Метод гальванизации под названием электрофорез давно приобрел популярность и значимость среди остальных физиотерапевтических методиках лечения. Ощутить заметный результат от процедуры электрофореза можно практически в каждой клинике России. Этот метод физиотерапии может носить и другие названия – ионофорез, ионогальванотерапия, ионотерапия, гальванотерапия и т.д. Подобный метод физиотерапии был внедрен в общую практику медицины еще в 1802 году, а это значит, что свой неоценимый вклад в медицину он демонстрирует уже на протяжении более двухсот лет.
Суть этого метода проста, как и все уникальное, — при помощи попеременно воздействующих токов разной силы и длины лекарственные препараты доставляются в очаг поражения сквозь слои кожи.
Гель электрофорез – это разновидность ионофореза, который используется для распределения макромолекул в соответствии с их различиями в размерах, электрическом заряде и ряде других отличительных физических свойств. Само название «электрофорез» — обозначает способность заряженных частиц мигрировать в соответствии с воздействием электрического поля. В случае электрофореза в геле, молекулы, подвергаясь силе электрического тока, двигаются сквозь гелевую массу. Гель электрофорез используется для разделения следующих биологических макромолекул – пептиды, аминокислоты, белки, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты и т.д. Эти макромолекулы содержат больше количество ионизированных групп, и могут существовать, как катионы или анионы в любом заданном рН. Электрофорез нуклеиновых кислот применяют при угнетении нормальной жизнедеятельности макроорганизма, что может проявляться при переизбытки токсинов и шлаков. Исходя из этого, выведение токсинов и шлаков из организма – это прямая профилактика предупреждения всех генерализованных заболеваний, а так как химический состав вредных токсинов близок к белковым соединениям и полипептидам, преимущественным выбором будет гель электрофорез с цинком. Хлористый цинк оказывает ощутимое дезинфицирующее действие, и при выполнении электрофореза проявляется прожигающими ощущениями и активацией рефлекторных реакций.
К примеру, самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля. Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК. Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике? Не все лабораторные методы могут разделить некоторые фрагменты ДНК, что мешает получить 100 %-нтный результат исследования. Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом. Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов:
- Силы образованного электрического поля;
- Диаметра и форм молекул;
- Относительной степени «боязни» воды образцов;
- Температурной кривой буфера и ионной силы.
Методика электрофореза с использованием агарозного геля должна учитывать, что «поры» для разделения макромолекул большого размера, и потому подходят только для молекул, молекулярная масса которых не меньше 200 кДа. К преимуществам агарозных гелей можно отнести относительно быстрое перемещение молекул, но полосы имеют ограниченное разрешение, так как склоны к быстрому размытию границ и распространению в разные стороны. Процедура электрофореза с гелем проводиться по следующим этапам:
- Во-первых, приготовление водного раствора, вид которого зависит от выбора электрофоретического буфера (например, трис – ацетатный, трис – фосфатный, трис – боратный). Конечная рН водного раствора должна составлять 8,0;
- Одновременно с приготовлением водного раствора выбранный буфер при помощи нагревания готовит расплав агарозы с концентрацией 0,4 – 2,0 %;
- Полученный расплав агарозы остужают до 50 градусов, после чего в него добавляют краситель – бромистый этидий в концентрации, которая требуется для дальнейшей визуализации дифференцированных молекул во время ультрафиолетового излучения. Длина волны УФ – света должна составлять 254 нм;
- В горизонтальную кювету помещается 50-ти градусный расплав агарозы, где в последующем за счет гребенки образуются углубления для внесения препаратов ДНК. В подобном состоянии расплав агарозы оставляется до момента достижения консистенции геля;
- После застывания гелеобразных лунок с добавленными препаратами ДНК, кювету помещают в электрофоретическую ванну;
- Одновременно приготавливается навеска гексилрезорцина, который включается в электрофоретический буфер до момента достижения высшей концентрации, составляющей 10 -3 М (0,194 г/л). Именно гексилрезорцин или С6 – алкилоксибензол проявляет наиболее выраженные фотопротекторные свойства;
- Буфер с содержанием указанного выше количества и концентрации С6 – алкилоксибензола, погружается также на на электрофоретическую ванну;
- Электрофоретическая ванна соединяется с источником света, на котором заранее установлены показатели режимов электрофореза;
- Источник тока отключается только после прошествии некоторого времени от разделения препаратов ДНК, что определяется получением частиц с разными характеристиками. После разделении молекул ДНК и отключения источника тока гелеобразную массу агарозы переносят на трансиллюминатор;
- На поверхности трансиллюминатора под воздействием УФ – излучения происходит детализации полученного разделения молекул ДНК, и создание документов при помощи цифровых устройств;
- Последним, заключающим этапом является, вырезание участка геля из агарозы с разделенным молкулами ДНК, для проведения последующих генно – инженерных исследований.
