Госты с использованием метода электрофореза

ГОСТ Р 52841-2007
Продукция винодельческая. Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза

Купить ГОСТ Р 52841-2007 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль»

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
Курьерская доставка (7 дней)
Самовывоз из московского офиса
Почта РФ

Распространяется на винодельческую продукцию и устанавливает метод определения содержания органических кислот — винной, яблочной, янтарной, лимонной и молочной в диапазоне измерений с учетом разбавления от 0,001 до 0,50 г\дм3 на основе измерения их массовых концентраций посредством капиллярного электрофореза.

3 Требования безопасности

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

7 Метрологические характеристики

8 Требования к условиям выполнения измерений

9 Подготовка к выполнению измерений

9.1 Приготовление буферных и вспомогательных растворов

9.2 Подготовка прибора и порядок проведения анализа

11 Обработка и оформление результатов измерений

Приложение А Электрофореграммы стандартного раствора органических кислот и образца винопродукции

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства» Россельхозакадемии (ГНУ «СКЗНИИСиВ» Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. № 470-ст

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

3 Требования безопасности. 2

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы. 2

7 Метрологические характеристики. 3

7.2 Прецизионность метода. 3

8 Требования к условиям выполнения измерений. 3

9 Подготовка к выполнению измерений. 3

9.1 Приготовление буферных и вспомогательных растворов. 3

9.2 Подготовка прибора и порядок проведения анализа. 4

9.3 Приготовление градуировочных растворов. 4

10 Проведение измерений. 5

11 Обработка и оформление результатов измерений. 5

Приложение А (справочное) Электрофореграммы стандартного раствора органических кислот

и образца винопродукции. 6

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза

Determination of organic acids by capillary electrophoresis method

Настоящий стандарт распространяется на винодельческую продукцию и устанавливает метод определения содержания органических кислот — винной, яблочной, янтарной, лимонной и молочной в диапазоне измерений с учетом разбавления от 0,001 до 0,050 г/дм 3 на основе измерения их массовых концентраций посредством капиллярного электрофореза.

Требования к контролируемым показателям по массовой концентрации лимонной кислоты установлены в ГОСТ Р 52404. ГОСТ Р 52523 и ГОСТ Р 52558.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений

ГОСТ Р 51144-98 Продукты винодельческой промышленности. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 52404-2005 Вина специальные и виноматериалы специальные ГОСТ Р 52523-2006 Вина столовые и виноматериалы столовые. Общие технические условия ГОСТ Р 52558-2006 Вина газированные и вина газированные жемчужные. Общие технические условия

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет, который опубликован по

состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям. опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ 12.1.019.

3.2 При выполнении анализов необходимо выполнять требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.1.007.

3.3 К выполнению измерений методом капиллярного электрофореза допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера, прошедшие соответствующий курс обучения, или лица, имеющие удостоверения на право работы методом газовой или высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Прибор (система) капиллярного электрофореза, оснащенный кварцевым капилляром длиной не менее 50 см до детектора, внутренним диаметром 75 мкм. фотометрическим детектором, работающим на длине волны 254 нм. или спектрофотометрическим детектором в интервале длин волн от 200 до 300 нм и электронно-вычислительной машиной (компьютером) с программным обеспечением для обработки электрофореграмм. например система капиллярного электрофореза «Капель» (НПФ Люмэкс).

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более * 0.0002 г.

Пипетки мерные 2-го класса точности по ГОСТ 29227.

Колбы мерные 2-го класса точности по ГОСТ 1770.

Пробирки одноразовые (типа Эппендорфа) вместимостью 1.5 см 3 .

Кислота винная с содержанием основного вещества не менее 99,0 %Ч

Кислота яблочная с содержанием основного вещества не менее 99,0 % 2) .

Кислота янтарная с содержанием основного вещества не менее 99,0 % 3) .

Кислота лимонная с содержанием основного вещества не менее 99,0 %*\

Лактат лития с содержанием основного вещества не менее 95,0 % 5) .

Кислота дипиколиновая с содержанием основного вещества не менее 99,0 % 6) .

Тетраметилэтилендиамин с содержанием основного вещества не менее 99.5 % 7 >.

Этилендиаминдиуксусная кислота с содержанием основного вещества не менее 99,0 %*>.

Примечание — Средства измерений должны быть поверены в установленные сроки. Допускается использовать средства измерений, вспомогательное оборудование и реактивы с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками.

Например, производства фирмы Sigma (наименование по каталогу T206-25G. D-tartaric acid. 99 %).

/ Например, производства фирмы Sigma (наименование по каталогу 112577-25G. L-malic acid. 99 %).

5 Например, производства фирмы Sigma (наименование по каталогу 27616-250G. Succinic acid. 99 %).

Например, производства фирмы Sigma (наименование по каталогу C1857-100G. Citric acid anhydrous. 99 %).

Например, производства фирмы Sigma (наименование по каталогу 440469-50G. Lithium lactate. 95 %).

6 ’ Например, производства фирмы Sigma (наименование по каталогу D0759-25G. Dipicolinic acid. 99 %).

Г> Например, производства фирмы Sigma (наименование по каталогу 411019-100ML. N.N.N’.N’-tetramethylet-hylenediamine. 99.5 %).

а ‘ Например, производства фирмы Sigma (наименование по каталогу 03575-5G. Ethylenediamine-N.N’-diacetic acid. 99%).

Метод капиллярного электрофореза определения массовой концентрации органических кислот основан на миграции и разделении анионных форм анализируемых компонентов под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности. Для детектирования кислот используют косвенный метод, регистрируя поглощение в ультрафиолетовой области спектра при 254 или 270 нм.

Диапазон измеряемых концентраций с учетом разбавления — от 0.001 до 0.050 г/дм 3 .

Показатели прецизионности метода определены в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2. ГОСТ Р ИСО 5725-3 и представлены в таблице 1.

Таблица 1 — Показатели прецизионности метода определения массовых концентраций органических кислот

Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости) %

Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости) (V. %

Предел повторяемости (относительное значение допускаемою расхождения между двумя результатами параллельных определений) г. %, Р = 0.95. п = 2

Предел воспроизводимости R. %. Р = 0.95, п = 2

Границы относительной погрешности при вероятности ± б, %. Р = 0.95. п = 2

Подготовку проб и измерения проводят в лабораторных условиях при температуре окружающего воздуха (23 :5) °С, атмосферном давлении от 87 до 107 кПа, относительной влажности воздуха не более 80 % при температуре 25 *С, частоте переменного тока (50.0 = 0.4) Гц. напряжении в сети 220 В.

9.1 Приготовление буферных и вспомогательных растворов

9.1.1 Раствор гидроксида натрия массовой долей 4%

В 50 — 60 см 3 дистиллированной воды растворяют 4 г гидроксида натрия. По окончании растворения разбавляют дистиллированной водой до объема 100 см 3 . Срок хранения в сосуде из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой — 2 мес.

9.1.2 Раствор соляной кислоты массовой долей 3,5 %

В мерную колбу вместимостью 100 см 3 помещают 8,3 см 3 соляной кислоты плотностью 1,18 г/см 3 , затем добавляют дистиллированную воду до метки и перемешивают. Срок хранения не ограничен.

9.1.3 Раствор дипиколиновой кислоты массовой долей 0,21 %

В стакан вместимостью 50 см 3 отбирают навеску 0,105 г дипиколиновой кислоты с точностью 0,001 г. В стакан добавляют 40 см 3 горячей (температурой не более 90 °С) дистиллированной воды (хранившейся с момента приготовления не более 4 сут) и перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения. Для интенсификации растворения допускается выдерживание раствора в стакане на водяной бане при температуре не более 90 °С. Затем раствор охлаждают до 20 в С, количественно переносят в мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 50 см 3 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

9.1.4 Раствор тетраметилэтилендиамина массовой долей 2,32 %

В стакан вместимостью 25 см 3 отбирают навеску 0.580 г тетраметилэтилендиамина с точностью 0.001 г. В стакан добавляют 10 см 3 дистиллированной воды (хранившейся с момента приготовления не более 4 сут) и перемешивают стеклянной палочкой. Затем раствор переносят в мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 25 см 3 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

9.1.5 Раствор этилендиаминдиуксусной кислоты массовой долей 0,176%

В стакан вместимостью 25 см 3 отбирают навеску 0,044 г этилендиаминдиуксусной кислоты с точностью 0.001 г. В стакан добавляют 10 см 3 горячей (температурой не более 90 °С) дистиллированной воды (хранившейся с момента приготовления не более 4 сут) и перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения. Для интенсификации растворения допускается выдерживание раствора в стакане на водяной бане при температуре не более 90 °С. Затем раствор охлаждают до 20 °С. переносят в мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 25 см 3 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.

