Определение скорости электрофоретического перемещения и величины электроосмотического потока ионов. Процесс уширения полос при хроматографии. Капиллярный зонный электрофорез белков. Разделение энантиомеров, изоэлектрическая фокусировка в капиллярах.
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
HTML-версии работы пока нет.
Cкачать архив работы можно перейдя по ссылке, которая находятся ниже.
Электрофорез как один из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии. Электрофорез белков в полиакриламидном и агарозном геле. Оборудование для проведения капиллярного электрофореза.
реферат [25,5 K], добавлен 31.08.2014
Разрушение клеток и экстракция, разделение белков путем осаждения. Буферные растворы и специальные добавки, применение детергентов. Принципы хроматографии, классификация методов. Иммунный электрофорез, методы меченых атомов, иммуноферментный анализ.
лекция [1,9 M], добавлен 18.10.2009
Электрофоретическая подвижность белка, влияющие факторов и условия электрофореза. Сущность метода полного разделения сложной смеси белков. Извлечение белков из геля после электрофореза. Гели агарозы и их применения. Влияние вторичной структуры ДНК.
реферат [37,9 K], добавлен 11.12.2009
Полимеризация акриламида и получение полимера полиакриламида. Пористость и механические характеристики ПААГ, выбор процентного соотношения полимеров к объему геля. Электрофорез белков в вертикальных пластинах, загрузка геля и окрашивание белков.
реферат [342,9 K], добавлен 11.12.2009
Физические, биологические и химические свойства белков. Синтез и анализ белков. Определение первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры белков. Денатурация, выделение и очистка белков. Использование белков в промышленности и медицине.
реферат [296,5 K], добавлен 10.06.2015
Структура мембранных белков. Очистка интегральных мембранных белков и получение их в биохимически активной форме. Необходимость поддержания концентрации детергента. Электрофорез в полиакриламидном геле. Связывание детергентов с мембранными белками.
реферат [635,6 K], добавлен 03.08.2009
Понятие градиентной элюции: переход на элюцию непрерывным градиентом концентрации соли. Ионообменная и распределительная хроматография. Гидрофобизированные матрицы сефарозы. Секвенирование белков по методу Эрдмана. Характеристика аффинной хроматографии.
реферат [162,9 K], добавлен 13.12.2009
Исследование ионобменной хроматографии (разделения молекул на основании ионных взаимодействий). Подвижная и неподвижная фазы. Катионная и анионная ионообменная хроматография. Хроматографическое фракционирование белков. Выбор условий хроматографии.
реферат [107,1 K], добавлен 13.12.2009
Проблемы сборки мембранных белков, методы исследования и условия переноса белков через мембраны. Сигнальная и мембранная (триггерная) гипотеза встраивания белков в мембрану. Процесс сборки мультисубъединичных комплексов и обновление мембранных белков.
курсовая работа [289,5 K], добавлен 13.04.2009
Изучение методов разделения пигментов с помощью бумажной хроматографии и определения их концентрации. Характеристика способов получения вытяжки пигментов, спектрофотометрирования, нанесения пигментов на бумагу, эллюции пигментов с бумажного носителя.
отчет по практике [149,7 K], добавлен 16.05.2010
источник
| ISBN | 978-5-91884-112-9 |
| Автор | Хенке Х. Лауэр, Герард П. Розинг (ред.) |
| Перевод | 2-го англ.изд. (2014, High Performance Capillary Electrophoresis) под ред. Лапина Б.П. |
| Количество страниц | 240 стр. |
| Формат | 165х235 мм |
| Год издания | 2019 |
В обновленном издании приведены основы метода, режимы работы установок и оборудование ВЭКЭ (HPCE). Подробно рассмотрены методы ВЭКЭ — капиллярный зональный электрофорез CZE, мицеллярная электрокинетическая хроматография MEKС, капиллярная электрохроматография CEC, система CE-MS и др. Освещены вопросы разделения для более эффективного внедрения методов в практику лабораторий. Особое внимание уделено применению метода в фармацевтическом анализе и других областях.
Издание хорошо иллюстрировано, содержит практические рекомендации по выбору оборудования и приборов, и послужит хорошим обучающим пособием для специалистов лабораторий.
Предисловие к русскому изданию
Предисловие
1. Принципы капиллярного электрофореза
1.1. Исторические предпосылки и этапы совершенствования; современное
состояние метода капиллярного электрофореза, области его
1.2. Основные компоненты системы для капиллярного электрофореза
1.3. Теория
1.3.1. Электрофорез
1.3.2. Электроосмотический по ток (EOF) и управление им
1.3.3. Подвижность и время миграции
1.3.4. Размывание зон и эффективность
1.3.4.1. Диффузия в продольном направлении
1.3.4.2. Джоулев разогрев
1.3.4.3. Длина вводимой зоны
1.3.4.4. Взаимодействие разделяемых веществ со стенкой капилляра
1.3.4.5. Электродисперсия
1.3.4.6. Влияние разных уровней жидкости в сосудах с буферным раствором
1.3.5. Разрешающая способность
1.3.4.7. Детектор
1.4. Характеристики метода капиллярного электрофореза
2. Режимы работ
2.1. Капиллярный зональный электрофорез (CZE)
2.2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография (MEKC)
2.3. Капиллярная электрохроматография (CEC)
2.4. Капиллярный гель-электрофорез (CGE)
2.5. Капиллярная изоэлектрофокусировка (CIEF)
2.6. Капиллярный изотахофорез (CITP)
3. Оборудование
3.1. Высоковольтный источник питания
3.2. Введение образца
3.2.1. Гидродинамическое введение
3.2.2. Электрокинетическое введение
3.2.3. Концентрирование образца непосредственно в капилляре
3.2.3.1. Стимулируемая электрическим полем упаковка в малый объем (FASS)
и стимулируемое электрическим полем введение образца (FASI)
3.2.3.2. Упаковка в малый объем (stacking) за счет изотахофореза
3.2.3.3. Упаковка в малый объем высокой концентрацией соли
3.3. Термостатирование капилляра
3.4. Регистрация
3.4.1. Обнаружение по поглощению света в ультрафиолетовой и видимой областях спектра
3.4.1.1. Уровень шума; чувствительность; ширина линейного динамического
диапазона
3.4.1.2. Проточные кюветы с увеличенной длиной оптического пути
3.4.1.3. Использование спектральных данных
3.4.1.4. Косвенное фотометрическое обнаружение
3.4.2. Стимулированная лазером флуоресценция (LIF)
3.4.3. Обнаружение с помощью бесконтактного кондуктометра (ССD)
3.5. Сбор фракций
3.6. Подключение системы для капиллярного электрофореза к масс-селективному детектору
и к масс-спектрометру с индуктивно связанной плазмой
3.6.1. Основы связи системы для капиллярного электрофореза с масс-спектрометром
3.6.2. Электрическое сопряжение
3.6.3. Гидравлическая связь
3.6.3.1. Устройство сопряжения с обволакивающим потоком
3.6.3.2. Устройства сопряжения без обволакивающего потока жидкости
3.6.4. Прочие методы ионизации
4. Практическая работа и разработка методов
4.1. Разделяющий капилляр
4.1.1. Кварцевые капилляры с непокрытой внутренней стенкой
4.1.2. Капилляры с покрытой внутренней стенкой
4.1.2.1. Создание постоянного покрытия на внутренней стенке капилляра
4.1.2.2. Динамически покрытые капилляры
4.2. Пополнение электролитом и кондиционирование капилляра
4.2.1. Пополнение буферным раствором
4.2.2. Кондиционирование капилляров
4.2.3. Обычно используемые системы буферов
4.3. Поиск причин возникших затруднений
4.4. Разработка метода
4.4.1. С чего начать?
