Капиллярный электрофорез в анализе лекарственных препаратов

научная статья по теме ПРИМЕНЕНИЕ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ДЛЯ АНАЛИЗА МЕТАЛЛОСОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Химия

Авторы работы:

Научный журнал:

Текст научной статьи на тему «ПРИМЕНЕНИЕ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ДЛЯ АНАЛИЗА МЕТАЛЛОСОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ»

ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2009, том 64, № 12, с. 1236-1243

ПРИМЕНЕНИЕ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ДЛЯ АНАЛИЗА МЕТАЛЛОСОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского Российской академии наук

119991 Москва, ул. Косыгина, 19 Поступила в редакцию 22.01.2009 г., после доработки 24.03.2009 г.

Эффективность разработки и применения лекарственных препаратов, в том числе на основе соединений металлов, в значительной степени зависит от совершенства используемой аналитической методологии. Обзор посвящен современному состоянию капиллярного электрофореза (КЭ) как метода анализа и исследования лекарственных средств на основе комплексов металлов. Приведены примеры, характеризующие достоинства КЭ по определению действующего вещества и его метаболитов, оценки фармакологических свойств и скрининга соединений, а также прогресс в совершенствовании его методических основ. В заключение критически обсуждены существующие недостатки КЭ в области и возможные пути их преодоления с целью дальнейшего развития и внедрения метода в клинической практике.

Роль различных соединений металлов, в частности, комплексов, в терапии различных заболеваний неуклонно растет [1]. Такие заболевания, как анемия, артрит и астма, диабет, инсульт и язва желудка, успешно лечат препаратами на основе комплексов железа, золота, ванадия, магния и висмута соответственно. Наиболее широко лекарственные средства, содержащие комплексы металлов, применяют в химиотерапии рака [2-4]. По экспертным оценкам, от 50 до 70% случаев для химического воздействия на злокачественные опухоли используют комплексы платины(11), три из которых применяют во всем мире (цисплатин, карбоплатин и оксалипла-тин) и еще три — в отдельных странах (например, не-даплатин в Японии) [5]. Без соединений металлов невозможна также современная медицинская диагностика, основанная на применении методов ЯМР (гадолиний) или радиоизотопной визуализации (кобальт, технеций). Аналогичные радиоактивные препараты используют для доставки обеззараживающего излучения в нужные участки организма (например, небольшие опухоли). Комплексы меди(11) и цинка(11) оказались полезными для современной медицины вследствие их бактериостатического или противовоспалительного действия.

Несмотря на значительные успехи в диагностике и лечении различных заболеваний с помощью соединений металлов, остается еще немало белых пятен в понимании механизма их действия. Это затрудняет направленную разработку новых препаратов, обладающих более высокой и разнообразной по действию физиологической активностью в сочетании с пониженной токсичностью. Другим и, пожалуй, более серьезным недостатком является невысокая эффективность процесса создания новых металлосодержащих лекарственных средств. Дей-

ствительно, только одно из тысячи испытанных соединений получает официальный статус. Это приводит к тому, что средняя стоимость разработки одного лекарства превышает 800 миллионов долларов США. К тому же весь процесс разработки — от времени синтеза и начала исследований до поступления препарата в продажу — занимает до 15 лет.

Ускорение поиска и более целеустремленное исследование новых лекарственных веществ должно привести к снижению общих затрат на их разработку (главным образом, за счет сокращения числа неудачных препаратов). Этого можно достичь за счет улучшения аналитических методов, находящихся в арсенале биохимических и фармацевтических лабораторий. Принципиальным требованием к таким методам является их способность разделять и определять отдельные комплексы металлов, оказывая минимальное воздействие на их состав в ходе анализа. С этих позиций важное место в анализе металлосодержащих целевых соединений, главным образом, противоопухолевого действия, занял капиллярный электрофорез (КЭ) [6]. Немаловажным при выборе этого метода является ряд его сопутствующих достоинств: простота аппаратурного оформления, разработки методики и проведения самого анализа; минимальный объем необходимой пробы; совместимость с физиологическими условиями; сочетаемость с различными методами детектирования и, что особенно важно при анализе смесей, содержащих множество метаболических форм часто с разной полярностью заряда, — высокая эффективность разделения. Кроме того, время анализа достаточно мало (обычно в пределах 10 мин). Это сводит к минимуму возможные изменения в исходном

распределении комплексных форм металлов в разделительной системе.

Целью настоящей работы является краткое обсуждение последних достижений и тенденций развития КЭ как метода анализа и исследования комплексов металлов, использующихся (или разрабатываемых) в качестве лекарственных средств или диагностических агентов. Особое внимание уделено аналитическим аспектам данной области и демонстрации того, как применение КЭ помогает ускорить испытание и внедрение новых лекарственных веществ и как это приложение, в свою очередь, влияет на развитие методологии самого КЭ. Авторы не ставили своей задачей дать анализ материала с библиографической полнотой; напротив, в обзоре рассмотрены лишь наиболее характерные примеры, взятые из литературы последних лет. Вниманию читателей, интересующихся фармакологическими аспектами использования КЭ, могут быть рекомендованы недавние обзоры [7-9].

Определение лекарственных веществ в биологических жидкостях. Необходимость анализа таких объектов, главным образом сыворотки крови и мочи, связана, прежде всего, с решением проблемы оптимального дозирования химиотерапевтических средств. Следует отметить, что из-за достаточно высоких вводимых доз, определение самих действующих веществ не вызывает особой трудности и, в частности, для нейтральных платиновых комплексов можно выполнить методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) [10]. Однако для идентификации и определения метаболитов, что является обязательным требованием в современной противораковой химиотерапии, необходим более чувствительный КЭ. Так, для определения гидролитического метаболита цисплати-на, цис-диамминаквахлоро-платины(П), в сыворотке крови Хирокава с сотр. [10] разработали вариант метода с on-line изотахофоретическим концентрированием (рис. 1). Принцип концентрирования состоит в электрофокусировке аналита между лидирующим ионом и замыкающим ионом, источниками которых служат соответственно сама анализируемая проба, содержащая хлорид-ион в высокой концентрации, и специально вводимый после нее в капилляр электролит. С использованием описанных выше КЭ методов изучены изменения в распределении форм цисплатина в крови, моделирующие ситуацию, которая будет наблюдаться после внутривенной инъекции препарата.

Одним из немногих других примеров КЭ-анали-за биологических жидкостей может служить определение контрастного агента для ЯМР визуализации, представляющего собой полиаминокарбокси-латный комплекс Gd(III), при детектировании методом масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (ЭРИ-МС) [11]. Показана высокая устойчивость препарата в сыворотке крови,

Рис. 1. Электрофореграмма, полученная после изота-хофоретического концентрирования пробы сыворотки крови. Пики: 1 — Mg2+; 2 — Ca2+; 3 — продукт гидролиза цисплатина; 4 — лизин; 5 — аргинин [10] (воспроизведено с разрешения издательства Elsevier).

что является важным условием для его клинического внедрения (из-за высокой токсичности гадолиния в ионной форме). КЭ-ЭРИ-МС использован также для определения данного комплекса в крови и моче на уровне микромолярных концентраций.

Анализ лекарственных форм. Наличие доступного метода определения активного вещества в готовой лекарственной форме — важный компонент как ее внедрения, так и контроля качества фармацевтических препаратов. Известны два примера анализа растворов для инъекции платиновых химиотерапевтических средств методом КЭ. С помощью простого зонного варианта КЭ (т.е. КЗЭ) анализировали препараты на основе цисплатина и кар-боплатина [12]. Определяемой формой служил цианидный комплекс Pt(IV), который получали при предварительном окислении Pt(П) до Pt(IV). Тем же методом платину в составе платиносодержащих лекарств определяли в виде хлоридного комплекса с контролем правильности методом атомно-эмисси-онной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ИСП) [13]. Авторами сделан вывод, что КЗЭ является эффективным методом определения комплексов платины в лекарственной форме.

Анализ твердых лекарственных препаратов представляет менее тривиальную задачу. Для перевода активного компонента галлиевых противоопухолевых средств орального действия в удобную для анализа форму нами использована ультразвуковая экстракция 8-гидроксихинолината галлия(Ш) водно-ацетоновой смесью [14]. Экстракты анализировали методом МЭКХ, и, как видно из таблицы, таб-летированная форма пригодна для применения после двух лет хранения. Для подтверждения этого вывода и, в частности, отсутствия в таблетках 8-гид-роксихинолина — продукта разложения основного вещества или примеси при синтезе — использовали независимый метод — хроматомасс-спектрометрию.

Результаты определения 8-гидроксихинолината галлия в таблетках методом МЭКХ [14] (воспроизведена с разрешения издательства Elsevier)

Для контроля за качеством реагентов в наборах для приготовления радиофармпрепарата, представляющих собой различные комплексы 99mTc, использовали КЭ с детектором по радоактивности [15, 16]. Разделение проводили или при высоком напряжении, или при приложении дополнительно давления (т.н. pressure-driven КЭ). В большинстве препаратов содержались чистые вещества, электрофореграм-мы которых соответствовали ожидаемым с учетом заряда исходных комплексов.

Разделение оптических изомеров и определение энантиомерной чистоты препаратов. Препараты на основе металлов с асимметричными лигандами могут существовать в виде смеси диастереомеров, причем изомеры могут отличаться по фармакологической активности. Возникший в ответ на постанов

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

АНДРЕЕВ Ю.А., БУРЫКИН И.В., ВАРНАВСКАЯ А.А. — 2014 г.

КАРЦОВА Л.А., ОБЪЕДКОВА Е.В. — 2013 г.

СЛИЖОВ Ю.Г., ХАСАНОВ В.В., ХАСАНОВ В.В. — 2013 г.

источник

Содержимое (Table of Contents)

Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Капиллярный ОФС.1.2.1.0022.15

электрофорез Вводится впервые

Скорость миграции частиц определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью буферного раствора.

