Крахмальный гель для электрофореза

Впоследствии были предложены технологии разделения на плотных носителях, среди которых особое место заняли гели. Последние сочетали удобства разделения в свободном растворе (в геле 95-99% воды) с возможностью фиксировать результаты электрофореза путем высушивания геля. Среди гелеобразующих веществ вначале получил признание крахмал, затем полисахариды из водорослей агар-агар (агароза) и наконец гели, искусственно получаемые путем полимеризации акриламида.

Полиакриламидный гель стал одним из наиболее популярных носителей для электрофореза. Полимеризацию проводят в буферном растворе. Затем гель помещают в электрофоретическую камеру, заполненную буферным раствором и содержащую электроды для образования электрического поля (рис.1.8). рН и другие параметры буферного раствора выбираются из расчета, чтобы разделяемые молекулы несли отрицательный заряд и двигались в электрическом поле слева направо. Поскольку разделяемые молекулы движутся в геле, те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к месту нанесения, чем меньшие.

Рис.1.8. Виды проведения электрофореза в полиакриламидном геле (слева — в трубках с гелем, справа — в прямоугольных блоках)

Следует иметь ввиду, что этот метод позволяет разделять молекулы большей частью по их размеру, и совсем необязательно, — по их молекулярной массе. Для примера рассмотрим две молекулы белка по 1000 аминокислот каждая. Одна из них представляет вытянутую цепь (А), а вторая (за счет образования связей между соседними участками) имеет форму шпильки (Б):

Поскольку они движутся внутри геля, обе молекулы будут вести себя как сферы, диаметр которых равняется длине вытянутой части молекулы. Обе молекулы имеют одинаковую молекулярную массу, однако благодаря тому, что вторичная структура Б де-лает её молекулу короче, чем А, быстрее будет передвигаться Б. Дабы устранить влияние различий по форме и оставить только различия по молекулярной массе, разделяемые молекулы должны иметь развернутую конформацию (без вторичной структуры). Для разрушения вторичной и третичной структуры используются различные методы подготовки препаратов белка.

Подготовка белков. Все белки обладают вторичной и третичной структурной организацией. При этом их молекулы не всегда несут отрицательный заряд в растворе. Для разрушения вторичной и третичной структуры и образования на поверхности белков отрицательного заряда их нагревают и обрабатывают детергентом – додецилсульфатом натрия (ДДС-натрий).

Если соблюсти вышеприведенные условия, разделение молекул при электрофорезе будет осуществляться в зависимости от их молекулярной массы. При этом удается, например, разделить 2 молекулы полинуклеотида, различающиеся на 1 мононуклеотид. Высокомолекулярные молекулы будут двигаться медленнее низкомолекулярных. Длина пройденного молекулой расстояния будет пропорциональна логарифму величины, обратной её молекулярной массе (log 1/MM).

Обычно гели изображают в вертикальном положении, где место нанесения находится вверху, а движение разделяемых молекул направлено сверху вниз. Тогда в верхней части геля располагаются большие молекулы, а в нижней – с меньшей молекулярной массой.

Как правило, рядом с опытными пробами на гель наносится смесь белковых (или каких-то других разделяемых) молекул с известной молекулярной массой. Такие стандарты «молекулярной массы» позволяют прокалибровать пробег молекул. Тогда, зная какое расстояние прошло изучаемое вещество, можно установить его молекулярную массу. Ниже на рисунке 1.9 показан гель после обработки его красителем. Молекулы красителя связываются с каким-то определенным классом макромолекул независимо от последовательности расположения мономеров в их составе.

Рис.1.9. Результат проведения электрофореза в полиакриламидном геле после окраски геля неспецифическим красителем

Изображенный на рис.1.9 образец 1 содержит макромолекулы одного размера. Это может быть очищенный белок. При сравнении с подвижностью стандартов ясно, что молекулярная масса этого соединения около 3. Образец 2. Это может быть смесь белков после окраски геля неспецифическим красителем. Здесь находится так много полос, что среди них невозможно вычленить необходимую. В подобных условиях без зонда (который действует как специфический краситель) нам едва ли удастся получить полезную информацию об интересующем соединении. Учитывая это обстоятельство, для определения индивидуальных белков пользуются сочетанием электрофореза с иммунологическими реакциями (иммуноэлектрофорез) (рис.1.10).

Рис.1.10. Схема проведения иммуноблот анализа для обнаружения белка после проведения электрофореза в полиакриламидном геле (описание этапов приведено в гл.13)

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9336 — | 7292 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Главное отличие зонного электрофореза от фронтального состоит в том, что при зонном электрофорезе используется поддерживающая среда, в которой осуществляется движение вещества, тогда как при фронтальном электрофорезе ионы свободно перемещаются в растворе. Поддерживающей средой, или носителем, служат обычно бумага, целлюлоза, крахмальные гели или блоки, пористые полиуретаны и полиакрил-амидные гели. [46]

Крахмал суспендируют в 270 мл буферного раствора, предназначенного для геля, в котором растворено 40 0 г мочевины. Все остальные процедуры проводят так же, как и при обычном горизонтальном электрофорезе в крахмальном геле ( стр. [47]

Спустя два года Линдквист и Сторгардс [185] опубликовали данные по фракционированию аминокислот и пептидов на колонках с крахмальным гелем и объяснили полученные результаты на основе эффекта молекулярных сит. В том же 1955 г. Лейт и Рутвен [167, 186] провели фракционирование смесей различных белков и меньших по размеру молекул на колонках с крахмальным гелем . Они первыми осуществили фракционирование образцов, молекулярные веса которых изменялись в широких пределах, и объяснили полученные данные на основании ограниченной проницаемости фракционируемых молекул в гели в зависимости от размеров этих молекул. Эти авторы далее показали, что область молекулярных весов фракционируемых молекул можно было значительно расширить путем набухания гранул крахмала и увеличения размеров пор в этих гранулах. [48]

Электрофорез в крахмальном геле имеет не только большое значение при диагностике парапротеинемий: он весьма важен при определении гомогенности нативных белков и полезен при анализе субъединичной структуры молекулы белка. Например, папаиновые фрагменты IgG ( Fab, Fc и Fc) или выделенные из него полипептидные цепи ( Н — и L-цепи) при электрофорезе в крахмальном геле образуют отдельные зоны. Это позволяет сравнивать субъединицы гомогенных IgQ ( миеломных белков или чистых антител) между собой. [49]

Используя окрашенный бумажный отпечаток, отмечают границы каждой фракции на крахмальном блоке. Каждый фрагмент крахмального геля отдельно суспендируют в 10 мл холодной дистиллированной воды, частицы крахмала осаждают центрифугированием при 2000 об / мин и в надоса-дочной жидкости определяют содержание белка. [50]

Некоторые методические сложности препятствуют широкому распространению электрофореза в крахмальном геле, несмотря на его весьма большую разрешающую способность. По сравнению с электрофорезом на бумаге электрофорез в крахмальном геле включает дополнительные операции, связанные с приготовлением и гидролизом крахмала, сборкой прибора, окрашиванием и количественным определением полученных фракций. Однако присущий крахмальному гелю эффект молекулярного сита увеличивает разрешающую способность данного метода по сравнению с электрофорезом на бумаге, и поэтому его используют для более тонкого анализа. [51]