9.1.6 Рабочий буферный раствор

Раствор дипиколиновой кислоты по 9.1.3, раствор тетраметилэтилендиамина по 9.1.4. раствор этилендиаминдиуксусной кислоты по 9.1.5 смешивают в объемном соотношении 8:1:1. Полученный рабочий буферный раствор помещают в пробирки Эппендорфа в количестве 0.8 см 3 и центрифугируют 4 мин при 6000 об/мин; не допускают хранение рабочего буферного раствора более 2 сут с момента приготовления при нормальных условиях. Исходные растворы (по 9.1.3. 9.14,9.1.5) хранят при комнатной температуре в плотно закрытых стеклянных емкостях не более 10 сут с момента приготовления.

9.2 Подготовка прибора и порядок проведения анализа

Прибор подготавливают к работе в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают следующие рабочие параметры:

— длина волны спектрофотометрического детектора — 270 нм. фотометрического — 254 нм;

— дозирование пробы — пневматическое при 30 мБар в течение 5 с при напряжении 0 кВ;

— рекомендуется термостатирование капилляра при температуре 20 °С.

Перед измерением подготавливают капилляр к работе, промывая его 3,5 %-ным раствором соляной кислоты (см. 9.1.2) в течение 3 мин, затем дистиллированной водой — 3 мин, затем 4 %-ным раствором гидроокиси натрия (см. 9.1.1) в течение 3 мин, затем дистиллированной водой в течение 3 мин и далее рабочим буферным раствором (см. 9.1.6) в течение 3 мин.

Капилляр промывают каждый раз при включении прибора. Результаты первого измерения отбрасывают. Содержимое одной пробирки с рабочим буферным раствором можно использовать для выполнения не более пяти измерений.

9.3 Приготовление градуировочных растворов

9.3.1 Основной градуировочный раствор смеси кислот концентрацией 1 г/дм 3

Отбирают навески винной, яблочной, янтарной, лимонной кислот массой 0,100 г каждую (для моногидрата лимонной кислоты навеска составляет 0.109 г), лактата лития массой 0.117 г с точностью 0,001 г и вносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 , добавляют 50—70 см 3 дистиллированной воды, растворяют содержимое и затем доводят до метки. Срок хранения основного градуировочного раствора — не более 1 мес в стеклянной таре с пришлифованной пробкой при температуре 2 °С—8 # С.

9.3.2 Рабочие градуировочные растворы (массовой концентрацией 0.001, 0,005, 0,010, 0,025 и 0,050 г/дм 3 ) готовят из основного градуировочного раствора по 9.3.1. Для этого вносят в пять мерных колб (с пришлифованными пробками) вместимостью 1000 см 3 пипетками 1.5.10.25 и 50 см 3 основного градуировочного раствора, соответственно, затем доводят объемы растворов в колбах до метки дистиллированной водой, закрывают колбы пробками и тщательно перемешивают. Срок хранения растворов не более двух суток в стеклянной таре с пришлифованной пробкой при температуре 2 °С—8 °С.

9.3.3 Градуировочные растворы концентрацией 0,001, 0,005. 0,010, 0,025, 0,050 г/дм 3 отбирают мерной пипеткой в объеме 0.8 см 3 в пробирку Эппендорфа и центрифугируют 4 мин при 6000 об/мин для удаления растворенного воздуха. Проводят измерение по 9.2. На основе полученных данных строят градуировочные зависимости. Градуировка признается удовлетворительной, если коэффициент корреляции, рассчитанный программой, будет не менее 0,99. Градуировка системы обязательно проводится заново в следующих случаях:

при замене хотя бы одного из компонентов буферного раствора;

при изменении рабочего напряжения;

при изменении времени ввода пробы и давления ввода;

при отрицательных результатах контроля стабильности градуировочной характеристики. Примеры электрофореграмм приведены в приложении А.

9.3.4 Приготовление раствора для контроля стабильности градуировочной характеристики

В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят навески винной и лимонной кислот по 0,05 г каждой, разбавляют до метки дистиллированной водой и перемешивают. Массовая концентрация винной и лимонной кислот — 0,05 г/дм 3 . Срок хранения раствора — 1 мес при температуре 2 °С—8 °С. Контрольный раствор используют для проверки работоспособности прибора и контроля стабильности градуировочной характеристики.

Перед проведением измерений по 9.2 исследуемые пробы разбавляют в 50—100 раз дистиллированной водой до концентрации анализируемых кислот не более 0.050 г/дм 3 и центрифугируют. В случае необходимости идентификации какой-либо из кислот следует добавить эту кислоту в анализируемый образец и выполнить измерение повторно.

11 Обработка и оформление результатов измерений

11.1 Используя электрофореграмму. зарегистрированную при помощи программного обеспечения к прибору, рассчитывают массовую концентрацию соответствующих кислот по установленным градуировочным характеристикам (см. 9.3.3).

Массовую концентрацию органических кислот в исследуемой пробе X. г/дм 3 , вычисляют по формуле

где к — коэффициент разбавления пробы (см. раздел 9);

С — концентрация кислоты, найденная по градуировочному графику, г/дм 3 .

11.2 За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение Х_со. г/дм 3 , двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

где X,, Х₂ — результаты двух параллельных измерений массовой концентрации кислоты в пробе, г/дм 3 ; Х^ — среднее значение двух параллельных измерений массовой концентрации кислоты в пробе. г/дм 3 ;

г — значение предела повторяемости (см. таблицу 1), %.

11.3 Результат анализа представляют в виде: Х^ ± д г/дм 3 ,

где Х_ср — среднеарифметическое значение двух определений массовой концентрации кислоты в пробе, признанных приемлемыми, г/дм 3 ; д — граница абсолютной погрешности определения, г/дм 3 , при доверительной вероятности Р = 0,95.

11.4 Границу абсолютной погрешности А вычисляют по формуле

где 6— граница относительной погрешности измерения (см. таблицу 1), %.

Числовое значение результата определения должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение границы абсолютной погрешности.

Электрофореграммы стандартного раствора органических кислот и образца винопродукции

Рисунок А. 1 — Электрофореграмма стандартного раствора кислот, с концентрацией 0.05 г/дм 3

Примечание — На электрофореграммах возможно появление пиков неиденгифицированных кислот, не мешающих проведению количественного анализа.

УДК 663.2.001.4:006.354 ОКС 67.160.10 Н79

Ключевые слова: продукция винодельческая, органические кислоты, буферный раствор, капиллярный электрофорез, электрофореграмма

источник

Для подведения постоянного тока к пациенту используют электроды из металлических пластин (свинца, станиоля) или токопроводящей графитизированной ткани и гидрофильных матерчатых прокладок.

Последние имеют толщину 1-1,5 см и выступают за края металлической пластаны или токопроводящей ткани на 1,5-2 см.

Существуют другие виды электродов: стеклянные ванночки для глаз, полостные — в гинекологии, урологии. Гидрофильные прокладки предназначены для исключения возможности контакта продуктов электролиза (кислоты, щелочи) с кожей и изготавливаются из белой ткани (фланели, байки, бумазеи).

Нельзя пользоваться прокладками из шерстяной или окрашенной ткани. Гидрофильные прокладки сшивают из 5-6 слоев материн (для удобства прополаскивания в воде, кипячения и сушки), пришивают карман из одного слоя фланели, в который вкладывают свинцовую пластинку, соединенную с токонесущим проводом, металлическим зажимом или припаянную непосредственно к проводу.

В кабинете целесообразно иметь набор свинцовых пластин различной площади от 4 до 800-1200 см2 или такой же площади углеграфитовых. В последние годы выпускают одноразовые электроды. Используют электроды специальной формы (в виде полумаски для лица, «воротника» для верхней части спины и надплечий, двухлопастные, круглые на область глаз и др.).

Следует знать, что ионы свинца вредно действуют на организм, поэтому медицинские сестры, постоянно работающие в этом кабинете, должны получать пектин или мармелад. Свинцовые пластины периодически необходимо чистить наждачной бумагой и протирать спиртом для снятия налета окиси свинца, а также тщательно разглаживать металлическим валиком перед процедурой. Электроды фиксируют с помощью эластичных бинтов, мешочков с песком или тяжестью тела больного.

Перед процедурой медицинская сестра должна ознакомить больного с характером ощущений под электродами: равномерное покалывание и легкое жжение. При появлении неприятных болезненных ощущений или неравномерного жжения на определенном участке кожи больной, не двигаясь и не меняя положения, должен вызвать сестру. Не рекомендуется во время процедуры читать, разговаривать, спать. После процедуры необходим отдых в течение 20-30 мин.