Электрофоретическая подвижность вещества (μ_эф) зависит от его характеристик (электрического заряда, размеров и формы) и от характеристик буферной среды, в которой происходит разделение (типа и ионной силы электролита, рН, вязкости и добавок):

где q – эффективный заряд частицы;

η – вязкость раствора электролита;

r – стоксовский радиус частицы.

Электрофоретическую скорость (ν_эф) для вещества сферической формы определяют по формуле:

где E – сила электрического поля;

V – приложенное напряжение;

Когда к капилляру, заполненному буферным раствором, приложено электрическое поле, внутри капилляра образуется поток растворителя, называемый электроосмотическим потоком. Скорость и направление электроосмотического потока зависят от электроосмотической подвижности (μ_эо), определяемой знаком и плотностью заряда на внутренней стенке капилляра, а также характеристиками буфера:

где ε – диэлектрическая константа буфера;

ζ – дзета-потенциал поверхности капилляра.

Электроосмотическую скорость (ν_эо) рассчитывают по формуле:

Электрофоретическая и электроосмотическая подвижность ионов могут быть направлены в одну и ту же или в противоположные стороны в зависимости от заряда частиц; таким образом, скорость движения растворенного вещества будет определяться уравнением:

Если электроосмотическая скорость выше электрофоретической, можно одновременно разделить как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. Время, затраченное ионом для миграции от конца, в котором вводится образец, до места детекции (l – эффективная длина капилляра), определяют по формуле:

Как правило, капилляры из плавленого кварца без покрытия при pH выше 3 несут на внутренней поверхности отрицательный заряд из-за диссоциации силанольных групп. При этом электроосмотический поток направлен от анода к катоду.

В некоторых случаях необходимо уменьшить или изменить направление электроосмотического потока. Для этого различным образом модифицируют внутреннюю стенку капилляра или изменяют рН буферного раствора.

После введения образца в капилляр каждый анализируемый ион движется внутри фонового электролита в виде отдельной зоны в соответствии со своей электрофоретической подвижностью. Степень размывания каждой зоны растворенного соединения определяется совокупностью различных причин. В идеальном случае единственной причиной размывания зон является продольная молекулярная диффузия растворенного вещества вдоль капилляра. В этом, идеальном, случае эффективность разделения полосы, характеризуемая числом теоретических тарелок (N), выражается формулой:

где D – молекулярный коэффициент диффузии растворенного вещества в буферном растворе.

На практике на размывание полос значительное влияние оказывают тепловое рассеяние, адсорбция образца на стенке капилляра, различная проводимость между образцом и буфером, длительность ввода пробы, размеры детектирующей ячейки и различия уровней жидкости в емкостях с буферными растворами.

Разделение между двумя полосами, называемое разрешением (R_s), определяют по формуле (8):

где μ_эфб и μ_эфа – электрофоретические подвижности каждого из двух разделенных ионов;

– их средняя электрофоретическая подвижность.

Среднюю электрофоретическую подвижность определяют по формуле:

Система для капиллярного электрофореза состоит из высоковольтного источника напряжения; двух флаконов с буферными растворами и погруженными в них электродами; капилляра, заполненного соответствующим раствором и погруженного обоими концами во флаконы с буферными растворами; системы ввода образца; детектора, способного в режиме реального времени регистрировать вещества, проходящие мимо оптического окна капилляра; системы термостатирования; регистрирующего прибора или подключенного компьютера.

Для введения пробы могут использоваться три способа: гидростатический – за счет разного уровня буферных растворов, гидродинамический – с помощью прилагаемого давления или вакуума и электрокинетический – благодаря прилагаемому напряжению. В последнем случае степень ввода в капилляр каждого компонента пробы зависит от соответствующей электрофоретической подвижности. Электрокинетическая система ввода для многокомпонентной смеси с разной электрофоретической подвижностью ведет к изменению соотношения концентраций ее составляющих и в данном случае может адекватно применяться лишь для качественного анализа. При условии определения в многокомпонентной смеси одного или двух соединений этот метод может использоваться и для количественного анализа. Кроме того, такой способ введения может позволить увеличить чувствительность анализа.

Детектирование осуществляется с помощью абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях, флуориметрии, кондуктометрии, амперометрии или масс-спектрометрии.

Для обнаружения не поглощающих в ультрафиолетовой области и не флуоресцирующих соединений используется непрямое детектирование. В этом случае в ведущий электролит вводится вещество, поглощающее ультрафиолетовое излучение и образующее выраженное фоновое поглощение. При этом зона определяемого вещества визуализируется в виде обратного пика. С использованием специального программного обеспечения электрофореграмме придают стандартный вид.

Применяемый раствор электролита фильтруют для того, чтобы удалить крупные частицы (размером более 0,45 мкм), и дегазируют для предотвращения образования пузырьков воздуха, которые могут быть помехой для детектирующей системы или могут нарушить электропроводность в капилляре во время проведения анализа. Для хорошей воспроизводимости времени миграции анализируемых компонентов проб для каждого определения должна быть разработана определенная процедура промывки капилляра.

Основными формами проведения капиллярного электрофореза являются: капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярный гель-электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование и капиллярный изотахофорез.

Аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор. Разделение происходит за счет того, что различные компоненты образца движутся с разными скоростями, образуя так называемые зоны. Скорость движения каждой зоны зависит от электрофоретической подвижности растворенного вещества и от электроосмотического потока в капилляре. Для уменьшения адсорбции веществ на поверхности плавленого кварца могут использоваться капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.

Использование капиллярного зонного электрофореза позволяет выполнить разделение как малых (молекулярная масса Мицеллярная электрокинетическая хроматография

В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение осуществляется в растворе электролита, содержащего поверхностно-активное вещество в концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы растворенного вещества распределяются между буферным раствором и псевдостационарной фазой, состоящей из мицелл. Этот метод может использоваться для разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве анионного поверхностно-активного вещества наиболее часто используется додецилсульфат натрия, в качестве катионного – соли цетилтриметиламмония.

При нейтральных и щелочных значениях рН возникает сильный электроосмотический поток, который движет ионы разделяющего буфера в сторону катода. При использовании в качестве поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия электрофоретическое движение анионных мицелл направлено в противоположную сторону – к аноду. В результате суммарная скорость движения мицелл снижена по сравнению с основным потоком раствора электролита. В случае нейтральных веществ скорость движения компонента, не имеющего электрофоретической подвижности, зависит только от его коэффициента распределения между мицеллой и водной средой. На электрофореграмме сначала появляется пик маркера электроосмотического потока, затем пики аналитов, и в конце – пик маркера мицелл. Время между первым и последним пиком называется окном разделения. На движение заряженных веществ влияют как их коэффициенты распределения между мицеллой и водным буферным раствором, так и их собственная электрофоретическая подвижность.

Движение аналитов и разрешение может быть описано термином «фактор удерживания (k)», представляющим собой отношение молярных долей аналита в мицелле и в подвижной фазе. Для нейтрального вещества k вычисляют по формуле:

где t_R – время миграции аналита;

t – время миграции неудерживаемого вещества;

t_mc – время миграции мицеллы;

K – коэффициент распределения аналита;

V_S – объем мицеллярной фазы;

Разрешение для двух близко движущихся аналитов (R_S) рассчитывают по формуле:

где N – число теоретических тарелок для одного из аналитов;

α – селективность разделения;

Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако следует учитывать, что увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и вязкости буферного раствора. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения.

Как и в капиллярном зонном электрофорезе, при мицеллярной электрокинетической хроматографии длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа и эффективность разделения. Увеличение длины капилляра уменьшает электрическое поле, увеличивает время миграции и повышает эффективность разделения. Уменьшение внутреннего диаметра повышает рассеяние тепла и увеличивает разрешение.

Величина рН среды влияет на электроосмотический поток в немодифицированных капиллярах. Уменьшение рН снижает электроосмотический поток и вследствие этого увеличивает разрешение нейтральных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии за счет увеличения времени анализа.

Для улучшения разделения гидрофобных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии используют органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). При этом необходимо учитывать, что добавление органического модификатора влияет на критическую концентрацию мицеллообразования.

Для разделения с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии энантиомеров в мицеллярную систему включают хиральные селекторы: ковалентно связанные с поверхностно-активным веществом (соли N-додеканоил-L-аминокислот, соли желчных кислот и др.) или вводимые в состав электролита (циклодекстрины).

Для улучшения селективности разделения в мицеллярной электрокинетической хроматографии применяют также вещества, способные изменить взаимодействие аналита с мицеллой путем адсорбции на последней. Этими добавками могут быть второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное), ведущее к образованию смешанных мицелл, катионы металлов, которые распределяются в мицелле и образуют координационные комплексы с аналитом, а также ион-парные соединения, которые взаимодействуют с заряженными компонентами пробы и задерживают их, например, тетрабутиламмония бромид.

В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, действующим в качестве молекулярного сита. При равном отношении заряда к массе более мелкие компоненты движутся в капилляре быстрее, чем более крупные. Капиллярный гель-электрофорез может быть использован для разделения биологических макромолекул по их молекулярной массе. Электроосмотический поток при этом полностью устраняется путем модификации внутренней стенки капилляра.

В капиллярном гель-электрофорезе используются два типа гелей: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически модифицированные гели, как, например, поперечно-сшитый полиакриламид, поливинилпирролидон, готовятся внутри капилляра посредством полимеризации мономеров. Они обычно связаны с кварцевой стенкой капилляра и не могут быть удалены без его разрушения. При использовании таких гелей для анализа белков в редуцирующих условиях буферный раствор содержит обычно додецилсульфат натрия и образцы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси додецилсульфата натрия с 2-меркаптоэтанолом или дитиотрейтолом. При анализе в нередуцирующих условиях 2-меркаптоэтанол и дитиотрейтол не используют. Разделение в поперечно сшитых гелях оптимизируют модификацией буферного раствора (как указано в разделе «Капиллярный зонный электрофорез») и контролем пористости геля во время его приготовления. Пористость этих гелей регулируют изменением концентрации акриламида, а также его соотношения со сшивающим реагентом. Уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности аналитов. Из-за неподвижности таких гелей допустимо только электрокинетическое введение пробы.