4.4.2. Капиллярный зональный электрофорез (CZE)
4.4.2.1. Имитация электрофоретических разделений с помощью программы
PeakMaster
4.4.3. Мицеллярная электрокинетическая хроматография (MEKC)
4.4.3.1. Разделение оптических изомеров
4.4.4. Капиллярная электрохроматография (CEC)
4.4.5. Пользование масс-спектрометром, подключенным к системе для капиллярного
электрофореза
4.4.5.1. Гидравлическая связь и обеспечение электрических подключений
4.4.5.2. Настройка давления газа, способствующего распылению
4.4.5.3. Подача обволакивающего растворителя; состав этого растворителя
4.4.5.4. Выбор буфера для системы CE-MS
4.4.6. Капиллярный гель-электрофорез (CGE)
4.4.7. Капиллярная изо электрофокусировка (CIEF)
Литература
источник
Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу — новому методу анализа, обладающему высокой разрешающей способностью и сочетающему преимущества электрофоретических методов разделения с возможностью автоматизации анализа и простотой количественного расчета, характерного для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Быстрота анализа и эффективность разделения в сочетании с широкой областью применения делают капиллярный электрофорез одним из наиболее высокоэффективных аналитических методов.
Материал книги включает основы капиллярного электрофореза как количественного метода анализа сложных биологических смесей, описание аппаратурного оформления метода и некоторые конкретные методики анализа.
В приложении к книге дано краткое описание приборов для капиллярного электрофореза, выпускаемых некоторыми зарубежными и отечественными фирмами.
Книга рассчитана на ученых и специалистов, работающих в области определения состава сложных биологических смесей при анализе объектов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных препаратов, в клиническом и токсилогическом анализе.
2. Основы капиллярного электрофореза (КЭ)
3. Эпектрофоретическое перемещение
4. Электроосмотический поток (ЭОП)
5. Уширение полос
5.1. Потеря эффективности вследствие диффузии
5.2. Потеря эффективности в результате температурных эффектов
5.3 Потеря эффективности в результате электрической дисперсии
5.4. Адсорбция на стенках
5.5. Перегрузка системы разделения
5.6. Наложение профилей потока
5.7. Резюме
6. Аппаратура
6.1. Источники напряжения
6.2. Капилляры
Характеристики капилляра
Таблица 7
6.3. Ввод пробы
6.3.1. Ввод пробы давлением
6.3.3. Электрокинетический ввод пробы
Таблица 10
6.3.4. Делитель пробы
6.3.5. Эффекты обогащения при вводе пробы (стэкинг)
6.4. Термостатирование
6.5. Детектирование
6.5.1. Уф-детектирование
Методы концентрирования («стэкинг»-методы) в КЭ
6.5.2. Флуоресцентное детектирование
6.5.3. Прочие методы детектирования
6.6. Количественный анализ
Методы детектирования в КЭ
Таблица 13
Зависимость времени прохождения пиками «окна» детектора от
Таблица 14
Таблица 16
7. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ)
7.1. Влияние рН
7.2. Влияние концентрации буфера
7.3. Выбор буфера
7.4. Области применения
8. Непрямое Уф-детектирование в КЭ
8.1. Непрямое Уф-детектирование анионов
8.2. Непрямое Уф-детектирование катионов
8.3. Сопоставление методов прямого и непрямого Уф-детектирования
9. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) белков
9.1. Оптимизация разделения в немодифицированных капиллярах
9.1.1. Значения рН
9.1.2. Добавление солей к буферу
9.1.3. Добавка органического модификатора к буферу
9.1.4. Применение буферных добавок для разделения белков (динамическое наполнение капилляров)
9.2. Использование капилляров с модифицированной поверхностью
9.2.1. Типы покрытий поверхности в КЭ
9.2.2. Изготовление химически модифицированных капилляров
9.2.2.1. Предварительная обработка кварцевых капилляров
9.2.2.2. Методы покрытия
9.2.3. Характеристики заполненных капилляров в КЭ
9.3. Обзор важнейших химических покрытий
9.3.1. Общепринятые покрытия
9.3.1.1. Алкил-силановые покрытия
9.3.1.2. Акрилпентафторидные покрытия
9.3.1.3. Гидрофильные гидроксил- и полиэфирные покрытия
9.3.1.4. Покрытия на основе белков
9.3.2. Полимерные покрытия
9.3.2.1. Покрытия на основе линейных полиакриламидов
9.3.2.2. Покрытия на основе поли(винилпирролидона)
9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином) (нанесение ионных слоев)
9.3.2.4. Покрытие капилляров поли(метилглутаматом)
9.3.2.5. Капилляры для ГХ и СКФХ с нанесенным полимером, используемые в КЗ
9.4. Выводы
10. Мицеллярная электрокинетическая хроматография
11. Разделение энантиомеров
11.2. Смешанные химические разделяющие системы
11.3. Капилляры с ЭОП и без него
11.4. Выбор подходящего LLQ
11.5. Оптимизация концентрации ЦД
11.6. Оптимизация значений рН
11.7. Оптимизация фоновых электролитов
11.8. Буферные добавки
12. Капиллярный гель-электрофорез
12.1. Гели на основе акриламида
12.1.1. Поперечносшитые полиакриламидные гели
12.1.2. Линейные полиакриламидные цепи
12.1.3. Полиакриламидный гелевый электрофорез белков с ДДСН
12.2. Гели на основе полисахаридов и других полимеров
12.3. Модели миграции биополимеров в полимерных растворах
13. Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) в капиллярах
15. Эпектрохроматография (ЭХ)
Рекомендуемые книги
Обзорные статьи
Список сокращений, часто встречающихся в тексте
источник
Название: Руководство по капиллярному электрофорезу
Автор: Волощук А. М.
Издательство: Научный совет Российской академии наук по хроматографии
Год издания: 1996
Страниц: 112
Формат: PDF
Размер: 1.44 Mб
Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу — новому методу анализа, обладающему высокой разрешающей способностью и сочетающему преимущества электрофоретических методов разделения с возможностью автоматизации анализа и простотой количественного расчета, характерного для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Быстрота анализа и эффективность разделения в сочетании с широкой областью применения делают капиллярный электрофорез одним из наиболее высокоэффективных аналитических методов. Материал книги включает основы капиллярного электрофореза как количественного метода анализа сложных биологических смесей, описание аппаратурного оформления метода и некоторые конкретные методики анализа. В приложении к книге дано краткое описание приборов для капиллярного электрофореза, выпускаемых некоторыми зарубежными и отечественными фирмами. Книга рассчитана на ученых и специалистов, работающих в области определения состава сложных биологических смесей при анализе объектов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных препаратов, в клиническом и токсилогическом анализе.
Скачать с depositfiles.com
Скачать с turbobit.net
| Рейтинг: | 4.8 баллов / 2537 оценок |
| Формат: | Книга |
| Уже скачали: | 12697 раз |
Нам показалось, что Книги ниже Вас заинтересуют не меньше. Эти издания Вы так же можете скачивать и читать совершенно бесплатно на сайте!
Название: Медицинская радиология Автор: Милько В.И., Лазарь А.Ф., Назимок Н.Ф. Страниц: 280 Формат: PDF Размер: 97,7 Мб Качество: Отличное Язык: Русский Год издания: 1980 Изложены вопросы радиобиологи . . .
Название: Большаков А. — Не болеть – это просто! Автор: Алексей Большаков Страниц: 270 Формат: RTF, FB2 Размер: 13,3 Mb Качество: Отличное Язык: Русский Год издания: 2016 Книга будет интересна всем, к . . .
Название: Лекарственные травы и рецепты древних времен Автор: Рабинович А.М. Страниц: 177 Формат: PDF Размер: 15 мб Качество: Отличное Язык: Русский Год издания: 1991 В книге рассказывается о целебных . . .
Название: Повреждения брюшной стенки Автор: Цибик А.И., Кириллов С.В. Страниц: 104 Формат: DJVU Размер: 6,9 Мб Качество: Отличное Язык: Русский Год издания: 2005 В монографии рассматриваются закрытые . . .
Название: Cutting-Edge Cycling Автор: Hunter Allen; Stephen Cheung Страниц: 280 Формат: PDF, EPUB Размер: 11 mb Качество: Отличное Язык: Английский Год издания: 2012 This is a book that tells you, as . . .
Название: Удар битой. Защита от нападения Автор: Михаил Алмаз Формат: SATRip Размер: 533 мб Качество: Отличное Язык: Русский Жанр: Обучающее видео Год издания: 2016 Добрый вечер уважаемые посетители н . . .