Перед процедурой следует убедиться в отсутствии царапин, ссадин, мацерации, сыпи на коже. Гидрофильные матерчатые прокладки хорошо смачивают теплой водопроводной водой и располагают на коже пациента, свинцовая пластина с токонесущим проводом находится при этом в кармашке. Желательно под матерчатый электрод положить на кожу фильтровальную бумагу, чтобы предохранить прокладку от загрязнения.

Расположение электродов на теле больного определяется локализацией, остротой и характером патологического процесса. Различают поперечную, продольную и поперечно-диагональную методики. При поперечном расположении электроды помещают на противоположных поверхностях тела — один против другого (живот и спина, наружная и внутренняя поверхности коленного сустава и т. д.), что обеспечивает более глубокое воздействие. При продольной методике электроды лежат на одной поверхности тела: один — более проксимально, другой — дистально (продольно по позвоночнику, по ходу нерва, мышцы).

В этом случае оказывается влияние на более поверхностные ткани. Для поперечно-диагональной методики характерно расположение электродов на разных поверхностях тела, но один -в проксимальных его отделах, другой — в дистальных. При близком расположении расстояние между электродами должно быть не меньше половины их диаметра.

Методом электрофореза в организм чаще всего вводят лекарства-электролиты, диссоциирующие в растворах на ионы. Положительно заряженные ионы (+) вводят с положительного полюса (анода), отрицательно заряженные (-) — с отрицательного полюса (катода). При лекарственном электрофорезе можно использовать различные растворители, универсальным и лучшим из них является дистиллированная вода. При плохой растворимости лекарства в воде в качестве растворителя применяют димексид, который также оказывает и противовоспалительное действие.

Для электрофореза сложных органических соединений (белки, аминокислоты, сульфаниламиды) используют буферные растворы. Лекарственные вещества, например, лидаза или ронидаза, растворенные в кислом (ацетатном) буферном растворе с рН = 5,2, вводят с положительного полюса. Пропись его: ацетат (или цитрат) натрия И,4 г, ледяной уксусной кислоты 0,91 мл, дистиллированной воды 1000 мл, 64 единицы лидазы (0,1 г сухого вещества). 0,5-1 г ронидазы растворяют в 15 или 30 мл ацетатного буфера.

Для электрофореза трипсина и химотрипсина используют боратный буфер с рН = 8,0-9,0 (щелочная среда), который вводят с отрицательного полюса. Его состав: борной кислоты 6,2 г, калия хлорида 7,4 г, натрия (или калия) гидроксида 3 г, дистиллированной воды 500 мл. 10 мг трипсина или химотрипсина растворяют в 15-20 мл боратного буфера. Учитывая сложность приготовления указанных буферов, B.C. Улащик и Д.К. Данусевич (1975) предложили пользоваться дистиллированной водой, подкисляемой 5-10% раствором соляной кислоты до рН = 5,2 (для введения с анода) или подщелачиваемой 5-10% раствором едкой щелочи до рН = 8,0 (для введения с катода).

Приводим табл. 1, где указывается необходимое количество едкой щелочи или соляной кислоты в различных разведениях для подщелачивания и подкисления. Например: берем 10 мл 0,5 раствора глютаминовой кислоты и добавляем 0,16 мл едкой щелочи, получаем раствор с рН — 8,0 и вводим с отрицательного полюса. При добавлении соляной кислоты создается рН = 5,0.

Концентрация растворов лекарственных веществ, применяемых для электрофореза, колеблется чаще всего в пределах от 0,5 до 5,0%, так как доказано, что большие количества вводить не следует. Расход лекарства на каждые 100 см2 площади прокладки составляет ориентировочно от 10-15 до 30 мл раствора. Сильнодействующие средства (адреналин, атропин, платифиллин и др.) вводятся из растворов в концентрации 1:1000 или наносятся на прокладку в количестве, равном высшей разовой дозе.

Лекарственные вещества готовятся не более, чем на неделю, сильнодействующие — непосредственно перед введением. С целью экономии лекарственные препараты наносятся на фильтровальную бумагу, которую располагают на коже пациента, а сверху располагают матерчатую прокладку, смоченную теплой водой. Лекарственные вещества, используемые для электрофореза, приведены в табл. 2.

При электрофорезе одного лекарственного препарата его раствором смачивают одну гидрофильную прокладку соответствующей полярности. При одновременном введении двух веществ различной полярности («биполярный» электрофорез) ими смачивают обе прокладки (анод и катод). При необходимости введения двух лекарств одинаковой полярности используют две прокладки, соединенные сдвоенным проводом с одним полюсом тока. При этом одну прокладку смачивают одним, вторую — другим лекарством.

Для электрофореза антибиотиков и ферментов, чтобы избегать инактивации их продуктами электролиза, применяют специальные многослойные прокладки, в середине которых помещают 3-4 слоя фильтровальной бумаги, смоченной «предохранительным» раствором глюкозы (5%) или гликоколя (1%). Можно пользоваться и обычными гидрофильными прокладками, но толщина их должна составлять не менее 3 см.

После каждой процедуры необходимо тщательно промывать прокладки проточной водой из расчета 8-10 л на одну, для удаления из них лекарственных веществ. В «кухне» должно быть 2 раковины: одна для индифферентных прокладок, другая — для активных, т. е. смоченных лекарственным веществом. Для сильнодействующих препаратов целесообразнее иметь отдельные прокладки, на которых можно вышить название лекарства.

Промывать и кипятить прокладки, смоченные различными лекарственными веществами следует раздельно, чтобы избежать загрязнения их вредными для организма ионами. В конце рабочего дня гидрофильные прокладки кипятят, отжимают и оставляют в сушильном шкафу.

Введение лекарственных веществ на димексидс с помощью тока называется суперэлектрофорезом. Диметилсульфоксиду (ДМСО) присуща способность усиливать действие многих лекарств и повышать устойчивость организма к повреждающему действию низких температур и радиации. ДМСО обладает выраженным транспортирующим свойством. ДМСО считается биполярным, однако более выражен перенос в сторону катода.

Можно применять димсксид в виде аппликаций на кожу, так как при этом он обнаруживается в крови уже через 5 мин. Максимальная концентрация наблюдается через 4-6 час, удерживается препарат в организме не более 36-72 часов. Выраженное действие оказывают 70-90% растворы, однако они редко применяются из-за выраженной аллергической реакции. Чистый димсксид лучше применять в виде компрессов, а при электрофорезе использовать как растворитель.

Труднорастворимыс лекарственные вещества, приготовленные на ДМСО, проникают в большем количестве и на большую глубину (дерма и подкожножировая клетчатка). При этом они быстрее поступают в кровь, а их фармакологический эффект значительно возрастает.

Для электрофореза водорастворимых лекарств рекомендуется использовать 20-25% водные растворы димексида, а для трудно- и водонерастворимых препаратов — 30-50% водные растворы. Для приготовления последних лекарство сначала растворяют в концентрированном растворе ДМСО, а затем при постоянном взбалтывании добавляют до нужной концентрации дистиллированную воду.

Для электрофореза из среды ДМСО используют 5-10% раствор аспирина в 50% ДМСО, 5-10% раствор анальгина в 25% ДМСО, 1-2% раствор трипсина в 25% ДМСО, 32-64 ЕД лидазы в 25% растворе ДМСО, 2-5% раствор адебита в 25% ДМСО. Все перечисленные препараты вводятся биполярно. Димсксид у некоторых пациентов вызывает аллергическую реакцию, поэтому перед первой процедурой следует нанести на небольшой участок кожи 25% раствор препарата и посмотреть реакцию через 30-40 мин. Если на коже появилась отечность, краснота, зуд, то ДМСО применять не следует.

Порядок назначения. В назначении указывают название метода (гальванизация или электрофорез с обозначением концентрации раствора и полярности иона), место воздействия, применяемую методику (продольная, поперечная и др.), силу тока в миллиамперах, продолжительность в мин, последовательность (ежедневно или через день), число процедур на курс лечения.

Боголюбов В.М., Васильева М.Ф., Воробьев М.Г.

источник

ГОСТ Р 54414-2011 РЫБА И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НЕЕ. ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ РЫБЫ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА С ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Добавил: Богдан Кривошея

Дата: [20.03.2018]

ГОСТ Р 54414-2011 РЫБА И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НЕЕ. ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ РЫБЫ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА С ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Fish and products from it. Species identification of fish by electrophoresis with sodium dodecyl sulphate in polyacrylamide gel method

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

1 Разработан Открытым акционерным обществом «Научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт по развитию и эксплуатации флота» (ОАО «Гипрорыбфлот»)

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 299 «Консервы и пресервы из рыбы и нерыбных объектов, тара, методы контроля»

3 Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 сентября 2011 г. N 334-ст

Настоящий стандарт распространяется на отварную, копченую, соленую продукцию с массовой долей поваренной соли не более 5, 5% и фаршевые изделия из рыбы, а также рыбу-сырец, охлажденную, мороженую, используемую для приготовления этой продукции, и устанавливает метод электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (далее — SDS-электрофорез) для видовой идентификации рыбы.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52840-2007 Рыба и продукция из нее. Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле.