Динамически модифицированные гели являются гидрофильными полимерами, как, например, линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и т. п., которые могут быть растворены в водных разделительных буферных растворах с образованием разделяющей среды, действующей как молекулярное сито. После приготовления они могут быть введены в капилляр под давлением. Замена геля перед каждой инжекцией улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей увеличивается при использовании полимеров с большей молекулярной массой или уменьшении концентрации полимера. Для выбранного буферного раствора уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности компонентов раствора. Так как растворение этих полимеров в буферном растворе дает растворы с низкой вязкостью, может быть использован гидродинамический или электрокинетический ввод пробы.

В изоэлектрическом фокусировании заряженные молекулы движутся под воздействием электрического поля в рН-градиенте, созданном амфолитами с широким диапазоном значений рI, растворенными в буфере разделения.

Тремя основными этапами изоэлектрического фокусирования являются введение пробы, фокусирование и мобилизация.

Этап введения пробы осуществляют в один прием, когда образец смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или под вакуумом, или в несколько приемов, когда в капилляр последовательно вводится ведущий буферный раствор, амфолиты, образец, смешанный с амфолитами, снова амфолиты и, наконец, заключающий буферный раствор. Объем образца должен быть достаточно малым, чтобы не изменять рН-градиент.

На этапе фокусирования амфолиты движутся после приложения напряжения к катоду или аноду согласно их суммарному заряду, создавая, таким образом, рН-градиент от более низкого рН (у анода) к более высокому рН (у катода). Движение каждого аналита продолжается до тех пор, пока он не достигнет рН, соответствующего его изоэлектрической точке (pI).

На этапе мобилизации полосы разделенных компонентов приводятся в движение в сторону детектора благодаря электроосмотическому потоку путем приложения давления после стадии фокусирования или с помощью добавления солей к флакону у катода или анода.

Достигнутое разделение, выражаемое как , зависит от градиента , количества амфолитов, имеющих различные значения pI, молекулярного коэффициента диффузии (D), интенсивности электрического поля (E) и вариации электрофоретической подвижности аналита в зависимости от :

Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке разделения, являются:

– Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании используется очень высокое электрическое поле – от 300 до 1000 В/см на этапе фокусирования.

– Капилляр. Электроосмотический поток должен быть уменьшен или полностью подавлен. Для уменьшения электроосмотического потока используют капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.

– Растворы. Анодный флакон заполняется буферным раствором с рН ниже, чем pI наиболее кислого амфолита, а катодный флакон заполняется раствором с рН выше, чем pI наиболее щелочного амфолита. Обычно для анода используется фосфорная кислота, а для катода – натрия гидроксид.

Добавление в раствор амфолита полимера, такого как метилцеллюлоза, ведет к подавлению конвекции и электроосмотического потока при увеличении вязкости. Широкие диапазоны рН используются для оценки изоэлектрической точки, в то время как более узкие диапазоны применяются для улучшения точности.

Осаждение белков в их изоэлектрической точке во время этапа фокусирования предотвращают в случае необходимости с помощью таких буферных добавок, как глицерин, поверхностно-активные вещества, мочевина или цвиттерионные буферные соли.

Изотахофорез – это метод разделения, который проводится в режиме поддержания постоянства тока (все разделенные зоны движутся с одной скоростью). При этом должно обеспечиваться постоянное отношение между концентрацией и подвижностью ионов в каждой зоне.

В капиллярном изотахофорезе применяются два буферных раствора, между которыми находятся зоны аналита. Например, для анализа анионов буфер должен быть выбран таким образом, чтобы ведущий электролит содержал анион с фактической подвижностью, превышающей характерную для разделяемых веществ. Аналогично ион завершающего электролита должен иметь меньшую подвижность, чем подвижность разделяемых веществ. В результате разделения ведущий анион движется первым, за ним движется анион с очередной высокой подвижностью и т. д. В капиллярном изотахофорезе индивидуальные анионы мигрируют в дискретных зонах, но все движутся с той же скоростью, что и ведущий анион. Концентрации анализируемых веществ одинаковы в каждой зоне; таким образом, длина каждой зоны пропорциональна количеству отдельного компонента. Зоны менее сконцентрированные, чем ведущий электролит, сужаются, зоны более сконцентрированные – расширяются. Принцип изотахофореза используется для предварительного концентрирования образца перед разделением его компонентов с помощью других методик капиллярного электрофореза.

Качественный анализ. К качественным результатам относится определение идентичности компонента пробы внутреннему или внешнему стандартному веществу по времени появления соответствующего пика.

Полуколичественный анализ. Полуколичественным результатом считается определение концентрации компонента пробы по площади или высоте пика при соотношении сигнал/фон от 2:1 до 3:1.

Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по формуле:

где: H – высота пика целевого компонента на электрофореграмме раствора сравнения, измеренная от максимума пика до базовой линии сигнала;

h – уровень шума на электрофореграмме, полученной после ввода холостой пробы.

Количественный анализ. Количественным результатом является определение концентрации искомого компонента пробы по площади пика при соотношении сигнал/шум больше, чем 3:1.

При количественном анализе образца для компенсации различий во временах миграции от анализа к анализу и для устранения различий в сигналах компонентов образца, обладающих различными временами миграции, площади пиков должны быть нормированы на соответствующие времена миграции. При использовании внутреннего стандарта необходимо убедиться, что ни один пик исследуемого вещества не маскируется пиком внутреннего стандарта.

Абсолютное содержание компонентов рассчитывают по отношению площадей анализируемого пика и пика стандарта. Процентное содержание одного или более компонентов анализируемого образца рассчитывают путем определения процентной доли скорректированных площадей пиков от общей площади всех пиков, за исключением пиков, вызванных растворителями или другими добавленными реактивами (процедура нормализации).

В качестве параметров пригодности системы используются: кажущееся число теоретических тарелок (N), разрешение (R_s), фактор емкости (k’) (только для мицеллярной электрокинетической хроматографии) и фактор симметричности (A_s).

Кажущееся число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано эмпирически по формуле:

где t_r – время миграции или расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика соответствующего компонента;

w_0,5 – ширина пика на половине высоты.

Разрешение (R_s) между пиками схожей величины двух компонентов вычисляют по формуле:

где t_r_,_b и t_r_,_a – времена миграции или расстояния вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков;

Фактор симметричности пика рассчитывают по формуле:

где w_0,05 – ширина пика на 1/20 от его высоты;

d – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передним краем пика на 1/20 от высоты пика.

В качестве параметров пригодности используются также испытания на воспроизводимость площади (стандартное отклонение площади или отношения площади к времени миграции) и воспроизводимость времени миграции (стандартное отклонение времени миграции).

В фармакопейной статье указывают использование определенного капилляра, буферного раствора, метода предварительной подготовки капилляра, пробоподготовки и условий миграции.

источник

Электрофорез — метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к перемещению в электрическом поле. Скорость перемещения ионов зависит от напряженности электрического поля, величины заряда, размера частицы, вязкости, pH среды, температуры и других факторов. Электрофоретическая подвижность — величина, характерная для испытуемого вещества. Различают абсолютную (измеряемую в сантиметрах в секунду) и относительную электрофоретическую подвижность (отношение к подвижности стандартного образца). По технике выполнения и аналитическим возможностям электрофорез на бумаге и в тонких слоях сорбента сходен с ТСХ. Он позволяет разделять и идентифицировать компоненты различных смесей.

Под действием электрического поля заряженные частички, растворенные или диспергированные в растворе электролита, передвигаются в направление к электроду противоположной полярности, а молекулы с положительными и отрицательными зарядами передвигаются в направлении их суммарного заряда. Скорость передвижения прямо пропорциональна суммарному заряду частицы и обратно пропорциональна ее размеру, либо молекулярной массе. В гель-электрофорезе движение частиц замедляется взаимодействием с окружающей матрицей геля, что действует как молекулярное сито. Встречные взаимодействия электрической силы и молекулярного сита приводят к диференциации скорости передвижения частиц в зависимости от их размеров, форм и зарядов. В ходе электрофореза из-за различия физико-химических свойств, разные макромолекулярные смеси передвигаются с разной скоростью и, таким образом, разделяются на дискретные фракции. Электрофоретическое разделение может быть проведено в системах без неподвижных фаз (например, свободное разделение раствора в капилярном электрофорезе) и в стабилизированных средах, таких как тонкослойные пластинки, пленки или гели.

# Существует два различных метода электрофореза: фронтальный и зональный. Фронтальный электрофорез проводят в свободной незакрепленной среде, и он является единственным способом определения абсолютной электрофоретической подвижности. Зональный электрофорез проводят в закрепленной среде, роль которой состоит в стабилизации электрофоретических зон.

Капиллярный электрофорез основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля за счёт подачи высокого напряжения к концам капилляра. Наиболее распространёнными вариантами метода КЭФ являются: капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) и мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ).Этот метод обычно используется лишь для небольших образцов испытуемых веществ. Природа носителя, например, бумага, гель агара, ацетат целлюлозы, крахмал, агароза, полиакриламид, смешанный гель, служит причиной ряда дополнительных факторов, влияющих на подвижность: а) вследствие наличия каналов в фазе носителя, среднее растояние, которое проходит вещество, становится меньше реально пройденного расстояния; б) некоторые фазы носителя электрически не нейтральны. Следовательно, скорость передвижения зависит от таких главных факторов: подвижности заряженной частицы, потока скорости электроэндоосмоса и испарения жидкости с фазы носителя, а также силы (напряжения поля). Поэтому необходимо проводить испытание в строго определенных экспериментальных условиях и, по возможности, использовать стандартные вещества.