Для препаративного выделений зон с поверхности геля сначала срезают тонкий слой, в котором определяют положение компонентов. В соответствии с этим зоны вырезают из оставшейся части геля. Если заморозить и оттаять кусочки крахмального геля , последний приобретает губчатую структуру и жидкость из него можно просто выдавить или извлечь центрифугированием. Чтобы избежать возможной адсорбции на поверхности твердой фазы, рекомендуется производить эту операцию по возможности быстро. [52]

Для препаративного выделения зон с поверхности геля сначала срезают тонкий слой, в котором определяют положение компонентов. В соответствии с этим зоны вырезают из оставшейся части геля. Если заморозить и оттаять кусочки крахмального геля , последний приобретает губчатую структуру и жидкость из него можно просто выдавить или извлечь центрифугированием. Чтобы избежать возможной адсорбции на поверхности твердой фазы, рекомендуется производить эту операцию по возможности быстро. [53]

источник

Методику разработали: А.А.Поморцев, канд. биол. наук; А.М.Кудрявцев. канд. биол. наук; В.В.Упелниек, канд. биол. наук (ИОГЕН РАН им.Н.И.Вавилова); В.Г.Конарев, акад. РАСХН; А.В.Конарев, проф.; И.П.Гаврилюк, проф., Н.К.Губарева, канд. биол. наук; Т.И.Пенева, канд. биол. наук; В.В.Сидорова, канд. биол. наук; С.П.Фарбер, канд. биол. наук (ВНИИР им.Н.И.Вавилова); А.П.Березкин, проф. МСХА им.К.А.Тимирязева; А.М.Малько, канд. биол. наук; начальник Государственной семенной инспекции Российской Федерации; Л.А.Смирнова, канд. экон. наук, начальник отдела семеноводства Федерального агентства по сельскому хозяйству; М.С.Бунин, д-р с.-х. наук, проф., зам. директора Депнаучтехполитики; П.Ф.Коненков, д-р с.-х. наук, проф., В.К.Гинс, д-р биол. наук, проф., В.И.Старцев, канд. с.-х. наук, Е.Г.Добруцкая, д-р с.-х. наук, проф. (ВНИИССОК)

Рецензенты:

В.Ф.Козловская, д-р биол. наук, проф., зав. сектором технических наук РАСХН; А.А.Соловьев, канд. биол. наук, доц. МСХА им.К.А.Тимирязева

Ответственный за выпуск

Л.А.Смирнова — начальник отдела семеноводства Федерального агентства по сельскому хозяйству Минсельхоза России

Разработана в соответствии с экономической политикой государства и современной законодательной базой в области селекции и семеноводства. Рассмотрены методические вопросы использования электрофоретического анализа белков по ряду сельскохозяйственных культур в целях совершенствования их сортовой идентификации. Введение методики в практику сортового контроля позволит усилить защиту прав потребителей семян и патентообладателей на сорта растений, способствовать повышению качества семенного материала в стране.

Издание предназначено для широкого круга специалистов в области селекции, семеноводства, сортового и семенного контроля, а также аспирантов и студентов. Рассмотрена и одобрена к изданию Научно-техническим советом Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (протокол N 17 от 24.03.04).

В Государственном реестре селекционных достижений, допущенных к использованию на 2004 г., находится более 8000 сортов растений. Существующая на сегодня нормативная база по закону «О селекционных достижениях», охраняя право на селекционное достижение посредством выдачи патента, делает возможным постепенный переход селекции растений на возвратную основу через сбор селекционного вознаграждения — роялти.

Федеральный закон Российской Федерации «О семеноводстве» является логическим продолжением закона «О селекционных достижениях». Им регламентируются правовые отношения производителей и потребителей семян в процессе производства, заготовки, обработки, хранения, транспортировки и использования семян сельскохозяйственных и лесных растений, а также регулируются организационные основы их деятельности.

В стране ежегодно апробируется и регистрируется более 20 млн га сортовых посевов, исследуется более 2,5 млн проб семян, включая проведение полного анализа и повторного — по окончании срока действия документа о качестве, определение всхожести перед посевом, а также влажности зерна перед уборкой семенных участков и др.

Семена, предназначенные для реализации, должны пройти процедуру сертификации. Сертификат выдается только на семена сортов, допущенных к использованию. Исключение составляют семена, производимые с целью реализации за пределами России. В соответствии с приказом Минсельхозпрода России от 08.12.99 N 859 «Об утверждении Положения о порядке проведения сертификации семян сельскохозяйственных и лесных растений» обязанности центрального органа по сертификации семян возложены на Государственную семенную инспекцию Российской Федерации.

Процесс сертификации семян включает: подачу заявки на проведение сертификации; рассмотрение заявки и принятие решения; контроль за соблюдением стандартов и другой нормативной документации при производстве, подработке, упаковке и реализации семян; проведение сортовой идентификации; отбор проб для проведения испытаний; проведение испытаний; анализ полученных материалов и принятие решения о возможности выдачи сертификата; выдачу сертификата; осуществление инспекционного контроля за сертифицированными семенами.

Современная нормативная правовая база в области семеноводства в целом унифицирована с законодательством развитых стран. Это создает предпосылки для плавной интеграции России в международный рынок семян, признания и поддержки ее авторитетными организациями, такими как ISTA (Международная ассоциация по контролю за качеством семян), UPOV (Международный союз по охране новых сортов растений), ISF (Международная федерация по семеноводству), OECD (Организация экономического сотрудничества и развития).

Разветвленная система государственного испытания новых сортов в Российской Федерации позволяет ежегодно выпускать государственный реестр селекционных достижений, что в сочетании с сертификацией семян является условием защиты прав потребителей. Это придает уверенность сельскому товаропроизводителю в том, что он покупает качественный семенной материал.

В то же время сбор селекционного вознаграждения — роялти относится к категории частного права патентообладателя, и механизм его осуществления проводится уже при помощи государства. Современная законодательная база позволяет осуществлять оборот партий семян после выплаты селекционного вознаграждения, что вместе с выдачей патента на сорт является защитой прав селекционеров растений.

Однако, несмотря на достаточно прогрессивную с точки зрения законодательства систему охраны селекционных достижений, постоянно возникают проблемы по оценке сортовых качеств семян. Некоторые из них можно успешно решить с помощью современных маркеров, к категории которых относятся биохимические и молекулярные методы идентификации сортов.

В мировой и отечественной практике производства семян возникали прецеденты, когда без методов электрофореза нельзя было установить сортовую принадлежность и чистоту семян, и здесь необходимо отметить, что лабораторный сортовой контроль с помощью различных типов электрофореза способен быть эффективным методом при проведении сравнительных анализов в арбитражных случаях. Можно рекомендовать использование этих методов для учреждений, устойчивых в финансовом отношении и желающих на добровольной основе дать потребителям более емкую информацию о качестве своих семян.