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть первая. Метрологические и технические требования.

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 83-79 Реактивы. Натрий углекислый. Технические условия

ГОСТ 244-76 Натрия тиосульфат кристаллический. Технические условия

ГОСТ 1277-75 Реактивы. Серебро азотнокислое. Технические условия

ГОСТ 1625-89 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 19814-74 Кислота уксусная синтетическая и регенерированная. Технические условия

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 SDS-электрофорез: Метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

3.2 маркерные белки: Основные белки, характерные (видоспецифичные) для каждого вида анализируемого объекта.

[ГОСТ Р 52840-2007, статья 3.2]

3.3 стандартные белки: Белки с известной молекулярной массой (ММ).

3.4 референс-образец: Образец продукции, используемый в качестве стандарта при оценке результатов идентификации.

Метод основан на видовой специфичности белков мышечной ткани рыб и заключается в переводе белков исследуемого образца в раствор с помощью додецилсульфата натрия и дальнейшем разделении белковых молекул в соответствии с их молекулярной массой в градиентном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Идентификацию проводят путем сравнения картин электрофоретического распределения белковых фракций анализируемого образца с соответствующим референс-образцом.

Для проведения анализа используют следующее оборудование, материалы и реактивы:

— универсальную модульную автоматизированную систему для разделения белков с использованием готовых гелевых сред в программируемом режиме и автоматической обработкой гелей (фиксация, окрашивание, отмывка), с контролем условий разделения (температуры, параметров тока) со следующими программными параметрами: напряжение от 10 до 2000 В, сила тока от 0, 1 до 50, 0 мА, мощность 7, 0 Вт, температура от 0°С до 70°С или иное электрофоретическое оборудование для разделения белков методом SDS-электрофореза (далее — система);

— центрифугу рефрижераторную с частотой вращения не менее 12000 мин -1 ;

— рН-метр — милливольтметр лабораторный рН — 673 М;

— пробирки центрифужные вместимостью 10 см 3 ;

— аппликатор с капиллярными отверстиями объемом 1 мкл для внесения образцов в гель;

— микродозатор с переменным объемом дозирования: от 0, 5 до 10, 0 мм 3 (шаг — 0, 1 мм 3 , точность ± (1, 5-5, 0)%, воспроизводимость от 1, 0% до 5, 0%);

— наконечники для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей;

— ступку фарфоровую по ГОСТ 9147;

— штамп для образца с лунками вместимостью не менее 1, 5 мкл;

— весы неавтоматического действия II класса точности с допускаемой погрешностью взвешивания не более ±0, 001 г по ГОСТ Р 53228;

— холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда по ГОСТ 26678;

— колбы стеклянные мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770;

— цилиндры стеклянные мерные лабораторные 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770;

— пипетки стеклянные 1-1-2-5, 1-1-2-10 по ГОСТ 29227;

— полоски буферные из агарозы;

— гели градиентные полиакриламидные с додецилсульфатом натрия, 10%-15%;

— бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;

— кислоту уксусную по ГОСТ 19814, х.ч, ;

— спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.;

— глицерин по ГОСТ 6259, ч.д.а.;

— краситель бромфеноловый синий, ч.д.а;

— краситель кумасси R 250, ч.д.а;

— трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорид, х.ч.;

— трис (гидроксиметил) аминометан, х.ч.;

— воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

— альдегид глутаровый с содержанием основного компонента не менее 25%;

— серебро азотнокислое по ГОСТ 1277;

— натрий углекислый 12, 5%-ный;

— натрия тиосульфат кристаллический по ГОСТ 244;

— формальдегид 37%-ный по ГОСТ 1625;

— набор стандартных белков для градуировки с известными молекулярными массами в диапазоне от 14400 до 97000 а.е.м.

Допускается использование других средств измерений и вспомогательного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам и качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

Допускается использование других реактивов, в том числе импортных, по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.

Отбор проб проводят по ГОСТ 31339.

7.1 Экстрагирующий раствор

В мерную колбу вместимостью 100 см 3 вносят 2 г додецилсульфата натрия и доводят объем до метки дистиллированной водой.

В мерную колбу вместимостью 50 см 3 вносят 5 см 3 водного раствора трис-буфера по 7.2.1, добавляют 4 см 3 глицерина, 8 см 3 10%-ного водного раствора додецилсульфата натрия, 2 см 3 2-меркаптоэтанола и 2 см 3 0, 1%-ного водного раствора бромфенолового синего.

7.2.1 Приготовление водного раствора трис-буфера: в мерную колбу вместимостью 100 см 3 вносят 3 см 3 раствора трис (гидроксиметил) аминометана молярной концентрацией 0, 5 моль/дм 3 и доводят объем до метки водным раствором трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорида молярной концентрацией 0, 5 моль/дм 3 . Значение рН водного раствора трис-буфера должно составлять 6, 8±0, 01.

7.2.1.1 Приготовление водного раствора трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорида молярной концентрацией 0, 5 моль/дм 3 : в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 78, 5 г трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорида и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.1.2 Приготовление водного раствора трис (гидроксиметил) аминометана молярной концентрацией 0, 5 моль/дм 3 : в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 60, 5 трис (гидроксиметил) аминометана и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.2 Приготовление 10%-ного водного раствора додецилсульфата натрия: в мерную колбу вместимостью 100 см 3 вносят 10 г додецилсульфата натрия и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.2.3 Приготовление 0, 1%-ного водного раствора бромфенолового синего: в мерную колбу вместимостью 100 см 3 вносят 0, 1 г бромфенолового синего и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.3 Растворы для обработки гелей при окрашивании раствором кумасси

7.3.1 Приготовление промывного раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 300 см 3 96%-ного этилового спирта, добавляют 600 см 3 дистиллированной воды и 100 см 3 уксусной кислоты.

7.3.2 Окрашивающий раствор состоит из основного и рабочего.

7.3.2.1 Приготовление основного раствора: в мерную колбу вместимостью 300 см 3 помещают 0, 4 г кумасси, добавляют 80 см 3 дистиллированной воды и перемешивают в течение 5-10 мин. Добавляют 120 см 3 96%-ного этилового спирта и перемешивают еще 2 мин.

7.3.2.2 Приготовление рабочего раствора: в мерной колбе вместимостью не менее 100 см 3 смешивают 50 см 3 основного раствора с 50 см 3 раствора 20%-ной уксусной кислоты.

7.3.2.3 Приготовление раствора 20%-ной уксусной кислоты: 20 см 3 уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см 3 и доводят до метки.

7.3.3 Приготовление консервирующего раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 40 см 3 глицерина, 40 см 3 уксусной кислоты и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.4 Растворы для обработки гелей при окрашивании серебром

7.4.1 Приготовление промывного раствора: в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 100 см 3 96%-ного этилового спирта, добавляют 850 см 3 дистиллированной воды и 50 см 3 уксусной кислоты.

7.4.2 Приготовление окрашивающего раствора: в мерную колбу вместимостью 100 см 3 вносят (0, 15±0, 001) г азотнокислого серебра и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.4.3 Приготовление раствора, усиливающего окраску: в мерной колбе вместимостью 100 см 3 смешивают 30 см 3 25%-ного глутарового альдегида и 60 см 3 дистиллированной воды.

7.4.4 Приготовление раствора, развивающего окраску: в мерную колбу вместимостью 1000 см 3 вносят 200 см 3 12, 5%-ного раствора углекислого натрия, 800 см 3 дистиллированной воды и 0, 4 см 3 37%-ного формальдегида.

7.4.5 Приготовление раствора, останавливающего окраску: в мерную колбу вместимостью 100 см 3 вносят (1, 60±0, 01) г тиосульфата натрия и (3, 70±0, 01) г трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорида и доводят объем дистиллированной водой до метки.

7.4.6 Приготовление консервирующего раствора: в мерную колбу вместимостью 100 см 3 вносят 10 см 3 глицерина и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.5 Растворы могут храниться в течение месяца при комнатной температуре. Рабочий раствор готовят в день использования.

В качестве референс-образца для видовой идентификации рыбы, в том числе в составе рыбной продукции, в соответствии с областью применения настоящего стандарта могут быть использованы: соответствующий образец рыбы-сырца (для однокомпонентных продуктов) или образец, приготовленный по технологии аналогичной технологии изготовления анализируемого образца (для одно- и многокомпонентных продуктов).