Прибор для электрофореза состоит из: источника постоянного тока, напряжение которого можно контролировать и, желательно, стабилизировать; электрофоретической камеры. Обычно это камера из стекла или твердой пластмассы, которая состоит из двух отдельных резервуаров – анодного и катодного, содержащих раствор электролита. В каждый резервуар камеры погружается электорд, напрмер, платиновый или графитовый. Они присоединяются изолированной схемой к соответствующему выходу источника питания и образуют анод и катод. Уровень жидкости в обоих резервуарах камеры поддерживается одинаковым для избежания переливания через сифон. Метод анализа — капиллярный электрофорез — на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа сложных смесей на составляющие компоненты и находит всё более широкое применение — и лекарственных средств. Метод характеризуется экспрессностью, микрообъемами анализируемого раствора, отсутствием колонки и твёрдого сорбента, проблем с его «старением» (в отличие от ВЭЖХ), физической и химической деструкции и любого неспецифического связывания с ним компонентов пробы, а также практически не требуется органических растворителей].

55. Масс-спектрометрия. Сочетание масс-спектрометрии с хроматографическими методами (ГХ-МС, ЖХ-МС). Применение в фармацевтическом анализе.
Масс-спектрометрия основана на прямом измерении отношения массы к числу элементарных положительных или отрицательных зарядов ионов (m/z ), полученных из анализируемого вещества и находящихся в газовой фазе. Данное отношение выражается в атомных единицах массы (1 а.е.м. = одной двенадцатой массы нуклида 12С). Ионы, образовавшиеся в ионном источнике, ускоряются и перед попаданием в детектор разделяются с помощью масс-анализатора. Все эти действия происходят в камере, в которой насосная система поддерживает вакуум от 10 −3 до 10 −6 Па. Результирующий масс-спектр является графиком зависимости относительного количества различных ионов от отношения m/z. Сигнал, отвечающий иону, представлен несколькими пиками, соответствующими статистическому распределению различных изотопов этого иона. Такой сигнал называется изотопным профилем, а пик, представляющий наиболее распространённые изотопы для каждого атома, — моноизотопным пиком. Масс-спектрометрический анализ даёт важную качественную (определение молекулярных масс; информация, касающаяся структуры определяемых фрагментов) и количественную (с использованием внешнего или внутреннего стандартов) информацию с пределом обнаружения от пикомоля до фемтомоля. Газовая хроматография (ГХ) представляет собой метод разделения, в котором подвижной фазой является газ (газ-носитель), а неподвижной фазой, помещенной в колонку, является твердое вещество или жидкость, нанесенные на твердый инертный носитель или равномерно покрывающие внутренние стенки колонки. Газовая хроматография основана на механизмах адсорбции и/или распределения. Жидкостная хроматография(ЖХ) представляет собой метод разделения, в котором подвижной фазой является жидкость, а неподвижной фазой, помещенной в колонку, является тонкодисперсное твердое вещество или жидкость, нанесенная на твердый тонкодисперсный носитель, или химически модифицированный тонкодисперсный носитель посредством введения органических групп. Жидкостная хроматография основана на механизмах адсорбции, распределения, ионного обмена или разделения по размерам молекул. Газовая хроматография/масс-спектрометрия. При использовании подходящих колонок (капиллярных или полукапиллярных) возможно непосредственное введение конца колонки в ионный источник прибора без применения сепаратора. Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия. Такая комбинация особенно полезна для анализа полярных соединений, которые являются недостаточно летучими либо слишком термолабильными, для того чтобы их можно было проанализировать методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Данный метод осложняется трудностью получения ионов в газовой фазе из жидкой фазы, что требует применения специальных интерфейсов, таких как:

56.Термические методы анализа: термогравиметрия, дифференциальный термический анализ, дифференциальная сканирующая калориметрия. Применение в фармацевтическом анализе.

Термический анализ объединяет группу методов, при помощи которых определяется зависимость различных физических свойств веществ от температуры. Обычно в большинстве используемых методов определяют изменение энергии или массы испытуемого образца. Характерной особенностью термических методов анализа — их универсальность. Инструментальные методы термического анализа дают информацию о кристаллической структуре, температуре кипения, дегидратации, твердофазном взаимодействии. Эта информация может быть использована для идентификации, определения чистоты, влажности и стабильности веществ, количественного определения термонестойких веществ, выявления присутствия полиморфных форм, для характеристики совместимости субстанций и вспомогательных веществ в лекарственных средствах, выбора упаковки и контроля качества. Различают термогравиметрию, дифференциальный термический анализ, дифференциальную отраженную колориметрию. Термические методы анализа не требуют больших количеств веществ, непродолжительны по времени выполнения. В частности, определение потери в массе при высушивании методом термогравиметрии включают в частные статьи на дорогие субстанции. В частных статьях следует указывать параметры, необходимые для корректного выполнения методики, например: скорость и температуру нагревания, инертный газ и скорость его потока. Термогравиметрия представляет собой метод, при помощи которого регистрируют изменение массы испытуемого образца от программированного изменения температуры.

57. Белоксвязывающие методы анализа: иммунохимические и рецепторные. Применение в фармацевтическом анализе.

В основе иммунохимических методов анализа лежит высокоспецифичная и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами. Антитела – это белки класса иммуноглобулинов, которые вырабатываются в имунной системе в результате проявления защитной функции (иммунитета) при попадании в организм чужеродного вещества – антигена. Антиген – это вещество, которое индуцирует выработку антител. Достоинства метода: быстрота и простота определения; возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях; не сложная пробоподготовка; высокая точность; не требуется дорогостоящей аппаратуры. Недостатками можно назвать узкую специфичность и влияние компонентов матрицы. Метод применяется для обнаружения вирусов, гормонов, лекарственных препаратов, определения биологически активных веществ. Существует два способа реализации иммунохимического анализа – прямой и непрямой. Прямой способ. Антитела нанесены на твердую фазу, ферментная метка вводится в антиген. Преимущества – небольшое число стадий и, соответственно, возможность автоматизации определения. Недостатоки – сложность и неуниверсальность методов синтеза ферментных коньюгатов (промежуточная стадия имунной реакции), а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента. Непрямой способ. Антиген наносится на твердую фазу, ферментной меткой отмечаются вторичные антитела, полученные против иммуноглобулинов соответствующего типа. Достоиством этого способа является возможность устранения влияний различных эффектов на каталитические свойства ферментов. На основе иммуннохимического метода создано множество тест-систем. Они реализуются обычно на микропланшетах или в пробирках. С помощью тест-систем определяются гормоны и лекарства в сыворотке крови. Кроме того, на основе иммунной реакции создаются биосенсоры. МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА. В методах с использованием меченых веществ могут применяться подходящие метки, например, ферменты, флуорофоры, люминофоры и радиоизотопы. МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕМЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ИЛИ АНТИТЕЛА. Методы иммунопреципитации.Методы иммунопреципитации включают процессы флокуляции и осаждения. При смешивании растворов антигена с соответствующим антителом в подходящих условиях реактанты образуют флокулирующие или преципитационные агрегаты. Иммунопреципитация может оцениваться визуально или по светорассеянию (нефелометрическое и турбидиметрическое определение).Если система иммунопреципитации состоит из одного антигена в комбинации с соответствующим антителом, система определяется как простая; если в ней участвуют родственные, но серологически неидентичные реактанты, система является сложной, а если в ней участвуют несколько серологически не связанных друг с другом реактантов, ее называют комплексной. Простая радиальная иммунодиффузия (ПРИД) представляет собой простой количественный иммуодиффузионный метод. При достижении равновесия между внешним и внутренним реактантами круговая область преципитации, начинающаяся от места локализации внешнего реактанта, прямо пропорциональна количеству нанесенного антигена и обратно пропорциональна концентрации антитела в геле.

Дата добавления: 2016-07-09 ; просмотров: 2545 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

Ознакомление с методом электрофореза. Подробное рассмотрение разновидности метода. Изучение последовательности анализа методом свободного (фронтального) и зонального (на носителях) электрофореза. Описание применения метода в оценке лекарственных средств.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГБОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия

Министерства Здравоохранения России

Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии

Применение метода электрофореза в анализе лекарственных средств

РБ, г. Минск, ул. Ландера, 62/1-65

электрофорез анализ зональный лекарственный

1.1 Электрокинетические явления

1.2.1 Свободный (фронтальный) электрофорез

1.2.2 Электрофорез на носителях (зональный электрофорез)

1.2.2.1 Электрофорез в свободной жидкости

1.2.2.2 Электрофорез в крупнопористых носителях

1.2.2.3 Электрофорез на мелкопористых носителях

2.1 Капиллярный электрофорез

Список используемых источников

Свойствами и анализом лекарственных веществ занимается фармацевтическая химия.

Фармацевтическая химия — наука, которая, базируясь на общих законах химических наук, изучает многообразный круг вопросов, связанных с лекарственными веществами: их получение и химическую природу, состав и строение, влияние отдельных особенностей строения их молекул на характер действия на организм, изучает физические и химические свойства лекарственных веществ и методы контроля их качества, определяет условия хранения лекарств.

Фармацевтическая химия занимает ведущее место в комплексе смежных фармацевтических наук (технология лекарств, токсикологическая химия, фармакогнозия, экономика и организация фармацевтического дела) и является необходимым фундаментом для их понимания и знания.

В то же время фармацевтическая химия, являясь специализированной наукой, не может не опираться на знания смежных химических (неорганическая, органическая, аналитическая, физиологическая и коллоидная химия), а также медико-биологических (фармакология, физиология, биологическая химия) дисциплин.

Знание биологических дисциплин необходимо для понимания сложных физиологических процессов, происходящих в организме, в основе которых лежат химические и физические реакции. Это позволяет более рационально применять лекарственные вещества, наблюдать за их действием в организме и на основании этого изменять в необходимом направлении структуру молекул создаваемых лекарственных веществ с целью получения желаемого фармакологического эффекта. По результатам фармакологического испытания лекарственных веществ дается заключение о возможности использования их в медицинской практике.

Одна из важных задач современной химии — надежный и точный анализ органических веществ, часто близких по строению и свойствам. Без этого невозможно проведение химических, биохимических и медицинских исследований, на этом в значительной степени базируются экологические методы анализа окружающей среды, криминалистическая экспертиза, а также химическая, нефтяная, газовая, пищевая, медицинская отрасли промышленности и многие другие отрасли народного хозяйства.

— изучить применение метода электрофореза в анализе лекарственных средств.

1. Ознакомится с методом электрофореза

2. Подробно рассмотреть разновидности метода

3. Изучить последовательность анализа методом электрофореза

4. Изучить область применения метода.

1.1 Электрокинетические явления

Электрокинетическими явлениями называют перемещение одной фазы относительно другой в электрическом поле и возникновение разности потенциалов при течении жидкости через пористые материалы (потенциал протекания) или при оседании частиц (потенциал оседания). Перенос коллоидных частиц в электрическом поле называется электрофорезом.

В эксперименте Ф.Ф. Рейсс погрузил в глину две стеклянные трубки, заполнил их водой и после наложения на них электрического поля наблюдал перемещение частиц глины в жидкости в направлении положительно заряженного электрода. Это был электрофорез. Таким образом, было обнаружено, что частицы имеют заряд, противоположный заряду жидкости. [1] Электрофорез применяют главным образом для разделения веществ, молекулы которых различаются по электрофоретической подвижности, т.е. отношению скорости электрофореза (скорости перемещения заряженных частиц вещества) к напряженности электрического поля, которое зависит от свойств заряженных частиц окружающей их среды. Путем изменения внешних условий (например, рН среды, температуры, силы тока, состава и концентрации буферного раствора или носителя) создают подходящие условия для разделения. Вследствие того что при разделении на молекулы действуют только электростатические силы, электрофорез считают «мягким» методом и поэтому часто применяют для работы с лабильными веществами.

Электрофорез можно проводить в растворе, но из-за неизбежного выделения теплоты и возникающей в связи с этим тепловой конвекции процесс, как правило, проводят на носителе.

Вследствие некоторых сопутствующих явлений (адсорбция, несоизмеримость размеров высокомолекулярных соединений и пор носителя) введение носителя ограничивает область применения метода.

Однако свойства носителя иногда используют для повышения эффективности разделения: например, при электрофорезе в градиенте полиакриламидного геля фракционирование осуществляется не столько за счет различной электрофоретической подвижности веществ, сколько за счет различия в их молекулярных массах.

Таким образом, мы рассмотрели и дали понятие электрокинетическим явлениям.

А также описали методику проведения данных явлений, с помощью электрофореза.

Электрофорез — это процесс направленного движения частиц, диспергированных в жидкости в постоянном электрическом поле.

Частицы одного и того же вещества несут одинаковые по знаку заряды. В электрическом поле положительно заряженные частицы перемещаются к отрицательному электроду — катоду, отрицательно заряженные частицы к положительному электроду — аноду.

Движение частиц к катоду иногда называют катафорезом, к аноду — анафорезом.

Скорость движения зависит от массы частиц, и их заряда в данных условиях, благодаря чему электрофорез позволяет разделять смеси веществ на составляющие их компоненты.

Рис. 1. Схема свободного (фронтального) электрофореза. Положение границ раздела: а — до опыта; б — после опыта. 1 — электроды; 2 — растворитель; 3 — раствор белка.

Различают следующие виды электрофореза.

1.2.1 Свободный (фронтальный) электрофорез

В этом случае электрофорез проводят в приборах, существенной частью которых является U-образная трубка (Рис. 1). Нижнюю часть трубки заполняют испытуемым объектом, например раствором белка, на который наслаивают растворитель. В растворитель погружают электроды, соединенные с источником постоянного тока. При этом электрически заряженные частицы белка перемещаются к одному из электродов, вследствие чего граница раздела между раствором и растворителем в одном колене поднимается (восходящая граница), а в другом опускается (нисходящая граница).

Приборы для свободного электрофореза, снабженные устройством автоматической регистрации перемещения каждого компонента в исследуемом объекте, применяют при анализе дисперсных систем, выделении из них отдельных компонентов, а также при клиническом исследовании сыворотки крови. [3, 4, 9]

Таким образом, мы рассмотрели один из видов электрофореза — свободный (фронтальный) электрофорез.

Также была описана методика проведения данного метода, на примере раствора белка.

1.2.2 Электрофорез на носителях (зональный электрофорез)

В качестве носителей используют бумагу, гели крахмала, агара, полиуретанов и др. В клинических лабораториях особо широкое распространение для исследования сыворотки крови получил электрофорез на бумаге, который проводится следующим образом: на полоску специального сорта бумаги, пропитанной соответствующим буферным раствором, наносят капельку сыворотки крови. Концы полоски опускают в чашечки, заполненные данным буферным раствором и снабженные электродами. При пропускании постоянного электрического тока отдельные белки сыворотки перемещаются вдоль полоски с разными скоростями, а иногда и в разных направлениях. По истечении определенного времени пропускание тока прекращают, полоску бумаги подсушивают и обрабатывают реактивом на белок. При этом на бумажной электрофореграмме выявляются окрашенные пятна. По числу пятен судят о количестве белковых фракций, а по интенсивности окраски пятен — о количественном содержании каждой белковой фракции в исследуемой сыворотке.

В последнее время широкое применение в исследовательской работе и в клинической диагностике находит электрофорез в тонких слоях гелей, нанесенных на стеклянные пластинки (дисковый электрофорез), а также помещенных в стеклянные трубочки.

Преимущества методов зонального электрофореза в сравнении с методами свободного электрофореза заключаются в следующем:

1. Все они значительно проще в осуществлении.

2. Необходимое количество исследуемого материала весьма мало. Например, для электрофореза на бумаге требуется 0,5—0,8 мг белка, а для электрофореза в полиакриламидном геле — всего 100—200 мкг. В то же время свободный электрофорез даже в аппаратах для микро- или полумикроанализа требует значительных количеств сыворотки. Это является одной из причин, по которым задерживается широкое использование свободного электрофореза в повседневной работе клинических лабораторий. Благодаря малому количеству белка, требующемуся для исследования методом зонального электрофореза, появилась возможность ставить практически неограниченное число анализов белков сыворотки. Зональный электрофорез широко используется для анализа белков в педиатрической практике и при исследовании материалов с низкой концентрацией белка (например, спинномозговая и тканевая жидкости), не говоря уже о чрезвычайно широком использовании этого метода в экспериментальных исследованиях на животных. Поскольку для опытов требуются лишь очень небольшие количества исследуемого материала, можно ставить сколько угодно параллельных проб, что в значительной мере повышает точность исследования.

3. После электрофоретического разделения белковые фракции можно фиксировать в поддерживающей среде и выявить с помощью специфического окрашивания. Среди многочисленных методов окрашивания особое значение в клинических исследованиях приобрели способы выявления связанных с белками липидных и углеводных компонентов. Благодаря простоте этих методов анализ липопротеидов и гликопротеидов стал обычным в повседневной клинической практике. Он приобрел большое значение в диагностике некоторых заболеваний, а это позволило значительно продвинуться в выяснении их патогенеза. Специальные методы окрашивания помогают также обнаружить трансферрин, гаптоглобин, церулоплазмин и другие компоненты сыворотки.

4. Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этому увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом.

5. При зональном электрофорезе разделение белковых фракций происходит очень быстро. Некоторые методы позволяют закончить всю процедуру, включая окрашивание, за 1—2 ч.

6. Прибор для зонального электрофореза имеет простое устройство и может быть изготовлен даже в небольшой мастерской. Стоимость такого самодельного или имеющегося в продаже прибора значительно ниже цены аппарата для свободного электрофореза.

7. Кроме обычного окрашивания, белки, меченные радиоактивным изотопом, после разделения зональным электрофорезом можно выявлять радиоавтографически. Большое значение имеет также тот факт, что с помощью соответствующих субстратов можно непосредственно в поддерживающей среде тестировать ферментативную активность полученных белковых фракций. Метод зонального электрофореза имеет и некоторые недостатки. С его помощью нельзя произвести прямого определения скорости миграции белков. Между исследуемыми белками и поддерживающей средой возможны нежелательные взаимодействия, в результате которых часть белка адсорбируется в среде. Адсорбция происходит сильнее всего на бумаге, менее выражена на ацетат-целлюлозной мембране и практически ничтожна в агаровом геле. [3, 5, 7]

Таким образом, был описан один из видов электрофореза — зональный электрофорез. Отмечены основные составляющие, при проведении данного метода и перечислены подвиды данного метода.

1.2.2.1 Электрофорез в свободной жидкости

Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез.

Изоэлектрическое фокусирование. В качестве среды используют жидкость, в которой создают объединенный градиент плотности и рН. Градиент рН достигают прибавлением амфолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминополикарбоновых кислот, или экспериментально подобранных смесей, которые при приложении электрического напряжения концентрируются в узких зонах своих изоэлектрических точек (рI). В результате в колонке создается градиент рН от 1 до 11. При электрофоретическом разделении, например смеси белков, каждый из них перемещается, пока дойдет до зоны, соответствующей его рI. Метод позволяет разделять вещества, различие в рI которых составляет до 0,02, а также определять их рI. В обоих методах полностью исключена адсорбция, что позволяет обнаруживать и количественно оценивать вещества во фракциях непосредственно после электрофореза. [5, 18]

Таким образом, мы рассмотрели основной принцип проведения электрофореза в свободной жидкости. Было отмечено, что проведения данного метода зависит от состояния среды внутренней трубки стеклянной охлаждаемой колонки.

1.2.2.2 Электрофорез на крупнопористых носителях

В качестве крупнопористых носителей применяют фильтровальную бумагу, крахмал, целлюлозу, порошкообразную пластмассу, агар-агар, ацетилцеллюлозу, стеклянный порошок.

Электрофорез в блоке. В качестве носителя используют крахмал, который формируют в виде блока, помещают на лоток, соединенный с двумя электродными сосудами, заполненными буферным раствором. Раствор исследуемого препарата замешивают на сухом крахмале и вносят в узкую поперечную траншею, сделанную в середине блока. После прекращения электрофореза блок разрезают на поперечные доли из каждой элюируют и количественно определяют исследуемое вещество. Метод применяется для разделения веществ с молекулярной массой выше 30 000, так как вещества с меньшей молекулярной массой проникают и адсорбируются внутри крахмальных зерен.

Электрофорез на колонках. Колонку заполняют суспензированным в буфере носителем. Фракционируемую смесь отрицательно заряженных веществ (что имеет место для большинства биологических материалов) наносят в колонку сверху, а положительно заряженных — снизу. Сбор фракций после электрофореза осуществляют путем последовательного элюирования буферным раствором.

Электрофорез на проточных установках. Кювета проточной установки представляет собой полую стенку, которую заполняют носителем. Электрическое поле накладывают в поперечном направлении. В кювете создают равномерный ток буферного раствора сверху вниз. Наверх кюветы в одно и то же место непрерывно подают тонкую струйку фракционируемого раствора. Под совместным влиянием электрического и гравитационного полей исходная смесь по мере спускания разделяется на расходящиеся веером компоненты. Со дна кюветы фракции собирают в серию пробирок.

Вариант этого метода на бумаге известен под названием вертикального электрофореза.

Электрофорез на бумаге. Вещество, подлежащее фракционированию, наносят на пропитанную проводящей жидкостью полоску фильтровальной бумаги на расстоянии не менее 1 см от края и не менее 2,5 см друг от друга. Бумагу подсушивают, помещают в камеру, концы погружают в кюветы с проводящей жидкостью. После пропитывания бумаги жидкостью к ее концам подключают электрический ток. По окончании электрофореза бумагу подсушивают в токе воздуха и оценивают результаты в соответствии с указаниями в статьях.

Для электрофореза пригодны только лучшие сорта хроматографической бумаги, которые должны содержать не менее 96% альфа — целлюлозы. Бумагу предварительно подвергают хроматографической очистке подходящими растворителями. Вместо бумаги могут быть использованы полоски ацетатцеллюлозы.[3,16]

Таким образом, мы рассмотрели основной принцип проведения электрофореза на крупнопористых носителях. Необходимо отметить тот факт, что проведение метода основано от выбора носителя. Данный метод применяют для разделения веществ с молекулярной массой свыше 30000.

1.2.2.3 Электрофорез на мелкопористых носителях

На мелкопористых носителях разделение веществ на зоны идет не только в соответствии с их электрическими зарядами, но и в зависимости от молекулярной массы и формы молекул.

Электрофорез в тонком слое проводится в закрепленном толщиной 1-2 мм слое силикагеля, агара, агарозы, крахмала, полиакриламидного геля, сефадекса, целлюлозы, кизельгура, окиси алюминия, алебастра. Проводящую жидкость вводят в слой носителя или ею опрыскивают слой после его формирования. Раствор исследуемого вещества вносят на поверхность слоя или внутрь отверстий, вырезанных в слое. Электрофоретический процесс можно проводить в устройствах, предназначенных для электрофореза на бумаге.

Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной 5-6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3-0,7 мм). В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором исследуемого вещества, и проводят одномерный или двухмерный электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках.

Преимущество горизонтального варианта — простота исполнения, вертикального — большая разрешающая сила.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель (ПАГ) представляет собой синтетический продукт сополимеризации акриламида и сшивающего агента, чаще всего N, N1-метиленбисакриламида.

Благодаря образованию поперечных связей между растущими соседними полиакриламидными цепями, возникающими в результате полимеризации винильных групп, такой гель имеет структуру трехмерной сетки. В отличие от природного полимера крахмала синтетический гель прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос. ПАГ готовят на буфере, в котором растворяют акриламид, сшивку и катализатор. Можно получить гель с концентрацией акриламида от 2 до 50%. Повышение концентрации геля понижает его пористость. Буферная система и состав геля определяются природой разделяемого вещества. Концентрацию (с) акриламида подбирают с учетом средней молекулярной массы (М. м.) фракционируемых веществ. [3, 5, 10]

Таким образом, было отмечено методика проведения данного вида электрофореза. Данный метод можно проводить в горизонтальных и вертикальных установках.

2.1 Капиллярный электрофорез

Опыт современной науки показывает, что сочетание казалось-бы противоположных свойств приводит к получению новых, неожиданных результатов. Именно такое сочетание свойств воды (водных растворов электролитов) и «камня» (диоксида кремния, кварца, из которого изготовлен капилляр), позволили создать новый метод анализа, который носит название капиллярного электрофореза (КЭФ). Собственно и электрофорез и капиллярность были известны достаточно давно, но только несколько десятилетий назад удалось разработать новый метод анализа, в котором эти явления используются для разделения проб сложного состава на составляющие компоненты.

На сегодняшний день капиллярный электрофорез является одним из наиболее перспективных методов анализа, он динамично развивается и получает всё более широкое применение в различных областях химии. Простота и доступность этого метода, а также неоспоримые преимущества, которые он даёт при выполнении измерений, позволяют надеяться на динамичное развитие методического обеспечения и скорейшее включение капиллярного электрофореза в перечень физико-химических методов анализа, наиболее часто применяемых в повседневной лабораторной практике. [6, 17]

Теоретические основы капиллярного электрофореза достаточно сложны, что обусловлено использованием в этом методе свойств поверхности раздела двух фаз — жидкости и твердого тела, свойств вязкости жидкости и свойств ионной электропроводности жидкости, потому, не претендуя на академическую строгость изложения, постараемся продемонстрировать основные моменты метода капиллярного электрофореза.

Рис. 2. Схема процессов, происходящих на поверхности кварца

а) ювенильная (свежесозданная) поверхность кварца

б) образование силанольных групп на поверхности кварца

в) диссоциация силанольных групп в водном электролите

г) гидратация образовавшихся ионов

д) связывание части катионов с поверхностью, формирование двойного электрического слоя

Обратимся к процессам, происходящим на границе раздела двух фаз: внутренней поверхности кварцевого капилляра и водного раствора электролита, заполняющего капилляр. На свежеобразованной (ювенильной) поверхности плавленого кварца (SiO2) находятся главным образом силоксановые группы (рис. 2а). При контакте с парами воды или водными растворами силоксановые группы, обладающие двойными связями, оказываются неустойчивыми и, присоединяя молекулу воды, образуют силанольные группы (рис. 1б). При контакте поверхности кварца с водными растворами, силанольные группы диссоциируют с отщеплением ионов Н+ (рис. 2в). Степень диссоциации зависит от температуры и состава водного раствора, в частности от величины рН. При рН> 2,5 на поверхности кварца образуются диссоциированные силанольные группы, которые создают отрицательный поверхностный заряд.

Диссоциированные ионы, находящиеся как на кварцевой поверхности, так и в объёме электролита, гидратируются (рис. 2г). За счёт сил кулоновского взаимодействия, противоположно заряженные гидратированные ионы, находящиеся на поверхности и в объёме жидкости, взаимно притягиваются. Действующие при этом силы настолько велики, что ионы (часть катионов и остатки силанольных групп) частично теряют гидратирующую воду. В результате этого, первый слой катионов, непосредственно прилегающий к поверхности, теряет подвижность, связывается (рис. 2д). Поскольку «пушистые» гидратированные катионы не могут все разместиться в виде монослоя и полностью компенсировать отрицательный заряд поверхности, некоторая часть катионов, нейтрализующих отрицательный заряд, отходит в толщу раствора и образует заряд, распределённый в объеме жидкости, прилегающем к границе раздела и, в силу меньшей энергии связи с поверхностью, обладающий способностью к перемещению (рис. 3а).

Рис. 3. Формирование двойного электрического слоя (а) и ход потенциала на границе раздела кварц-электролит (б)

Несмотря на сильное кулоновское взаимодействие рекомбинации зарядов не происходит. В результате взаимодействующие системы зарядов образуют двойной электрический слой, состоящий как бы из двух изолированных друг от друга обкладок конденсатора, имеющих заряды противоположного знака. Одну из обкладок составляют отрицательно заряженные остатки силанольных групп, другая состоит из двух частей — неподвижного слоя катионов, непосредственно примыкающих к поверхности кварца, и диффузного слоя, образованного катионами, находящимися в объеме жидкости. Распределение катионов между неподвижным и диффузным слоями, а, следовательно, и толщина двойного электрического слоя зависит в первую очередь от общей концентрации электролита в растворе. Чем она выше, тем бoльшая часть положительного заряда диффузного слоя перемещается в неподвижный слой и тем меньше становится толщина диффузного слоя (рис. 3б). При концентрации бинарного однозарядного электролита 10-3. 10-4 М толщина двойного электрического слоя составляет в среднем 30-50 мкм.

Свернём (мысленно) рассматриваемую поверхность в виде трубы с внутренним диаметром 50-100 мкм, тогда окажется, что практически вся жидкость, заполняющая её, будет представлять собой диффузную часть двойного электрического слоя. Трубу столь малого диаметра принято называть капилляром. Если в такой системе вдоль оси капилляра приложить электрическое поле, то в капилляре возникнет продольное движение свободных носителей электрических зарядов (разнополярных ионов) во взаимно противоположных направлениях, а поскольку в диффузной части двойного электрического слоя присутствует избыточная концентрация катионов, то число ионов, перемещающихся к катоду будет значительно больше, при этом их движение будет увлекать за собой всю остальную массу жидкости в капилляре (вследствие молекулярного сцепления и внутреннего трения). Возникает так называемый электроосмотический поток (ЭОП), направленный к катоду, который будет осуществлять пассивный перенос раствора внутри капилляра (рис. 3). [7, 12, 19]

Рис. 4. Схема процессов в кварцевом капилляре. Стрелкой показано направление электроосмотического потока.

