Автоматические системы капиллярного электрофореза Qsep, BiOptic сконструированы для быстрого фрагментного анализа нуклеиновых кислот. Все этапы электрофореза — заливка геля, нанесение образцов, разделение фрагментов, визуализация и анализ результатов — в одном приборе в одну стадию!
- Скрининг ПЦР-продуктов;
- генотипирование;
- количественный и качественный анализ библиотек для NGS и нанопорового секвенирования;
- анализ фрагментированности геномной ДНК;
- анализ внеклеточной ДНК;
- анализ олигонуклеотидов;
- анализ продуктов рестриктазного расщепления;
- оценка целостности РНК (RNA Quality Number).
Электрофорез происходит в картридже, внутри которого находится капилляр, заполненный гелем с флуорофором для детекции биомолекул. Процесс разделения фрагментов отражается в реальном времени. Анализ результатов производится с помощью ПО Q-Analyzer (в комплекте поставки).
- Автоматическая подача образцов (от 1 до 96);
- несколько типов картриджей для разных молекул (фрагментированная ДНК, геномная ДНК, РНК, белки), рассчитанных на анализ 100-300 образцов;
- время анализа одного образца — от 2 до 7 минут;
- разрешение — 1-4 нуклеотида (в диапазоне длин от 100 до 500 нуклеотидов);
- чувствительность — от 100 пг/мкл;
- объём образца — 1 или 20 мкл, из которых в капилляр вводится 1 пл;
- визуализация, количественный и качественный фрагментный анализ с помощью ПО;
- низкая себестоимость анализа (по сравнению с аналогичным оборудованием).
| Анализ результатов электрофореза:
Система капиллярного электрофореза Qsep — это автоматическая платформа для быстрого фрагментного анализа нуклеиновых кислот. Все этапы электрофореза — заливка геля, нанесение образцов, разделение фрагментов, визуализация и анализ результатов, делаются в одном приборе в одну стадию. Принцип работы: электрофорез происходит в картридже, внутри которого находится капилляр, заполненный гелем с флуорофором для детекции биомолекул. Процесс разделения фрагментов отражается в реальном времени. Анализ результатов производится с помощью ПО Q-Analyzer. Особенности системы Qsep100:
Технические характеристики системы Qsep100:
Комплект поставки: Qsep100: ПО Q-Analyzer Basic, воздушный насос Qairbox, набор 1-канальных картриджей S1 и S2, выравнивающий маркер 20-1000, выравнивающий маркер 20-5000, маркер длин 15-622, маркер длин 50-3000. Картриджи для системы капиллярного электрофореза Qsep 100: электрофорез в Qsep происходит в картриджах разных типов для разделения ДНК, РНК и белков. Картридж рассчитан на анализ 100-300 образцов. В комплект поставки входят все необходимые расходные материалы для электрофореза — буфер для разделения, буфер для разведения образцов, пробирки в стрипах, ванночки и пипетки для буфера, выравнивающий маркер. источник +7 (499) 346-74-93 +7 (800) 200-74-93 Бесплатно по России
DEFAULT_VALUE] => ) [manufacturer] => Array ( [ID] => 7 [TIMESTAMP_X] => 2014-07-29 12:35:13 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Производитель [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => manufacturer [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => E [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 2 [WITH_DESCRIPTION] => N [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => Y [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => 2010 [VALUE] => 183 [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [ DEFAULT_VALUE] => ) [paramsInText] => Array ( [ID] => 13 [TIMESTAMP_X] => 2014-08-04 12:50:00 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Параметры товара [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => paramsInText [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => S [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => N [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => HTML [USER_TYPE_SETTINGS] => Array ( [height] => 200 ) [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [ DEFAULT_VALUE] => ) [bestOffer] => Array ( [ID] => 70 [TIMESTAMP_X] => 2014-08-29 09:59:41 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Лучшее предложение [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => bestOffer [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => L [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => N [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [VALUE_ENUM_ID] => [ DEFAULT_VALUE] => ) [inStock] => Array ( [ID] => 71 [TIMESTAMP_X] => 2014-08-29 09:59:41 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Есть на складе [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => inStock [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => L [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => N [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [VALUE_ENUM_ID] => [ DEFAULT_VALUE] => ) [documents] => Array ( [ID] => 74 [TIMESTAMP_X] => 2015-07-16 10:58:43 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Документация [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => documents [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => F [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => Y [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => Y [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [ DEFAULT_VALUE] => ) [pdf] => Array ( [ID] => 81 [TIMESTAMP_X] => 2016-08-26 12:41:46 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => PDF [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => pdf [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => F [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => Y [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [ Высокоэффективный капиллярный электрофорез P/ACE MDQ Фирма Beckman Coulter создала свой первый прибор высокоэффективного капиллярного электрофореза в 1989 году и начала им серию P/ACE . Уже тогда было применено много эффективных инженерных решений (картридж для капилляра с водяным охлаждением, микропрепаративный коллектор фракций и т .д ), делающих прибор не только передовым словом технологии, но также надежным и удобным. Beckman Coulter является признанным лидером в области технологии капиллярного электрофореза. Фирма постоянно развивает и внедряет новые возможности в оборудование, программное обеспечение и наборы реактивов. К таким новшествам относятся лазерный флуориметрический детектор (LIF), детектор диодная матрица, независимое термостатирование буферов и образца, интерфейс для подключения внешних детекторов и др. Система капиллярного электрофореза P/ACE MDQ применяется и конфигурируется для исследований, создания стандартных методов и контроля качества. Капиллярный электрофорез позволяет проводить качественный, количественный анализ и анализ примесного состава. Система имеет модульную структуру и сменные детекторы. Стандартно прибор может комплектоваться УФ/Вид, диодно-матричным и LIF детекторами. С использованием стандартного внешнего интерфейса может подключаться любой дополнительный внешний детектор (например, массспектрометрический ). Предлагаемая фирмой BECKMAN система капиллярного электрофореза P/ACE MDQ в сочетании с готовыми наборами реактивов и капилляров позволяет успешно решать самые разнообразные аналитические задачи, в том числе разделение белков, олигонуклеотидов и фрагментов ДНК, разделение энантиомеров и низкомолекулярных веществ (витаминов, аминокислот, антибиотиков и др.), определение структуры олигосахаридов и многое другое. В этом высокопроизводительном приборе для разработки новых методик анализа лекарственных веществ и контроля качества фармацевтической продукции, образцы размещаются в 96-луночных планшетах, буферы — в кри о- или микропробирках . Все исследования полностью автоматизированы. Два сменных детектора — УФ-детектор и детектор на основе диодной матрицы. Сравнительно новый аналитический метод. В практике с 1989 года. Является дополнением или альтернативой Высокоэффективной жидкостной хроматографии и в значительной мере гель-электрофорезу В области медицинской диагностики капиллярный электрофорез это прибор позволяющий контролировать уровень медикаментов в крови, моче, ЦСЖ или слюне при минимальной пробоподготовке или вообще без нее, производить анализ катехоламинов и других биогенных аминов крови и мочи .