9.1 Подготовка образцов к анализу

Пробы анализируемого образца и референс-образца готовят в идентичных условиях.

9.1.1 Мышечную ткань анализируемого образца массой не менее 1 г измельчают в ступке.

9.1.2 Пробу анализируемую образца по 9.1.1 отбирают массой (0, 50±0, 01) г в центрифужные пробирки вместимостью 10 см 3 и заливают 2 см 3 2%-ного водного раствора додецилсульфата натрия по 7.1, смесь периодически перемешивают в течение 30 мин.

9.1.3 Смесь, полученную по 9.1.2, центрифугируют при частоте вращения 12000 мин -1 при температуре 20°С в течение 15 мин.

9.1.4 Надосадочную жидкость, полученную по 9.1.3, фильтруют через бумажный фильтр и отбирают в стеклянные пробирки вместимостью 10 см 3 по 0, 25 см 3 фильтрата.

9.1.5 К раствору, полученному по 9.1.4, добавляют 1, 5 см 3 буферного раствора, приготовленного по 7.2, и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, при необходимости фильтруют и используют для проведения электрофореза.

9.2 Приготовление раствора стандартных белков

9.2.1 Набор стандартных белков для градуировки с известной молекулярной массой растворяют в 1, 5 см 3 буферного раствора, приготовленного по 7.2, и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и используют для проведения электрофореза.

9.2.1.1 Для видовой идентификации рыбы методом SDS-электрофореза используется набор стандартных белков для градуировки с молекулярной массой от 14400 до 97000 а.е.м. промышленного производства в виде сухой замороженной смеси.

9.2.1.2 Для автоматизированной разделительной системы используется набор белков с общей массой 100 мкг:

— фосфорилаза Б с молекулярной массой 97000 а.е.м.;

— альбумин с молекулярной массой 66000 а.е.м.;

— овальбумин с молекулярной массой 45000 а.е.м.;

— карбоангидраза с молекулярной массой 30000 а.е.м.;

— ингибитор трипсина с молекулярной массой 20100 а.е.м.;

— альфа-лактальбумин с молекулярной массой 14400 а.е.м.

9.3 Проведение SDS-электрофореза

9.3.1 Полиакриламидный гель помещают в систему в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

9.3.2 Вставляют буферные полоски в отделения держателя буферных полосок: одну — в отделение катода и одну — в отделение анода.

9.3.3 Электроды устанавливают в верхнем положении.

9.3.4 Формируют лунки в парафиновой пленке с помощью штампа: штамп с лунками, обращенными вверх, кладут на стол, накрывают парафиновой пленкой защитным слоем вверх (по направлению линий отверстий), в парафиновой пленке, двигаясь вдоль линии лунок, делают углубления при помощи стеклянной палочки, а затем снимают защитный слой.

9.3.5 Растворы, т.е. раствор анализируемого образца и аналогично приготовленный раствор референс-образца, полученные по 9.1.5, а также раствор стандартных белков для градуировки с известной молекулярной массой, приготовленный по 9.2, вносят микродозатором в каждую лунку 1, 5 мкл.

9.3.6 Аппликатор опускают на поверхность растворов (стандартных белков для градуировки, анализируемого образца и референс-образцов), помещенных в лунки по 9.3.5, сформированные в парафиновой пленке с помощью штампа по 9.3.4, нарушая поверхность капель для заполнения капилляров.

9.3.7 Аппликатор, наполненный образцами по 9.3.6, помещают в систему со стороны катода и проводят электрофорез в автоматическом режиме в соответствии с инструкцией к системе.

Условия разделения: напряжение 220 В, ток 10 мА, мощность 2, 5 Вт, температура 15°С. Когда разделение закончено, гель вынимают и переносят в камеру окрашивания. Окончанием разделения служит звуковой сигнал, подаваемый системой.

9.4 Проведение окрашивания

Полиакриламидные гели окрашивают в автоматическом режиме с применением кумасси в соответствии с таблицей 1 или азотнокислого серебра в соответствии с таблицей 2.

источник

ГОСТ Р 58254-2018 Мед натуральный. Определение водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза

Текст ГОСТ Р 58254-2018 Мед натуральный. Определение водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза

ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Федеральный научный центр пчеловодства» (ФГБНУ «ФНЦ пчеловодства»)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 432 «Пчеловодство»

3 УТ8ЕРЖДЕН И 8ВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 октября 2018 г. № 831-ст

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. Nt 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок—в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра /замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

3 Термины и определения. 2

5 Требования к условиям измерений. 2

6 Требования к квалификации оператора. 2

7 Требования к показателям точности метода. 2

8 Требования безопасности проведения работ. 4

9 Отбор и подготовка проб. 4

10 Определение содержания витаминов. 4

10.1 Средства измерений, оборудование, материалы и реактивы. 4

10.2 Подготовка к проведению измерений. 5

10.3 Контроль стабильности градуировочной характеристики. 11

10.4 Проведение измерений. 11

10.5 Обработка результатов измерений. 12

10.6 Проверка приемлемости результатов измерений. 12

10.7 Оформление результатов измерений. 12

10.8 Оценка приемлемости результатов, получаемых в условиях вспроизводимости. 12

11 Контроль точности результатов измерений при реализации метода. 13

11.1 Контроль с использованием образцов для контроля. 13

11.2 Контроль стабильности. 13

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Определение водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза

Natural honey. Determination of water-soluble vitamins by capillary electrophoresis method

Настоящий стандарт распространяется на натуральный мед и устанавливает метод капиллярного электрофореза для определения содержания водорастворимых витаминов: 8, (тиаминхлорида). В₂ (рибофлавина), В₂ (лантотеновой кислоты), В₅ (никотиновой кислоты и никотинамида), В₆ (пиридоксина), В_с (фолиевой кислоты), С (аскорбиновой кислоты) с целью идентификации их естественного содержания.

Настоящий стандарт не применяется для идентификации различных видов меда или его фальсификатов.

в настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.0.004 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770 (ИСО 1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4199 Реактивы. Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия

ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5644 Сульфит натрия безводный. Технические условия ГОСТ 9656 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 14919 Электроплиты, электроплитки и жарочные элекгрошкафы бытовые. Общие техни

ческие условия ГОСТ 16317 ГОСТ 19792 ГОСТ 22180 ГОСТ 25336

Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

Мед натуральный. Технические условия

Реактивы. Кислота щавелевая. Технические условия

Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и

ГОСТ 25629 Пчеловодство. Термины и определения

ГОСТ 29227 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725*6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов из* мерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 58144 вода дистиллированная. Технические условия

При мече н ие — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных 8 данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ 25629.

Метод капиллярного электрофореза основан на разделении сложных смесей компонентов в кварцевом капилляре при приложении к нему электрического напряжения. Возникающее в капилляре электрическое поле вызывает миграцию зоны пробы и ее разделение. Разделение пробы происходит вследствие различия скоростей перемещения зараженных частиц в растворе под влиянием электрического поля.

В зависимости от состава анализируемой пробы натурального меда используют два варианта метода капиллярного электрофореза:

— метод капиллярного зонного электрофореза (далее — КЗЭ) не применяют для определения В? (рибофлавина) и В₅ в форме никотинамида;

— метод мицеллярной электрокинетической хроматографии (далее — МЭКХ) не применяют для определения В, (тиаминхлорида).

При выполнении измерений следует соблюдать следующие условия:

— температура окружающего воздуха. (25 ± 5) в С:

• относительная влажность воздуха. (55 ± 25) %;

-атмосферное давление. 97.1—101.1 кПа(730—760мм рт.ст.>.

Выполнение измерений должен проводить инженер-химик, техник или лаборант, квалификацией не ниже 4-го разряда, подготовленный по ГОСТ 12.0.004. имеющий высшее или специальное образование. опыт работы в химической лаборатории, изучивший техническую документацию на капиллярный электрофорез.

Диапазоны измерений содержания витаминов и значения показателей повторяемости, воспроизводимости и точности при вероятности Р — 0.95 приведены в таблице 1.

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений. гмг

отклонено повторяемости) о_г%

расхождения между двумя результатами определений, полученными в услоодях воспроизводимости) Р.%.Р = 0.95

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

Баня водяная с регулятором нагрева.

Пробирки центрифужные полипропиленовые.

Дозаторы переменного объема 10—100 мм э . 100—1000 мм 3 . 1000—5000 мм 3 и с пределом допускаемой погрешности измерения не более ±5 %.

Наконечники полипропиленовые для дозаторов, вместимостью 0.3 см 3 ,1.0 см 3 и 5.0 см 3 .

Сосуды из темного стекла с герметично завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками вместимостью 10—40 см 3 для приготовления основных растворов витаминов.

Колбы плоскодонные с притертыми пробками Кн-2-50-18(22) по ГОСТ 25336.