Ведущие клиники могут провести гальванотерапию с гелем с учетом самых высоких технологий, преследуя следующие цели:
- Разделение молекул, составляющих ДНК и РНК, по разнице в размерах. Размер молекул определяется по маркеру;
- Оценка ДНК, и вычисление ее примерного количества по яркости свечения;
- Для многочисленных лабораторных исследований вырезание определенного, требуемого участка ДНК из геля;
- Анализирование и оценка результатов теста ПЦР;
- Часто внедряется в научные исследования по клонированию, например, в течение операции с плазмидой, в ходе которой из плазмиды вырезается участок с использованием рестриктаз, для его последующего использования;
- Секвенирование по Сэнгеру, но в этом случае для электрофореза необходим полиакриламидный гель, который гарантирует разделение молекул самых небольших молекул ДНК, различающиеся на 1 нуклеотид.
Эффекты после проведения электрофореза с гелем:
- Разделение частиц разных размеров и форм;
- Отделение главного участка нуклеотидной цепи, который необходим для генетических исследований;
- Постановление верного диагноза, после проведения ПЦР и оценки результатов исследования;
- Ощутимый вклад в развитие медицинской практики в сфере клонирования;
Из всего вышеописанного можно сделать заключение, что при правильно выбранной клинике для проведения геля электрофореза, точность и грамотность выполнения будет на высоком уровне. В полученных результатах можно не сомневаться, и активно приниматься за полноценное лечение.
источник
Впоследствии были предложены технологии разделения на плотных носителях, среди которых особое место заняли гели. Последние сочетали удобства разделения в свободном растворе (в геле 95-99% воды) с возможностью фиксировать результаты электрофореза путем высушивания геля. Среди гелеобразующих веществ вначале получил признание крахмал, затем полисахариды из водорослей агар-агар (агароза) и наконец гели, искусственно получаемые путем полимеризации акриламида.
Полиакриламидный гель стал одним из наиболее популярных носителей для электрофореза. Полимеризацию проводят в буферном растворе. Затем гель помещают в электрофоретическую камеру, заполненную буферным раствором и содержащую электроды для образования электрического поля (рис.1.8). рН и другие параметры буферного раствора выбираются из расчета, чтобы разделяемые молекулы несли отрицательный заряд и двигались в электрическом поле слева направо. Поскольку разделяемые молекулы движутся в геле, те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к месту нанесения, чем меньшие.
Рис.1.8. Виды проведения электрофореза в полиакриламидном геле (слева — в трубках с гелем, справа — в прямоугольных блоках)
Следует иметь ввиду, что этот метод позволяет разделять молекулы большей частью по их размеру, и совсем необязательно, — по их молекулярной массе. Для примера рассмотрим две молекулы белка по 1000 аминокислот каждая. Одна из них представляет вытянутую цепь (А), а вторая (за счет образования связей между соседними участками) имеет форму шпильки (Б):
Поскольку они движутся внутри геля, обе молекулы будут вести себя как сферы, диаметр которых равняется длине вытянутой части молекулы. Обе молекулы имеют одинаковую молекулярную массу, однако благодаря тому, что вторичная структура Б де-лает её молекулу короче, чем А, быстрее будет передвигаться Б. Дабы устранить влияние различий по форме и оставить только различия по молекулярной массе, разделяемые молекулы должны иметь развернутую конформацию (без вторичной структуры). Для разрушения вторичной и третичной структуры используются различные методы подготовки препаратов белка.
Подготовка белков. Все белки обладают вторичной и третичной структурной организацией. При этом их молекулы не всегда несут отрицательный заряд в растворе. Для разрушения вторичной и третичной структуры и образования на поверхности белков отрицательного заряда их нагревают и обрабатывают детергентом – додецилсульфатом натрия (ДДС-натрий).
Если соблюсти вышеприведенные условия, разделение молекул при электрофорезе будет осуществляться в зависимости от их молекулярной массы. При этом удается, например, разделить 2 молекулы полинуклеотида, различающиеся на 1 мононуклеотид. Высокомолекулярные молекулы будут двигаться медленнее низкомолекулярных. Длина пройденного молекулой расстояния будет пропорциональна логарифму величины, обратной её молекулярной массе (log 1/MM).
Обычно гели изображают в вертикальном положении, где место нанесения находится вверху, а движение разделяемых молекул направлено сверху вниз. Тогда в верхней части геля располагаются большие молекулы, а в нижней – с меньшей молекулярной массой.
Как правило, рядом с опытными пробами на гель наносится смесь белковых (или каких-то других разделяемых) молекул с известной молекулярной массой. Такие стандарты «молекулярной массы» позволяют прокалибровать пробег молекул. Тогда, зная какое расстояние прошло изучаемое вещество, можно установить его молекулярную массу. Ниже на рисунке 1.9 показан гель после обработки его красителем. Молекулы красителя связываются с каким-то определенным классом макромолекул независимо от последовательности расположения мономеров в их составе.
Рис.1.9. Результат проведения электрофореза в полиакриламидном геле после окраски геля неспецифическим красителем
Изображенный на рис.1.9 образец 1 содержит макромолекулы одного размера. Это может быть очищенный белок. При сравнении с подвижностью стандартов ясно, что молекулярная масса этого соединения около 3. Образец 2. Это может быть смесь белков после окраски геля неспецифическим красителем. Здесь находится так много полос, что среди них невозможно вычленить необходимую. В подобных условиях без зонда (который действует как специфический краситель) нам едва ли удастся получить полезную информацию об интересующем соединении. Учитывая это обстоятельство, для определения индивидуальных белков пользуются сочетанием электрофореза с иммунологическими реакциями (иммуноэлектрофорез) (рис.1.10).