По мере улучшения экономического состояния сельскохозяйственного производства в целом можно предположить, что методы оценки качества семян будут постоянно совершенствоваться и от оценки фенотипа приближаться к оценке генотипа.

Электрофорез — метод, используемый для разделения заряженных частиц под влиянием электрического поля. Этот метод впервые использовал Тизелиус еще в 1925 г. Первые эксперименты проводились в растворе (электрофорез в свободной жидкости), что делало разделение трудным для наблюдения. В 1950 г. были введены поддерживающие среды, после чего метод стал широко использоваться учеными в различных областях. Среда-носитель применяется, чтобы удержать заряженные частицы, когда они подвергаются разделению, минимизировав таким образом диффузию. Существует много типов сред-носителей, включая бумагу и ацетат целлюлозы, но наиболее широко используемыми являются гели различных типов — агар, агароза, гидролизированный картофельный крахмал, а также состоящие из синтетического полимера полиакриламида (ПААГ).

В биохимии электрофорез применяется для разделения смесей больших молекул, таких как белки или нуклеиновые кислоты, которые в растворе ведут себя как заряженные частицы. Чтобы понять основы теории электрофореза и осознать целесообразность применения метода для идентификации сортов, следует знать структуру белка. Белки состоят из длинных цепей аминокислот, которые имеют общую формулу OOC-R-CH(NH )+. В белках найдено 20 аминокислот, различающихся по типу химической группы, обозначенной как R в формуле молекулы. Некоторые из этих R-групп способны ионизироваться, т.е. становиться заряженными. Точная последовательность аминокислот в конкретном белке, а также число аминокислот в белке (что обусловливает его молекулярную массу) определяются генетически. Существуют тысячи различных видов белков, и все они имеют уникальную последовательность аминокислот. Из-за этого, а также из-за различной длины аминокислотных цепей белки различаются как по электрическому заряду, так и по молекулярной массе. Оба этих параметра используются при электрофоретическом разделении.

Используемые методы электрофореза в гелевых носителях (полиакриламидном и крахмальном гелях) основаны на двух принципах:

а) заряженные молекулы белка движутся в поле постоянного электрического тока, скорость движения зависит от величины заряда молекулы;

б) эффект молекулярного сита в используемых гелях — полиакриламидный и крахмальный гели имеют пористую структуру, в которой размер пор соизмерим с размерами белковых молекул. Поэтому в геле полипептиды с большей молекулярной массой будут двигаться медленнее в сравнении с полипептидами с меньшей молекулярной массой.

Таким образом, смесь белков может быть разделена на дискретные зоны в зависимости от заряда и размера их молекул. Проводя электрофоретическое разделение, необходимо визуализировать белки тем или иным способом, так как их нельзя увидеть непосредственно. Для этого используются различные методики окрашивания.

В этом состоит суть электрофоретического разделения белков, хотя описание сильно упрощено. Существует несколько приемов электрофореза, необходимо иметь некоторые представления об их различиях.

Существует много версий электрофоретических методов, все они имеют общие черты. Гель определенных размеров, но с разной величиной пор, удерживается между стеклянными пластинками или в стеклянных трубках и содержит буфер какого-либо вида (известный как буфер геля). Ионная сила и рН буфера могут меняться, чтобы соответствовать белкам, разделение которых представляет интерес. Электродный (или резервуарный) буфер также используется, чтобы переносить электрический заряд через гель. Разделение смеси белков может быть выполнено как горизонтально, так и вертикально. В ряде случаев существенным является контроль температуры геля и буфера в процессе разделения.

Существует много различных типов оборудования как промышленного производства, так и самодельных. Однако при проведении анализа должны использоваться единые образцы технических средств.

Выделяют четыре принципиально различных вида электрофореза.

Нативный электрофорез. Метод, в котором разделение основано на различиях как заряда белков, так и их размера. В основной версии этого метода используется один и тот же буфер как в геле (рабочий буфер), так и в электродном резервуаре (электродный буфер). Этот метод известен как непрерывный.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE или ДДС-Na-ПААГЭ). Метод первоначально разработал Лаемли. В этом типе электрофореза рабочий буфер, электродный буфер и буфер исходного раствора белкового препарата включают ДДС-Na. Все белки, находясь в восстановленной форме, связывают ДДС-Na примерно в одной и той же пропорции (1,4 г ДДС-Na на 1 г белка, что составляет примерно одну молекулу детергента на два аминокислотных остатка). Так как ДДС-Na несет сильный отрицательный заряд, он нейтрализует все положительные заряды белков. В результате разделение белков, обработанных ДДС-Na, основывается только на размере белков при условии, что белки не являются гликопротеинами. Широко используемый ДДС-Na-ПААГЭ метод является ступенчатой системой (рН электродного и гелевого буферов различаются).

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ). Данный вид электрофореза отличается от двух предыдущих тем, что рабочий и электродный буферы не применяются. Вместо этого в геле создается градиент рН путем добавления смеси химических соединений, известных как носители амфолитов. Хотя белковые молекулы имеют электрический заряд, величина и знак заряда зависят от рН раствора, в котором белок растворен. Это обусловлено структурой аминокислот, которые содержат химические группы и могут быть как положительно, так и отрицательно заряжены. Для каждого белка существует такое значение рН, при котором число положительных и отрицательных зарядов равно, т.е. он не несет суммарного заряда. Это значение рН известно как изоэлектрическая точка или pI. При значениях рН ниже pI белки будут иметь положительный заряд, в то время как при рН выше pI они будут отрицательно заряжены. В методах ИЭФ смесь белков наносится на гель, содержащий градиент рН. Когда накладывается электрическое поле, белки мигрируют в геле до тех пор, пока не достигнут точки, где значение внешнего рН равно значению их pI. После этого белки не могут двигаться, так как не несут больше заряда. Эффект становится «сфокусированным». Из-за того что белки, различающиеся только немного по pI, могут быть таким образом легко разделены, ИЭФ также стало эффективным средством разделения смесей белков.

Двумерные методы. При двумерном электрофорезе проба сначала подвергается электрофоретическому фракционированию в первом направлении, затем гель с разделенными белками формирует стартовую зону для другого разделения, проводимого под прямым углом к первому. Такие двумерные методы являются самыми эффективными по разрешению электрофоретическими системами, особенно когда используются вместе с высокочувствительными методиками окрашивания (например, серебром). Для двумерного электрофореза используются различные комбинации, наиболее распространенной из них является ИЭФ+ДДС-Na-ПААГЭ, известная как методика O’Farrell. Хотя двумерные методы и позволяют наиболее полно выявлять различия, в существующем виде они не пригодны для массового анализа семян в силу своей сложности, длительности и дороговизны.

Успешное применение электрофоретических методов для идентификации сортов растений основано на том, что белки являются продуктами структурных генов, которые наследуются кодоминантно. Таким образом, белки могут рассматриваться как «маркеры» структурных генов, которые их кодируют. Следовательно, сравнение состава белков от индивидуальных семян или популяции является сравнением изменений в экспрессии генов. Изучая достаточное количество маркеров, можно охватить большую часть генома. Так как генотипы сортов сельскохозяйственных растений различаются по аллелям генов, сравнение состава определенных белков позволяет проводить «типизацию» или «паспортизацию» материала. При этом подходе необходимо рассматривать полиморфные белки, т.е. существующие во многих различных молекулярных формах.

При работе с семенами электрофоретическому анализу подвергают белки семян. Существуют четыре типа белков, но наиболее пригодными для идентификации сортов являются запасные белки. Почти у всех видов запасные белки проявляют значительный полиморфизм в отношении заряда, размеров или обоих параметров. Более того, они кодируются генами в различных локусах, присутствуют в сравнительно больших количествах и легко экстрагируются. Следовательно, электрофоретическое исследование состава запасных белков семян является эффективным и удобным методом характеристики генотипа растения, пригодным для идентификации сортов и гибридов. В качестве альтернативного метода использование специфических красителей может выявить множественные молекулярные формы определенных ферментов (изозимов). Как и запасные белки, они напрямую экстрагируются из тканей. Генетический контроль многих ферментов хорошо изучен. Таким образом, нет недостатка в удобных белковых маркерах, встречаемых в большинстве сельскохозяйственных растений, будь это белки семян или изоферменты из различных тканей растений.

Наиболее удобную и распространенную классификацию белков семян, основанную на их различной растворимости, предложил Т.Б.Осборн. Согласно этой классификации выделяют четыре типа белков: а) альбумины, водорастворимые в воде и включающие в себя в основном белки-ферменты; б) глобулины, растворимые в разбавленных растворах солей и присутствующие в мембранно-связанных белковых телах, т.е. это запасные белки в строгом смысле этого слова; в) проламины, растворимые в водно-спиртовых растворах и также являющиеся истинно запасными белками; г) глютенины, растворимые в кислых или щелочных растворах и являющиеся в основном структурными или запасными белками, хотя некоторые из них могут иметь метаболические функции. Эти типы белков различаются по аминокислотному составу. Доля каждого типа белков изменяется от вида к виду. Например, семена пшеницы, ячменя, кукурузы, ржи характеризуются высоким уровнем белков проламинового типа, в то время как в овсе и рисе доминируют глобулины. Семена бобовых (бобы, горох) также характеризуются высоким уровнем белков глобулинового типа.

Для эффективной работы по идентификации, определению сортовой чистоты и гибридности семян используемые белки должны отвечать следующим требованиям:

электрофореграммы используемых белков должны быть достаточно сортоспецифичны, т.е. электрофоретические спектры белков большинства сортов должны хорошо различаться, а электрофореграммы белков гибридов должны четко отличаться от таковых родительских линий или форм. Это предполагает, с одной стороны, наличие нескольких генов или локусов, контролирующих белки, с другой — множественный аллелизм этих генов или локусов;

электрофореграммы белков не должны зависеть от условий, места выращивания, длительности и условий хранения семян;

методика электрофоретического анализа должна быть быстрой, достаточно производительной и дешевой для проведения массовых анализов.

Этим требованиям наиболее полно у зерновых культур отвечают спирторастворимые запасные белки эндосперма — проламины (глиадины пшеницы, гордеины ячменя, зеины кукурузы, авенины овса). Проламины чрезвычайно разнообразны и обладают сортоспецифичностью (достаточно сказать, что, например, по электрофореграммам глиадинов различаются более 95% сортов пшеницы и около 80% сортов ячменя). Электрофоретические спектры этих белков не зависят ни от условий выращивания растений, ни от условий и длительности хранения семян. Эти белки появляются в эндосперме на 11-й день после оплодотворения и сохраняются минимум в течение трех суток после прорастания зерновки. Электрофореграммы глиадина можно получить даже из выпеченного хлеба или макаронных изделий.

Для сортовой идентификации могут использоваться и ферментные белки. Однако подавляющее большинство из них имеет ограниченный полиморфизм. Недостаток полиморфизма можно в определенной мере компенсировать большим количеством изучаемых генов или локусов, контролирующих различные ферменты.

В электрофоретических методах используются химические реактивы и оборудование, которые могут оказаться опасными при неправильном обращении с ними. Анализы должны проводиться только обученным персоналом в лабораториях, оборудованных соответствующим образом. Необходимо быть осторожным при обращении с используемыми химическими реактивами, так как некоторые из них являются токсичными и оказывают вредное длительное воздействие на организм. Применяемое высокое напряжение требует хорошего технического обслуживания оборудования и периодической проверки на электрическую и механическую безопасность.

1. Источник постоянного тока с параметрами на выходе: V (напряжение) до 600 Вт, A (сила тока) до 400 мА.

Этим условиям удовлетворяют источники питания:

УИП-1, 2301 MACRODRIVE-1, фирма LKB, DESATRONIC 2000/300, фирма «Desaga».

2. Приборы для электрофореза (рис.1), включающие в себя следующие элементы:

Рис.1. Элементы прибора для электрофореза гордеинов в крахмальном геле:

1 — верхняя камера; 2 — нижняя камера; 3 — электроды; 4 — резиновая пробка; 5 — стеклянные трубки; 6 — штатив с пробирками для проб

а) верхнюю камеру, изготовленную из органического стекла толщиной 5 мм, представляющую собой куб с ребром 120 мм и пятью гранями. В грань, противоположную отсутствующей грани, вклеено кольцо из органического стекла толщиной 4 мм, высотой 20 мм и внутренним диаметром 69 и 71 мм. Меньший диаметр кольца прилегает к грани камеры;

б) нижнюю камеру, представляющую собой обыкновенный химический стакан вместимостью 800-1000 мл;

в) резиновую коническую пробку из эластичной резины толщиной 10 мм и диаметром по срезам 68 и 66 мм, имеющую 41 отверстие диаметром 6 мм для трубок, расположенное по спирали. Отверстия для трубок легко выполнить с помощью пробочного сверла N 1;

г) стеклянные трубки длиной 120 мм и внешним диаметром 7 мм, внутренним — 4-5 мм;

д) электроды из нержавеющей стали, представляющие собой стержни толщиной 1-3 мм, длиной 300 мм (-) и 200 мм (+), припаянные к обычному двухжильному электрическому проводу с двухполюсной электрической вилкой на конце;

е) три емкости шириной 280 мм, длиной 400, высотой — 240 мм соответственно для фиксации, окрашивания и отмывки гелей после электрофореза;

ж) штативы для фиксирования, окрашивания и отмывки гелей после электрофореза, изготовленные из органического стекла, куда вставлены в два ряда 40 стеклянных трубок диаметром 11-12 мм и высотой: в первом ряду 160 мм, втором — 190 мм;

з) круглодонную колбу вместимостью 1 л из термостойкого стекла для заваривания и деаэрации геля и закачивания его в трубки;

и) пробирки вместимостью 0,5 мл (стеклянные или пластиковые) для приготовления проб;

к) пробирки микробиологические для гелей и штативы для пробирок.

4. Магнитная мешалка типа ММ-15.

5. Электромеханическая мешалка (для приготовления больших объемов фиксирующего и окрашивающего растворов) типа MR-25.

6. Водоструйный насос или масляный вакуумный насос.

7. Колбу Бунзена вместимостью 2-3 л и воронку Бюхнера.

8. Термостат, способный поддерживать температуру 38±0,5°С (типа ТВЗ-25).

10. Химическая посуда: стаканы, цилиндры, колбы различных объемов.

12. Световой столик со штативом для фотоаппарата для фотографирования гелей.

16. Весы лабораторные типа ВЛТК-500.

1. Алюминия лактат (молочно-кислый алюминий).

3. Ацетат натрия (уксуснокислый натрий).

5. Калий двухромовокислый (бихромат калия).

6. Крахмал картофельный высшей степени очистки.

7. Кислота соляная концентрированная.

8. Кислота серная концентрированная.

9. Кислота молочная (40%-ная отечественная или 92%-ная фирмы «Serva»).

10. Кислота трихлоруксусная.

12. Нигрозин водорастворимый.

15. Фенол — 1,5%-ный водный раствор фенола.

17. Этанол 70%-ный.

Используемые реактивы должны быть категории ОСЧ или ХЧ.

Для приготовления крахмального геля используют частично гидролизованный картофельный крахмал. Однако до гидролиза крахмал необходимо отмыть от посторонних примесей (частичек земли, песка, прочих посторонних включений).

4-5 кг картофельного крахмала, предварительно просеянного через сито 0,1 мм, заливают 3-4 л холодной дистиллированной воды и тщательно размешивают (можно руками) до полного перехода крахмала во взвесь и оставляют примерно на 1 ч до момента, когда крахмал образует плотный осадок. Затем самый верхний слой осадка взмучивают, чтобы осевшие на поверхности частицы примесей перешли во взвесь, и воду сливают. Осадок следует размять руками до получения возможно меньших комочков, вновь заливают дистиллятом и размешивают до полного перехода крахмала во взвесь. Разминать осадок без воды следует для того, чтобы образующаяся при последующей заливке водой пена захватывала мелкие частицы примесей (эффект флотации). Отмывку водой повторяют 4-5 раз. После последней отмывки крахмал переносят на воронку Бюхнера и подсушивают ацетоном (на 0,5 кг требуется примерно 150-200 мл ацетона). Это нужно для того, чтобы на влажном крахмале не поселялись микроорганизмы. Затем подсушенный крахмал выкладывают на фильтровальную бумагу и оставляют при комнатной температуре на двое суток (до исчезновения запаха ацетона). Высушенный крахмал вновь просеивают через сито с отверстиями размером 0,1 мм и помещают в плотно закрывающиеся сосуды. Отмывку следует проводить в течение дня во избежание закисания крахмала. В случае необходимости крахмал, залитый водой, можно оставить на ночь в холодильнике.

Отмытый высушенный крахмал подвергают частичному кислотному гидролизу: 400 г крахмала помещают в емкость с притертым горлом (или плотно закрывающейся крышкой), которую помещают в термостат при температуре 38,5°С и оставляют на ночь. Емкость не закрывать! В этот же термостат и на это же время помещают плотно закрытую емкость с 1 л безводного ацетона. Это делается для того, чтобы крахмал и ацетон нагрелись до требуемой температуры. Перед гидролизом в ацетон добавляют 12 мл концентрированной соляной кислоты, ставят еще на 1 ч в термостат, затем эту смесь быстро выливают в емкость с крахмалом, плотно закрывают пробкой, быстро перемешивают до полного перехода крахмала во взвесь и вновь ставят в термостат при температуре 38,5°С в закрытом виде. В зависимости от партии крахмала время гидролиза, после которого получается крахмал для приготовления гелей требуемого качества, может колебаться от 30 до 50 мин. Это время подбирается опытным путем на небольших (50-100 г) навесках крахмала. После окончания времени гидролиза его останавливают раствором уксуснокислого натрия (28 г CH COONa на 500 мл дистиллированной воды), выливая раствор в смесь ацетона, соляной кислоты и крахмала. Содержимое сосуда тщательно перемешивают и переносят на воронку Бюхнера на предварительно помещенный туда бумажный фильтр для удаления ацетона и промывки крахмала дистиллятом для удаления образовавшейся соли (NaCl) и уксусной кислоты. Для этих целей на 400 г крахмала требуется не менее 3 л дистиллята. После отмывки водой крахмал подсушивают ацетоном (как при отмывке) и выкладывают на фильтровальную бумагу для сушки. После высушивания крахмал просеивают через сито с отверстиями размером 0,1 мм и перекладывают в плотно закрывающиеся емкости.

Оптимальным считается гидролиз, позволяющий получать 12-14%-ные гели с хорошими механическими свойствами. Но для работы вполне пригодны гели с концентрацией крахмала от 11 до 16% (если они имеют соответствующие механические свойства). В отличие от ПААЭ изменения в концентрации крахмального геля не влияют на получаемые электрофореграммы.

Приготовление фиксирующего и красящего растворов

Для приготовления фиксирующего раствора 1000 г ТХУ (трихлоруксусная кислота) растворяют в 20 л дистиллированной воды.

Для приготовления окрашивающего раствора 400 г водорастворимого нигрозина растворяют в 20 л дистиллированной воды. Порошок красителя постепенно добавляют в воду при постоянном перемешивании с помощью механической мешалки. Раствор перемешивают в течение 1,5-2 ч до полного растворения нигрозина.

Растворы переливают в специальные емкости (см. раздел 2, пункт е). Растворы ТХУ и нигрозина в зависимости от интенсивности работы могут использоваться от 6 до 10 месяцев. Емкости с растворами устанавливают в вытяжном шкафу и накрывают крышками.

Для электрофореза в крахмальном геле используется алюминий-лактатный буфер. На 1 л буфера берут 1,5 г лактата алюминия и доводят значение рН молочной кислотой до 3,1. Один раз определив необходимое количество молочной кислоты для получения рН буфера 3,1 для конкретных фасовок лактата алюминия и молочной кислоты, в дальнейшем рН-метром можно не пользоваться.

Приготовление крахмального геля

Крахмальный гель готовят на буфере с добавлением мочевины до трех молей. Расчетное количество гидролизованного крахмала, мочевины и буфера (табл.1) помещают в круглодонную колбу вместимостью 1 л. Колбу с содержимым при постоянном энергичном помешивании нагревают на пламени спиртовки. По мере нагревания находящаяся в колбе смесь становится вязкой, затем разжижается и становится прозрачной. Заваривать гель следует до начала закипания. После заваривания гель в колбе деаэрируют с помощью масляного или водоструйного вакуумного насоса. После деаэрации гель заливают в трубки. Для формирования одинаковых столбиков геля стеклянные трубки длиной 120 мм, внешним диаметром 7 и внутренним 4 мм вставляются в резиновую пробку толщиной 1 см с отверстиями (обычно отверстий 41, расположены по спирали) таким образом, чтобы они не выходили за обрез пробки. Затем пробку с трубками плотно вставляют в крышку так, чтобы между обрезом пробки и дном крышки оставалось свободное пространство 2-3 мм. После этого в центральную трубку с помощью груши с клапаном закачивают заваренный деаэрированный гель (рис.2). Все трубки при этом заполняются одновременно и до одного уровня по закону сообщающихся сосудов. Когда верхняя граница геля окажется примерно в 1 см от верхнего края трубок, заливку прекращают. Трубки с залитым гелем помещают в насыщенный водными парами эксикатор (или накрывают влажным химическим стаканом) на ночь или на 1,5-2 ч в холодильник при t +4°С. После того как гель застыл, на него можно наносить экстракты белков и ставить электрофорез.

Соотношение компонентов для приготовления крахмального геля, %

источник

Кафедра судебной медицины (зав. — доц. Л.И. Иванников) Крымского медицинского института, Симферополь

Поступила в редакцию 1/III 1965 г.

библиографическое описание:
Определение типов гаптоглобина в жидкой крови при горизонтальном электрофорезе в крахмальном геле / Старостин Н.Н. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1966. — №3. — С. 34-37.

Гаптоглобин (условное обозначение Нр) является составной частью фракции α₂-глобулинов сыворотки крови. Он образует с гемоглобином комплексное соединение и имеет относительно высокую пероксидазную активность, что и было использовано для его определения.

Существует 3 основных типа гаптоглобина. Нр 1-1 соответствует группе сыворотки I и имеет только одну гаптоглобиновую фракцию, передвигающуюся непосредственно перед фракцией свободного (избыточного) гемоглобина. Гаптоглобиновые типы Нр 2-2 и Нр 2-1 соответствуют группам сыворотки IIВ и IIА. Нр 2-2, кроме фракции свободного гемоглобина, имеет до 4 гемоглобинсвязывающих фракций, расположенных в области αβ-глобулинов. Нр 2-1 имеет непосредственно за βc-глобулинами обособленную фракцию, а в области αβ-глобулинов отмечается до 6 гаптоглобиновых полосок. Следовательно, Нр 1-1 имеет величину миграции, примерно одинаковую с гемоглобином, Нр 2-1 мигрирует наиболее далеко, Нр 2-2 занимает промежуточное положение (рис. 1).

Гаптоглобин стоек к внешним воздействиям, не связан с изосерологическими системами, передается по наследству. Последнее свойство широко используют в экспертизах о спорном материнстве или отцовстве.

Гаптоглобин можно определять йодометрическим и электрофоретическим методами. Первый позволяет установить общее количество гаптотлобина, а второй — тип его. Мы использовали горизонтальный электрофорез в крахмальном геле по Smithies в модификации Prokop с сотрудниками. Учитывая известные трудности в освоении указанной методики, мы предлагаем внести некоторые уточнения, позволяющие получить более стабильные результаты.

Наши исследования не подтвердили указания о пригодности только определенных сортов крахмала. Лучшим оказался аптечный картофельный крахмал, — по-видимому, более чистый химически.

Порцию картофельного крахмала 250 г просушивают 1—2 суток при 40°, гидролизуют без взбалтывания в 400 мл очищенного ацетона в смеси с 20 мл 25% раствора соляной кислоты в течение 20 мин. при 40°. Предварительно ацетон в смеси с соляной кислотой выдерживают при 40° не менее 12 часов. Важно поддерживать постоянную температуру при гидролизе (суховоздушный электрический термостат 2Ц-450 повышенной точности: ±0, 3°). По истечении указанного срока ацетон по возможности сливают и при отсутствии воронки Бюхнера крахмал промывают 8—10 л дистиллированной воды до нейтральной реакции. В качестве нейтрализатора можно применять 150 мл 1М раствора ацетата натрия. Крахмал обезвоживают в 300 мл ацетона, высушивают при 40° и развешивают по 39 г.

Можно использовать буферные растворы следующих составов: 1) борной кислоты 0, 93 г, едкого натра 0,66 г, дистиллированной воды до 1 л, перед употреблением добавить дистиллированной воды 1:1; ионная сила 6, 05, pH 11,0; 2) борной кислоты 9, 3 г, едкого натра 1,3 г, дистиллированной воды до 1 л; ионная сила 0, 93, pH 9, 0.

Исследуемую сыворотку отделяют от эритроцитов центрифугированием (гемолиз не оказывал существенного влияния на качество исследования). Ее соединяют с гемоглобином: 10 капель сыворотки + 1 капля раствора гемоглобина, ибо физиологическое содержание гемоглобина в сыворотке (1—3 мг%) недостаточно для отчетливого выявления типов гаптоглобина. Для получения гемоглобина эритроциты до 10 раз промывают физиологическим раствором до полного удаления сыворотки и добавляют троекратное количество дистиллированной воды. Полученный раствор гемоглобина фильтруют и сохраняют при 2—5° (при указанных условиях гемоглобина сохраняется до 1,5 месяцев). Относительно длительное хранение исследуемой сыворотки, замораживание, появление признаков гниения не оказывали существенного влияния на результаты установления типов гаптоглобина.

Рис. 1. Фракция типов гаптоглоби-на, ближайшая к аноду фракция свободного гемоглобина.

От 300 мл крахмального буферного раствора отливают 39 мл. Из полученного количества 200 мл буферного раствора помещают в сосуд для заваривания крахмала, а остаток — в делительную воронку, в которую предварительно высыпают 39 г гидролизованного крахмала и взбалтывают. Этот раствор нагревают до кипения и при энергичном помешивании добавляют взвешенный в буферном растворе крахмал равномерной струей через отверстие (обычный диаметр 0, 2 см) в пробке делительной воронки. При этом получают 13% гель, что обеспечивает более убедительные результаты. Через фильтр (обычную чулочную капроновую ткань) горячий гель выливают в плоскую плексигласовую кювету (размер 13X18X1,7 см), на дно которой предварительно помещают’Стеклянную пластинку (толщиной 2—3 мм); расплавленный гель для предотвращения испарения закрывают аналогичным стеклом. Следя за тем, чтобы высота геля была одинаковой после того, как он остынет (станет упруго-эластичным), гелевый блок извлекают и, перевернув нижней поверхностью вверх (в ней меньше пузырей), специально отточенным обоюдоострым скальпелем, под контролем линейки, через равные промежутки делают сквозные разрезы длиной до 1 см, куда вводят пропитанные исследуемой сывороткой полоски фильтровальной бумаги (размер 1X1,5 см). Затем блок помещают в рабочую плексигласовую камеру (рис. 2), дно которой должно быть максимально тонким, что необходимо для уменьшения расстояния между нижним уровнем блока и электродным буферным раствором (для уменьшения сопротивления). На края гелевого крахмального блока накладывают полоски фильтровальной бумаги (несколько слоев) шириной до 13 см, свободные концы ее опускают в буферный раствор, налитый по 200 мл в 2 ванночки. Электродный буферный раствор после опыта выливают и заменяют свежим. Постоянный ток подают через платиновые электроды от выпрямителя ПЭФ-1 (можно использовать другие аппараты, дающие постоянный ток среднего напряжения). Лучше применять рабочую камеру, где возможен непосредственный контакт электродного буфера с гелевым блоком (рис. 3). Аппарат аналогичной конструкции описан И.М. Маркеловым 1 .

Рис. 2. Камера для горизонтального электрофореза (контакт между крахмальным блоком и электродным буферным раствором осуществляют полосками фильтровальной бумаги).

Рис. 3. Камера для горизонтального электрофореза (непосредственный контакт между блоком и электродным буферным раствором).

Для получения стабильных результатов важно, кроме правильного проведения гидролиза крахмала, в процессе электрофореза поддерживать постоянную силу тока (в среднем до 30 ма), что достигается небольшим периодическим изменением напряжения. (Напряжение при указанных условиях опыта не превышает 150 в. ) Через 10—15 мин. после начала опыта фильтровальные бумажки извлекают (форез можно не прерывать), а через 2—3 часа, когда гаптоглобины полностью разделятся, крахмальный блок извлекают и разрезают туго натянутой проволокой с круглым сечением (диаметр не более 1—1,5 мм) на уровне средней трети, где наблюдается оптимальное разделение гаптоглобинов. На поверхности разрезов 2 половин блока накладывают полоски фильтровальной бумаги, через которые производят окрашивание гаптоглобинов. Реактив Smithies: 100 мл воды, 0, 5 мл ледяной уксусной кислоты, 0, 2 г бензидина и 0, 2 мл 30% раствора перекиси водорода. Хороший результат дает реактив, состоящий из 1 г бензидина, 4 г пероксида бария (для однократного пользования берут 0, 1—0, 2 г указанного порошка и растворяют в 10 мл 50% раствора уксусной кислоты). Для окрашивания 2 половин блока вполне достаточно 10 мл реактива, приготовленного непосредственно перед употреблением. Гаптоглобины окрашиваются в светло-голубой цвет. Результаты учитывают в течение первых 5—10 мин. По истечении указанного срока без консервации контуры полос фракций гаптоглобина становятся нечеткими и цвет их меняется. Фотографирование производят аппаратом «Зенит» на пленке «Микрат-300».

Введение в практику судебной медицины зонального электрофореза для определения типов гаптоглобина имеет большое значение.

источник

Движение частиц в жидкой фазе под действием электрического поля называется, электрофорезом. Скорость движения макромолекул в электрическом поле можно использовать для определения молекулярной массы белков, для идентификации макромолекул по заряду, по форме, для определения изменений в первичной структуре, а также для количественного разделения различных видов макромолекул.

Рассмотрим коротко теоретические основы электрофореза. На макромолекулы с суммарным зарядом q в электрическом поле с напряженностью Е действует электрическая сила

Под действием этой силы происходит ускоренное движение макромолекул. В результате такого движения возникает сопротивление вязкой среды с силой трения Fc = fv, где v – скорость движения макромолекул. Через определенное время, когда силы уравновешиваются (Fэ = Fc), наступает стационарное состояние, и макромолекулы движутся с постоянной скоростью v . Тогда

Отношение скорости v к напряженности электрического поля Е называется электрофоретической подвижностью u. Из (3.45)

Электрофоретическая подвижность измеряется в м 2 •В -1 •с -1 . Для сферических макромолекул f = 6πηr, тогда

где η– вязкость среды; г–радиус макромолекулы.

Как видно, коэффициент электрофоретической подвижности, дает информацию о радиусе макромолекулы, соответственно, и о ее размерах. Однако среда, в которой происходит движение заряженных частиц, является не изолятором, а электролитом, состоящим из различных ионов. Это обстоятельство вносит большие затруднения для теоретического описания движения заряженной частицы в электрическом поле. Макромолекула в растворе электролита окружена ионной оболочкой, экранирующей ее от приложенного электрического поля. Ионная оболочка частично нарушается как действием электрического поля, так и при движении частицы. Существующая теория электрофореза пока не в состоянии точно описать эти ( ряд других) процессов, и поэтому данные электрофореза не могут трактоваться с точки зрения информации о макромолекулярной структуре. Но, тем не менее, различные варианты электрофореза широко применяются для аналитических и препаративных целей. Методы препаративного электрофореза разработаны для получения относительно больших количеств чистого (гомогенного) материала. Аналитический электрофорез используется для контроля чистоты препаратов, определения количества компонентов в смеси, оценки их соотношения и т. д. На практике оптимальные условия для электрофореза тех или иных препаратов подбираются в большинстве случаев эмпирическим путем.

Для разделения макромолекул электрофорезом используют специальные приборы. Существуют три основных типа электрофореза: с подвижной границей, зональный и непрерывный.

При электрофорезе с подвижной границей макромолекулы присутствуют во всем обьеме раствора и положение молекул с течением времени можно определять оптическими методами.

В зональном электрофорезе раствор препарата наносят в виде пятна или полосы, и частицы мигрируют через растворитель. Растворитель обычно содержится в гомогенной инертной среде ( бумага, гель).

В непрерывном электрофорезе образец также наносят в виде зоны, но раствор наносится не однократно, а прибавляется постоянно по мере проведения электрофореза.

Наибольшее применение на практике нашли различные модификации зонального электрофореза с различными носителями: на бумаге, на ацетате целлюлозы, на геле. Два остальных типа электрофореза используются сравнительно редко. Рассмотрим более подробно один из методов зонального электрофореза – гель-электрофорез, нашедший наиболее широкое применение в исследовании макромолекул.

Лучшие результаты при электрофоретическом разделении белков и нуклеиновых кислот достигаются при использовании в качестве носителя гелей из крахмала, полиакриламида, агарозы и комбинированных гелей из этих веществ. Качественное разделение макромолекул при использовании этих носителей достигается тем, что эффект электрофоретического разделения дополняется разделяющим действием гель-проникающей хромотаграфии (эффект «молекулярного сита»). Первоначально для гель-электрофореза применяли крахмальный гель, однако, в настоящее время его заменили полиакриламидные и агарозные гели. Полиакриламид оказался наиболее эффективным носителем для электрофореза белков и небольших молекул РНК, например т-РНК. Это связано с тем, что в полиакриламидном геле можно контролировать эффект молекулярного сита ( размер пор в геле ) с помощью изменения концентрации геля. Для нуклеиновых кислот, размер молекул которых больше размеров пор полиакриламида, используются агарозные или агарозно-полиакриламидные гели. Полиакриламидный гель получается при сшивании акриламида с метилен-бис-акриламидом. Такой гель готовят непосредственно перед экспериментом в контейнере ( стеклянная трубка, пластина) для проведения электрофореза (Рис. 9). После окончания электрофоретического разделения, зоны распределения макромолекул в геле обнаруживают путем окрашивания специфическими красителями и или другими способами. Например, для обнаружения белков используются красители амид черный, бромфеноловый синий, Кумасси бриллиантовый голубой. Если разделяются биологически активные молекулы, положение молекулы можно идентифицировать по измерению активности, например, по измерению ферментативной активности. Локализацию нуклеиновых кислот в гелях определяют после обработки флоуресцентными красителями (например, бромид этидия) или по радиоактивности разделенных фрагментов.

Рис.. 9. Устройство для электрофореза на горизонтальных пластинах геля ( Фрайфельдер, с.229)

1. Пластина геля; 2. охлаждающая подложка; 3. отсек для буферного раствора; 4. бумажный электрод между гелем и буфером; 5. циркуляционный термостат с охлаждающей жидкостью; 6. электроды; 7. источник электрического тока

Электрофорез в полиакриламидном геле проводят или в колонках (трубках) с гелем или на пластинах с гелем. Рассмотрим один из вариантов этого метода, наиболее широко используемых для разделения белков .

ДСН-гель-электрофорез. Для определения молекулярной массы белков используют электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле. Этот метод предложили в 1969 году Клаус Вебер и Мери Осборн.

До проведения электрофореза белок обрабатывают 1 % раствором додецилсульфата натрия (ДСН) с 0,1 М β-меркаптоэтанолом при нейтральном рН. В таком растворе большинство многоцепочечных белков связываются с ДСН и диссоциируют, дисульфидные связи разрываются, вторичная структура белка исчезает.

Додецилсульфат натрия совершенно одинаково связывается с молекулами различных белков: 1,4 кг ДСН связывается с 1 кг белка. Каждая молекула ДСН несет один отрицательный заряд и, таким образом, общая плотность заряда примерно одинаковая для разных белков. Таким образом, поверхностная шуба из молекул ДСН устраняет зарядовые различия, существующие в нативных белках. После обработки ДСН, полипептидная цепь представляет вытянутый цилиндр с диаметром 1,8 нм. Длина таких стержней коррелирует с молекулярной массой белков: чем длиннее цилиндр, тем больше молекулярная масса (рис. 1, а). Обработанные таким образом белки имеют одну и ту же форму и одинаковое отношение заряд/масса. Электрофоретическая подвижность таких молекул будет зависеть только от молекулярной массы вследствие движения в молекулярном сите.

В качестве носителя при электрофорезе используют полиакриламидный гель в концентрации от 5 до 15 %. Экспериментально установлена линейная связь между электрофоретической подвижностью и логарифмом молекулярной массы:

где а и b – постоянные величины, зависящие от свойств полиакриламидного геля.

Определение молекулярной массы исследуемого белка проводят по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой в идентичных условиях проводится электрофорез маркерных белков с известной молекулярной массой и строится зависимость u = f (lgM) (рис. 1, б). По значению электрофоретической подвижности на калибровочной кривой с высокой точностью (до 5 %) находят молекулярную массу исследуемого белка.

Кроме измерения молекулярной массы, ДСН-гель- электрофорез позволяет определить и идентифицировать субъединичное строение сложных белков, имеющих четвертичную структуру.

Изоэлектрическое фокусирование белков.

Белковые молекулы являются амфолитами, т.е. содержат положительно и отрицательно заряженные группировки. Для таких молекул характерна зависимость их заряда от рН . При низких значениях рН отрицательные заряженные группировки молекулы нейтрализуются ионами Н + и в целом она имеет положительный заряд. При высоких значениях рН такие молекулы заряжены отрицательно, т.к. положительно заряженные группировки молекулы нейтрализуются ионами гидроксила. Для каждого амфолита существует такое значение рН, при котором заряд молекулы равен нулю. Это значение рН называется изоэлектрической точкой рI молекулы. При электрофорезе в градиенте рН молекулы белков будут двигаться до тех пор, пока не достигнут области геля, где рН геля будет равен значению рI молекулы. В этой точке заряд молекулы будет равен нулю, т.е. она станет незаряженной и перестанет двигаться. В случае разгонки смеси белков, каждый белок остановится в той области градиента рН, которая соответствует значению изоэлектрической точки соответствующей молекулы (рис 11). Такой метод разделения белков в градиенте рН, основанный на различиях значений изоэлектрических точек, называется изоэлектрическим фокусированием. Для создания стабильного градиента рН в состав геля добавляют синтетические низкомолекулярные полиамфолиты (многозарядные молекулы с м.м. 300-600). Полиамфолиты представляют собой смесь полимеров алифатических амино- и карбоновых кислот, например, амфолины фирмы LKB. Меняя соотношение различных амфолитов, можно приготовить гель с соответствующим, для определенных белковых молекул, интервалом градиента рН. При приложении на гель электрического поля начинается движение полиамфолитов и через определенное время устанавливается градиент рН

Изоэлектрическое фокусирование по сравнению с электрофорезом характеризуется более высокой разрешающей способностью разделения и возможностью концентрации разделяемых фракций. В последние годы появились методы, комбинирующие оба способа разделения белковых молекул. На гелевых пластинах в одном направлении проводят разделение электрофорезом, в другом, перпендикулярном направлении – изоэлектрическим фокусированием. За счет такого двумерного разделения, разрешающая способность метода резко возрастает, что делает возможным разделение компонентов, которое нельзя осуществить другими методами.

Рис. 11. Принцип электрофоретического разделения заряженных молекул в градиенте рН ( метод изоэлектрического фокусирования ) . (Фрайфельдер,240с)

Дата добавления: 2014-01-11 ; Просмотров: 1452 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

21. Электрофорез. Наиболее существенные открытия в развитии методов электрофореза. Теория электрофореза. Скорость и электрофоретическая подвижность. Типы электрофореза.

э-форез — движение заряженых частиц в растворителе под действием электромагнитного поля.

разделение молекул по массе, заряду, конфигурации

определение молекулярной массы, с использованием шкалы

выявление изменений в составе белков и нк

молекула, имеющая заряженные частицы, способна двигаться в электромагнитном поле.

белки бывают + или -, зависти от рН и изоэлектрической точки белка; нк всегда —

белки с разной изоэлектрической точкой в одинаковой рН будут двигаться с разной скоростью. метод позволяет разделять вва, различающиеся в рН до 0,02 ед

вокруг частицы в поле образуется двойной электрический слой, из за силы трения. (как бы диполь. +частица и -шлейф). у незаряженой частицы такого нет.

1. скорость частицы в заряженом поле напряженностью Е

2. электрофоретическая подвижность μ (скорость движения частицы при напряжении поля в 1В/см)

(см2*см(-1)* В(-1))

при постоянной вязкости среды и постоянном напряжении подвижность ионов пропорциональна отношению заряда к радиусу частицы

— параметры поля (напряжение, сила тока, сопротивление)

— характеристики буфера (рН, ионная состояние, температура)

— характеристики поддержания среды (структура и физхим свойства, адсорбция, электроосмос?)

1) по агрегатному состоянию среды: фронтальный (ж), зональный (на тв носителе)

2) по способу нанесения образца: с подвижной границей (в свободной среде?), зональный (на носителе), в свободном потоке (непрерывный)

3) по принципу фракционирования:

— по вел. заряда в постоянной рН

— изоэлектрофокусирование (по изоэлектрической точке)

— изотахофорез (по электрофоретической подвижности)

— э-форез на носителе (по мол. массе)

22. Фронтальный и зональный электрофорез: сравнительные особенности.

источник