Название: Биохимия человека Автор: Л. Капилевич, Е. Дьякова, Е. Кошельская, В. Андреев Формат: PDF Размер: 50,3 Мб Качество: Отличное Язык: Русский Год издания: 2016 Раздел биохимии, занимающийся изуч . . .
Название: Библиотека Men`s Health — 7 книг Автор: коллектив Страниц: 2422 Формат: PDF, DJVU Размер: 274 мб Качество: Отличное Язык: Русский Год издания: 2008-2012 Книжная серия покажет вам, каким . . .
Название: Себя преодолеть! Автор: Алексеев А.В. Страниц: 145 Формат: PDF Размер: 13.2 Мб Качество: Нормальное Язык: Русский Год издания: 1978 В книге рассматривается ряд проблем психической подготовки . . .
Название: Удары без напряжения мышц Автор: Влад Гаевский Формат: SATRip Размер: 585 мб Качество: Отличное Язык: Русский Жанр: Обучающее видео Год издания: 2016 Добрый день уважаемые посетители нашего . . .
Если вы хотите скачивать книги, журналы и аудиокниги бесплатно, без рекламы и без смс, оставлять комментарии и отзывы, учавствовать в различных интересных мероприятиях, получать скидки в книжных магазинах и многое другое, то Вам необходимо зарегистрироваться в нашей Электронной Библиотеке.
К сожалению, в нашей Бесплатной Библиотеке пока нет отзывов о Книге Руководство по капиллярному электрофорезу. Помогите нам и другим читателям окунуться в сюжет Книги и узнать Ваше мнение. Оставьте свой отзыв или обзор сейчас, это займет у Вас всего-лишь несколько минут.
источник
Содержимое (Table of Contents)
Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Капиллярный ОФС.1.2.1.0022.15
электрофорез Вводится впервые
Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.
Скорость миграции частиц определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью буферного раствора.
Электрофоретическая подвижность вещества (μэф) зависит от его характеристик (электрического заряда, размеров и формы) и от характеристик буферной среды, в которой происходит разделение (типа и ионной силы электролита, рН, вязкости и добавок):
где q – эффективный заряд частицы;
η – вязкость раствора электролита;
r – стоксовский радиус частицы.
Электрофоретическую скорость (νэф) для вещества сферической формы определяют по формуле:
где E – сила электрического поля;
V – приложенное напряжение;
Когда к капилляру, заполненному буферным раствором, приложено электрическое поле, внутри капилляра образуется поток растворителя, называемый электроосмотическим потоком. Скорость и направление электроосмотического потока зависят от электроосмотической подвижности (μэо), определяемой знаком и плотностью заряда на внутренней стенке капилляра, а также характеристиками буфера:
где ε – диэлектрическая константа буфера;
ζ – дзета-потенциал поверхности капилляра.
Электроосмотическую скорость (νэо) рассчитывают по формуле:
Электрофоретическая и электроосмотическая подвижность ионов могут быть направлены в одну и ту же или в противоположные стороны в зависимости от заряда частиц; таким образом, скорость движения растворенного вещества будет определяться уравнением:
Если электроосмотическая скорость выше электрофоретической, можно одновременно разделить как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. Время, затраченное ионом для миграции от конца, в котором вводится образец, до места детекции (l – эффективная длина капилляра), определяют по формуле:
Как правило, капилляры из плавленого кварца без покрытия при pH выше 3 несут на внутренней поверхности отрицательный заряд из-за диссоциации силанольных групп. При этом электроосмотический поток направлен от анода к катоду.
В некоторых случаях необходимо уменьшить или изменить направление электроосмотического потока. Для этого различным образом модифицируют внутреннюю стенку капилляра или изменяют рН буферного раствора.
После введения образца в капилляр каждый анализируемый ион движется внутри фонового электролита в виде отдельной зоны в соответствии со своей электрофоретической подвижностью. Степень размывания каждой зоны растворенного соединения определяется совокупностью различных причин. В идеальном случае единственной причиной размывания зон является продольная молекулярная диффузия растворенного вещества вдоль капилляра. В этом, идеальном, случае эффективность разделения полосы, характеризуемая числом теоретических тарелок (N), выражается формулой:
где D – молекулярный коэффициент диффузии растворенного вещества в буферном растворе.
На практике на размывание полос значительное влияние оказывают тепловое рассеяние, адсорбция образца на стенке капилляра, различная проводимость между образцом и буфером, длительность ввода пробы, размеры детектирующей ячейки и различия уровней жидкости в емкостях с буферными растворами.
Разделение между двумя полосами, называемое разрешением (Rs), определяют по формуле (8):
где μэфб и μэфа – электрофоретические подвижности каждого из двух разделенных ионов;
– их средняя электрофоретическая подвижность.
Среднюю электрофоретическую подвижность определяют по формуле:
Система для капиллярного электрофореза состоит из высоковольтного источника напряжения; двух флаконов с буферными растворами и погруженными в них электродами; капилляра, заполненного соответствующим раствором и погруженного обоими концами во флаконы с буферными растворами; системы ввода образца; детектора, способного в режиме реального времени регистрировать вещества, проходящие мимо оптического окна капилляра; системы термостатирования; регистрирующего прибора или подключенного компьютера.
Для введения пробы могут использоваться три способа: гидростатический – за счет разного уровня буферных растворов, гидродинамический – с помощью прилагаемого давления или вакуума и электрокинетический – благодаря прилагаемому напряжению. В последнем случае степень ввода в капилляр каждого компонента пробы зависит от соответствующей электрофоретической подвижности. Электрокинетическая система ввода для многокомпонентной смеси с разной электрофоретической подвижностью ведет к изменению соотношения концентраций ее составляющих и в данном случае может адекватно применяться лишь для качественного анализа. При условии определения в многокомпонентной смеси одного или двух соединений этот метод может использоваться и для количественного анализа. Кроме того, такой способ введения может позволить увеличить чувствительность анализа.
Детектирование осуществляется с помощью абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях, флуориметрии, кондуктометрии, амперометрии или масс-спектрометрии.
Для обнаружения не поглощающих в ультрафиолетовой области и не флуоресцирующих соединений используется непрямое детектирование. В этом случае в ведущий электролит вводится вещество, поглощающее ультрафиолетовое излучение и образующее выраженное фоновое поглощение. При этом зона определяемого вещества визуализируется в виде обратного пика. С использованием специального программного обеспечения электрофореграмме придают стандартный вид.
Применяемый раствор электролита фильтруют для того, чтобы удалить крупные частицы (размером более 0,45 мкм), и дегазируют для предотвращения образования пузырьков воздуха, которые могут быть помехой для детектирующей системы или могут нарушить электропроводность в капилляре во время проведения анализа. Для хорошей воспроизводимости времени миграции анализируемых компонентов проб для каждого определения должна быть разработана определенная процедура промывки капилляра.
Основными формами проведения капиллярного электрофореза являются: капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярный гель-электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование и капиллярный изотахофорез.
Аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор. Разделение происходит за счет того, что различные компоненты образца движутся с разными скоростями, образуя так называемые зоны. Скорость движения каждой зоны зависит от электрофоретической подвижности растворенного вещества и от электроосмотического потока в капилляре. Для уменьшения адсорбции веществ на поверхности плавленого кварца могут использоваться капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.
Использование капиллярного зонного электрофореза позволяет выполнить разделение как малых (молекулярная масса Мицеллярная электрокинетическая хроматография
В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение осуществляется в растворе электролита, содержащего поверхностно-активное вещество в концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы растворенного вещества распределяются между буферным раствором и псевдостационарной фазой, состоящей из мицелл. Этот метод может использоваться для разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве анионного поверхностно-активного вещества наиболее часто используется додецилсульфат натрия, в качестве катионного – соли цетилтриметиламмония.
При нейтральных и щелочных значениях рН возникает сильный электроосмотический поток, который движет ионы разделяющего буфера в сторону катода. При использовании в качестве поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия электрофоретическое движение анионных мицелл направлено в противоположную сторону – к аноду. В результате суммарная скорость движения мицелл снижена по сравнению с основным потоком раствора электролита. В случае нейтральных веществ скорость движения компонента, не имеющего электрофоретической подвижности, зависит только от его коэффициента распределения между мицеллой и водной средой. На электрофореграмме сначала появляется пик маркера электроосмотического потока, затем пики аналитов, и в конце – пик маркера мицелл. Время между первым и последним пиком называется окном разделения. На движение заряженных веществ влияют как их коэффициенты распределения между мицеллой и водным буферным раствором, так и их собственная электрофоретическая подвижность.
Движение аналитов и разрешение может быть описано термином «фактор удерживания (k)», представляющим собой отношение молярных долей аналита в мицелле и в подвижной фазе. Для нейтрального вещества k вычисляют по формуле:
где tR – время миграции аналита;
t – время миграции неудерживаемого вещества;
tmc – время миграции мицеллы;
K – коэффициент распределения аналита;
VS – объем мицеллярной фазы;
Разрешение для двух близко движущихся аналитов (RS) рассчитывают по формуле:
где N – число теоретических тарелок для одного из аналитов;
α – селективность разделения;
Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако следует учитывать, что увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и вязкости буферного раствора. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения.
Как и в капиллярном зонном электрофорезе, при мицеллярной электрокинетической хроматографии длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа и эффективность разделения. Увеличение длины капилляра уменьшает электрическое поле, увеличивает время миграции и повышает эффективность разделения. Уменьшение внутреннего диаметра повышает рассеяние тепла и увеличивает разрешение.
Величина рН среды влияет на электроосмотический поток в немодифицированных капиллярах. Уменьшение рН снижает электроосмотический поток и вследствие этого увеличивает разрешение нейтральных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии за счет увеличения времени анализа.
Для улучшения разделения гидрофобных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии используют органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). При этом необходимо учитывать, что добавление органического модификатора влияет на критическую концентрацию мицеллообразования.
Для разделения с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии энантиомеров в мицеллярную систему включают хиральные селекторы: ковалентно связанные с поверхностно-активным веществом (соли N-додеканоил-L-аминокислот, соли желчных кислот и др.) или вводимые в состав электролита (циклодекстрины).
Для улучшения селективности разделения в мицеллярной электрокинетической хроматографии применяют также вещества, способные изменить взаимодействие аналита с мицеллой путем адсорбции на последней. Этими добавками могут быть второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное), ведущее к образованию смешанных мицелл, катионы металлов, которые распределяются в мицелле и образуют координационные комплексы с аналитом, а также ион-парные соединения, которые взаимодействуют с заряженными компонентами пробы и задерживают их, например, тетрабутиламмония бромид.
В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, действующим в качестве молекулярного сита. При равном отношении заряда к массе более мелкие компоненты движутся в капилляре быстрее, чем более крупные. Капиллярный гель-электрофорез может быть использован для разделения биологических макромолекул по их молекулярной массе. Электроосмотический поток при этом полностью устраняется путем модификации внутренней стенки капилляра.
В капиллярном гель-электрофорезе используются два типа гелей: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически модифицированные гели, как, например, поперечно-сшитый полиакриламид, поливинилпирролидон, готовятся внутри капилляра посредством полимеризации мономеров. Они обычно связаны с кварцевой стенкой капилляра и не могут быть удалены без его разрушения. При использовании таких гелей для анализа белков в редуцирующих условиях буферный раствор содержит обычно додецилсульфат натрия и образцы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси додецилсульфата натрия с 2-меркаптоэтанолом или дитиотрейтолом. При анализе в нередуцирующих условиях 2-меркаптоэтанол и дитиотрейтол не используют. Разделение в поперечно сшитых гелях оптимизируют модификацией буферного раствора (как указано в разделе «Капиллярный зонный электрофорез») и контролем пористости геля во время его приготовления. Пористость этих гелей регулируют изменением концентрации акриламида, а также его соотношения со сшивающим реагентом. Уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности аналитов. Из-за неподвижности таких гелей допустимо только электрокинетическое введение пробы.
Динамически модифицированные гели являются гидрофильными полимерами, как, например, линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и т. п., которые могут быть растворены в водных разделительных буферных растворах с образованием разделяющей среды, действующей как молекулярное сито. После приготовления они могут быть введены в капилляр под давлением. Замена геля перед каждой инжекцией улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей увеличивается при использовании полимеров с большей молекулярной массой или уменьшении концентрации полимера. Для выбранного буферного раствора уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности компонентов раствора. Так как растворение этих полимеров в буферном растворе дает растворы с низкой вязкостью, может быть использован гидродинамический или электрокинетический ввод пробы.
В изоэлектрическом фокусировании заряженные молекулы движутся под воздействием электрического поля в рН-градиенте, созданном амфолитами с широким диапазоном значений рI, растворенными в буфере разделения.
Тремя основными этапами изоэлектрического фокусирования являются введение пробы, фокусирование и мобилизация.
Этап введения пробы осуществляют в один прием, когда образец смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или под вакуумом, или в несколько приемов, когда в капилляр последовательно вводится ведущий буферный раствор, амфолиты, образец, смешанный с амфолитами, снова амфолиты и, наконец, заключающий буферный раствор. Объем образца должен быть достаточно малым, чтобы не изменять рН-градиент.
На этапе фокусирования амфолиты движутся после приложения напряжения к катоду или аноду согласно их суммарному заряду, создавая, таким образом, рН-градиент от более низкого рН (у анода) к более высокому рН (у катода). Движение каждого аналита продолжается до тех пор, пока он не достигнет рН, соответствующего его изоэлектрической точке (pI).
На этапе мобилизации полосы разделенных компонентов приводятся в движение в сторону детектора благодаря электроосмотическому потоку путем приложения давления после стадии фокусирования или с помощью добавления солей к флакону у катода или анода.
Достигнутое разделение, выражаемое как 
, зависит от градиента 
, количества амфолитов, имеющих различные значения pI, молекулярного коэффициента диффузии (D), интенсивности электрического поля (E) и вариации электрофоретической подвижности аналита в зависимости от 
:
Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке разделения, являются:
– Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании используется очень высокое электрическое поле – от 300 до 1000 В/см на этапе фокусирования.
– Капилляр. Электроосмотический поток должен быть уменьшен или полностью подавлен. Для уменьшения электроосмотического потока используют капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.
– Растворы. Анодный флакон заполняется буферным раствором с рН ниже, чем pI наиболее кислого амфолита, а катодный флакон заполняется раствором с рН выше, чем pI наиболее щелочного амфолита. Обычно для анода используется фосфорная кислота, а для катода – натрия гидроксид.
Добавление в раствор амфолита полимера, такого как метилцеллюлоза, ведет к подавлению конвекции и электроосмотического потока при увеличении вязкости. Широкие диапазоны рН используются для оценки изоэлектрической точки, в то время как более узкие диапазоны применяются для улучшения точности.
Осаждение белков в их изоэлектрической точке во время этапа фокусирования предотвращают в случае необходимости с помощью таких буферных добавок, как глицерин, поверхностно-активные вещества, мочевина или цвиттерионные буферные соли.
Изотахофорез – это метод разделения, который проводится в режиме поддержания постоянства тока (все разделенные зоны движутся с одной скоростью). При этом должно обеспечиваться постоянное отношение между концентрацией и подвижностью ионов в каждой зоне.
В капиллярном изотахофорезе применяются два буферных раствора, между которыми находятся зоны аналита. Например, для анализа анионов буфер должен быть выбран таким образом, чтобы ведущий электролит содержал анион с фактической подвижностью, превышающей характерную для разделяемых веществ. Аналогично ион завершающего электролита должен иметь меньшую подвижность, чем подвижность разделяемых веществ. В результате разделения ведущий анион движется первым, за ним движется анион с очередной высокой подвижностью и т. д. В капиллярном изотахофорезе индивидуальные анионы мигрируют в дискретных зонах, но все движутся с той же скоростью, что и ведущий анион. Концентрации анализируемых веществ одинаковы в каждой зоне; таким образом, длина каждой зоны пропорциональна количеству отдельного компонента. Зоны менее сконцентрированные, чем ведущий электролит, сужаются, зоны более сконцентрированные – расширяются. Принцип изотахофореза используется для предварительного концентрирования образца перед разделением его компонентов с помощью других методик капиллярного электрофореза.
Качественный анализ. К качественным результатам относится определение идентичности компонента пробы внутреннему или внешнему стандартному веществу по времени появления соответствующего пика.
Полуколичественный анализ. Полуколичественным результатом считается определение концентрации компонента пробы по площади или высоте пика при соотношении сигнал/фон от 2:1 до 3:1.
Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по формуле:
где: H – высота пика целевого компонента на электрофореграмме раствора сравнения, измеренная от максимума пика до базовой линии сигнала;
h – уровень шума на электрофореграмме, полученной после ввода холостой пробы.
Количественный анализ. Количественным результатом является определение концентрации искомого компонента пробы по площади пика при соотношении сигнал/шум больше, чем 3:1.
При количественном анализе образца для компенсации различий во временах миграции от анализа к анализу и для устранения различий в сигналах компонентов образца, обладающих различными временами миграции, площади пиков должны быть нормированы на соответствующие времена миграции. При использовании внутреннего стандарта необходимо убедиться, что ни один пик исследуемого вещества не маскируется пиком внутреннего стандарта.
Абсолютное содержание компонентов рассчитывают по отношению площадей анализируемого пика и пика стандарта. Процентное содержание одного или более компонентов анализируемого образца рассчитывают путем определения процентной доли скорректированных площадей пиков от общей площади всех пиков, за исключением пиков, вызванных растворителями или другими добавленными реактивами (процедура нормализации).
В качестве параметров пригодности системы используются: кажущееся число теоретических тарелок (N), разрешение (Rs), фактор емкости (k’) (только для мицеллярной электрокинетической хроматографии) и фактор симметричности (As).
Кажущееся число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано эмпирически по формуле:
где tr – время миграции или расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика соответствующего компонента;
w0,5 – ширина пика на половине высоты.
Разрешение (Rs) между пиками схожей величины двух компонентов вычисляют по формуле:
где tr,b и tr,a – времена миграции или расстояния вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков;
Фактор симметричности пика рассчитывают по формуле:
где w0,05 – ширина пика на 1/20 от его высоты;
d – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передним краем пика на 1/20 от высоты пика.
В качестве параметров пригодности используются также испытания на воспроизводимость площади (стандартное отклонение площади или отношения площади к времени миграции) и воспроизводимость времени миграции (стандартное отклонение времени миграции).
В фармакопейной статье указывают использование определенного капилляра, буферного раствора, метода предварительной подготовки капилляра, пробоподготовки и условий миграции.
источник
Год выпуска: 2010
- Основные термины и понятия
- Физические основы электрофореза
- Важнейшие термины и определения из фармакологии
- История развития метода лекарственного электрофореза
- Физико-химические основы электрофореза лекарственных веществ
- Прохождение электрического тока через живые ткани
- Физико-химические явления, сопровождающие прохождение электрического тока через ткани
- Пути проникновения лекарств в организм при их электрофорезе
- Глубина введения лекарственных веществ при электрофорезе
- Количественная характеристика электрофореза лекарственных веществ
- Законы Фарадея и лекарственный электрофорез
- Влияние физико-химических характеристик веществ и растворов на лекарственный электрофорез
- Кожа и лекарственный электрофорез
- Дозиметрические параметры и вид тока при электрофорезе лекарств
- Общее уравнение лекарственного электрофореза и его практическое применение
- Влияние лечебных физических факторов на введение лекарств электрофорезом (количественные аспекты)
- Особенности и механизмы действия лекарственного электрофореза и вводимых лекарств
- Пути и механизмы действия лекарственных веществ и электрического тока
- Основные особенности метода лекарственного электрофореза
- Сочетанное действие лекарственных веществ и постоянных токов
- Методология разработки частных методик лекарственного электрофореза
- Исследование устойчивости лекарств к действию электрического тока
- Определение полярности и некоторых электрофоретиче-ских свойств лекарств
- Изучение проникновения лекарственных веществ через кожу при электрофорезе
- Оценка особенностей и достоинств электрофореза лекарственных веществ
- Особенности разработки методик электрофореза белков и ферментов
- Сравнение лекарственного электрофореза с другими физикофармакотерапевтическими методами
- Технология электрофореза лекарственных веществ
- Используемые токи и аппаратура
- Способы электрофореза и их краткая характеристика
- Электроды и прокладки для лекарственного электрофореза
- Полярность введения лекарственных веществ
- Растворы лекарственных веществ и их приготовление
- Дозирование лекарственного электрофореза
- Особенности лекарственного электрофореза у детей
- Вопросы безопасности при электрофорезе лекарственных веществ
- Основные методики лекарственного электрофореза и показания к их применению
- Методики лекарственного электрофореза
- Показания и противопоказания к использованию лекарственного электрофореза
- Особые методы и методики электрофореза лекарственных веществ
- Внутритканевой электрофорез и его клиническое применение
- Электродрегинг — особый вариант лекарственного электрофореза
- Пролонгированный лекарственный электрофорез
- Лекарственный электрофорез по А. И. Смайлису и С. Ю. Рагелису
- Аэроэлектрофорез лекарственных веществ
- Микроэлектрофорез лекарственных веществ
- Лабильный электрофорез лекарственных веществ
- Трансдермальные электротерапевтические системы
- Сочетанные методы лекарственного электрофореза
- Индуктотермоэлектрофорез лекарственных веществ
- Вакуум-электрофорез лекарств
- Электрофонофорез лекарственных веществ
- Криоэлектрофорез лекарственных веществ
- Общие гидроэлектрические ванны
- Грязьэлектрофорез
- Электрофотофорез лекарств
- Магнитоэлектрофорез лекарств
- Характеристика лекарственных средств, используемых для электрофореза
Уроки истории и перспективы метода
Литература
источник
Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.
Научный совет Российской академии наук по хроматографии Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу —
новому методу анализа, обладающему высокой разрешающей способностью и сочетающему преимущества электрофоретических методов разделения с возможностью автоматизации анализа и простотой количественного расчета, характерного для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Быстрота анализа и эффективность разделения в сочетании с широкой областью применения делают капиллярный электрофорез одним из наиболее высокоэффективных аналитических методов.
Материал книги включает основы капиллярного электрофореза как количественного метода анализа сложных биологических смесей, описание аппаратурного оформления метода и некоторые конкретные методики анализа.
В приложении к книге дано краткое описание приборов для капиллярного электрофореза, выпускаемых некоторыми зарубежными и отечественными фирмами.
Книга рассчитана на ученых и специалистов, работающих в области определения состава сложных биологических смесей при анализе объектов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных препаратов, в клиническом и токсилогическом анализе.
Перевод: д.х.н. Р.Ш. Вартапетян Под редакцией д.х.н. А.М.Волощука Ил.107.Табл. 30.
Рецензент: к.х.н. И.В. Назимов ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ. Предисловие. 1. Введение. 2. Основы капиллярного электрофореза (КЭ). 3. Эпектрофоретическое перемещение. 4. Электроосмотический поток (ЭОП). 5. Уширение полос. 5.1. Потеря эффективности вследствие диффузии. 5.2. Потеря эффективности в результате температурных эффектов. 5.3 Потеря эффективности в результате электрической дисперсии. 5.4. Адсорбция на стенках. 5.5. Перегрузка системы разделения. 5.6. Наложение профилей потока. 5.7. Резюме. 6. Аппаратура. 6.1. Источники напряжения. 6.2. Капилляры. Характеристики капилляра. Таблица 7. 6.3. Ввод пробы. 6.3.1. Ввод пробы давлением. 6.3.3. Электрокинетический ввод пробы. Таблица. 10. 6.3.4. Делитель пробы. 6.3.5. Эффекты обогащения при вводе пробы (стэкинг). 6.4. Термостатирование. 6.5. Детектирование. 6.5.1. Уф-детектирование. Методы концентрирования («стэкинг»-мвтоды) в КЭ. 6.5.2. Фпуоресцентное детектирование. 6.5.3. Прочие методы детектирования. 6.6. Количественный анализ. Методы детектирования в КЭ. Таблица 13. Зависимость времени прохождения пиками «окна» детектора от. Таблица 14. Таблица 16. 7. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ). 7.1. Влияние рН. 7.2. Влияние концентрации буфера. 7.3. Выбор буфера. 7.4. Области применения. 8. Непрямое Уф-детектирование в КЭ. 8.1. Непрямое Уф-детектирование анионов. 8.2. Непрямое Уф-детектирование катионов. 8.3. Сопоставление методов прямого и непрямого Уф-детектирования. 9. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) белков. 9.1. Оптимизация разделения в немодифицированных капиллярах. 9.1.1. Значения рН. 9.1.2. Добавление солей к буферу. 9.1.3. Добавка органического модификатора к буферу. 9.1.4. Применение буферных добавок для разделения белков. (динамическое наполнение капилляров). 9.2. Использование капилляров с модифицированной поверхностью. 9.2.1. Типы покрытий поверхности в КЭ. 9.2.2. Изготовление химически модифицированных капилляров. 9.2.2.1. Предварительная обработка кварцевых капилляров. 9.2.2.2. Методы покрытия. 9.2.3. Характеристики заполненных капилляров в КЭ. 9.3. Обзор важнейших химических покрытий. 9.3.1. Общепринятые покрытия. 9.3.1.1. Алкил-силановые покрытия. 9.3.1.2. Арилпентафторидные покрытия. 9.3.1.3. Гидрофильные гидрокоил- и полиэфирные покрытия. 9.3.1.4. Покрытия на основе белков. 9.3.2. Полимерные покрытия. 9.3.2.1. Покрытия на основе линейных полиакриламидов. 9.3.2.2. Покрытия на основе поли(винилпирролидона). 9.3.2.3. Покрытие капилляров поли(этиленимином). (нанесение ионных слоев). 9.3.2.4. Покрытие капилляров поли(метилглутаматом). 9.3.2.5. Капилляры для ГХ и СКФХ с нанесенным полимером, используемые в КЗ. 9.4. Выводы. 10. Мицеллярная электрокинетическая хроматография. 11. Разделение энантиомеров. 11.2. Смешанные химические разделяющие системы. 11.3. Капилляры с ЭОП и без него. 11.4. Выбор подходящего LLQ. 11.5. Оптимизация концентрации ЦД. 11.6. Оптимизация значений рН. 11.7. Оптимизация фоновых электролитов. 11.8. Буферные добавки. 12. Капиллярный гепь-эпектрофорез. 12.1. Гели на основе акриламида. 12.1.1. Поперечносшитые полиакрипамидные гепи. 12.1.2. Линейные полиакриамидные цепи. 12.1.3. Полиакриламидный гелевый электрофорез белков с ДДСН. 12.2. Гепи на основе пописахаридов и других полимеров. 12.3. Модели миграции биополимеров в полимерных растворах. 13. Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) в капиллярах. 14. Изотахофорез (ИТФ). 15. Эпектрохроматография (ЭХ). 16. Перспективы. Рекомендуемые книги. Обзорные статьи. Список сокращений, часто встречающихся в тексте. Предисловие В основу книги положены лекции профессора Саарбрюкенского университета (Германия) Х.Энгельгардта, предназначенные для специалистов, желающих овладеть капиллярным электрофорезом — новым современным методом анализа сложных смесей.
Книга выпущена в качестве учебного пособия для школы по капиллярному электрофорезу, проводимой для российских ученых и специалистов сотрудниками Саарбрюкенского университета под руководством проф. X. Энгельгардта в Москве в апреле 1996 года. Программа школы включает практические занятия на приборах некоторых зарубежных фирм. В приложении к «Руководству по капиллярному электрофорезу» приведена информация о фирмах, специализирующихся в выпуске аппаратуры для капиллярного электрофореза: Beckman, BioRad, Cheminst (Dionex, Gilson), Hewlett Packard, Perkin-Elmer, Termo Separation Products, Waters, Экотехника.
Издание данной книги стало возможным благодаря финансовой поддержке фонда «Фольксваген» ( Германия).
Научный совет РАН по хроматографии выражает искреннюю благодарность проф.
Х.Энгельгардту и его сотрудникам за предоставленные материалы, фонду «Фольксваген» за финансовую поддержку, а также д.х.н. Р.Ш. Вартапетяну, д.х.н. A.M. Волощука, к.х.н.
Л.Н. Коломиец, к.х.н. И.В. Назимову и Р.И.Хамидуллину за подготовку книги «Ру ководство по капиллярному электрофорезу» к изданию.
1. Введение Такие аналитические методы, как хроматография и электрофорез, находят широкое применение в определении состава сложных биологических смесей при анализе объектов окружающей среды и промышленной продукции.
Методы газовой хроматографии (ГХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) позволяют за короткое время проводить разделение, идентификацию и количественное определение состава сложных смесей. Благодаря сочетанию высокоэффективных разделительных систем с чувствительными, селективными и специфическими детекторами, такими, например, как диодно матричный детектор (ДМД) в видимой и УФ-областях спектра, масс-спектрометрия и ИК фурье-спектроскопия (ИКФС) удается надежно идентифицировать отдельные вещества.
Приборное оформление этих методов настолько хорошо развито, что почти всегда удается автоматизировать проведение хроматографических анализов.
Области применения методов ГХ и ВЭЖХ ограничиваются требованиями, предъявляемыми к пробам в каждом из этих аналитических методов. Поэтому ВЭЖХ в настоящее время является наиболее широко распространенным методом разделения с хорошими перспективами на дальнейшее расширение области его применения. (Темпы прироста рынка приборов для ВЭЖХ стабильно превышают 10% в год). Проблемы при применении ВЭЖХ возникают тогда, когда необходимо быстро и с большой эффективностью проанализировать полярные и ионогенные пробы, особенно пробы, обладающие высокой основностью, а также биополимеры. Это — одна из наиболее сложных проблем хроматографии, связанная с использованием стационарных фаз на основе силикагеля. Хотя в последние годы появились фазы, при использовании которых удается решить эти проблемы, для дальнейшего развития аналитических методов разделения ионогеннных веществ необходимо высокое мастерство и глубокое понимание протекающих при этом многообразных сорбционных ионообменных процессов. Фазы на основе чистых органических веществ из-за своей способности к набуханию обладают меньшей эффективностью и ограниченной устойчивостью к давлению по сравнению со стационарными фазами на основе силикагеля. Поэтому неудивительно, что эти фазы до настоящего времени не получили широкого распространения. Хотя в распоряжении исследователей имеются ионообменные фазы как на основе силикагеля, так и на основе полимеров, ионнообменная хроматография также не получила широкого распространения, так как для разделения компонентов неоходима градиентная техника (градиенты рН или ионной силы). Для ионогенных соединений предлагается элекрофоретическая техника разделения.
Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие «электрофорез» или «электрический перенос». Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами: (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут уско ряться в различной степени;
(б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения.
Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их мо лекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью).
Классический электрофорез (гель-электрофорез или электрофорез на бумаге) имеет две характерные особенности. Во первых, количественный анализ возможен только с помощью измерений в отраженном свете, а в случае белков только по степени их окрашивания, и поэтому часто бывает ошибочным. Во-вторых, падение напряжения при прохождении через гель не может быть выбрано слишком высоким. Степень нагрева возрастает пропорционально напряжению, так что необходимо эффективное охлаждение, чтобы избежать высыхания геля. Время анализа на отрезке геля длиной в 10 см может достигать нескольких часов. В любом случае при гель-электрофорезе воз можно проводить одновременно большое число разделений на одном геле, при этом производительность сильно увеличивается. В плоскостном варианте метода, кроме того, можно без затруднений проводить двумерные 2D-процессы с использованием различных механизмов разделения. Отметим также высокую разрешающую способность 2D-гель-электрофореза при анализе белков.
2. Основы капиллярного электрофореза (КЭ) Развитие КЭ началось с пионерских работ Миккерса и Эвериртса (конец 70-х годов) и Йортенсона и Лукаса (начало 80-х годов). Быстрое развитие метода было обусловлено двумя решающими усовершенствованиями: во-первых, был существенно уменьшен внутренний диаметр разделительного капилляра;
во-вторых, детектирование по электропроводности, пришедшее первоначально из изотахофореза, было заменено на прямое УФ-двтектирование в потоке жидкости. Предпосылкой для дальнейшего развития метода была возможность использования кварцевого капилляра с высокой прозрачностью в ближней УФ-области и с равномерным внутренним диаметром от до 100 мкм. При этом улучшились как разделение, так и возможности детектирования.
С помощью кварцевого капилляра с внутренним диаметром 50-100 мкм удалось достигнуть высокоэффективного разделения белков и дансил-аминокислот, при котором из-за сравнительно большого отношения поверхности к объему было сильно уменьшено влияние мешающей разделению термически индуцированной конвекции.
Применение кварцевого капилляра позволило использовать модифицированный ВЭЖХ-детектор для определения разделяемых веществ непосредственно в капилляре.
Простота аппаратуры и возросшая потребность в разделении биомолекул привели во второй половине 80-х годов к повышенному интересу к данному методу.
Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте рН, формируемом добавлением амфолита к 6уферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ.
Схематическое изображение аппаратуры КЭ представлено на рис. 1. Тонкий кварцевый капилляр (25-100 мкм) длиной от 20 до 100 см соединяет два буферных сосуда, между которыми приложено напряжение около 30 кВ. Сравнительно небольшое количество пробы (несколько нл) вводится на анодном конце капилляра. Это достигается подъемом или опусканием соответствующих буферных сосудов, созданием давления в сосуде для пробы, созданием вакуума в катодном буферном резервуаре или просто за счет электрофоретической миграции пробы в капилляр. Достоинства и недостатки разных способов ввода пробы подробно обсуждаются в разделе «Аппаратура».
Рис. 1. Схема аппаратуры КЭ.
Разделение пробы достигается приложением напряжения к буферным сосудам.
Возникающее в капилляре электрическое поле вызывает миграцию зоны пробы. На электрофоретическое перемещение всегда накладывается более или менее интенсивный электроосмотический поток (ЭОП), который способствует пассивному транспорту зоны пробы, а не ее разделению.
Этот ЭОП сильно зависит от значений рН буфера и от свойств поверхности капилляра.
Он может быть настолько большим, что будут двигаться не только нейтральные молекулы, но даже отрицательно заряженные ионы могут перемещаться к детектору, несмотря на их электрофоретическую миграцию.
После того, как в большинстве буферов на поверхности кварцевых капилляров из-за диссоциации силанольных групп образуются отрицательные заряды, вблизи стенки индуцируются положительные заряды и электроосмотический поток направлен к катоду.
Это обусловливает необходимость расположения детектора вблизи катодного пространства. ЭОП помогает переносить зоны проб к детектору настолько, что при достаточно больших значениях ЭОП к катоду могут переноситься даже анионы. Пример разделения катионных, анионных и нейтральных веществ посредством капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) приведен на рис. 2. При этих условиях все незаряженные молекулы перемещаются с одинаковой скоростью, равной скорости электроосмотического потока, и не могут быть разделены, в то время как разделение заряженных ионов возможно благодаря их различной электрофоретической подвижности.
Наряду с этой простейшей формой капиллярного электрофореза, существует множество его вариантов, которые будут обсуждаться в последующих разделах при рассмотрении наиболее типичных областей их применения Рис.2.
Пример разделения нейтральных, положительно и отрицательно заряженных проб в одном опыте. Условия разделения: L=30/37 см;
внутренний диаметр — 75 мкм;
детектирование УФ/214 им. (1) триметилфениламмонийбромид, (2) гистамин, (3) 4 аминопиридин, (4) бензиновый спирт, (5) фенол, (6) сирингальдегид, (7) 2-(парагидроксифенил)-уксусная кислота, (8) бензойная кислота, (9) ванилиновая кислота, (10) пара гидроксибензойная кислота.
3. Эпектрофоретическое перемещение Увеличивающееся напряжение и возрастающая при этом напряженность поля Е приводят к постоянному повышению скорости перемещения U (скорости электрофореза) и, вследствие этого, к более высокой скорости анализа. Электорофоретическая подвижность ионов µ связана со скоростью электрофоретического перемещения U м напряженностью поля Е соотношением:
U=µ.E=Leff/t Здесь Leff- эффективная длина капилляра (от входа до детектора), t — время перемещения.
Эта формула может быть преобразована с учетом равновесия сил, действующих на перемещающийся ион.
На отдельный ион действует сила КB, ускоряющая его:
z F E KB = N A где F- константа Фарадея (96500 Кл/моль), z — эффективный заряд иона.
Эта сила приблизительно равна силе трения КR, которая в соответствии с законом Стокса выражается уравнением:
KR = 6 • • • r • U При этом -динамическая вязкость [Па-с], r -cтоксовский радиус [см]. Скорость электрофоретического перемещения U тогда может выражаться как :
z F E U = 6 r N A Если затем накладывается напряжение (обычно от 10 кВ до 30 кВ) то происходит разделение за счет различной скорости перемещения пробы в разделительном буфере.
При этом ионы перемещаются в электрическом поле со скоростью, которая может быть выражена следующим уравнением:
Leff Leff Lges µ = = t E t U При расчетах важно различать общую длину капилляра (Lges) и эффективную длину капилляра от места ввода пробы до детектора (Leff). так как электрическое поле уменьшается на протяжении общей длины капилляра, а молекулы мигрируют лишь в пределах эффективной длины капилляра. Поэтому данные о длине капилляров характеризуются отношением длин в см Leff/Lges.
Электрофоретическое разделение возможно лишь тогда, когда ионы различаются по их подвижности. Эффективный заряд представляет собой заряд иона за вычетом части заряда окружающего противоположно заряженного двойного электрического слоя. При перемещении ион притягивает эту часть двойного электрического слоя и передвигается из-за этого более медленно. Это явление называется электрофоретическим эффектом, который наиболее сильно проявляется в тонких диффузных двойных слоях вокруг ионов. Этот характеристический двойной электрический слой может быть рассчитан по теории Дебая-Хюккеля. Он обратно пропорционален корню квадратному из концентрации электролита. Отсюда следует, что эффективный заряд иона и, соответственно, скорость перемещения при увеличении ионной силы уменьшаются.
Для крупных частиц с радиусом большим, чем размер двойного электрического слоя, подвижность частиц близкого состава не зависит от их размеров, что затрудняет разделение больших молекул при электрофорезе, поскольку скорость перемещения молекул ДНК и белков, денатурированных ДДСН, в чистом растворителе идентична.
Разделение достигается лишь тогда, когда миграция обусловлена молекулярно-ситовым эффектом (например, в гелях).
4. Электроосмотический поток (ЭОП) В то время как электрофорез обусловливает разделение частиц с различной подвижностью, электроосмос определяет течение буферного раствора в электрическом поле.
В большинстве случаев при капиллярном электрофорезе на электрофоретическое перемещение ионов накладывается ЭОП. Этот поток зависит от распределения зарядов вблизи поверхности капилляра. Почти все поверхности несут на себе определенный заряд. В случае кварцевых капилляров — это отрицательные заряды, обусловленные диссоциацией силанольных групп. Этот поверхностный заряд локализуется в жидкости напротив соответстующих противоионов с противоположным зарядом. В таком двойном электрическом слое, схематически изображенном на рис. 3, преобладают положительные ионы, которые распределены между неподвижными и подвижными слоями.
Рис. 3. Разделение зарядов па поверхности кварца и образование -потенциала.
Если параллельно поверхности капилляра приложено электрическое поле, то оно притягивает противоионы из подвижного слоя вдоль оси и засасывает жидкость в капилляр. Поэтому в случае кварцевых капилляров электроосмотический поток направлен к катоду. Образуется очень плоский профиль потока. Это приводит к значительно меньшему уширению пиков, чем при гидродинамическом течении, при котором образуются сильно зависящие от радиуса капилляра и скорости течения параболические профили потока — профили Хагена-Пуазейля (рис. 4).
В капиллярах, загруженных стеклянными шариками или частицами силикагеля, ЭОП не должен зависеть от диаметра частиц, и направление потока в загруженном капилляре должно быть таким же, как и в пустом. При этом нет необходимости в применении очень маленьких частиц (с диаметром около 1 мкм или даже меньше) или длинных колонок, как при хроматографических методах. Поэтому метод ЭХ вызывает все возрастающий интерес, так как он сочетает селективность ВЭЖХ с высокой разделительной способностью КЭ. Благодаря применению непористых частиц можно исключить влияние диффузии в поры на уширение полос или пиков.
Рис. 4. Профиль ЭОП, обусловленный давлением (a), и идеальный профиль (b).
Величина ЭОП может быть упрощенно описана с помощью так называемого уравнения Гельмгольца.
E u = Она пропорциональна диэлектрической проницаемости, напряженности приложенного поля Е и количеству зарядов на стенке капилляра или возникающему при этом -потенциалу и обратно пропорциональна вязкости электролита. В кварцевых капиллярах ЭОП уменьшается при увеличении концентрации электролита и добавлении органических компонентов и возрастает с увеличением степени диссоциации поверхностных силанольных групп, что означает увеличение ЭОП с возрастанием значений рН (рис. 5). Если же при добавлении катионных поверхностно активных веществ (ПАВ) к разделительному буферу на поверхности капилляра адсорбируется положительный заряд (см. рис. 6), то ЭОП меняет направление и переносит разделительный буфер в направлении анода.
Зависимость ЭОП в кварцевых капиллярах от значений рН и соответствующая воспроизводимость подвижности представлены на рис. 5. ЭОП проявляет при циклическом обмене буферов типичный эффект гистерезиса. Наибольшие отклонения наблюдаются в средней области рН при значениях, близких к значению рК кремневой кислоты. Благодаря увеличению времени кондиционирования в зависимости от изменений значений рН буфера удается несколько уменьшить это отклонение, и яв ления гистирезиса уменьшаются. Для воспроизводимости работ с незагруженными капиллярами необходимо при обмене буферов стандартизовать время заполнения и кондиционирования с тем, чтобы можно было устранить явление гистерезиса ЭОП.
подвижность [ x10 -4 см2/В*с] Рис. 5. Зависимость электроосмотического потока от рН. Условия:
внутренний диаметр капилляра мкм, L=40/47 см, буфер: фосфат 10 мМ, нейтральный маркер:
Как уже упоминалось, ЭОП уменьшается по мере возрастания ионной силы. При этом зависимость ЭОП от логарифма концентрации буфера носит линейный характер (рис. 7).
ЭОП присутствует во всех электрофоретических методах разделения, так как никогда не удается полностью исключить возникновение поверхностных зарядов. Он может привести, с одной стороны, к концентрационному перемещению электрофоретических зон, однако, с другой стороны, играет существенную и иногда решающую роль при переносе зон через капилляр. Из-за постоянно существующего ЭОП при капиллярном электрофорезе детектор во всех случаях располагается в непосредственной близости от катода.
Анионы сами переносятся к катоду, соответственно скорость их электрофоретического перемещения ниже, чем скорость ЭОП. Таким образом, ЭОП позволяет проводить разделение катионных и анионных соединений в одном анализе (сравни с рис. 2). При других методах капиллярного электрофореза (например, при мицеллярной электрохроматографии) ЭОП используется исключительно для переноса проб (частично незаряженных) к детектору.
Двойной электрический слой катионных ПАВ Рис. 6. Адсорбция катионных ПАВ на стенке капилляра.
Стенка капилляра Благодаря химической модификации поверхности капилляров, ЭОП может контролироваться, исключаться или даже обращаться. Определение значения ЭОП служит единственной возможностью определить изменения на поверхности капилляров, например, благодаря необратимой адсорбции компонентов пробы. Все другие методы характеристики поверхности капилляров исключаются при очень небольших поверхностях (1 см2). Поверхностно-модифицированные капилляры не проявляют явле ний гистерезиса при смене буферов и из-за незначительной адсорбции очень хорошо подходят для анализа белков (см. ниже).
За счет добавления длинноцепочечных катионных детергентов, таких как, например, цетилметиламмониевые соли, которые адсорбируются на силанольмых группах поверхности, можно осуществить даже обращение ЭОП. При этом образуется двойной слой детергента, обращенный положительным зарядом в направлении электролита.
При использовании капилляров с такими покрытиями удается осуществлять разделение быстро перемещающихся неорганических ионов. Таблица 1 дает представление о возможностях влияния на ЭОП.
Рис 7. Концентрационная зависимость ЭОП. Условия:
кружок — боратный буфер, квадрат — фосфатный буфер (в каждом случае рН 8.0). А: ЭОП в зависимости от ln концентрации буфера;
В: ЭОП в зависимости от In ионной силы буфера.
Возможности влияния на ЭОП.
Изменения в системе Воздействие на ЭОП Примечание разделения рН буфера ЭОП возрастает при Может также влиять на заряд уменьшении рН пробы Концентрация буфера ЭОП возрастает при Высокая концентрация уменьшении концентрации обусловливает сильное буфера течение, малая концентрация легко приводит к перегрузке Температура Изменяется вязкость ( 2 — Может также влиять на 3%на1°С) селективность Органические Изменение ЭОП и вязкости Комплексное изменение растворители буфера разделительной cистемы, в большинстве случаев с изменением селективности ПАВ как добавки к Адсорбция на стенке ка- Анионные ПАВ могут буферам или пилляра. увеличить ЭОП, катионные нейтральные гидрофобные Характерное изменение ЭОП ПАВ уменьшают или полимеры обращают ЭОП Динамические При образовании мицелл Проблемы со стабильностью покрытия сильное изменение се лективности Ковалентные покрытия Влияют на ЭОП, уменьшают Проблемы со стабильностью адсорбцию на стенках Радиальное Изменение ЭОП Ограниченное распро электрическое поле странение Изменение концентрации буфера представляется наиболее эффективной и простой возможностью влиять на ЭОП разделительной системы. Чтобы оценить действие концентрации буфера на разделение, было проведено разделение тест-смеси, содержащей ионы с различными отрицательными зарядами в боратном буфере с концентрацией от 5 мМ до 100 мМ как при постоянном токе, так и при постоянном напряжении.
Результаты испытаний представлены на рис. 8 и 9. Благодаря этим измерениям было четко показано, что ЭОП увеличивается по мере уменьшения концентрации буфера и поэтому подходит для анализа сильно отрицательно заряженных, мигрирующих против ЭОП проб. При постоянном напряжении (10 кВ) и концентрации буфера 5 мМ бензолтрикарбоновая кислота еще может быть обнаружена, однако при том же самом времени анализа и концентрации буфера 50 мМ можно детектировать только бензойную кислоту При этом ток повышается с 10 до 130 мА. Аналогичное поведение можно наблюдать для веществ, подвергаемых разделению при постоянном токе (100 мА). Работая с буфером 10 мМ при 26 кВ, в течение 8 минут можно обнаружить все четыре тестовых вещества, в то время как в буфере 50 мМ удается детектировать только нейтральный маркер (бензиловый спирт). В этом буфере при максимальной силе тока 100 мА можно достигнуть напряжения лишь в 5.5 кВ. Если пост роить зависимость времени анализа от концентрации буфера, то можно отчетливо видеть параллельный ход кривых бензойной кислоты и бензилового спирта. Наивысшая скорость перемещения достигается при самой низкой концентрации буфера. Если рассчитать электрофоретическую подвижность бензойной кислоты, то она при различных концентрациях буфера остается постоянной, поэтому бензойная кислота может служить веществом-индикатором при качественном анализе.
Для уменьшения времени анализа или для анализа многозарядных анионов необходимо работать с буферами низкой концентрации и при щелочных значениях рН. Этот эффект представлен на рис. 10.
Рис. 8. Разделение тестовой смеси анионов при постоянном напряжении. Условия: прибор — Beckmaa Р/АСЕ 2000;
проба — бензоловый спирт (1), бензойная кислота (2), фталевая кислота (3), 1,3,5 бензолтрикарбоновая кислота (4).
Рис.9. Разделение тестовой смеси анионов при постоянном токе.
источник