Рис.1.10. Схема проведения иммуноблот анализа для обнаружения белка после проведения электрофореза в полиакриламидном геле (описание этапов приведено в гл.13)
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Для студента самое главное не сдать экзамен, а вовремя вспомнить про него. 10033 — 
| 7498 — 
или читать все.
195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями.
в плашку для электрофореза залить «подложку» — слой агарозы 1.5-2.0% толщиной
2-3 mm, дать застыть;
ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля. Низкопроцентные гели особенно чувствительны к перегрузке по количеству DNA на дорожку.
Разделение линейных молекул
Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с различной концентрацией агарозы:
|
Меньший предел определяется (в основном) диффузией полосы в геле. Т.е. в гелях с низкой концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы не четкие.
Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более длинные молекулы можно эффективно разделить.
Разделение суперскрученных и кольцевых молекул
К сожалению относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий фореза: % геля, скорость фореза (в частности, это означает, что нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул).
Приведенная таблица дает некоторое представление о соотношении подвижностей при умеренной (
6V/cm) скорости фореза (в скобках — при более быстром разгоне):
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию EtBr.
На 1% агарозном форезе ssDNA бежит чуть быстрее (
10%), чем dsDNA того же размера. ssDNA окрашивается EtBr заметно слабее, чем ds (разница в
4-5 раз). Tо есть, чтобы полосы имели одинаковую интенсивность окраски, требуется взять
Чтобы разделить цепи, нужно либо непосредственно перед форезом прогреть
1′ 100 o C, либо добавить к образцу NaOH до 0.1 М, 5-10′ (NT или 37 o C);
При оценке напряженности поля для горизонтального фореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.
На рисунке показана схема форезов, при разном напряжении. Форезы проводились разное время, так, чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля.
Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для высококачественных или препаративных форезов:
2V/cm(можно меньше для ON форезов). Для аналитических форезов приемлемое качество сохраняется до
DNA особенно легко теряет EtBr при повышенной температуре (что обычно случается, если гонять форезы при высоком напряжении).
EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.
Количество DNA, которое можно наносить на дорожку
Нижний предел определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то не стоит надеяться увидеть 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере
0.005-0.02%) могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. По нашему опыту, элюция фрагмента в РEG вместе с любым из этих красителей не оказывает заметного влияния на меченье, лигирование и трансформацию.
Cresol red (Na соль) — (стоковый раствор 50mM в H 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере
0.1mM) совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV.
OrangeG — (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере
0.01-0.05%) наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV.
Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле. Обычно приводимые в методиках
0.025% для бромфенолового синего и ксиленцианола (в 1х буфере) по нашему мнению слишком большое количество.
* буфера с различными красителями.
* различные разведения буфера для внесения (10х, 2х, 1х). При этом образец любого объема собирается из двух компонентов (буфер+образец), а не из трех (буфер+ вода + образец).
1x если объем образца 25-75%;
10x ==> 75%
Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/
| Дополнения, комментарии, вопросы Для оптимального разделения не очень больших фрагментов, можно пользоваться буфером для внесения по рецепту, указанному в каталоге MBI Fermentas: 6x Orange Loading Dye Solution (#R0631) При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. Такой подход позволяет оптимизировать рабочее напряжение, а, соответственно, и разделение. И еще — я человек в мол.биологии непросвещенный, а потому да простят меня профессионалы, если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки. Люди, хелп! Если кто-нибудь знает что-то про технологию внесения биополимеров в гель под названием Shark Teeth, напишите, пожалуйста! А почему бы заодно не добавить в текст, что рабочая концентрация бромистого этидия, например, 0,5 мкг/мл и что его можно добавлять прямо в гель, что гель с добавленным в него EthBr спокойно стоит ночь под электродным буфером без заметного вымывания из него краски? Полезные, вобшем-то факты, хоть и мелкие, но, с моей точки зрения, вполне не лишние. Акульи зубы — не гель. а гребенка в виде этих самых зубок. Втыкается в гель, и не вынимается, а образец наносится тонким-тонким носом в дырки между зубами. См. инструкцию к Макрофору. Только это не про агарозный форез. 2Re: что это гребенка такая, я знаю. Только сейчас вижу, что по формулировке моего вопроса кажется, будто это гель так называется:) Все, спасибо, уже поздно:) Только по моим данным, это имено про форез. Не знаю уж, про агарозный или ПААГ, по-моему, в данном случае не суть важно Народ, а какова длина волны для визуализации ПЦР-фрагментов? народ, а как точно называется маркер мол веса (лестница)? и куда, как ее наносить? а почему в гел Этьбромид а не GelStar ? GelGreen ? GelRed ? SYBRSafe ? а почему ТБЕ ТАЕ а не SB (sodium borate) ? а почему UV а не Blue ( Safe Imager , Dark Reader , FlashGel) А ПОКОЧАНУ )))) ответ от радио Molbiol — Не выпендрюйся Василий Иваныч-слушай свои «Валенки» 1: Biotechniques. 2004 Feb;36(2):214-6. Links Erratum in: Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA. PMID: 14989083 [PubMed — indexed for MEDLINE] All: 1 1: Electrophoresis. 2001 Mar;22(5):814-28.Click here to read Links Clare Chemical Research, Inc, Denver, CO 80206, USA. mseville@clarechemical.com The Dark Reader optical system (Clare Chemical Research, Denver, CO, USA) uses relatively low intensity broad-band visible blue light in combination with broad-band optical filters to detect fluorescence with a level of sensitivity that often surpasses that of UV transilluminators and can rival that of laser-based scanners. Applications of DR (Clare Chemical Research) devices include the detection of DNA and SYBR-stained protein samples following, and also during, electrophoresis. Unlike laser-based imaging systems, the fluorescence is directly visible to the user as well as being fully compatible with charge-coupled device (CCD) and Polaroid camera-based detection and imaging. Additionally, the DR optical system functions well in multicolor fluorophor environments. Because the Dark Reader does not emit any UV light, the extent of DNA damage incurred when visualizing DNA samples is drastically reduced compared to the damage produced by a UV device and this can have a significant benefit on downstream cloning protocols. Furthermore, dye photobleaching is minimal, extending the length of time that a fluorescent sample is visible. The inherent flexibility of the DR optical system allows many different configurations of the Dark Reader to be constructed such as transilluminators, hand lamps and integrated transilluminator-electrophoresis units. PMID: 11332748 [PubMed — indexed for MEDLINE] Today’s Featured Review Until recently Sybr green had been our labs nucleic stain of choice. We have, however, recently migrated to Biotium’s GelRed. GelRed is a newer nucleic acid gel stain that is safer and more temperature stable than other dyes. GelRed is safer because it is non mutagenic and is diluted in water. It is more thermostable than Sybr dyes because it does not degrade with repeated freeze-thaws or long storage (couple months at RT) and can be stored at room temperature, and sensitivity seems to at least equal if not exceed Sybr green when visualized with UV transilluminator. The dye is used similarly to Sybr dyes with staining (available at 10,000X ) or direct sample additions. The technology is not particularly ground breaking or new but the safety profile of this product makes it a viable alternative to potentially more dangerous dyes. Review by Vitelli Using GelGreen ‘In-Gel’ Save even more Time. GelGreen Safety FlashGel™ DNA System The FlashGel System is the fastest way to separate DNA and the only way to watch DNA migration as it happens. This revolutionary new tool separates DNA in 2 – 7 minutes. Monitor gel runs right at the bench, without UV light. The highly sensitive system allows a 5X reduction in DNA levels – saving both time and money. * Get results in 5 minutes or less. The FlashGel System consists of enclosed, disposable, precast agarose gel cassettes and a combination electrophoresis and transilluminator unit. * FlashGel Cassettes contain precast, prestained agarose gels and buffer – no need for gel preparation, buffer addition or gel staining. это все называется «ДНК технология» — не путайте с одноименной фирмой всем привет. Здравствуйте! «. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. « а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации. Скорее всего малая концентрация? Спасибо —Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно —. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. « —а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит. Вроде красители в агарозе мигрируют на одно и тоже Rf не зависимо от процентности. А вот фрагменты сильно зависимо от процентности. Берете 2 маркера 100b и 1000b и в разных процентностях агарозы гоните с красителями и очень хорошо определяете, что с чем бежит. 3 процентный агароз вам уже трудно будет растворить. Я так дУмаю-у Мне кажется это лишняя работа элюировать ДНК из геля для последующей амплификации. Срез геля в воду, заморозить-разморозить и 1-2 мкл на ПЦР. Вы реамплифицируете кг. Спасибо, попробую на следующей неделе. А что если уже выделил из геля с помощью QG и при исходнике с приблизительной количеством 50 нг получил 40 мкг в 40 мкл. На форезе 1,2% в 10 мкл пробы ясен перец ничего не видно, агароза супер. Поставил на ПЦР, отправил 20 мкл в смесь, жду результатов. Сколько приблизительно может быть продукта? Спасибо Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка?? 1% агарозу (в 2% линейная ДНК идет очень близко к суперскрученной, в 0.7% — близко к релаксированной). Если требуется проконтролировать циклизацию 3kbp фрагмента, то надо использовать 2% агарозу. если у Вас не нарабатывается большое кол-во продукта (20 нг в мкл и выше), дело уж конечно не в пирофосфатах- откуда бы им взяться, коли буквы не включились в амплификат (его мало)? Скорее всего проблемы с праймерами- посмотрите, нет ли «бомбы» (димер праймеров) внизу, или полимераза дохнет, что вря ли. Если проблема не лечится «в лоб», то просто замешайте исходно большой объем смеси, грубо говоря, накопите продукт экстенсивным путем, и всех делов. Я наверное перегрелся на солнцепёке (отпуск все-таки) — не понимаю в чем проблема плазмида или вставка, одна пара праймеров. По классике в ПЦР сильнее амплифицмруется всегда более короткий фрагмент. Без бутылки не разберешься, дождусь вечера. Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? И на какой стадии (до или после фиксирования в кислоте). Обязательно ли сушить? -Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? Бромий этидием или сибирским зеленым и иже с ними -до или после фиксирования в кислоте. «если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки» Чем тогда думали в Сигма, если сделали столик в камере для фореза из белого пластика, к тому же скользкого в первом случае можно наклеить синей изоленты под место, где карманы)) Но от скольжения избавиться сложно — гель частенько уплывает от любых дуновений во время фореза. хоть гвоздями прибивай Можно ли заменить ТВЕ-буфер на Трис-СІ+EDTA для фореза ДНК, и какой молярности? За Трис.НСI в форезном буфере ставлю кол. Борная кислота испорчена у нас. Похоже, это ко мне . Поставляем наборы готовых гелей для электрофореза ДНК, рассчитанные на использование в ПЦРных лабораториях. В каждый комплект входит пузырёк ТАЭх20 (50 мл) для приготовления литра электрофоретического буферного раствора (EtBr 0,5 мкг/мл). Если нужно, то эти пузырёчки можно продавать и без гелей . Если интересно, то пишите. Ели реклама здесь неуместна, то удалите. Размер:: 19.19к кол-во скачиваний: 1724 Ну как может испортиться борная кислота? Купите тогда в аптеке. Борная кислота старая и «Ч.» по квалификации чистоты. Надо заказывать новые реактивы. Могу отсыпать сухой (белый порошок) ТВЕ. И дам пропись как самому готовить. Но про Трис.НСI для фореза — забудь. Лучше водопроводную воду. Забудьте и про Трис-HCl, и про все прочие буферы на основе Триса. Наиболее продвинутые пользователи за бугром переходят на Li-борат и Li-ацетат. Давно хотел попробовать карбонатный буфер, но всё руки не доходили. Недавно дошли. Приготовили Li-карбонатный буфер. Форезы получаются отлично! При 10V/см ни перегрева, ни закисления или защелачивания. Очень рекомендую! * ubMed will retrieve 2 records. J Virol Methods. 2010 May 13. [Epub ahead of print]Fast short-fragment PCR for rapid and sensitive detection of shrimp viruses. Mrotzek G, Haryanti, Koesharyani I, Tretyakov AN, Sugama K, Saluz HP. Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute, Beutenbergstrasse 11a, 07745 Jena, Germany; Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany. This article describes a fast short-fragment PCR method for the detection of white spot syndrome virus (WSSV), infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and monodon baculovirus (MBV). Fast two-temperature (95 degrees C denaturation and 60 degrees C annealing/extension) PCRs were performed in 5-10mul volume samples in miniaturized microplates using a fast Peltier thermal cycler. 40 cycles were completed in 25-30min. Rapid high-resolution agarose gel electrophoresis of 70-150bp PCR fragments was performed in 10min. High sensitivity of PCR product detection (50-100pg) was obtained using ultra sensitive dyes such as GelStar(®) and a gel documentation system equipped with a blue-light transilluminator. This novel method is faster and more sensitive than its TaqMan(®) real-time PCR counterparts. Copyright © 2010. Published by Elsevier B.V. да уж сам себя не похвались как оплеванный ходишь. © источник При подготовке определенной серии опытов удобно заранее Для приготовления геля маточные растворы мономеров и бу- Рассмотрим некоторые факторы, влияющие на этот процесс. Кислород воздуха в контакте с раствором мономеров может Если в качестве инициатора используют рибофлавин, то фор- вая артефакты при их фракционировании. В тех случаях, когда Полимеризация — экзотермический процесс, поэтому в слу- Гель получается наиболее однородным, если время полиме- Количество ТЕМЕД в объемных процентах можно брать Состав буферов, используемых для электрофореза белков и децилсульфат натрия, Тритон Х-100, цетавлон и др. Сахароза Весьма существенно обеспечить чистоту поверхности стеклян- ПААГ хорошо прилипает к стеклу даже при малой концент- Гели с высоким содержанием акриламида могут настолько Особого внимания требует полимеризация «градиентных» ге- выделение при полимеризации такого геля будет заметно боль- Выбор концентраций мономеров Для удобства изложения используются следующие обозна- Чем же диктуется выбор значений T и С? Прежде всего, на На первый взгляд кажется очевидным, что поры ПААГ тем Неправильно было бы считать ПААГ регулярной простран- мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основ- Между прочим, такая же ситуация возникает и при затверде- Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень вы- Рассмотрим теперь подробнее влияние выбора значений Т и сти с такими же, как у буфера геля, значениями рН и ионной си- В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее, Для эффективного разделения белков при электрофорезе в Выбор значения Т зависит от природы различия электрофо- при малых значениях Т), т. е. как бы в свободной жидкости, Ориентировочно о характере различия электрофоретических Пожалуй, самый существенный вывод из проведенного каче- В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать источник Электрофорез в агарозном геле. Принцип метода электрофореза. Электрофорез – метод разделения макромолекул, различающихся по таким параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пр о- странственная конфигурация, вторичная структура и элек трический заряд. Физический принцип метода заключается в следующем. Наход я- щиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым су м- марным электрическим зарядом, величина и знак которого зависит от рН среды. Если через этот раствор, зак люченный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т.е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью поте н- циалов по концам канала, отнесен ной к его длине (В/с). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом м и- грируют в направлении катода или анода, причем их трение об окр у- жающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от в е- личины заряда и размеров мол екулы приобретают различные скорости. Постепенно исходный препарат, состоящий из различных молекул, ра з- деляется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой скоростью. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем, наличие сетки которого вн осит важную дополнительную деталь в эле к- трофоретическую миграцию молекул. Фракционируемые молекулы сталкиваются с нитями полимера, образующую сетку геля, что увел и- чивает сетку геля и снижает скорость движения молекул. Препятствия для миграции становятся о собенно серьезными, если средний размер пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами ма к- ромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линей ных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот в о- обще не могут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекр а- титься. В настоящее время используют ПААГ и агарозный гель. В а- рьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень шир оким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрич еские заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигур ацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. В ходе электрофореза зоны макромолекул остаются невид и- мыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же зн а- ка, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость м и- грации наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают. Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их дифф у- зии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси, кислоты выпадают в осадок в том мес те, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачив а- ния геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат ра з- деляется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. Кроме того, поскольку гель заливают в форму для п о- лимеризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содерж а- ние добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следовательно, плотность тока и напряжение электрического поля также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия фракционирования ра з- ных препаратов и дает возможность достоверного сопоставления их с о- става путем сравнения положения полос в параллельных треках. Особенности агарозного геля. Агароза – это особо чистая фракция природного линейного пол и- сахарида агара, который получают из морских красных водорослей (Gracilaria, Gelidium, Ahnfeltia). Агароза состоит из строго чередующихся остатков 3-О- замещенной-β-D-галактопиранозы и 4-О-замещенной 3-6-ангидро-α-L- галактопиранозы. Молекулярная масса ее составляет 10 4 -10 5 . Гелеобразование идет путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обр а- зуют прочные гели уже при концентрации 0,3%. При температурах 84 -96 o (а у специальных типов – уже при 70 o ) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – «плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10 -15 с П, что примерно соответствует вязкости 50% -ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выр а- женным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значител ь- но более низких температурах (36 -42 o ). У легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30 o . Такая особенность облегчает ман и- пуляции с расплавленной агарозой — можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную агарозу пре д- варительно охлаждают до 50 -55 o и уже при этой температуре заливают в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных те п- ловых деформаций. Гели агарозы не вполне прозрачны, что обусловлено «кристалл и- зацией» геля. Затвердевший гель представляет собой н е вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жи д- кость. Температура плавления и гелеобразования зависят от с одержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3 -4%. Наличие этих групп затрудняет гелеоб разование. В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Чем меньше в агарозе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электр о- статического отталкивания между молекулами полимера и выше их способность к связыванию водородными связями. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза. В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эндосмоса, суть которого в след ующем: отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные ионы, находясь в водной фазе под действием электрического поля м и- грируют в направлении катода. Их место занимают катионы, которые увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и вместе с ней – растворенные в водной фазе геля макромолекулы. Эле к- трофорезом в агарозном геле чаще всего разделяют отрицательно зар я- женные макромолекулы, а эндосмос направлен в про тивоположную сторону и ухудшает разделение. Поэтому агарозу подвергают спец и- альной очистке, и содержание иона сульфата в продажных препаратах не превышает 0,5%. Рис. 1. Влияние эндосмоса в агарозном геле на характер фракционирования двунитевых ДНК одина кового разме- 1 — сверхскрученная ДНК; 2 — линейная; 3 — кольцевая; степень эндосмоса увеличивается слева направо Типы агарозы, отличающиеся слабо выраженным эндосмосом, с о- держат менее 0,3% сульфата. В случае необходимости мо жно провести дополнительную очистку агарозы от сульфата обработкой 1М NаОН в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаждением 50% -ным этанолом. Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и не специфическую сорбцию белков на агарозе, в результате чег о полосы расплываются с образованием «хвостов». Степень эндосмоса колич е- ственно оценивают с помощью коэффициента относительной миграции (-m r ) – представляющего собой отношение скоростей миграции незаряженного полимера (за счет только эндосмоса) и сходного с ним по структуре полианиона при электрофорезе в агарозе данного типа. Некоторые типы агарозы по номенклатуре фирмы « Miles»: тип LE – малая степень эндосмоса -m r =0,1-0,15; тип HE – сильно выраженный эндосмос -m r =0,23-0,26. Агароза с повышенными темпера турами плавления и гелеобразования (тип HGT) имеет -m r r >0,3) , но не за счет увеличения сульфатов, б лагодаря чему неспецифической сорбции белков на агарозе этого типа почти не происходит. Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентр а- ции навеску порошка растворяют в соответствую щем буфере и нагре- вают до 90-95 o . Перед заливкой в форму раствор агарозы охлаждают до 50 o . Выбор концентрации агарозы, т.е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2% — ного геля агарозы приблизительно соот ветствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель -фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для м о- лекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрич е- ском поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют аг а- розные гели с концентрацией 0,4 -2%. Ниже представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %) для некоторых распространенных объектов фракционирования: Высокомолекулярная ДНК вирусов и пла з- Рестрикты ДНК (5-20 тыс. пар оснований) Реовирусная двунитевая РНК (500 -5000 пар Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100 -1000 Разновидности электрофореза в агарозном геле. Современные варианты электрофореза используют пластинки или колонки с агарозным гелем. В зависимости от цели исследований эоектрофорез в агарозном геле может быть аналитическим и/или препаративным. Аналитический электрофорез в агарозном геле имеет целью электрофоретическое разделение макромолекул с последующей визуализ а- цией и анализом полученных результатов. Агарозный электрофорез применяют в препаративных целях. Для извлечения из геля разделенных компо нентов используют несколько способов: агарозный гель подвергают элюции буферными растворами, центрифугированию, замораживанию и оттаиванию.и др. Вертикально расположенные трубки Вертикальное расположение гелей и меет то преимущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность геля. Затруднение при вертикал ь- ном расположении могут возникать при недостаточной сцепле нности геля со стеклом, он будет сползат ь вниз. Все приборы для с вертикальным расположением гелей ко н- структивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположением, т.к. верхний электродный резервуар должен быть поднят над гелем. Необходимо уплотнение в местах сочленения его с трубками или пл а- стинами. Трубки (12-18штук) с уже заполимеризованным в них гелем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верхние концы выступали над дном резервуара. Если используют не все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе с трубками в ерхний электродный резервуар устанавливают на нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором расстоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар электродным буфером до такого уровня, что трубки оказываются почти полностью погруженными в буфер. Это делается для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза. С этой же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой или вводят допо л- нительную охлаждающую систему. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной формы изготавливают из плексигласа , что позволяет следить за продвижением фронта красителя. В резервуарах должны быть закреплены электроды из платиновой проволоки. Нижний эле к- трод при этом должен располагаться так, чтобы поднимающиеся от н е- го пузырьки газа не попадали на нижние торцы трубо к, что создавало бы помехи протекания через них тока. Объемы электродных резерву а- ров достаточно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изм е- нялся под влиянием продуктов электролиза. Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок з а- клеивают парафильмом и устанавливают строго вертикально в штатив. Заливают гель. Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный резервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой наслаивают препарат, в который добавляют предварительно 5 -10% сахарозы. При любом варианте эле к- трофореза надо быть уверенным в том, что исходный препарат своб о- ден от взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соб и- раться на торце геля и однородность тока по его сечению, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон. В этом случае препарат сл е- дует отфильтровать или очистить центрифугированием. По окончанию электрофореза гель из трубки извлекают. В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и зату п- ленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов трубки, кр у- говыми движениями отслаивая гель от ее стенок. Если необходимо т а- кую операцию проводят и с другого конца. Через иглу при этом пост у- пает вода из закрепленного выше резервуара. Если гель отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5 -1% раствор детергента. Во избеж а- ния поломки следует дать гелю возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над которым проделывают эти манипуляции. Иногда д ля удаления геля из очень длинных трубок по его периферии с концов впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой из присоединя е- мого к трубке шприца. Если гель высокой концентрации вынуть не уд а- ется, его приходится замораживать, а трубку разбивать моло тком. Иногда можно решить проблему путем вымачивания трубки с гелем в мет а- ноле: гель постепенно съеживается и отстает от стенки. Основным недостатком электрофореза в трубках является з а- трудненный отвод тепла даже при диаметре 5мм. На оси геля темпер а- тура оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности. Это приводит к изгибу зон и соответственно окрашенных полос, п о- скольку электрофоретическая подвижность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотвода можно вести микроэлектрофорез в к а- пиллярах диаметром 0,7 -1,5мм. Вертикально расположенные пластины Для электрофореза белков обычно используют пластины ш и- риной 8-14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 -28 см. Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а затем и электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зе р- кального стекла толщиной 5 -6мм. Расстояние между пластинами зад а- ется толщиной прокладок из тефлона или плексигласа («спейсеров») и определяет толщину геля. Прокладки шириной 10 -15мм устанавливают вдоль боковых краев стекол. Эти же прокладки можно использовать и для уплотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердевш е- го геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно такой же толщины по нижнему краю стекол и плотно прижимают ее к фрезер о- ванным торцам боковых прокладок. При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить проще — заклеить торцы стекол липкой лентой. Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать. Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с прокладками и лент ой быстро застынет и заметного ее вытекания не будет. Для надежности можно сначала залить н е- большой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а п о- том залить остальной ее объем. Собранную и уплотненную форму устанавливают вертикал ь- но и заливают в нее раствор мономеров ПААГ или расплавленную аг а- розу. В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно затем с о- поставить при идентичных условиях разделения. Сопоставляемые пр е- параты фракционируют в параллельных друг другу «треках». В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы — «карманов», в которые затем вн о- сят исследуемые препараты. Для этого в еще незаполимеризовавшийся гель или горячую агарозу вставляют гребенку из тефлона или плекс и- гласа. Прямоугольные зубцы гребенки и формируют карманы. Гель или агарозу заливают между пластинами с таким расч е- том, что при опускании гребенки до упора жидкий гель заполнил пр о- межутки между ее зубцами. Гре бенку начинают вставлять с некоторым перекосом, чтобы под ее зубцами не задерживались пузырьки воздуха. Когда гель готов, вынимают нижнюю прокладку или снимают липкую ленту и осторожно вытаскивают гребенку. При работе с концентрир о- ванным ПААГ гель может прилипать к зубцам гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться неровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос в геле. В таком случае имеет смысл вв е- сти еще один слой геля пониженной концентрации, и гребенку устана в- ливают в него. Для проведения электрофореза чаще всего используются приборы конструкции, предложенной Стадиером. Верхний и нижний резервуары прямоугольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой имеется вырез, ведущий в полость верхнего резе рвуара. Такой же вырез имеет и одна из двух стеклянных пластин, меду которыми п о- лимеризуется гель. Пластины прижимаются пружинными зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпадали. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, чтобы он через в ырез покрывал верхний торец геля. При этом вторая, не вырезанная, стеклянная пл а- стинка выступает в роли передней стенки резервуара. В месте совм е- щения двух вырезов, между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осуществлено уплотнение, препятствующее вытеканию верхне го буфера. В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой пр о- волоки. При установке в прибор форму с гелем частично погр ужают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец оказывается приподнят ым над дном резервуара. После погружения необходимо удалить пузырьки воздуха. По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаивая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают между пласт и- нами со стороны карманов и слегка поворачивают. Со вто рой пластины гель снимают руками и переносят в ванночку для фиксации или окр аски. Необходимо проводить манипуляции в перчатках, т.к. случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверхности геля при современных чувствительных методах окрашивания может остави ть на геле артефактное белковое пятно. Горизонтально расположенные пластины Преимущество-отсутствие проблемы уплотнения. Оба эле к- тродных буфера находятся в резервуарах, расположенных ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель. Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке или плашке из плексигласа, помещают на столик открытой поверхн о- стью кверху, поскольку препарат вносят не с торца, а в ряд специал ь- ных «колодцев», расположенных на некотором расстоянии от края. Электрофорез проводят в форезных камерах. Препараты вносят в «к о- лодцы» вместе с красителем — бромфеноловым синим, содержащим также глицерин, который «прижимает» краситель и препарат, не позв о- ляя им диффундировать в геле или в буфере. Пластины для горизонтального элект рофореза в агарозе можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально установленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло определенного размера и на него выливают расплавленный раствор агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB рекомендует наносить препараты прямо на поверхность агарозы через прорези наложенного на пластину специального шаблона со щелями. Препарат объемом 2 — 4 мкл вносят в щель шаблона, откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравнительно пр о- стое приспособление, смонтированное на столике для заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при з аливке агарозы образовать колодцы для препаратов. Перед использованием пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфере в течение суток. Итак, электофорез в агарозном геле позволяет идентифицировать большое количество белковых фракций. Пример – электрофоретическое разделение белков сыворотки крови. Электрофорез проводят в 1% -ном агарозном геле в мединал — вероналовом буфере рН=8,6 с ионной силой 0,05. Все белки сыворотки крови при рН=8,6 заряжаются отрицательно заряд и движутся от катода к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую молекулярную массу, затем располагаются 1 -, 2 -, — и -глобулины. Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на н е- сколько подфракций. Первоначальная оценка результатов электрофор е- тического разделения сывороточных белков (выявление нормы или п а- тологии) должна проводиться визуально, путем сравнения с картиной нормальной сыворотки, а количественные данные предназначены тол ь- ко для документирования результатов и динамического наблюдения. Для электрофореза белков используются различные аппараты, как ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных мембран или гелевых пластинок (определения относительного колич е- ства белков в каждой фракции) используется электронный цветной ск а- нер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность и воспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает во з- можность усредненного расчета оптической плотности отдельных фракций путем автоматического определения границ «дорожек» и мн о- гократного сканирования каждой из них в нескольких «разрезах», что позволяет исключить ошибки из -за локальных микродефектов и неро в- ного положения носителя, а также до определенной степени нивелир о- вать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится график — денситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций. При необходимости маркеры границ фракций на графике можно ско р- ректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофор е- грамм; их можно в любое время извлечь и просмотреть. Электрофорез белков, позволяющий определить их количественные сдвиги и физико — химические характеристики, помогает выявить заб олевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразов а- ния (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетически е поломки Методика электрофореза в агарозном геле. Для приготовления агарозного геля в СВЧ-печи или на водяной бане расплавляют смесь агарозы, буфера и воды. Охлажденную до 50-60 о С смесь тонким слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле лунки для нанесения образца. Исследуемый препарат (раствор белка, ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля — полужидкой среды с сетчатой пространственной структурой (обычно для электрофореза используют тонкие пластины геля). Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещаются в электрическом поле. Молекулы одинакового размера (и одинакового заряда) движутся единым фронтом, образуя в геле дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся. Постепенно исходный препарат, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распределенные по длине пластинки. За ходом электрофореза следят по перемещению в геле красителя — заряженного низкомолекулярного вещества, которое вносят в каждую лунку перед началом электрофореза. Когда краситель достигает конца пластины, электрофорез останавливают, а гель окрашивают красителем, прочно связывающимся с белками или нуклеиновыми кислотами. Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после электрофореза получается набор четких полос, расположенных одна под другой. Если же распределение молекул по размеру более или менее непрерывно, то получается смазанная картина. По интенсивности окраски полос можно судить о концентрации макромолекул в образце. Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров источник |