Стаканы химические В-1-100 (150,250) ТС по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2-25 (50.100)-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры 1 (3)-10(25) по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1(2.3,5>-1(1а.2.2а)>2>1(5,10) по ГОСТ 29227.

Фильтры целлюлозно-ацетатные, размер пор — 0,2 мкм. диаметр — 25 мм.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор молярной концентрации с (NaOH) = 0,5 моль/дм 3 .

Кислота соляная по ГОСТ 3118.

Кислота борная по ГОСТ 9656.

Натрия сульфит безводный по ГОСТ 5644.

Кислота щавелевая по ГОСТ 22180.

Натрий тетраборнокислый. стандарт-титр.

Натрий тетраборнокислый 10-водный по ГОСТ 4199.

Натрия додецилсульфат. витамин В, (тиаминхлорид).

Витамин В₃ (пантотеноеая кислота), витамин В₅ (никотиновая кислота).

Витамин В_е (пиридоксин), витамин В_с (фолиевая кислота).

Витамин С (L-асхорбиновая кислота).

Вода дистиллированная по ГОСТ Р 58144.

1 Допускается применение средств измерений и оборудования с такими же или лучшими метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

2 Все применяемые средства измерений должны быть проверены (калиброваны), испытательное оборудование — аттестовано.

3 Все реактивы должны быть квалификации х. ч. или ч. д. а.

10.2 Подготовка к проведению измерений

10.2.1 Приготовление вспомогательных растворов

10.2.1.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с (НО) = 6 моль/дм 3

50 см 3 концентрированной соляной кислоты смешивают в химическом стакане вместимостью

200 см 3 с 50 см 3 дистиллированной воды. Смесь переносят в стеклянную емкость с притертой пробкой для хранения. Срок хранения не ограничен.

10.2.1.2 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с (НО) = 1 моль/дм 3

17 см 3 раствора соляной кислоты, приготовленного по 10.2.1.1. смешивают в химическом стакане

вместимостью 200 см 3 с 83 см 3 дистиллированной воды. Смесь переносят в стеклянную емкость с притертой пробкой для хранения. Срок хранения не ограничен.

10.2.1.3 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации с (NaOH) = = 0.5 моль/дм 3

Навеску гидроокиси натрия массой 2.000 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см 3 с 50—60 см 3 дистиллированной воды и объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки. Раствор перемешивают и хранят в емкости из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой. Срок хранения — не более 2 мес.

Примечание — Растворы по 10.2.1.2,10.2.1.3 предназначены только для промывок капилляра.

10.2.1.4 Приготовление раствора борной кислоты молярной концентрации с (1/3 Н₃ВО₃) = = 0.2 моль/дм 3

Навеску борной кислоты массой 1.238 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см 3 в 50— 80 см 3 дистиллированной воды, доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Раствор хранят в емкости из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой. Срок хранения — не более 2 мес.

10.2.1.5 Приготовление раствора соляной кислоты объемной концентрации 1 %

2 см 3 раствора соляной кислоты, приготовленной по 10.2.1.1, растворяют в 98 см 3 дистиллированной воды в стеклянной емкости вместимостью 100—150 см 3 и тщательно перемешивают. Раствор хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой. Срок хранения не ограничен.

10.2.1.6 Приготовление раствора щавелевой кислоты с массовой долей 1 %

Навеску безводной щавелевой кислоты массой 1.000 г или 2-водной щавелевой кислоты массой 1.400 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см 3 в дистиллированной воде, доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Раствор хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой. Срок хранения не ограничен.

10.2.1.7 Приготовление раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации с (Na₂8₄O₇ • ЮН₂О) = 0,05 моль/дм 3

Раствор готовят из стандарт-титра по прилагаемой к нему инструкции и хранят в полиэтиленовой емкости с плотно завинчивающейся крышкой. Срок хранения — не более 2 мес.

Примечание — При отсутствии стандарт-титра раствор готовят из 10-водното тетраборнокислого натрия. Для этого навеску препарата массой 19,071 г растворяют в мерной колбе вместимостью 1 дм 3 в свежелрокипячен-ной и охлажденной без доступа воздуха дистиллированной воде. pH раствора при 20 *С должен быть (9,22 ± 0,10).

10.2.1.8 Приготовление раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации c(Na₂B₄O₇ • 10Н₂0) = 0,01 моль/дм 3

20 см 3 раствора тетраборнокислого натрия, приготовленного по 10.2.1.1, помещают в химический стакан вместимостью 100 см 3 , добавляют 20 см 3 раствора борной кислоты (см. 10.2.1.4) и тщательно перемешивают. Раствор хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой. Срок хранения — не более 2 мес.

10.2.1.9 Приготовление ведущего электролита № 1

40 см 3 тетраборнокислого натрия, приготовленного по 10.2.1.7. помещают в химический стакан вместимостью 100 см 3 , добавляют 20 см 3 раствора борной кислоты (см. 10.2.1.4) и тщательно перемешивают. Раствор хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой. Срок хранения — не более 2 мес.

10.2.1.10 Приготовление ведущего электролита No 2

Навеску додецилсульфата натрия массой 0.578 г помещают в мерную колбу вместимостью 25 см 3 , добавляют 15—17 см 3 ведущего электролита No 1 (см. 10.2.1.9) и перемешивают. Доводят объем в колбе до метки этим же раствором и снова перемешивают. Раствор хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой. Срок хранения — не более 1 мес.

10.2.1.11 Подготовка растворов ведущих электролитов для проведения измерений

Непосредственно перед началом измерений растворы ведущих электролитов необходимо:

— профильтровать через ацетатно-целлюлозный фильтр, отбросив первые порции фильтрата (1—1.5 см 3 );

— дегазировать центрофугироеанием в течение 3—5 мин при скорости вращения 5000 об/мин.

10.2.1.12 Приготовление раствора сульфита натрия молярной концентрации с (1/2 Na₂SO₃) = 0.1 моль/дм 3 .

Навеску безводного сульфита натрия массой 0,630 г помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3 , добавляют 20—30 см 3 дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения препарата и доводят объем раствора в колбе дистиллированной водой до метки.

Раствор используют только в день приготовления, поэтому указанный выше объем (50 см 3 ) не является строго определенным. Его изменяют в зависимости от интенсивности использования раствора в течение предстоящего рабочего дня.

10.2.1.13 Приготовление экстрагирующего раствора для получения вытяжки витаминов из испытуемых проб

Раствор тетраборнокислого натрия (см. 10.2.1.7) смешивают с раствором сульфита натрия (см. 10.2.1.12) в соотношении 3:2 в химическом стакане вместимостью 250 см 3 . Раствор хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой и используют только в день приготовления.

10.2.2 Подготовка капилляра к работе

10.2.2.1 Подготовка нового капилляра к работе

Подготовку нового капилляра к работе проводят в соответствии с руководством по эксплуатации системы капиллярного электрофореза.

10.2.2.2 Ежедневная подготовка капилляра к работе

Если капилляр оставлен на ночь заполненным дистиллированной водой, то перед работой его необходимо промыть раствором гидроокиси натрия (см. 10.2.1.3) и дистиллированной водой по 5 мин. затем раствором соответствующего ведущего электролита в течение времени, предусмотренного инструкцией к прибору.

В том случае, если накануне в капилляре был оставлен раствор ведущего электролита, то на следующий день в зависимости от предстоящего метода определения витаминов капилляр промывают следующим образом:

« при работе методом КЗЭ — свежей порцией ведущего электролита (см. 10.2.1.9) в течение 10— 15 мин без напряжения:

— при работе методом МЭКХ следует проводить последовательную промывку дистиллированной водой, раствором гидроокиси натрия (см. 10.2.1.3) и снова дистиллированной водой по 5 мин. а затем ведущим электролитом (см. 10.2.1.10) в течение 10—15 мин без напряжения.

Во всех случаях следует проверять состояние капилляра, проанализировав контрольный раствор (см. 10.2.3.6).

Между анализами капилляр промывают соответствующим ведущим электролитом в течение 3 мин.

После работы с испытуемыми образцами в конце рабочего дня необходимо проводить последовательную промывку капилляра дистиллированной водой в течение 10 мин. раствором соляной кислоты (см. 10.2.1.2) и дистиллированной водой по 5 мин, а затем раствором гидроокиси натрия (см. 10.2.1.3) и дистиллированной водой по 10 мин.

При определении витаминов методом КЗЭ капилляр оставляют на ночь заполненным дистиллированной водой.

При определении витаминов методом МЭКХ капилляр промывают ведущим электролитом № 1 (см. 10.2.1.9) в течение 10—15 мин и оставляют на ночь с этим же раствором.