Вследствие этого процесса в электролите, заполняющем капилляр, возникает направленное перемещение массы жидкости, которое вызвано приложенной разностью потенциалов, при этом вся масса жидкости (за малым исключением приповерхностного слоя) перемещается с одинаковой скоростью, т.е. формируется плоский профиль скоростей. Это очень важное обстоятельство, которое позволяет получить чрезвычайно высокую разрешающую способность метода, поэтому на него надо обратить особое внимание.

Минимальный состав системы, реализующей метод капиллярного электрофореза, должен иметь в своём составе следующие компоненты: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и устройство вывода информации. Дополнительные устройства позволяют автоматизировать подачу образцов, термостатировать капилляр и сделать более удобной обработку получаемой информации.

На рис. 5 представлена схема системы капиллярного электрофореза в простейшем случае. Капилляр заполняется раствором электролита, своими концами капилляр опущен в два сосуда, содержащих тот же электролит. Электролит обязательно должен обладать буферными свойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изменению состава раствора в приэлектродных пространствах, а с другой — стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа. В сосуды введены электроды, к которым прикладывается разность потенциалов. Под действием разности потенциалов в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через него протекает электроосмотический поток (ЭОП), на который будет накладываться электромиграция катионов и анионов во взаимно противоположных направлениях.

Рис. 5. Схема системы капиллярного электрофореза

Как правило, в приборах капиллярного электрофореза ЭОП направлен от входного конца капилляра к детектору поэтому, при использовании кварцевого капилляра, разность потенциалов устанавливают таким образом, что входной конец капилляра имеет положительную полярность (анод), а детектор устанавливается вблизи катода. Если теперь в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить зону пробы к катоду, и она некоторое время будет находиться в капилляре под воздействием электрического поля высокой напряженности. В течение этого времени компоненты пробы, имеющие заряды и отличающиеся от компонентов рабочего буфера, будут перемещаться в соответствии с присущими им электрическими подвижностями, специфичными для каждого компонента. Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток. Скорость их движения будет складываться из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионные компоненты будут появляться первыми и тем раньше, чем больше электрическая подвижность данного иона. Нейтральные компоненты пробы будут перемещаться только под действием ЭОП, и появятся на выходе, когда его достигнет зона пробы. Анионные компоненты перемещаются к аноду с различными скоростями. Некоторые из них, медленно мигрирующие, будут появляться вблизи детектора после выхода ЭОП, а те, чья скорость миграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, рано или поздно выйдут из капилляра в прианодное пространство.

Если время нахождения пробы в капилляре (которое можно регулировать длиной капилляра, скоростью ЭОП или приложенной разностью потенциалов) достаточно, то на выходе капилляра вблизи катода формируются зоны раствора, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы. Происходит, таким образом, разделение исходной смеси. Если теперь с помощью детектора зарегистрировать появление компонентов на выходе из капилляра, то полученная запись будет называться электрофореграммой и может служить основой для качественного и количественного анализа смеси. Описанный вариант анализа носит название капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ). В этом варианте могут определяться катионные компоненты проб и некоторые медленно мигрирующие анионы. Однако главные анионы, определяющие минеральный состав воды, зарегистрировать таким способом невозможно. [8, 12]

Анализ анионов методом капиллярного электрофореза

Для того чтобы методом КЗЭ можно было определять анионные компоненты проб, необходимо изменить полярность прикладываемого напряжения. Однако в этом случае изменится не только направление миграции анионов, но также направление ЭОП и он будет препятствовать перемещению в сторону детектора медленно мигрирующих анионов. Для изменения направления ЭОП необходимо модифицировать поверхность кварцевого капилляра таким образом, чтобы знаки зарядов двойного электрического слоя поменялись на обратные, и направление ЭОП совпадало с направлением перемещения анионов. Это достигается введением в рабочий буферный раствор катионного поверхностно-активного вещества, например, бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ). Катион ЦТАБ активно сорбируется на кварцевой поверхности, занимая при достаточной его концентрации, все вакансии в ближайшем к поверхности слое. Поверхность как бы «ощетинивается» длинными цетильными (С16Н33-) цепочками. при дальнейшей промывке рабочим буферным раствором поверхность сорбирует еще один слой поверхностно-активного катиона, ориентированного аммонийным концом наружу (сорбция «щетка в щетку»). В результате первая обкладка двойного электрического слоя становится положительно заряженнной, а вторая (в том числе и диффузная её часть) приобретает отрицательный заряд, и теперь ЭОП снова перемещается в направлении от входного конца капилляра к детектору.

Аналогичными свойствами по модификации поверхности капилляра обладают и другие буферные растворы, например, приготовленный на основе 2-[N-Циклогексиламино] этан-сульфоновой кислоты с модификатором электроосмотического потока в гидроксильной форме (тетрадецетилтриметил аммония гидроксид) и т.п.

В системах капиллярного электрофореза наиболее часто применяется фотометрическое детектирование, в котором используется одна ила несколько длин волн, обычно лежащих в ультрафиолетовой области спектра. Соответственно отклик детектора будет наблюдаться только в том случае, когда определяемый компонент имеет заметное поглощение на длине волны детектирования. Это — прямое детектирование. Электрофореграмма будет представлять собой набор положительных пиков, возвышающихся над базовой линией.

Однако, анионы, растворенные в воде, зарегистрировать таким простым способом не удается, т.к. они не обладают собственным поглощением в указанном спектральном диапазоне. В этом случае применяется косвенное детектирование, суть которого состоит в том, что ведущий электролит готовится с добавкой вещества, поглощающего свет на длине волны детектирования. В случае определения анионов добавка также должна быть анионом, например, это может быть хромат-ион. Вследствие того, что ионная сила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне, где находится непоглощающий ион, эквивалентно уменьшается концентрация поглощающего иона. В этом случае на электрофореграмме будут наблюдаться обратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациям определяемых ионов. В дальнейшем, при компьютерной обработке результатов измерений, график «переворачивается» и приобретает вид, удобный для рассмотрения, с положительно расположенными пиками.

Таким образом, вариант зонного капиллярного электрофореза с модификацией поверхности капилляра и непрямым детектированием позволяет анализировать компоненты, которые в условиях проведения анализа находятся в форме анионов. [13]

Метод анализа — капиллярный электрофорез — на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа сложных смесей на составляющие компоненты и находит всё более широкое применение — особенно в зарубежной практике, в том числе и лекарственных средств. Метод характеризуется экспрессностью, микрообъемами анализируемого раствора, отсутствием колонки и твёрдого сорбента, проблем с его «старением» (в отличие от ВЭЖХ), физической и химической деструкции и любого неспецифического связывания с ним компонентов пробы, а также практически не требуется органических растворителей.

Метод капиллярного электрофореза (КЭФ) основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля за счёт подачи высокого напряжения к концам капилляра.

Наиболее распространёнными вариантами метода КЭФ являются: капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) и мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ).

КЗЭ — метод разделения, реализуемый в капиллярах и основанный на различии в электрокинетических подвижностях заряженных частиц как в водных, так и в неводных электролитах.

МЭКХ — вариант капиллярного электрофореза, который позволяет проводить разделение соединений ионного и нейтрального характера при использовании поверхностно-активных веществ (ПАВ). Разделение электронейтральных соединений осуществляется благодаря введению в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ мицеллообразователей. Чаще всего используют анионный ПАВ (например, додецилсульфат натрия — ДДСН) в концентрациях, превышающих критическую концентрацию мицелообразования, что приводит к формированию так называемой «псевдостационарной фазы», и аналиты распределяются между мицеллой и буферным электролитом согласно их гидрофобности.Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью (более сотни тысяч теоретических тарелок). Это объясняется прежде всего уникальным свойством ЭОП в кварцевом капилляре, который заключается в формировании плоского профиля потока (в отличие от параболического в ВЭЖХ), не вызывающий при движении зон компонентов практически их уширения. Очень высокая эффективность разделения позволяет широко применять метод для выявления не только близких по строению веществ (белков, пептидов, аминокислот, наркотиков, витаминов, красителей и др.), но и для контроля качества, технологического контроля, идентификации лекарственных препаратов, исследования фармакокинетики.

Эффективность, выраженная числом теоретических тарелок, может быть определена непосредственно из электрофореграммы.

К снижению эффективности могут привести ряд факторов: увеличение зоны вводимой пробы (определяемая длительность ввода); образование температурного градиента (за счёт разницы температуры в центре капилляра и на внутренней стенке капилляра). Возникающий вследствие этого градиент вязкости приводит к тому, что вещество у стенки перемещается медленнее, чем в центре, что вызывает уширение полос и снижение эффективности; адсорбция на стенках капилляра, приводящая к искажению формы пиков (появление хвостов), и другие факторы. Все эти параметры управляются путём создания оптимальной схемы разделения.

Основным способом детектирования в системах капиллярного электрофореза («Капель — 103 Р», «Капель — 104 Т», «Капель — 103 РТ», «Капель — 104 М», «Капель — 105», «Капель — 105 М») отечественного производителя — фирмы «Люмекс», является фотометрический .

Особенностью фотометрического детектирования разделённых аналитов в условиях кварцевого капилляра является малая толщина слоя (что обусловлено внутренним диаметром капилляра), а также — введением очень малых объёмов проб (

Чувствительность метода КЭФ с УФ-детектированием может быть существенно повышена за счёт концентрирования образца непосредственно в капилляре. Одним из наиболее общих подходов к увеличени концентрационной чувствительности в КЭФ является приём стекинга. Концентрирование образца происходит, когда ионы аналитов пересекают границу, которая отделяет зону низкой проводимости раствора и высокой — ведущего электролита. В случае если проба образца имеет значительно более низкую проводимость (за счёт разбавления водой или буфером), чем ведущий электролит, в зоне образца возникает относительно высокое электрическое поле. Аналиты внутри зоны образца движутся с более высокой скоростью, и, замедляясь на границе с зоной ведущего электролита, концентрируются. Стекинг образца применяется только к заряженным аналитам.

