dsGreen, аналог SYBR ® Green I, это флуоресцентный краситель, который специфически связывается с двухцепочечной ДНК. Существует три варианта протокола окрашивания: окрашивание путем инкубирования геля в растворе красителя, добавление красителя в гель и добавление красителя к образцу.
Примечание: Во всех нижеприведенных протоколах окрашивания dsGreen может быть заменен SYBR Green I в такой же концентрации.
Это классический метод окрашивания ДНК в агарозных и полиакриламидных гелях (ПААГ)
- Проведите электрофорез образца(ов) в агарозном или полиакриламидном геле.
- В химическом стакане смешайте 10 мкл раствора 10 000 × dsGreen в ДМСО и 100 мл 1 × TE, TBE или TAE буфера (для мини-гелей) или 50 мкл раствора 10 000 × dsGreen в ДМСО и 500 мл 1 × TE, TBE или TAE буфера (для гелей среднего размера). Тщательно перемешайте раствор шпателем, стеклянной палочкой или магнитной мешалкой.
- Перелейте разбавленный раствор dsGreen в подходящий лоток или сосуд и поместите туда гель.
- Инкубируйте гель в растворе красителя в течение 5-10 мин при перемешивании.
- Просмотрите или cфотографируйте гель, используя подходящий источник света и зеленый/желтый фильтр. Для визуализации гелей, окрашенных dsGreen, можно использовать трансиллюминаторы с синим светом или с УФ ртутной лампой низкого давления с длиной волны 254 нм. Также можно использовать ртутную лампу высокого давления с длиной волны 365 нм, но этот источник света дает несколько менее эффективное возбуждение.
Этот метод подходит только для агарозных гелей, но не для ПААГ.
Примечание: Этот метод окрашивания может иногда приводить к деформации полос ДНК или их диффузии в геле. В этом случае используйте метод инкубирования геля в растворе красителя.
- Нагрейте до кипения агарозу в буфере TAE или TBE и дождитесь полного растворения. Для нагрева можно использовать микроволновую печь или другое нагревательное устройство.
- Пока раствор не превратился в гель, добавьте 1 мкл реагента 10 000 × dsGreen в ДМСО на каждые 10 мл раствора геля. Тщательно перемешайте.
- Залейте получившуюся смесь в форму для геля и дождитесь затвердевания.
- Для достижения наилучших результатов добавьте 1 мкл раствора 10 000 × dsGreen в ДМСО на каждые 10 мл буфера вблизи анода («+», красный провод).
- Проведите электрофорез образцов. Возможно наблюдение за мигрирующими полосами ДНК в режиме реального времени под ртутной лампой низкого давления с длиной волны 254 нм.
- Просмотрите или cфотографируйте гель, используя подходящий источник света и зеленый/желтый фильтр. Для визуализации гелей, окрашенных dsGreen, можно использовать трансиллюминаторы с синим светом или с УФ ртутной лампой низкого давления с длиной волны 254 нм. Также можно использовать ртутную лампу высокого давления с длиной волны 365 нм, но этот источник света дает несколько менее эффективное возбуждение.
Это наименее чувствительный, но самый экономичный метод.
- Смешайте 25 мкл ДМСО и 1 мкл раствора 10 000 × dsGreen в ДМСО.
- Добавьте 1 мкл полученного раствора к каждому образцу, который должен быть разделен на агарозном или полиакриламидном геле, перемешайте.
- Проведите электрофорез образцов. Возможно наблюдение за мигрирующими полосами ДНК в режиме реального времени под ртутной лампой низкого давления с длиной волны 254 нм.
- Просмотрите или cфотографируйте гель, используя подходящий источник света и зеленый/желтый фильтр. Для визуализации гелей, окрашенных dsGreen, можно использовать трансиллюминаторы с синим светом или с УФ ртутной лампой низкого давления с длиной волны 254 нм. Также может использоваться ртутная лампа высокого давления с длиной волны 365 нм, но этот источник света дает несколько менее эффективное возбуждение.
источник
Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.
Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.
Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.
Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.
Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.
источник
Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК,таккак выделение, рестрикция,полимеразная цепная реакция(ПЦР),молекулярное клонирование, наиболее частоиспользуютэлектрофорез.
Электрофорез — метод разделения макромолекул (в том числе
молекул и фрагментов ДНК) в геле по размеру и заряду в постоянном электрическом поле. Существует два вида электрофореза: горизонтальный и вертикальный.
Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя ДНК, например бромида этидия.
На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов.
Концентрация агарозы в геле.Агарозный гель — пористая струк-
тура, причем увеличение концентрации агарозы в геле приводит к
уменьшению размеров его пор. Это позволяет при помощи геля с
разной концентрацией агарозы разделять линейные молекулы
ДНКв широком диапазоне их размеров, вплоть до 60 тыс. пар
нуклеотидов (п. н.).
Существует зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК
от концентрации агарозы в геле;
Концен- 0,3 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,2 1,5 2,0
Длина 5-60 1-30 1-20 0,8-12 0,6-10 0,5-8 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2
Заряд молекулы.Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы
ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной
среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода (отрицательный электрод) к аноду (положительный электрод). Электрофоретическая подвижность молекулы ДНК существенно снижается с увеличением ее длины.
Напряженность электрического поля.На скорость движения заряженных молекул ДНК в геле влияет напряженность электрического поля, определяемая напряжением постоянного электрического поля, подаваемого на электроды. Данные, приведенные на
рисунке 1, свидетельствуют о наличии обратно пропорциональной зависимости между длиной пробега ДНК в геле и напряженностью электрического поля. Число полученных электрофореграмм различно, поэтому разделение фрагментов ДНК для
аналитических целей (только с целью детекции ДНК) с максимальным разрешением рекомендуют проводить при напряжении 10—15 В/см, а для препаративных (если ДНК будет в дальнейшем выделена из геля и использована, например, для клони-
рования) — при
Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с
одинаковой скоростью. Однако подвижность суперспирализованных и кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера. Таким образом, методом элект-рофореза можно фракционировать три формы молекул ДНК бактерий:
• суперспирализованную (нативная молекула, стабилизированная белками);
•линейную (расщепленная рестриктазой кольцевая молекула).
Разделение трех типов молекул ДНК в одном геле выглядит следующим образом (по подвижности от катода к аноду):
Кольцевая молекула ДНК
Линейная молекула ДНК
Суперспирализованная молекула ДНК
При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в одну из лунок геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с
известными значениями молекулярных масс).
Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза.
Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания
электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 ч, гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254—400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм), при этом
становится видна ДНК.
Внимание! Используемый в качестве красителя бромид этидия является мутагенным веществом. При работе с ним необходимо использовать резиновые или латексные перчатки.
Методы вертикального и горизонтального электрофореза
принципиально сходны, однако в последнем случае вместо агарозного используют полиакриламидный гель (ПААГ) и процесс электрофореза проходит вертикально. Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью.
Кроме того,акриламид является токсичным веществом. Приготовить ПААГ
значительно сложнее, чем агарозный гель. В связи с этим в работе
с ДНК преимущественно используют метод горизонтального
электрофореза в агарозном геле.
Цель работы. Ознакомиться с методом горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле.
Оборудование и материалы.1. Прибор для горизонтального электрофореза.
2. Источник постоянного тока. 3. Электрическая плитка или СВЧ-печь. 4. Гельдокументирующая видеосистема. 5. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 6. Колба мерная вместимостью 1 л. 7. Колба коническая
вместимостью 0,5 л. 8. Цилиндр мерный вместимостью 250 мл. 9. Кристаллизатор.
10. Набор реагентов для электрофореза (например, производимый ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ»)включает: смесь для приготовления электродного буфера;
навеску агарозы; раствор бромида этидия; раствор краски-лидера (бромфеноловый синий). 11. Проба исследуемой плазмидной ДНК. 12. ДНК-маркер молекулярных масс. 13. Перчатки резиновые или латексные неопудренные. 14. Теплоизолирующая рукавица. 15. Вода дистиллированная.
Ходработы.Приготовлениерабочегобуферногораствора для электрофореза. Содержимое пакета «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мерную колбу, раство-ряют в 600—800 мл дистиллированной воды (для более быстрого
растворения следует подогреть раствор до 40—45 «С при постоян-
ном помешивании) и доводят объем полученного раствора до 1 л
дистиллированной водой.
Подготовка прибора для электрофореза к работе. Пользуясь встроенными уровнями и винтовыми ножками,
прибор устанавливают строго горизонтально. В рабочую камеру
наливают буфер для электрофореза. Для формирования гелевой
пластины собирают кювету, в нее помещают аппликатор (гребенку) для формирования лунок в толще геля (рис. 2). Регулируемую
высоту аппликатора выставляют таким образом, чтобы расстояние
от дна кюветы до каждого из зубцов составляло 1—2 мм. В зависимости от числа анализируемых проб одновременно можно установить одну, две или три гребенки.