Примечание — При работе с испытуемыми пробами на эпектрофореграмме может наблюдаться дрейф базовой линии, появление ступеней и смещение времени выхода компонентов, что связано с возможным мешающим влиянием матричных компонентов или примесей. В этом случае рекомендуется:

• во время проведения анализов увеличить время промывки капилляра между анализами:

— проводить промывку в течение 3 мин под напряжением;

— при появлении ступеней заменить свежими порциями ведущий электролит в пробирках.

Порядок хранения капилляра при перерывах в работе зависит от интенсивности использования прибора.

При перерывах в работе на 2—3 сут (до недели) капилляр следует промыть дистиллированной водой и оставить заполненным дистиллированной водой.

При перерывах на срок более недели капилляр необходимо после тщательной промывки дистиллированной водой высушить и оставить в сухом состоянии. 8 этом случае для восстановления работоспособности капилляра его нужно подготовить к работе, как новый капилляр.

10.2.3 Приготовление градуировочных растворов

10.2.3.1 Приготовление основных растворов витаминов В., (тиаминхлорида). В^ (пактотеноеой кислоты), В₅ (никотиновой кислоты), В₅ (никотинамида), В₆ (пиридоксина) с номинальными значениями массовых концентраций 1 мг/см 3 .

Навески витаминов в соответствии с таблицей 2 вносят в отдельные емкости из темного стекла и растворяют в 5 см 3 дистиллированной воды. Растворы хранят а герметично закрытых емкостях в холодильнике. Срок хранения — 3 мес.

Таблица 2 — Рекомендуемые навески с учетом форм витаминов, необходимых для приготовления основных растворов, и коэффициенты пересчета навески на массу соответствующего витамина

Витамин в форма взвешивания

Витамин В₅ (никотиновая кислота)

Массовые концентрации витаминов в каждом растворе С_г мг/см 3 , вычисляют по формуле

где т₍ — масса навески соответствующего витамина в форме взвешивания, мг:

— коэффициент пересчета массы навески на массу соответствующего витамина:

V,- — объем основного раствора соответствующего витамина, см 3 .

10.2.3.2 Приготовление основного раствора витамина В_с (фолиевой кислоты) с номинальным значением массовой концентрации 0.5 мг/см 3

Навеску фолиевой кислоты массой в соответствии с таблицей 2 вносят в емкость из темного стекла вместимостью 10—15 см 3 , добавляют 10 см 3 раствора тетрабориокислого натрия (см. 10.2.1.8) и тщательно перемешивают до полного растворения навески. Массовую концентрацию витамина В_с (фолиевой кислоты) в полученном растворе вычисляют по формуле (1). Раствор хранят в герметично закрытой емкости в холодильнике. Срок хранения — 1 мес.

10.2.3.3 Приготовление основного раствора витамина С (аскорбиновой кислоты) с номинальным значением массовой концентрации 2 мг/см 3

Навеску аскорбиновой кислоты массой в соответствии с таблицей 2 вносят в емкость из темного стекла вместимостью 10—15 см 3 , добавляют 1 см 3 раствора соляной кислоты (см. 10.2.1.5), 4 см 3 рас* твора щавелевой кислоты (см. 10.2.1.6) и перемешивают до полного растворения навески. Массовую концентрацию витамина С (аскорбиновой кислоты) в полученном растворе вычисляют по формуле (1). Раствор хранят в герметично закрытой емкости в холодильнике. Срок хранения — одна неделя.

10.2.3.4 Приготовление основного раствора витамина В₂ (рибофлавина) с номинальным экачени» ем массовой концентрации 0.5 мг/см 3

Навеску рибофлавина массой в соответствии с таблицей 2 вносят в емкость из темного стекла вместимостью 10—15 см 3 , добавляют 0.2 см 3 раствора соляной кислоты (см. 10.2.1.1), леремешивают до полного растворения, добавляют 8 см 3 раствора щавелевой кислоты (см. 10.6.1.6). 1,8 см 3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают. В случае неполного растворения навески следует нагреть раствор в закрытом сосуде на водяной бане при температуре 80 ’С. Массовую концентрацию витамина В₂ (рибофлавина) в полученном растворе вычисляют по формуле (1). Раствор хранят в герметично закрытой емкости в холодильнике. Срок хранения — 1 мес.

10.2.3.5 Приготовление градуировочных растворов витаминов

Основные растворы витаминов помещают в стеклянную емкость в объемах, указанных в таблице 3. Добавляют 1065 мм 3 раствора тетрабориокислого натрия (см. 10.2.1.8). 240 мм 3 раствора щавелевой кислоты (см. 10.2.1.6). 60 мм 3 раствора соляной кислоты (см. 10.2.1.5) и тщательно перемешивают. Массовые концентрации витаминов в градуировочном растворе С_г, мг/дм 3 , вычисляют по формуле

где С, — массовая концентрация витамина в основном растворе, мг/дм 3 ;

V, — объем основного раствора соответствующего витамина, мм 3 ;

1000 — коэффициент пересчета см 3 в дм 3 ;

2000 — общий объем градуировочного раствора, мм 3 .

Градуировочный раствор используют в течение 2 ч с момента приготовления.

Таблица 3 — Объемы основных растворов витаминов, используемых для приготовления градуировочных растворов

Витамин В_& (никотиновая кислота)

10.2.3.6 Приготовление контрольного раствора витаминов

8 пробирку помещают 20 мм 3 основного раствора пиридоксина и 40 мм 3 основного раствора ри-бофлавина. специально приготовленных для этой цели по 10.2.3.1 и 10.2.3.4 соответственно. Добавляют 940 мм 3 раствора тетраборнокислого натрия (см. 10.2.1.6) и перемешивают. Массовые концентрации витаминов в контрольном растворе С_е вычисляют по формуле

где С, — массовая концентрация витамина в основном растворе, мг/дм 3 ;

V, — объем основного раствора соответствующего витамина, мм 3 :

1000 — коэффициент пересчета см 3 в дм 3 ;

1000 — общий объем градуировочного раствора, мм 3 .

Контрольный раствор следует использовать в течение 2 ч с момента приготовления для проверки работоспособности прибора и для контроля стабильности градуировочной характеристики (см. 10.2.5).

10.2.4.1 Градуировка системы методом КЗЭ

Рекомендуемые параметры ввода и условия анализа представлены в таблице 4. Непосредственно перед анализом растворы центрифугируют е течение 5 мин при 5000—6000 об/мин.

Таблица 4 — Условия анализа градуировочного раствора методом КЗЭ

Определяемые витамины в порядке выхода

В, (тиамин), В₂ (рибофлавин). В_е (пиридоксин).

С (аскорбиновая кислота). В₃ (пантотеновая кислота).

В₅ (никотиновая кислота), В_с (фолиевая кислота)

Ввод градуировочного раствора (пробы)

В начале анализа — 0. после появления пика В& (пиридоксина) прикладывают давление 30 до конца анализа

При выполнении анализа необходимо изменение условий регистрации электрофореграммы. а именно приложения давления после появления пика пиридоксина.

Для определения момента времени, по истечении которого необходимо приложить давление, готовят пробный раствор витаминов в соответствии с 10.2.3.5 и снимают пробную электрофореграмму. В этом случае после регистрации пиридоксина (третьего компонента анализируемого раствора) в ручном режиме задают давление 30 мбар и ведут анализ до появления лика последнего компонента (фолиевой кислоты) пробы. Пробную электрофореграмму не используют для построения градуировочной зависимости. Операцию нахождения времени включения давления, описанную выше, можно выполнить один раз и использовать полученный параметр до тех пор. пока время выхода пиридоксина будет меньше задеваемого.

Установленный промежуток времени вносят в программу поэтапного анализа системы капиллярного электрофореза и используют ее для записи электрофореграммы градуировочного раствора и анализа растворов, полученных из испытуемых проб.

Для проведения градуировки системы последовательно, не менее трех раз. готовят и сразу же анализируют градуировочный раствор (см. 10.2.3.5). В таблице концентраций создают столько градуировочных уровней, сколько получено электрофореграмм. при этом концентрации компонентов в каждом уровне будут одинаковые.

Градуировку следует считать успешной, если отклонения времени выхода ликов компонентов не превышают 5 % от среднеарифметических значений. Если градуировку признают неудовлетворительной. продолжают готовить и анализировать градуировочный раствор, создавая дополнительные градуировочные уровни до тех пор. пока указанные условия не будут выполнены. При этом допускается отбраковывать неудовлетворительные данные, однако число принятых к градуировке точек должно быть не менее трех.

10.2.4.2 Градуировка системы методом МЭКХ

Рекомендуемые параметры ввода и условия анализа представлены в таблице 5. Непосредственно перед анализом растворы центрифугируют в течение 5 мин при 5000—6000 об/мин.