Чувствительность метода КЭФ с УФ-детектированием может быть также повышена за счет увеличения длины оптического пути при использовании капилляров с расширенным световым путем. Существует несколько способов: зону детектирования выполняют в форме пузырька, возрастание чувствительности в 3-5 раз; используют капилляры Z-формы, увеличение чувствительности в 20-40 раз.

Важной задачей любого сепарационного метода является селективность разделения компонентов пробы. Повышение селективности разделения в КЭФ может быть обеспечено за счёт изменения рН ведущего электролита, изменения напряжения, температурного режима в системе, введения в состав буферного раствора макроциклов, органических растворителей и др.

Применение метода капиллярного электрофореза при аналитических исследованиях.

Капиллярный электрофорез как новый и быстро развивающийся метод широко применяется в фармацевтической практике лекарственных средств, в том числе и в биологических средах с целью идентификации и количественного анализа. Используются преимущественно кварцевые капилляры и УФ-детекторы. Однако находят применение в зарубежной практике и электрохимическое детектирование, амперометрические детекторы типа «отражающая стенка» с электродами из углеродного волокна, меди, вольт-амперометрические детекторы, а также масс-спектроскопия, лазерная флюоресценция.

Капиллярный электрофорез применяется и при определении нелетучих примесей в лекарственных веществах и составляет конкуренцию методу ВЭЖХ, отличаясь очень высокой эффективностью и сводя к минимуму размытие пиков. Как правило, метод используется для анализа водных растворов (буферные растворы), с добавлением ПАВ, либо не содержащих ПАВ. В отдельных работах показаны возможности использования неводного капиллярного электрофореза.

Использование сепарационного метода анализа позволяет эффективно решать вопросы стандартизации лекарственных препаратов сложного состава. Была изучена возможность применения капиллярного электрофореза для качественного обнаружения и количественного определения бутоконазола нитрата в лекарственном препарате и биологических жидкостях. Проведена сравнительная оценка фармакокинетических параметров, противогрибковой активности и мукоадгезивных свойств бутоконазола нитрата. Методика использована для изучения накопления бутоконазола в сыворотке крови.

Проведено изучение возможности анализа доксициклина в моче капиллярным электрофорезом с использованием отечественного прибора «Нанофор-1». Методика характеризуется высокой воспроизводимостью и достаточной чувствительностью (граница обнаружения — 5 мкг/мл мочи).

Фоминым А.Н. с соавторами показана возможность идентификации ряда азотсодержащих соединений основного характера в присутствии соэкстрактивных веществ мочи и крови методом капиллярного электрофореза «Капель-105» по электрофоретическим спектрам. Установлено, что на количественные характеристики исследуемых соединений не оказывают существенного влияния компоненты мочи и крови. [6, 7, 15]

Таким образом, в практической части курсовой был рассмотрен метод электрофореза — капиллярный электрофорез, который основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля за счет подачи высокого напряжения к концам капилляра. Данным методом был проведен анализ анионов. Также данный метод используется для анализа водных растворов.

В ходе проведенной работы над курсовой работой были рассмотрены поставленные задачи:

— ознакомились с методом электрофореза;

— рассмотрели подробно фронтальный, зональный и капиллярный методы электрофореза;

— изучили последовательность анализа лекарственных средств методом электрофореза;

— изучили область применения метода.

В курсовой работе всесторонне изучен метод электрофореза для анализа лекарственных средств. Электрофорез — это процесс направленного движения частиц, диспергированных в жидкости в постоянном электрическом поле. Частицы одного и того же вещества несут одинаковые по знаку заряды. В электрическом поле положительно заряженные частицы перемещаются к отрицательному электроду — катоду, отрицательно заряженные частицы к положительному электроду — аноду. Различают фронтальный, зональный и капиллярнэлектрофорез. Электрофорез занимает сейчас центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности. На сегодняшний день электрофорез является одним из наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа сложных смесей на составляющие компоненты и получает все более широкое применение в различных областях химии. Создается огромное количество лекарственных препаратов и для каждого из них нужен наиболее точный метод анализа, для того чтобы предупредить поступление на фармацевтический рынок некачественных препаратов.

Список используемых источников

1. Арзамасцев А.П., Сенов П.Л. Стандартные образцы лекарственных веществ. М.: «Медицина», 1978. — 248 с.

2. Арзамасцев А.П., Яскина Д.С. Ультрафиолетовые и инфракрасные спектры лекарственных веществ. М.: «Медицина», 1975. — 151 с.

3. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч. / В.Г. Беликов. — Пятигорск, 2003. — 720 с.

4. «Большая советская энциклопедия», Б.А. Введенский, издательство Б.С.Э., Москва, 1995 г.

5. Государственная фармакопея; Общие методы анализа; Москва «Медицина», 1987 г.

6. Государственная фармакопея Российской Федерации / 12 — издание. — «Издательство «НЦЭСМП», 2008. — 704 с.

7. Г.А. Мелентьева, Л.А. Антонова; Фармацевтическая химия; Москва «Медицина», 1985г.

8. Глазков И.Н. Определение органических примесей в фармацевтических препаратах / И.Н. Глазков, Н.Л. Бочкарёва, И.А. Ревельский // Журн. аналит. химии. — 2005. — №24.

9. Дорохова Е.Н., Прохорова Г.В. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа. — М.: Высшая школа, 1991

10. Использование метода капиллярного электрофореза для изучения фармакокинетики бутоконазола нитрата / С.П. Сенченко [и др.] // Хим.-фармац. журн. — 2009. — №11. — С. 7-10.

11. Каменцев Я.С. Основы метода капиллярного электрофореза. Аппаратурное оформление в области применения / Я.С. Каменцев, Н.В. Комарова // Журн. «Аналитика и контроль». — 2002. Т. 6. — №1. — С. 13-18.

12. Комарова Н.В. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «Капель». — Санкт-Петербург: ООО «Веда», 2006. — 212 с.

13. Ларская К.С. Разработка способов анализа бутоконазола нитрата в лекарственном препарате и биологических жидкостях: Автореф. дис. канд. фарм. наук. — Пятигорск, 2012. — 23 с.

14. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 2. Методы химического анализа: Учеб. для вузов/ Под ред. Ю.А.Золотова. — 2-е изд. — М.: Высш. шк.; 2002. — 494

15. Отто М. Современные методы аналитической химии. / М. Отто. — М.: Техносфера, 2006. — 416 с.

16. Фармацевтическая химия; изд. «Медицина»; Ленинградское отделение, 1986г

17. Фармацевтический анализ лекарственных средств; под. ред. В.А. Шапаловой; Харьков ИМП «Рубикон», 1995

18. Черноглазов В.Н. Развитие капиллярного электрофореза и его аппаратурного оформления / В.Н. Черноглазов, П.Н. Нестеренко // Рос. хим. журн. — 1996. — №1. — С. 100-110.

Метод капиллярного электрофореза: история появления, основной принцип. Двойной электрический слой. Схема процессов, происходящих на поверхности кварца. Формирование двойного электрического слоя и ход потенциала на границе раздела кварц-электролит.

реферат [217,2 K], добавлен 08.01.2012

Методы фармацевтического анализа и их классификация. Отличительные особенности полярографического метода анализа. Схема полярографической установки. Условия проведения полярографического анализа и его применение при контроле лекарственных средств.

реферат [113,0 K], добавлен 25.06.2015

Изотахофорез — вид электрофореза, при котором все заряженные компоненты движутся в электрическом поле с одинаковыми скоростями. Приборы, применяемые при нем. Изучение белков методом разделения различных типов ионов по их подвижности в электрическом поле.

реферат [97,9 K], добавлен 09.06.2013

Методы окислительно-восстановительного титрования. Основные окислители и восстановители. Факторы, влияющие на окислительно-восстановительные реакции. Применение реакции окисления-восстановления в анализе лекарственных веществ. Растворы тиосульфата натрия.

презентация [1,0 M], добавлен 21.10.2013

Структура строения, синтез и свойства барбитуратов. Исследование общих методов определения подлинности лекарственных средств, содержащих барбитураты. Испытание на чистоту лекарственных средств, содержащих барбитуратов. Хранение и применение барбитуратов.

курсовая работа [378,1 K], добавлен 19.03.2016

Исследование возможности применения фотометрических реакций в фармацевтическом анализе для различных групп лекарственных веществ. Реакция с реактивом Марки. Приборы и компоненты для анализа. Реакция диазотирования, азосочетания и комплексообразования.

курсовая работа [516,4 K], добавлен 25.04.2015

Титриметрический метод анализа. Теория броматометрического метода анализа. Техника титрования. Достоинства и недостатки броматометрического метода. Фенолы. Определение фенола. Химические реакции, используемые в методах титриметрии.

курсовая работа [35,9 K], добавлен 26.03.2007

Источники и причины загрязнения лекарственных средств. Способы определения примесей в субстанции. Испытание на соли тяжелых металлов, мышьяк растворов лекарственных веществ. Определение потери в массе лекарственного препарата методом высушивания.

курсовая работа [2,5 M], добавлен 16.09.2017

Представление линейно поляризованного света как результата наложения двух когерентных составных частей с круговой поляризацией. Удельное вращение и закон Био. Мешающие факторы при поляриметрических измерениях. Определение опитической активности.

реферат [195,1 K], добавлен 09.12.2014

Нахождение параметров уравнения Аррениуса методом наименьших квадратов. Получение статистической модели абсорбера с помощью метода Брандона. Математическое описание аппаратов. Синтез оптимальной тепловой системы с помощью эвристического метода.

курсовая работа [292,7 K], добавлен 01.11.2009

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

источник