( в комплекте с лазерным флуориметром ). А также производить: -Анализ белков крови и мочи. -Определение гликозилированного гемоглобина при сахарном диабете. -Аномальных гемоглобинов при талассемии и сходных заболеваниях. -Анализ липопротеинов крови. -Анализ биологически активных пептидов в крови и моче. -Изоферментов креатинфосфокиназы , щелочной фосфатазы, и т.п. Как прибор для контроля качества медикаментов и пищевых веществкапиллярный электрофорез идеален из-за минимальной пробоподготовки , крайней устойчивости к посторонним примесям в пробе и низкой себестоимости анализа. Капиллярный электрофорез это единственный в своем роде способ разделения энантиомеров в силу крайней экономичности и большей разрешающей способности по сравнению с НР LC Высокочувствительный лазерный флуориметр и наборы для DNA позволяют крайне эффективно производить HLA-типирование и идентификацию личности по STR участкам ДНК, другие работы с ДНК и РНК. Прекрасное дополнение ПЦР! Стандартные интерфейсы позволяют легко подключить прибор к масс-спектрометру. Такой прибор просто незаменим в научной работе, службе СЭС, криминалистике и при допин г- контроле. Работа на капиллярном электрофорезе имеет следующие достоинства : — Практически не требуется специализированных реагентов. — Основным расходным материалом являются буферные соли — бораты, фосфаты, ацетаты, SDS, NaOH 0,1моль/л и HCL 0,1моль/л, флуоресцентный маркер, если работе ведется с лазером, и капилляр. — Капилляр многоразовый и служит дольше колонки HPLC, легче регенерируется и стоит 5 раз дешевле. — Разрешающая способность капилляра значительно выше — Даже при очень интенсивной работе расходуется 10-20 миллилитров буфера в день. — Все буферные растворы легко изготавливаются в любой лаборатории, — Рабочая чувствительность при комплектации лазерным флуориметром достигает -12М — Специальные микропробирки позволяют работать с пробами по 5-10 мкл. На анализ забирается не более — 0,1мкл пробы. — Стандартные пробирки, мини и микро размещаются в одной карусели. В РЕЗУЛЬТАТЕ ПО СРАВНЕНИЮ С ВЭЖХ: — Расходы на растворители, реагенты и пробоподготовку в 50-200 раз ниже. — Трудоемкость в 3-5 раз меньше — Производительность (проб/день) на 15-20% выше. — Обслуживание проще (кроме автосамплера нет движущихся деталей) Beckman использует жидкостное охлаждение капилляра. Охлаждающая жидкость неэлектропроводна , негорюча , нетоксична. Это позволяет использовать капилляры большого внутреннего диаметра (до 200 мкм) для препаративных разделений, большие токи и напряжения для быстрых разделений, использовать высокие (0,1-0,4 моль/л) концентрации солей там где это необходимо Эти режимы работы невозможны при воздушном охлаждении Воспроизводимость также выше при жидкостном охлаждении Прибор оборудован автосамплером , по заказу может быть оборудован холодильником для образцов. В автосамплере может производиться автоматическая дериватизация проб. В препаративном режиме он же служит коллектором фракций. Beckman Instruments — предлагает готовые наборы капилляров и реактивов для самых разнообразных разделений. — для разделения DNA до 100 пар оснований — для разделения DNA до 1000 пар оснований — для разделения DNA до 20 000 пар оснований — для разделения белков в геле SDS-PAAG (14-200 kDa ) — для разделения энантиомеров . — для разделения белков и пептидов — для изоэлектрофокусирования белков рН3-10 — для разделения малых молекул (витамины, аминокислоты, антибиотики, антиконвульсанты и др.) 477170 МОДЕЛЬ P/ACE 5000, UV ДЕТЕКТОР 477172 МОДЕЛЬ P/ACE 5500, DAD ДЕТЕКТОР 267845 МОДЕЛЬ P/ACE DNA, UV + LIF ДЕТЕКТОР 267819 МОДЕЛЬ P/ACE DNA, LIF ДЕТЕКТОР 144001 P/ACE MDQ UV ДЕТЕКТОР 144000 P/ACE MDQ DAD ДЕТЕКТОР 477126 LIF488 ДЕТЕКТОР ДЛЯ P/ACE 267838 LIF635 ДЕТЕКТОР ДЛЯ P/ACE 144901 LIF488 ДЕТЕКТОР ДЛЯ MDQ 477430 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА МАЛЫХ МОЛЕКУЛ Amino 477445 НАБОР ДЛЯ Э/ФОРЕЗА БЕЛКОВ Neutral 477435 НАБОР ДЛЯ Э/ФОРЕЗА БЕЛКОВ Amino 477420 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА БЕЛКОВ ПО МАССЕ SDS14-200 477490 НАБОР ДЛЯ ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЯ БЕЛКОВ 477480 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА ДНК до 100 оснований 477410 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА ДНК до 1000 пар оснований 477486 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА ДНК до 20 000 пар оснований 501300 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА ОПТИЧЕСКИХ ИЗОМЕРОВ 477600 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА СТРУКТУРЫ ОЛИГОСАХАРИДОВ Система P/ACE MDQ имеет ряд особенностей. — Прибор работает с микроплашками , виалками 2 и 0,5 мл и пробирками для PCR. Может программироваться, как позиция виалки для отбора, так и вывода образца. — Возможно задавать до 36 пар буферов. Улучшенный температурный контроль. Патентованная система водяного охлаждения намного эффективнее воздушного. Такая система дополнительно позволяет: — Использовать буферы большой ионной силы (500 ммоль/л) для улучшения разделения сложных смесей — Использовать капилляры большого диаметра (150-200 мкм) для увеличения объема вводимой пробы и улучшения чувствительности. — Улучшает воспроизводимость времени миграции Опция термостатирования образца от 5 до 60°C позволяет работать с термонестабильными соединениями Система ввода позволяет работать в трех режимах ввода пробы: вакуум, давление, электрокинетическая инжекция Модульная система позволяет легко менять и подключать внешние детекторы Валидация – специальное программное обеспечение, тестовые смеси и точное оборудование позволяют проводить валидации в соответствии с GLP и CGMP. Простое и интуитивно понятное программное обеспечение 32 Carat под управлением операционной системы Windows позволяет легко управлять прибором, собирать и обрабатывать данные. Программное обеспечение специально ориентировано на капиллярный электрофорез и при обработке учитывает особенности данного аналитического метода. Выпускается ряд стандартных систем оптимизированных под решение конкретных задач. К ним поставляются стандартные наборы реагентов. источник Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК,таккак выделение, рестрикция,полимеразная цепная реакция(ПЦР),молекулярное клонирование, наиболее частоиспользуютэлектрофорез. Электрофорез — метод разделения макромолекул (в том числе Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя ДНК, например бромида этидия. На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов. Концентрация агарозы в геле.Агарозный гель — пористая струк- Существует зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК Концен- 0,3 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,2 1,5 2,0 Длина 5-60 1-30 1-20 0,8-12 0,6-10 0,5-8 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2 Заряд молекулы.Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы Напряженность электрического поля.На скорость движения заряженных молекул ДНК в геле влияет напряженность электрического поля, определяемая напряжением постоянного электрического поля, подаваемого на электроды. Данные, приведенные на Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с • суперспирализованную (нативная молекула, стабилизированная белками); •линейную (расщепленная рестриктазой кольцевая молекула). Кольцевая молекула ДНК При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в одну из лунок геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза. Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания Внимание! Используемый в качестве красителя бромид этидия является мутагенным веществом. При работе с ним необходимо использовать резиновые или латексные перчатки. Методы вертикального и горизонтального электрофореза Кроме того,акриламид является токсичным веществом. Приготовить ПААГ Цель работы. Ознакомиться с методом горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле. Оборудование и материалы.1. Прибор для горизонтального электрофореза. Ходработы.Приготовлениерабочегобуферногораствора для электрофореза. Содержимое пакета «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мерную колбу, раство-ряют в 600—800 мл дистиллированной воды (для более быстрого Подготовка прибора для электрофореза к работе. Пользуясь встроенными уровнями и винтовыми ножками, высоту аппликатора выставляют таким образом, чтобы расстояние Приготовление агарозного геля. Навеску агарозы, Проведение электрофореза. В лунки застывшего агарозного геля осторожно вносят по 3 мкл раствора исследуемых образцов ДНК. В соседнюю лунку геля вносят 3 мкл маркера молекулярных масс фрагментов ДНК. В одну или Внимание! Во избежание повреждения сетчатки глаз ультрафиолетовым излучением наблюдать зоны ДНК следует только через за-щитное стекло из комплекта трансиллюминатора или защитные (стеклянные) очки. Полученные результаты регистрируют визуально или с использованием гель-документирующей видеосистемы,пользуясь инструкцией к ней. Контрольные вопросы.1. Какой принцип лежит в основе метода электрофоре- Задания.1. Поместить схему или фотографию электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Определить и подписать размеры фрагментов ДНК-маркера (согласно описанию к нему). 3. По электрофореграмме определить электрофоретическую подвижность и рассчитать примерную молекулярную массу исследуемой плазмидной ДНК, используя маркеры молекулярных масс. 4. Определить, какой из ДНК нижеперечисленных плазмид соответствует исследуемая ДНК, если ДНК плазмиды РСЕМ-2Гимеет размер 3000 п.н.ДНК плазмиды рВК322 — 4361,а ДНК плазмидыр РСУ002—8560 п.н. источник Содержимое (Table of Contents) Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Капиллярный ОФС.1.2.1.0022.15 электрофорез Вводится впервые Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля. Скорость миграции частиц определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью буферного раствора. Электрофоретическая подвижность вещества (μэф) зависит от его характеристик (электрического заряда, размеров и формы) и от характеристик буферной среды, в которой происходит разделение (типа и ионной силы электролита, рН, вязкости и добавок): где q – эффективный заряд частицы; η – вязкость раствора электролита; r – стоксовский радиус частицы. Электрофоретическую скорость (νэф) для вещества сферической формы определяют по формуле:
где E – сила электрического поля; V – приложенное напряжение; Когда к капилляру, заполненному буферным раствором, приложено электрическое поле, внутри капилляра образуется поток растворителя, называемый электроосмотическим потоком. Скорость и направление электроосмотического потока зависят от электроосмотической подвижности (μэо), определяемой знаком и плотностью заряда на внутренней стенке капилляра, а также характеристиками буфера:
где ε – диэлектрическая константа буфера; ζ – дзета-потенциал поверхности капилляра. Электроосмотическую скорость (νэо) рассчитывают по формуле:
Электрофоретическая и электроосмотическая подвижность ионов могут быть направлены в одну и ту же или в противоположные стороны в зависимости от заряда частиц; таким образом, скорость движения растворенного вещества будет определяться уравнением:
Если электроосмотическая скорость выше электрофоретической, можно одновременно разделить как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. Время, затраченное ионом для миграции от конца, в котором вводится образец, до места детекции (l – эффективная длина капилляра), определяют по формуле:
Как правило, капилляры из плавленого кварца без покрытия при pH выше 3 несут на внутренней поверхности отрицательный заряд из-за диссоциации силанольных групп. При этом электроосмотический поток направлен от анода к катоду. В некоторых случаях необходимо уменьшить или изменить направление электроосмотического потока. Для этого различным образом модифицируют внутреннюю стенку капилляра или изменяют рН буферного раствора. После введения образца в капилляр каждый анализируемый ион движется внутри фонового электролита в виде отдельной зоны в соответствии со своей электрофоретической подвижностью. Степень размывания каждой зоны растворенного соединения определяется совокупностью различных причин. В идеальном случае единственной причиной размывания зон является продольная молекулярная диффузия растворенного вещества вдоль капилляра. В этом, идеальном, случае эффективность разделения полосы, характеризуемая числом теоретических тарелок (N), выражается формулой:
где D – молекулярный коэффициент диффузии растворенного вещества в буферном растворе. На практике на размывание полос значительное влияние оказывают тепловое рассеяние, адсорбция образца на стенке капилляра, различная проводимость между образцом и буфером, длительность ввода пробы, размеры детектирующей ячейки и различия уровней жидкости в емкостях с буферными растворами. Разделение между двумя полосами, называемое разрешением (Rs), определяют по формуле (8):
где μэфб и μэфа – электрофоретические подвижности каждого из двух разделенных ионов; Среднюю электрофоретическую подвижность определяют по формуле:
Система для капиллярного электрофореза состоит из высоковольтного источника напряжения; двух флаконов с буферными растворами и погруженными в них электродами; капилляра, заполненного соответствующим раствором и погруженного обоими концами во флаконы с буферными растворами; системы ввода образца; детектора, способного в режиме реального времени регистрировать вещества, проходящие мимо оптического окна капилляра; системы термостатирования; регистрирующего прибора или подключенного компьютера. Для введения пробы могут использоваться три способа: гидростатический – за счет разного уровня буферных растворов, гидродинамический – с помощью прилагаемого давления или вакуума и электрокинетический – благодаря прилагаемому напряжению. В последнем случае степень ввода в капилляр каждого компонента пробы зависит от соответствующей электрофоретической подвижности. Электрокинетическая система ввода для многокомпонентной смеси с разной электрофоретической подвижностью ведет к изменению соотношения концентраций ее составляющих и в данном случае может адекватно применяться лишь для качественного анализа. При условии определения в многокомпонентной смеси одного или двух соединений этот метод может использоваться и для количественного анализа. Кроме того, такой способ введения может позволить увеличить чувствительность анализа. Детектирование осуществляется с помощью абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях, флуориметрии, кондуктометрии, амперометрии или масс-спектрометрии. Для обнаружения не поглощающих в ультрафиолетовой области и не флуоресцирующих соединений используется непрямое детектирование. В этом случае в ведущий электролит вводится вещество, поглощающее ультрафиолетовое излучение и образующее выраженное фоновое поглощение. При этом зона определяемого вещества визуализируется в виде обратного пика. С использованием специального программного обеспечения электрофореграмме придают стандартный вид. Применяемый раствор электролита фильтруют для того, чтобы удалить крупные частицы (размером более 0,45 мкм), и дегазируют для предотвращения образования пузырьков воздуха, которые могут быть помехой для детектирующей системы или могут нарушить электропроводность в капилляре во время проведения анализа. Для хорошей воспроизводимости времени миграции анализируемых компонентов проб для каждого определения должна быть разработана определенная процедура промывки капилляра. Основными формами проведения капиллярного электрофореза являются: капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярный гель-электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование и капиллярный изотахофорез. Аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор. Разделение происходит за счет того, что различные компоненты образца движутся с разными скоростями, образуя так называемые зоны. Скорость движения каждой зоны зависит от электрофоретической подвижности растворенного вещества и от электроосмотического потока в капилляре. Для уменьшения адсорбции веществ на поверхности плавленого кварца могут использоваться капилляры с модифицированной внутренней поверхностью. Использование капиллярного зонного электрофореза позволяет выполнить разделение как малых (молекулярная масса Мицеллярная электрокинетическая хроматография В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение осуществляется в растворе электролита, содержащего поверхностно-активное вещество в концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы растворенного вещества распределяются между буферным раствором и псевдостационарной фазой, состоящей из мицелл. Этот метод может использоваться для разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве анионного поверхностно-активного вещества наиболее часто используется додецилсульфат натрия, в качестве катионного – соли цетилтриметиламмония. При нейтральных и щелочных значениях рН возникает сильный электроосмотический поток, который движет ионы разделяющего буфера в сторону катода. При использовании в качестве поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия электрофоретическое движение анионных мицелл направлено в противоположную сторону – к аноду. В результате суммарная скорость движения мицелл снижена по сравнению с основным потоком раствора электролита. В случае нейтральных веществ скорость движения компонента, не имеющего электрофоретической подвижности, зависит только от его коэффициента распределения между мицеллой и водной средой. На электрофореграмме сначала появляется пик маркера электроосмотического потока, затем пики аналитов, и в конце – пик маркера мицелл. Время между первым и последним пиком называется окном разделения. На движение заряженных веществ влияют как их коэффициенты распределения между мицеллой и водным буферным раствором, так и их собственная электрофоретическая подвижность. Движение аналитов и разрешение может быть описано термином «фактор удерживания (k)», представляющим собой отношение молярных долей аналита в мицелле и в подвижной фазе. Для нейтрального вещества k вычисляют по формуле:
t – время миграции неудерживаемого вещества; tmc – время миграции мицеллы; K – коэффициент распределения аналита; VS – объем мицеллярной фазы; Разрешение для двух близко движущихся аналитов (RS) рассчитывают по формуле:
где N – число теоретических тарелок для одного из аналитов; α – селективность разделения; Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако следует учитывать, что увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и вязкости буферного раствора. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения. Как и в капиллярном зонном электрофорезе, при мицеллярной электрокинетической хроматографии длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа и эффективность разделения. Увеличение длины капилляра уменьшает электрическое поле, увеличивает время миграции и повышает эффективность разделения. Уменьшение внутреннего диаметра повышает рассеяние тепла и увеличивает разрешение. Величина рН среды влияет на электроосмотический поток в немодифицированных капиллярах. Уменьшение рН снижает электроосмотический поток и вследствие этого увеличивает разрешение нейтральных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии за счет увеличения времени анализа. Для улучшения разделения гидрофобных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии используют органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). При этом необходимо учитывать, что добавление органического модификатора влияет на критическую концентрацию мицеллообразования. Для разделения с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии энантиомеров в мицеллярную систему включают хиральные селекторы: ковалентно связанные с поверхностно-активным веществом (соли N-додеканоил-L-аминокислот, соли желчных кислот и др.) или вводимые в состав электролита (циклодекстрины). Для улучшения селективности разделения в мицеллярной электрокинетической хроматографии применяют также вещества, способные изменить взаимодействие аналита с мицеллой путем адсорбции на последней. Этими добавками могут быть второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное), ведущее к образованию смешанных мицелл, катионы металлов, которые распределяются в мицелле и образуют координационные комплексы с аналитом, а также ион-парные соединения, которые взаимодействуют с заряженными компонентами пробы и задерживают их, например, тетрабутиламмония бромид. В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, действующим в качестве молекулярного сита. При равном отношении заряда к массе более мелкие компоненты движутся в капилляре быстрее, чем более крупные. Капиллярный гель-электрофорез может быть использован для разделения биологических макромолекул по их молекулярной массе. Электроосмотический поток при этом полностью устраняется путем модификации внутренней стенки капилляра. В капиллярном гель-электрофорезе используются два типа гелей: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически модифицированные гели, как, например, поперечно-сшитый полиакриламид, поливинилпирролидон, готовятся внутри капилляра посредством полимеризации мономеров. Они обычно связаны с кварцевой стенкой капилляра и не могут быть удалены без его разрушения. При использовании таких гелей для анализа белков в редуцирующих условиях буферный раствор содержит обычно додецилсульфат натрия и образцы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси додецилсульфата натрия с 2-меркаптоэтанолом или дитиотрейтолом. При анализе в нередуцирующих условиях 2-меркаптоэтанол и дитиотрейтол не используют. Разделение в поперечно сшитых гелях оптимизируют модификацией буферного раствора (как указано в разделе «Капиллярный зонный электрофорез») и контролем пористости геля во время его приготовления. Пористость этих гелей регулируют изменением концентрации акриламида, а также его соотношения со сшивающим реагентом. Уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности аналитов. Из-за неподвижности таких гелей допустимо только электрокинетическое введение пробы. Динамически модифицированные гели являются гидрофильными полимерами, как, например, линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и т. п., которые могут быть растворены в водных разделительных буферных растворах с образованием разделяющей среды, действующей как молекулярное сито. После приготовления они могут быть введены в капилляр под давлением. Замена геля перед каждой инжекцией улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей увеличивается при использовании полимеров с большей молекулярной массой или уменьшении концентрации полимера. Для выбранного буферного раствора уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности компонентов раствора. Так как растворение этих полимеров в буферном растворе дает растворы с низкой вязкостью, может быть использован гидродинамический или электрокинетический ввод пробы. В изоэлектрическом фокусировании заряженные молекулы движутся под воздействием электрического поля в рН-градиенте, созданном амфолитами с широким диапазоном значений рI, растворенными в буфере разделения. Тремя основными этапами изоэлектрического фокусирования являются введение пробы, фокусирование и мобилизация. Этап введения пробы осуществляют в один прием, когда образец смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или под вакуумом, или в несколько приемов, когда в капилляр последовательно вводится ведущий буферный раствор, амфолиты, образец, смешанный с амфолитами, снова амфолиты и, наконец, заключающий буферный раствор. Объем образца должен быть достаточно малым, чтобы не изменять рН-градиент. На этапе фокусирования амфолиты движутся после приложения напряжения к катоду или аноду согласно их суммарному заряду, создавая, таким образом, рН-градиент от более низкого рН (у анода) к более высокому рН (у катода). Движение каждого аналита продолжается до тех пор, пока он не достигнет рН, соответствующего его изоэлектрической точке (pI). На этапе мобилизации полосы разделенных компонентов приводятся в движение в сторону детектора благодаря электроосмотическому потоку путем приложения давления после стадии фокусирования или с помощью добавления солей к флакону у катода или анода. Достигнутое разделение, выражаемое как
Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке разделения, являются: – Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании используется очень высокое электрическое поле – от 300 до 1000 В/см на этапе фокусирования. – Капилляр. Электроосмотический поток должен быть уменьшен или полностью подавлен. Для уменьшения электроосмотического потока используют капилляры с модифицированной внутренней поверхностью. – Растворы. Анодный флакон заполняется буферным раствором с рН ниже, чем pI наиболее кислого амфолита, а катодный флакон заполняется раствором с рН выше, чем pI наиболее щелочного амфолита. Обычно для анода используется фосфорная кислота, а для катода – натрия гидроксид. Добавление в раствор амфолита полимера, такого как метилцеллюлоза, ведет к подавлению конвекции и электроосмотического потока при увеличении вязкости. Широкие диапазоны рН используются для оценки изоэлектрической точки, в то время как более узкие диапазоны применяются для улучшения точности. Осаждение белков в их изоэлектрической точке во время этапа фокусирования предотвращают в случае необходимости с помощью таких буферных добавок, как глицерин, поверхностно-активные вещества, мочевина или цвиттерионные буферные соли. Изотахофорез – это метод разделения, который проводится в режиме поддержания постоянства тока (все разделенные зоны движутся с одной скоростью). При этом должно обеспечиваться постоянное отношение между концентрацией и подвижностью ионов в каждой зоне. В капиллярном изотахофорезе применяются два буферных раствора, между которыми находятся зоны аналита. Например, для анализа анионов буфер должен быть выбран таким образом, чтобы ведущий электролит содержал анион с фактической подвижностью, превышающей характерную для разделяемых веществ. Аналогично ион завершающего электролита должен иметь меньшую подвижность, чем подвижность разделяемых веществ. В результате разделения ведущий анион движется первым, за ним движется анион с очередной высокой подвижностью и т. д. В капиллярном изотахофорезе индивидуальные анионы мигрируют в дискретных зонах, но все движутся с той же скоростью, что и ведущий анион. Концентрации анализируемых веществ одинаковы в каждой зоне; таким образом, длина каждой зоны пропорциональна количеству отдельного компонента. Зоны менее сконцентрированные, чем ведущий электролит, сужаются, зоны более сконцентрированные – расширяются. Принцип изотахофореза используется для предварительного концентрирования образца перед разделением его компонентов с помощью других методик капиллярного электрофореза. Качественный анализ. К качественным результатам относится определение идентичности компонента пробы внутреннему или внешнему стандартному веществу по времени появления соответствующего пика. Полуколичественный анализ. Полуколичественным результатом считается определение концентрации компонента пробы по площади или высоте пика при соотношении сигнал/фон от 2:1 до 3:1. Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по формуле:
где: H – высота пика целевого компонента на электрофореграмме раствора сравнения, измеренная от максимума пика до базовой линии сигнала; h – уровень шума на электрофореграмме, полученной после ввода холостой пробы. Количественный анализ. Количественным результатом является определение концентрации искомого компонента пробы по площади пика при соотношении сигнал/шум больше, чем 3:1. При количественном анализе образца для компенсации различий во временах миграции от анализа к анализу и для устранения различий в сигналах компонентов образца, обладающих различными временами миграции, площади пиков должны быть нормированы на соответствующие времена миграции. При использовании внутреннего стандарта необходимо убедиться, что ни один пик исследуемого вещества не маскируется пиком внутреннего стандарта. Абсолютное содержание компонентов рассчитывают по отношению площадей анализируемого пика и пика стандарта. Процентное содержание одного или более компонентов анализируемого образца рассчитывают путем определения процентной доли скорректированных площадей пиков от общей площади всех пиков, за исключением пиков, вызванных растворителями или другими добавленными реактивами (процедура нормализации). В качестве параметров пригодности системы используются: кажущееся число теоретических тарелок (N), разрешение (Rs), фактор емкости (k’) (только для мицеллярной электрокинетической хроматографии) и фактор симметричности (As). Кажущееся число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано эмпирически по формуле:
где tr – время миграции или расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика соответствующего компонента; w0,5 – ширина пика на половине высоты. Разрешение (Rs) между пиками схожей величины двух компонентов вычисляют по формуле:
где tr,b и tr,a – времена миграции или расстояния вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков; Фактор симметричности пика рассчитывают по формуле:
где w0,05 – ширина пика на 1/20 от его высоты; d – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передним краем пика на 1/20 от высоты пика. В качестве параметров пригодности используются также испытания на воспроизводимость площади (стандартное отклонение площади или отношения площади к времени миграции) и воспроизводимость времени миграции (стандартное отклонение времени миграции). В фармакопейной статье указывают использование определенного капилляра, буферного раствора, метода предварительной подготовки капилляра, пробоподготовки и условий миграции. источник Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью. Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.
Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду. Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.
Электрофорез нуклеиновой кислоты представляет собой аналитический метод , используемый для разделения ДНК или РНК фрагменты по размеру и реакционной способности . Молекулы нуклеиновых кислот , которые должны быть проанализировано установлены на вязкие среды, гель , где электрическое поле индуцирует нуклеиновые кислоты (которые отрицательно заряженные из — за их сахарный фосфатный позвоночник) , чтобы мигрировать по направлению к аноду (который положительно заряженная потому это электролитический , а не гальванический элемент ). Разделение этих фрагментов достигается за счет использования подвижностей с которыми разного размера молекулы , которые способны пройти через гель. Более длинные молекулы мигрируют медленнее , потому что они испытывают большее сопротивление внутри геля. Поскольку размер молекулы влияет на его подвижность, более мелкие фрагменты , в конечном итоге ближе к аноду , чем более длинные в течение определенного периода. Через какое — то время, напряжение снимается и градиент фрагментации анализируется. Для больших расстояний между аналогичными фрагментами размером, либо напряжение , либо время выполнения может быть увеличено. Расширенные проходят через гель низкого напряжения дает наиболее точное разрешение. Напряжение, однако, не является единственным фактором, определяющим электрофорез нуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота должны быть разделены , может быть получена несколько способов перед разделением с помощью электрофореза. В случае больших молекул ДНК, ДНК часто режут на более мелкие фрагменты с использованием ДНК эндонуклеазы рестрикции (или рестриктазы). В других случаях, такие как ПЦР амплифицированных образцы, ферменты , присутствующие в образце , которые могут повлиять на разделение молекул удаляются с помощью различных средств перед проведением анализа. После того, как нуклеиновая кислота должным образом подготовлены образцы раствора нуклеиновой кислоты помещают в лунки геля и напряжение прикладывается через гель в течение определенного промежутка времени. Фрагменты ДНК различной длины визуализировали с использованием флуоресцентного красителя , характерным для ДНК, таких как бромид этидия . Гель показывает полосы , соответствующих различные молекулы нуклеиновых кислот популяций с различной молекулярной массой. Размер фрагмента, как правило , сообщается в «нуклеотидов», «пар оснований» или «т.п.н.» (для тысяч пар оснований) в зависимости от того, был ли отделен одно- или двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Определение размера фрагмента , как правило , осуществляется путем сравнения с коммерчески доступными ДНК — маркеры , содержащие линейные фрагменты ДНК известной длины. Типы геля , наиболее часто используемые для электрофореза нуклеиновых кислот являются агарозы (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламида (за большой размер коротких молекул ДНК, например , в последовательности ДНК ). Гели были традиционно работают в формате «плиты» , такой как показано на рисунке, но капиллярный электрофорез стало важным для таких применений, как секвенирования ДНК с высокой пропускной способностью . Методы , используемые для электрофореза в оценке повреждений ДНК , включают щелочной гель — электрофорез и электрофорез в импульсном поле геля . Для коротких сегментов ДНК , такой как от 20 до 60 пар оснований двухцепочечной ДНК, запуская их в полиакриламидном геле (ПААГ) даст лучшее разрешение (родное состояние). Аналогичным образом , РНК и одноцепочечной ДНК можно запускать и визуализировали с помощью PAGE гелей , содержащих денатурирующих агентов , таких как мочевина. PAGE гели широко используются в методах , такие как ДНК — футовых печати, EMSA и другие методы взаимодействия ДНК-белок. Измерение и анализ в основном осуществляются с помощью специализированного программного обеспечения для анализа геля. Капиллярная результаты электрофореза , как правило , отображается в виде следов , называемого electropherogram . Ряд факторов может повлиять на миграцию нуклеиновых кислот: размерность поры геля, напряжение , используемое, ионную силу буфера и концентрации интеркалирующего краситель , такие как бромид этидий , если используются во время электрофореза. Гель сит ДНК размером молекулы ДНК в результате чего более мелкие молекулы движутся быстрее. Двухцепочечной ДНК движется со скоростью , которая приблизительно обратно пропорциональна логарифму числа пар оснований. Это соотношение , однако ломается при очень больших фрагментах ДНК , и это не возможно , чтобы отделить их с использованием стандартного электрофореза в агарозном геле . Предел разрешения зависит от состава геля и напряженности поля. и подвижность большой кольцевой ДНК может быть более сильно , чем влияние линейной ДНК размера пор гель. Разделение очень больших фрагментов ДНК требует гель — электрофореза поля импульса (PFGE). В электрофорезе геля инверсии поля (ФИГА, своего рода PFGE), можно иметь «инверсию зон» — где большие молекулы могут двигаться быстрее , чем малые молекулы. Конформации молекулы ДНК могут существенно влиять на движении ДНК, например, суперспирализовано ДНК , как правило , двигается быстрее , чем расслабленный ДНК , поскольку она плотно спиральная и , следовательно , более компактным. В нормальной подготовке плазмидной ДНК, множественные формы ДНК могут присутствовать, и гель — электрофореза из плазмид обычно показывает основную группу , которая была бы отрицательно суперспирализована форма, в то время как другие формы ДНК могут появляться как незначительные слабые полосы. Эти небольшие полосы могут быть зазубрины ДНК (открыть круглую форму) и расслаблена закрыта круглая форма , которые обычно работают медленнее , чем суперспиральный ДНК и одноцепочечная форма (которые иногда могут появляться в зависимости от способов получения) могут двигаться вперед суперспирального ДНК , Скорость , с которой различными формами перемещения , однако , может изменяться с использованием различных условий электрофореза, например , линейные ДНК могут работать быстрее или медленнее , чем суперспирализованная ДНК в зависимости от условий и подвижность большой кольцевой ДНК может быть более сильным влиянием , чем линейная ДНК с помощью поры размер геля. Если суперспиральной ДНК — маркеры не используются, размер кольцевой ДНК плазмиды , как , следовательно , может быть более точно судить после того, как она была линеаризована рестрикции дайджеста . Повреждение ДНК из — за увеличенное поперечное сшивание также приведет к уменьшению электрофоретической миграции ДНК в зависимости от дозы. Круговая ДНК более сильно зависит от концентрации бромида этидия, чем линейная ДНК, если бромид этидия присутствует в геле при электрофорезе. Все встречающиеся в природе круги ДНК underwound, но бромид этидия, который интеркалирует в кольцевую ДНК может изменить заряд, длину, а также superhelicity молекулы ДНК, поэтому его присутствие при электрофорезе может повлиять на его перемещение в геле. Повышение этидийбромид интеркалированный в ДНК может изменить его с отрицательно суперспирализованной молекулы в полностью расслабленный вид, то положительно спиральная суперспираль при максимальной интеркаляции. Электрофорез в агарозном геле может быть использован для решения круговой ДНК с различной топологией суперспирализации. Концентрация геля определяет размер пор геля , который влияет на миграцию ДНК. Разрешение ДНК изменяется с процентной концентрацией геля. Повышение концентрации агарозы геля снижает скорость миграции и улучшает разделение на более мелкие молекулы ДНК, при одновременном снижении концентрации геля позволяет большие молекулы ДНК должны быть разделены. Для стандартного электрофореза в агарозном геле, 0,7% дает хорошее разделение или разрешение крупных 5-10kb фрагментов ДНК, в то время как 2% гель дает хорошее разрешение небольших фрагментов 0.2-1kb. До 3% может быть использованы для отделения очень маленьких фрагментов , но вертикальный полиакриламидный гель будет более подходящим для решения небольших фрагментов. Высокие концентрации геля , однако , требует больше времени запускать раз (иногда дней) и высокий процент гелей часто являются хрупкими и могут не устанавливать равномерно. Высокий процент гели агарозов должны работать с PFGE или ФИГОЙ. Низкий процент гели (0,1-0,2%) являются хрупкими и могут сломаться. 1% гели являются общими для многих приложений. При низких напряжениях, скорость миграции ДНК пропорциональна приложенного напряжения, т.е. чем выше напряжение, тем быстрее движется ДНК. Тем не менее, в увеличении напряженности электрического поля, подвижность высокой молекулярной массы фрагментов ДНК увеличивается дифференциально, и эффективный диапазон разделения уменьшается и, следовательно, разрешение ниже при высоком напряжении. Для получения оптимального разрешения ДНК больше, чем 2 КБ размера в стандартной гель-электрофореза, от 5 до 8 В / см рекомендуется. Напряжение также ограниченно тот факт, что он нагревает гель и может вызвать гель, чтобы расплавить, если гель проводит при высоком напряжении в течение длительного периода, особенно для низкой температуры плавления агарозного геля. Подвижность ДНК, однако, может измениться в нестационарном поле. В поле, которое периодически обращено, подвижность ДНК определенного размера может значительно снижаться при определенной частоте езды на велосипеде. Это явление может привести к инверсии зон в результате чего более крупные фрагменты ДНК движутся быстрее, чем более мелкие в PFGE. Отрицательный заряд его остова ДНК перемещает в сторону положительно заряженного анода при электрофорезе. Тем не менее, миграция молекул ДНК в растворе, в отсутствии гелевой матрицы, не зависит от молекулярной массы при электрофорезе, т.е. не существует никакого разделения по размеру без гелевой матрицы. Гидродинамическое взаимодействие между различными частями ДНК отрезано потоковыми противоионами двигается в противоположном направлении, так что не существует никакого механизма, чтобы генерировать зависимость скорости от длины на шкале больше, чем скрининг длиной около 10 нм. Это делает его отличным от других процессов, таких как седиментация или диффузии, где дальнодействующий гидродинамическое взаимодействие является важным. Гелевая матрица, следовательно , отвечает за разделение ДНК по размерам в процессе электрофореза, однако точный механизм , ответственное разделение не совсем понятно. Ряд моделей существует для механизма разделения биомолекул в гелевой матрице, широко распространенный из них является модель Ogston , которая рассматривает матрицу полимера в виде сита , состоящее из случайно распределенной сети взаимосвязанных пор. Шаровые белки или случайная катушка ДНК перемещается через подсоединенные поры достаточно большой , чтобы вместить его прохождение, и движение больших молекул, более вероятно, будет затруднено и замедлены столкновениями с гелевой матрицей, а молекулы различных размеров могут поэтому быть разделены в этом процессе просеивания. Модель Ogston однако ломается при больших молекул в результате чего поры значительно меньше , чем размер молекулы. Для молекул ДНК размера более 1 кб, А рептации модель (или его варианта) наиболее часто используется. Эта модель предполагает , что ДНК может сканировать в моде «змеиной» (отсюда «рептации») через пору в виде удлиненной молекулы. При более высокой напряженности электрического поля, это превратилось в необъективную модель рептаций, в результате чего передний конец молекулы становится сильно предвзятым в прямом направлении, и это передний край тянет остальную часть молекулы вместе. В полностью предвзятом режиме, подвижность достигается точка насыщения и ДНК сверх определенного размера не могут быть разделены. Идеальное параллельное выравнивание цепочки с полем , однако, не наблюдается на практике , поскольку это означало бы такую же подвижность для длинных и коротких молекул. Дальнейшее уточнение необъективной модели рептаций учитывает внутренние колебания цепи. Предвзятая модель рептаций также была использована для объяснения подвижности ДНК в PFGE. Ориентация ДНК постепенно застроена рептациями после начала поля, а время она достигла стационарного режим скорости зависит от размера молекулы. Когда поле изменяются, более крупные молекулы занять больше времени, чтобы перепрофилировать, поэтому можно различить длинные цепочки, которые не могут достичь своей установившегося состояние скорости от коротких, которые путешествуют большую часть времени в постоянной скорости. Другие модели, однако, также существуют. В режиме реального времени флуоресцентной микроскопии окрашенных молекул показали более тонкие динамики при электрофорезе, с ДНК, показывая значительную эластичность, как она попеременно растяжения в направлении приложенного поля, а затем договаривающуюся в шарик, или становится замкнув в U-образную форму, когда он получает пойманы на полимерных волокон. Это наблюдение можно назвать модель «гусеница». Другая модель предполагает, что ДНК запутывается с полимерной матрицей, и чем больше молекулы, тем более вероятно, запутаться и его движение затруднено.
Наиболее распространенный краситель , используемый , чтобы сделать ДНК или РНК полосы открыты для электрофореза в агарозном геле является бромид этидия , как правило , сокращенно EtBr. Это флуоресцирует в УФ — свете , когда интеркалированная в большую бороздку ДНК (или РНК). Выполнив ДНК через EtBr обработанного геля и визуализации его с УФ — светом, любая группа , содержащая больше , чем 20 нг ДНК становится отчетливо видны. EtBr является известным мутагены , и более безопасные альтернативы, такие как GelRed , производства Biotium , который связывается с малой бороздкой. SYBR Green I является еще дц пятно, произведенный Invitrogen . Это дороже, но в 25 раз более чувствительны, и , возможно , безопаснее , чем EtBr, хотя нет никаких данных адресации его мутагенность или токсичности в организме человека. SYBR Safe представляет собой вариант SYBR Green , который , как было показано , чтобы иметь достаточно низкий уровень мутагенности и токсичности считается безвредным отходов в соответствии с федеральными правилами США. Он имеет такой же уровень чувствительности к EtBr, но, как SYBR Green, значительно дороже. В странах , где безопасное удаление опасных отходов является обязательным, стоимость утилизации EtBr может легко перегнать первоначальную разницу в цене, однако. Так как EtBr окрашенных ДНК не видны при естественном освещении, ученые смешивают ДНК с отрицательно заряженными загрузки буферов перед добавлением смеси в гель. Загрузка буфера являются полезными , поскольку они видны при естественном освещении (в отличие от УФ — излучений для EtBr окрашенных ДНК), и они со-осадок с ДНК (то есть они двигаются с той же скоростью , как ДНК определенной длиной). Ксиленцианол и бромфеноловый синий являются общими красители найдены в загрузке буферов; они работают примерно такой же скоростью, что и фрагменты ДНК , которые являются 5000 пар оснований и 300 пар оснований в длину , соответственно, но точное положение изменяется в зависимости от процентной доли геля. Другие менее часто используемые маркеры прогресса Cresol Красный и оранжевый G , который при температуре около 125 б.п. и 50 б.п., соответственно. Визуализация также может быть достигнуто путем переноса ДНК , после того, как SDS-PAGE на нитроцеллюлозную мембрану с последующим воздействием на гибридизации зонда . Этот процесс называется Southern блоттинга . Для люминесцентных красителей, после электрофореза гель освещается с ультрафиолетовой лампой (обычно путем размещения его на коробке света, при использовании защитного механизма , чтобы ограничить воздействие ультрафиолетового излучения). Устройство подсветки основном также содержит устройство формирования изображения , который принимает изображение геля, после освещения с УФ — излучением. Этидийбромид флуоресцирует красновато-оранжевый в присутствии ДНК, поскольку она интеркалированный с ДНК. Полосу ДНК также может быть вырезана из геля, а затем может быть растворена для получения очищенной ДНК. Гель может быть затем сфотографировал , как правило , с цифровой или поляроидной камерой. Несмотря на то, окрашивали нуклеиновой кислоты флуоресцирует красновато-оранжевый, изображения, как правило , представлены в черно-белый (см фигуры). УФ повреждение образца ДНК может снизить эффективность последующей манипуляции с образцом, таким как лигирование и клонирование. УФ — излучение , длина волны (короче 302 или 312 нм) вызывает больший ущерб, например , воздействия всего за 45 секунд может значительно снизить эффективность трансформации . Поэтому , если ДНК будет использовать для последующих процедур, воздействие более короткой длиной волны УФ — излучения должна быть ограничена, а не более длины волны УФ — излучения (365 нм) , которые вызывают меньше повреждений , следует использовать. Более высокие длины волны излучения , однако производит более слабую флуоресценцию, поэтому , если необходимо , чтобы захватить изображение геля, более короткая длина волны ультрафиолетового света может быть использован короткий промежуток времени. Добавление цитидин или гуанозин в буфер электрофореза в концентрации 1 мМ может защищать ДНК от повреждений. В качестве альтернативы, синий источник света возбуждения с синимами-возбудимым пятном , такими как SYBR Green или GelGreen может быть использован. Гель исследование электрофореза часто использует преимущества программного обеспечение на основе инструментов анализа изображений, такие как ImageJ . источник |
– их средняя электрофоретическая подвижность.
где tR – время миграции аналита;
, зависит от градиента 
, количества амфолитов, имеющих различные значения pI, молекулярного коэффициента диффузии (D), интенсивности электрического поля (E) и вариации электрофоретической подвижности аналита в зависимости от 
:
Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.
источник