Таблица 5 — Условия анализа градуировочного раствора методом МЭКХ

Определяемые витамины в порядке выхода

В^кикогинамид). В& (пиридоксин), В₂ (рибофлавин).

С (аскорбиновая кислота). В₃ (пантотеновая кислота).

В₅(никотиновая кислота). В_с (фолиевая кислота). В, (тиаминхпорид)

Ввод градуировочного раствора (пробы)

240 (после пика пантотеноеой кислоты)

В начале анализа — 0. после появления пика (пантотеноеой кислоты) прикладывают давление 50 до конца анализа

№ 2 (приготовление по 10.2.1.10)

При выполнении анализа необходимо изменение условий регистрации электрофореграммы, а именно приложение давления и изменение рабочей длины волны после появления пика пантотеноеой кислоты.

Для определения момента времени, по истечении которого необходимо приложить давление и изменить длину волны, готовят пробный раствор витаминов в соответствии с 10.2.3.5 и регистрируют пробную электрофореграмму при длине волны 200 нм. В этом случае после регистрации пантотеноеой кислоты (пятого компонента анализируемого раствора) в ручном режиме задают давление 50 мбар и ведут анализ до появления пика последнего компонента (тиаминхлорида) пробы. В ручном режиме длина волны без остановки анализа не может быть установлена, поэтому заканчивают пробную электрофореграмму при измерении на длине волны 200 нм. Пробную электрофореграмму не используют для построения градуировочной зависимости. Операцию нахождения времени включения давления и изменения длины волны регистрации, описанную выше, можно выполнить один раз и использовать полученный параметр до тех пор, пока время выхода пантотеноеой кислоты будет меньше задаваемого.

Установленный промежуток времени вносят в программу поэтапного анализа вместе с изменением длины волны регистрации и используют ее для записи электрофореграмм градуировочных растворов и анализа растворов, полученных из испытуемых проб.

Для проведения градуировки системы последовательно, не менее трех раз. готовят и сразу же анализируют градуировочные растворы (см. 10.2.3.5). На полученных электрофореграммах проверяют правильность автоматической разметки пиков, при необходимости, корректируют разметку, удаляют лишние пики. В таблице компонентов должно быть столько строк, сколько витаминов анализируют. 8 таблице концентраций создают столько градуировочных уровней, сколько получено электрофореграмм. при этом концентрации компонентов в каждом уровне будут одинаковые.

Градуировку следует считать успешной, если отклонения времени выхода пиков компонентов не превышают 5 % среднеарифметических значений. Если градуировка признается неудовлетворительной. продолжают готовить и анализировать градуировочные растворы, создавая дополнительные градуировочные уровни до тех пор. пока указанное условие не будет выполнено. При этом допускается отбраковывать неудовлетворительные данные, однако число принятых к градуировке точек должно быть не меньше трех.

10.3 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале рабочего дня перед измерениями анализируемых проб.

Для проверки работоспособности системы и контроля стабильности градуировочной характеристики используют свежеприготовленный контрольный раствор витаминов (см. 10.2.3.6). который анализируют в условиях, соответствующих анализу градуировочных растворов.

Градуировка признается стабильной, если выполняется неравенство

где X— измеренное значение массовой концентрации соответствующего витамина в контрольном растворе, мг/дм 3 ;

С,. — массовая концентрация соответствующего витамина в контрольном растворе. мг/дм 3 ;

G — норматив контроля стабильности градуировочной характеристики. %.

На стадии освоения метода в качестве значения G принимают значения, равные 10 % для пиридоксина и 16 % для рибофлавина.

При накоплении статистических данных лаборатория вправе устанавливать собственные нормативы контроля стабильности градуировочной характеристики, не превышающие значений, приведенных выше.

При невыполнении условия (4) заново анализируют контрольный раствор еще два раза. При повторных отклонениях, превышающих указанные нормативы хотя бы один раз. градуировку системы проводят заново, начиная с приготовления новых запасных растворов.

Также необходимо обращать внимание на время выхода пиков компонентов, отклонения которых не должны превышать 5 % средних значений.

Рекомендуется начинать работу с пробами только после проведения градуировки системы. Однако анализ получаемых растворов необходимо проводить в течение первых 1.5—2 ч после их приготовления.

10.4.1 Получение вытяжки витаминов из испытуемой пробы

Навеску меда массой 1.000 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 50 см 3 , добавляют 25 см 3 экстрагирующего раствора, приготовленного по 10.2.1.13. и ставят в перемешивающее устройство при комнатной температуре на 15 мин.

Часть полученной вытяжки переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 5000—6000 об/мин. Раствор над осадком отбирают в чистую пробирку.

Примечание — Вытяжку из навески исследуемой пробы необходимо анализировать 8 течение первых 1.5—2 ч после ее получения, что связано с низкой стабильностью витамина С (аскорбиновой кислоты).

10.4.2 Анализ полученных водных вытяжек

10.4.2.1 Анализ полученных вытяжек витаминов методом КЗЭ

Промывают капилляр ведущим электролитом № 1 е течение 10—15 мин. Далее устанавливают на выходе в рабочее положение пробирку с этим же электролитом, а на входе — пробирку с пробой и проводят ее ввод.

На полученных электрофореграммах необходимо проверить правильность автоматической разметки пиков, удалить лишние лики и настроить отчет так. чтобы маркировка пиков включала наименование компонента и его массовую концентрацию.

10.4.2.2 Анализ полученных водных вытяжек методом МЭКХ

Рекомендуется приступать к работе в мицеллярном варианте после проведения всех необходимых измерений в капиллярном зонном варианте, что связано с нежелательным частым кондиционированием капилляра при переходе с одного ведущего электролита на другой. Смена ведущего электролита чаще одного раза в течение рабочего дня может привести к загрязнению капилляра, которое потребует длительной промывки.

Промывают капилляр ведущим электролитом № 2 е течение 10—15 мин. Далее устанавливают на выходе в рабочее положение пробирку с этим же ведущим электролитом и проверяют стабильность градуировочной характеристики ло 10.2.5. Если стабильность удовлетворительная, проводят ввод пробы и затем анализ. Если стабильность градуировочной характеристики признают неудовлетворительной. то для сохранения приготовленного раствора сначала проводят анализ подготовленных проб, затем градуировку системы повторяют, создают на этой основе новый метод и обрабатывают полученные электрофореграммы в новом методе.

10.5 Обработка результатов измерений

Содержание соответствующего витамина в пробе Х_е г/кг. вычисляют ло формуле

где С,- — массовая концентрация соответствующего витамина в экстракте, указанная на электрофоре-грамме или прочитанная в отчете, мг/дм 3 ;

V₍ — объем полученного экстракта, равный 0.025 дм 3 ; т — масса навески пробы, г.

10.6 Проверка приемлемости результатов измерений

В случае проведения экспресс-анализов возможно получение результата измерения содержания витаминов по единичному определению.

При проведении контрольных измерений в качестве результата измерения принимают среднеарифметическое результатов параллельных определений, если выполняется условие приемлемости

где С₁. С₂ — результаты двух параллельных определений измерений массовой концентрации соответствующего витамина в пробе, мг/дм 3 :

С_ср — среднее значение двух параллельных определений измерений массовой концентрации соответствующего витамина в пробе, мг/дм 3 ;

г — значение предела повторяемости (таблица 1), %.

Если условие (6) не выполняется, то находят и устраняют причины нестабильности, заново регистрируют электрофореграммы и обрабатывают полученные результаты.

10.7 Оформление результатов измерений

Результат измерения представляют в виде X ± Д_г г/кг. Р — 0.95.

По полученному результату анализа С, и значению относительной погрешности рассчитывают абсолютную погрешность ло формуле

где С/— среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, мг/дм 3 .

Допускается результат измерения в документах, выдаваемых лабораторией, представлять в виде X ± Д,, г/кг. Р — 0,95. при условии Д_л 1 /^. Гарнитура Ариал. Уел. печ. л. 2.32. Уч.-изд. л. 2.10.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

Создано в единичном исполнении для комплектования Федеральною информационного фонда стандартов. 117413 Москва. Нахимовский пр-т. д. 31. к. 2.

источник

Госты с использованием метода электрофореза

ГОСТ Р 52841-2007 Продукция винодельческая. Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза

ГОСТ Р 54414-2011 РЫБА И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НЕЕ. ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ РЫБЫ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА С ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

ГОСТ Р 54414-2011 РЫБА И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НЕЕ. ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ РЫБЫ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА С ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

ГОСТ Р 58254-2018 Мед натуральный. Определение водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза

Текст ГОСТ Р 58254-2018 Мед натуральный. Определение водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза

ГОСТ Р 52841-2007
Продукция винодельческая. Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза