вва, различающиеся в рН до 0,02 ед

вокруг частицы в поле образуется двойной электрический слой, из за силы трения. (как бы диполь. +частица и -шлейф). у незаряженой частицы такого нет.

1. скорость частицы в заряженом поле напряженностью Е

2. электрофоретическая подвижность μ (скорость движения частицы при напряжении поля в 1В/см)

(см2*см(-1)* В(-1))

при постоянной вязкости среды и постоянном напряжении подвижность ионов пропорциональна отношению заряда к радиусу частицы

— параметры поля (напряжение, сила тока, сопротивление)

— характеристики буфера (рН, ионная состояние, температура)

— характеристики поддержания среды (структура и физхим свойства, адсорбция, электроосмос?)

1) по агрегатному состоянию среды: фронтальный (ж), зональный (на тв носителе)

2) по способу нанесения образца: с подвижной границей (в свободной среде?), зональный (на носителе), в свободном потоке (непрерывный)

3) по принципу фракционирования:

— по вел. заряда в постоянной рН

— изоэлектрофокусирование (по изоэлектрической точке)

— изотахофорез (по электрофоретической подвижности)

— э-форез на носителе (по мол. массе)

22. Фронтальный и зональный электрофорез: сравнительные особенности.

источник

Содержимое (Table of Contents)

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Электрофорез ОФС.1.2.1.0023.15

в полиакриламидном геле Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также в зависимости от конфигурации молекул. Изменяя концентрацию полимера, можно получать гели с широким диапазоном размеров пор, позволяющих проводить разделение белков и пептидов с молекулярными массами от 2 до 300 тыс. кДа. Можно также изменять электрический заряд макромолекул (путем вариации рН буферного раствора) и их конформацию за счет введения в буферный раствор денатурирующих агентов или детергентов.

Протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима с целью исключения изменений вязкости, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов.

Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними, причем скорость миграции наиболее подвижных макромолекул пробы должна быть несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда фронт красителя достигает противоположной границы геля, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и выдерживают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты фиксируются в том самом месте, где закончилась их миграция. После фиксации или одновременно с ней проводят окрашивание зон путем выдерживания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.

Вместо окрашивания или наряду с ним могут использоваться радиоактивные метки и приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.

Гель полиакриламида имеет ряд преимуществ, определяющих его широкое использование. Он прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей, и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос.

Разделяющие свойства полиакриламидных гелей (ПААГ) определяются трехмерной сетью волокон и пор, которая сформирована за счет бифункциональных бисакриламидных связей между смежными полиакриламидными цепями. Полимеризация катализируется системой, производящей свободные радикалы, составленной из аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина.

С увеличением концентрации акриламида в геле эффективный размер пор уменьшается. Эффективный размер пор геля определяет его разделяющие свойства, то есть сопротивление геля к перемещению макромолекул. Существуют пределы концентраций акриламида, которые могут использоваться. При высоких концентрациях акриламида гели становятся более ломкими и трудны в обращении. С уменьшением размера пор геля уменьшается скорость перемещения белка через гель. Регулируя размер пор геля путем изменения концентрации акриламида, можно оптимизировать разрешающую способность метода для конкретного анализируемого образца. Таким образом, физическое состояние ПААГ характеризуется по составу акриламида и бисакриламида. Обычно используются гели, в которых общая концентрация мономера и сшивающего агента находится в диапазоне от 3 до 30 %, а количество сшивающего агента обычно составляет от одной десятой до одной двадцатой от количества мономера. При этом содержание сшивающего агента тем меньше, чем выше общая концентрация геля.

Электрофорез в полиакриламидных гелях с использованием натрия додецилсульфата (SDS) – наиболее распространенный способ электрофореза, используемый для оценки подлинности и чистоты белковых продуктов. Денатурированные под воздействием высокой температуры полипептиды, связываясь с анионным детергентом SDS, становятся отрицательно заряженными и приобретают конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы независимо от типа белка. Поскольку количество связанного SDS почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от последовательности аминокислот в полипептиде, SDS-полипептидные комплексы мигрируют через полиакриламидные гели с подвижностью, прямо пропорциональной молекулярной массе полипептида.

Молекулярная масса белка может быть оценена по его относительной подвижности на прокалиброванном геле, и обнаружение отдельной полосы в таком геле является критерием чистоты.

Однако, наличие у полипептида радикалов типа N- или O-связанных гликозидов оказывает существенное влияние на оценку молекулярной массы белка, поскольку SDS не связывается с углеводной частью молекулы так же, как с полипептидной. Таким образом, пропорциональность отношения «заряд к массе» не выдерживается и электрофоретическая подвижность белков, подвергшихся посттрансляционным модификациям, не является истинным отражением молекулярной массы полипептидной цепи.

Трехмерная структура белков часто поддерживается за счет дисульфидных связей. Цель анализа SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить эту структуру путем расщепления дисульфидных связей. Денатурация и дезагрегация белков заключается в обработке их 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (DTT), в результате которой происходит разрыв S-S связей, разворачивание полипептидной цепи и последующее связывание с SDS. В этих условиях молекулярная масса полипептидных субъединиц может быть рассчитана методом линейной регрессии при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.

Без обработки восстанавливающими агентами типа 2-меркаптоэтанола или DTT дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Невосстановленные белки не могут полностью насыщаться SDS и, следовательно, не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Это делает определение молекулярных масс этих молекул методом SDS-ПААГ менее стандартизованным, чем исследование полностью денатурированных полипептидов. Однако, выявление одной полосы в таком геле (т.е. отсутствие любых компонентов, отличных от основного компонента) является показателем чистоты белка.

Электрофорез белков в полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом (SDS-PAGE), как правило, проводится в неоднородной буферной системе, которая описывается ниже.

Электрофорез в геле с неоднородной буферной системой (диск—электрофорез)

Метод диск-электрофореза, благодаря своей высокой разрешающей способности, рекомендуется для характеристики смесей белков и для обнаружения примесей, которые могут иметь подвижность, близкую к подвижности главного компонента.

Метод подразумевает использование прерывистой системы, состоящей из двух отличных гелей: разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего) геля. Эти два геля имеют различную пористость (верхний – крупнопористый, нижний – мелкопористый). Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. Пористость, длина и тип буфера для нижнего геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза.

Отличительной особенностью данного вида электрофореза является обязательное использование в составе электродного буферного раствора подвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки; например, применение иона Cl — для щелочных буферных растворов или иона K + – для кислых. В этом буферном растворе подвижность иона, мигрирующего в том же направлении, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для этого удобно использовать цвиттерионы: например, простые аминокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки лежат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97).

Под действием электрического поля ионы глицина, входящие в состав электродного буферного раствора, следуют за белками в концентрирующий гель. Область перемещающихся границ быстро формируется под действием высоко подвижных хлорид-ионов во фронте и относительно медленных замыкающих ионов глицина. Хлорид-ион из-за его небольшого размера мигрирует быстрее, чем любой из белков, присутствующих в образце. Величина рH образца и концентрирующих слоев выбирается так, чтобы быть приблизительно на 3 единицы ниже, чем верхнее значение pK_a глицина. Поэтому, на пересечении этих слоев только около 0,1% глициновых молекул имеют отрицательный заряд. Таким образом, быстродвижущиеся хлорид-ионы постепенно замещаются ионами глицина, которые при рН 6,8 в концентрирующем геле нейтрализуются и перестают участвовать в проведении тока. Сопротивление верхней части концентрирующего геля резко возрастает, а вместе с ним возрастает и напряженность поля. Локализованные зоны высоковольтового градиента между передним и задним ионными фронтами вызывают относительно высокую скорость миграции белков в концентрирующем геле, которая не ограничивается благодаря крупнопористой структуре этого геля.

На границе концентрирующего и разделяющего гелей белки достигают высокоплотных слоев геля и замедляются из-за уменьшающегося размера пор разделяющего геля. Более высокое значение pH, с которым фронт электродного буферного раствора встречается в разделяющем геле, также заставляет глицинат мигрировать быстрее, и напряженность поля падает, что также снижает скорость движения белков. Таким образом, происходит концентрирование пробы и все компоненты образца, независимо от первоначальной высоты столбика пробы в лунке, входят в нижний гель практически одновременно в виде узкой зоны с высокой концентрацией белка.

В мелкопористом разделяющем геле начинается процесс медленной миграции белков и их фракционирования в зависимости от молекулярных масс, а то обстоятельство, что процесс разделения начинается с узкой исходной зоны, обеспечивает высокую разрешающую способность системы вцелом.

Прибор для электрофореза состоит из:

1) источника постоянного тока с регулируемым напряжением и со стабилизатором напряжения;

2) камеры для электрофореза, служащей для размещения пластинки или трубки геля и поддержания постоянных условий проведения анализа. Камера обычно имеет прямоугольную форму, изготовлена из стекла или твердой пластмассы с двумя изолированными буферными резервуарами (анодным и катодным), содержащими раствор электролита. В каждый резервуар погружен электрод (например, платиновый), подключенный к соответствующему полюсу источника тока. Должен поддерживаться одинаковый уровень электролитов в резервуарах, чтобы предотвратить поток жидкости и гидростатическое давление на гель. Камера для электрофореза оснащена крышкой, которая предотвращает испарение растворителей и обеспечивает равномерно насыщенную влагой атмосферу во время всего процесса. Предпочтительно использование предохранителя для отключения электропитания, когда крышка камеры снята. Если мощность тока, приложенного к электрофоретической пластинке, превышает 10 Вт, то рекомендуется применять охлаждение камеры.

3) устройства для заливки геля, представляющего собой стеклянную трубку, стеклянную пластину или пару прямоугольных пластин (ячейку), служащих для формирования поддерживающей среды, в которой непосредственно проводится процесс электрофоретического разделения. Пластины могут быть расположены в камере вертикально или горизонтально (вариант горизонтального электрофореза обычно применяется для агарозных гелей) и должны быть погружены или иметь контакт посредством фитилей с катодным и анодным изолированными буферными резервуарами, содержащими раствор электролита. Преимуществом пластин для проведения процесса является возможность сравнения образцов в одной общей ячейке геля, что более информативно по сравнению с набором гелей из ряда трубок. Преимущество горизонтальных пластин по сравнению с вертикальными заключается в отсутствии проблемы герметизации швов, а недостаток – в большой поверхности контакта с воздухом и, соответственно, риске испарения жидкости.

Сборку прибора и его очистку после использования проводят в соответствии с инструкцией производителя.

Перед заливкой геля основание и боковые стороны ячейки закрывают подходящими прокладками, толщина которых определяет толщину рабочего геля (при этом после полимеризации геля прокладку в основании убирают). Ячейку заполняют раствором мономера с поперечно-сшивающим агентом и катализатором. Растворы должны быть дегазированы перед полимеризацией и гели должны использоваться свежеприготовленными. Заливку растворов проводят таким образом, чтобы исключить попадание внутрь ячейки пузырьков воздуха.

Гребенку, имеющую зубцы соответствующего размера (в зависимости от объемов наносимого образца), устанавливают в верхнюю часть ячейки на разделяющий гель и оставляют там до окончания полимеризации геля. Формирование геля обычно занимает не менее 30 мин и может считаться законченным, когда между гелем и водным слоем появляется четкая граница. После удаления гребенки из геля, прошедшего полимеризацию, остается ряд лунок.

Заполняют нижний и верхний резервуары камеры предписанным электродным буферным раствором. Готовят испытуемый и стандартный растворы, содержащие краситель и сахарозу или другой плотный и вязкий растворитель. Наносят образцы шприцем или микропипеткой в основания лунок, сразу включают электрический ток и начинают электрофорез, соблюдая предписанные условия (температуру и величину напряжения).

После окончания процесса (когда краситель достигает нижней границы пластины) ток выключают, пластину удаляют из камеры, зоны фиксируют, окрашивают и при необходимости пластину высушивают.

Подготовка полиакриламидного геля для вертикального электрофореза с SDS в неоднородной буферной системе

Сначала готовят и заливают в подготовленную ячейку нижний разделяющий гель, а затем сверху наслаивают концентрирующий гель.

В конической колбе готовят рассчитанное в зависимости от объема ячейки количество раствора для разделяющего геля, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в Таблице 1. Смешивают компоненты в указанном порядке. В тех случаях, где требуется, перед добавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (TEMED) раствор фильтруют, и, если необходимо, дегазируют раствор через мембрану из ацетата целлюлозы (с диаметром пор
0,45 мкм) под вакуумом при перемешивании. Добавляют соответствующие количества раствора аммония персульфата и TEMED как указано в табл. 1, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки. Оставляют достаточное место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя суженную стеклянную пипетку, тщательно наслаивают на гель сверху воду или изобутанол. Оставляют гель в вертикальном положении при комнатной температуре до завершения полимеризации.

После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.

В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл.2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04 8% акриламида Вода очищенная 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2 Раствор акриламида 1) 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03 10% акриламида Вода очищенная 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8 Раствор акриламида 1) 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 12% акриламида Вода очищенная 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5 Раствор акриламида 1) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 14% акриламида Вода очищенная 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8 Раствор акриламида 1) 2,3 4,6 7,0 9,3 11,6 13,9 18,6 23,2 1,5 М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 15% акриламида Вода очищенная 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5 Раствор акриламида 1) 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02