Приготовление агарозного геля. Навеску агарозы,
необходимую для приготовления 1%-ного геля, полностью переносят в коническую стеклянную колбу вместимостью 250—500 мл,
добавляют 150 мл рабочего раствора буфера для электрофореза и
перемешивают. Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в
СВЧ-печи или на электроплитке, периодически помешивая (колбу
держать, только надев на руку теплоизолирующую рукавицу). Продолжают нагревание до тех пор, пока содержимое колбы не станет
совершенно прозрачным (обычно еще 1 мин). Расплав охлаждают
до 55—60 °С, добавляют 10 мкл раствора бромида этидия, перемешивают (работу проводят в латексных или резиновых перчатках) и
наливают на столик для заливки геля (см. описание к прибору для
электрофореза), не допуская образования воздушных пузырьков,
так, чтобы толщина слоя была не менее 5 мм, а зубцы гребенок
были погружены в гель не менее чем на 4 мм. Гель полностью застывает через 15—20 мин. Столик с готовым агарозным гелем и гре-
бенками переносят в камеру для электрофореза, в которую нали-
вают рабочий раствор буфера для электрофореза так, чтобы по-
крыть гелевую пластину слоем в 2—3 мм. Извлекают гребенки из
агарозного геля легким и плавным движением вверх, стараясь не
повредить образовавшиеся лунки.
Проведение электрофореза. В лунки застывшего агарозного геля осторожно вносят по 3 мкл раствора исследуемых образцов ДНК. В соседнюю лунку геля вносят 3 мкл маркера молекулярных масс фрагментов ДНК. В одну или
две (по краям пластины геля) свободные лунки вносят 2—3 мкл
краски-лидера. Закрывают крышку прибора для электрофореза и
подключают его к источнику постоянного тока, строго соблюдая
полярность электродов и учитывая, что движение фрагментов
ДНК происходит в направлении от катода к аноду (от «минуса» к
«плюсу»). На вольтметре источника постоянного тока устанавли-
вают напряжение 120—150 В. В таком режиме процесс электрофо-
реза продолжают около 30 мин, ориентируясь на фронт пробега
краски-лидера (приблизительно на 3 см). По окончании электро-
фореза источник напряжения отключают, снимают крышку при-
бора, пластину агарозного геля осторожно переносят на свето-
фильтр (просмотровый столик) УФ-трансиллюминатора для де-
текции Включают трансиллюми-
натор. Зоны ДНК, окрашенные бромидом этидия, светятся при
УФ-облучении.
Внимание! Во избежание повреждения сетчатки глаз ультрафиолетовым излучением наблюдать зоны ДНК следует только через за-щитное стекло из комплекта трансиллюминатора или защитные (стеклянные) очки. Полученные результаты регистрируют визуально или с использованием гель-документирующей видеосистемы,пользуясь инструкцией к ней.
Контрольные вопросы.1. Какой принцип лежит в основе метода электрофоре-
за? 2. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2,5%-ного геля?
3. Какой концентрации агарозный гель нужно использовать для разделения мето-
дом электрофореза фрагментов ДНК размером 350 и 150 п.н.? 4. В каком направ-
лении и почему движутся молекулы ДНК при проведении электрофореза? 5. От
каких факторов зависит скорость движения молекул ДНК в агарозном геле в про-
цессе электрофореза? 6. Почему нужно избегать образования в геле пузырьков
воздуха? 7. За счет чего происходит визуализация ДНК в геле? 8. Каким образом
можно контролировать движение молекул ДНК в геле во время электрофореза?
9. На каких этапах проведения электрофореза необходимо работать в перчатках и
почему?
Задания.1. Поместить схему или фотографию электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Определить и подписать размеры фрагментов ДНК-маркера (согласно описанию к нему). 3. По электрофореграмме определить электрофоретическую подвижность и рассчитать примерную молекулярную массу исследуемой плазмидной ДНК, используя маркеры молекулярных масс. 4. Определить, какой из ДНК нижеперечисленных плазмид соответствует исследуемая ДНК, если ДНК плазмиды РСЕМ-2Гимеет размер 3000 п.н.ДНК плазмиды рВК322 — 4361,а ДНК плазмидыр РСУ002—8560 п.н.
источник
Уважаемые форумчане, всех с текущими праздниками и удачи в будущем году.
Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле.
В этом году на работе возникла необходимость продумать и реализовать серию лабораторных-демонстрационных работ для студентов. Работы должны быть посвящены наиболее фундаментальным методам молекулярной биологии. Общий план такой: выделение ДНК, электрофорез (днк и белки), ПЦР (если поднакопим то возможно и реал тайм пцр), и, конечно, клонирование каких-нибудь «интересных» генов в бактерии: для наблюдения какого-нибудь люминофорного свойства в фенотипе. Потом, возможное, добавим ещё какие-нибудь блоты.
В связи с этим прошу поделится рекомендациями и мыслями по поводу одной из работ:
методики проведения демонстрационной лабораторной работы электрофореза ДНК (необходима бюджетная, но надежная и проверенная технология).
А именно, прошу рекомендаций в выборе:
1. оборудование и измерительные приборы.
-Мы уже приобрели «SE-1» с заливочной камерой и, наверное, возьмём источник питания рекомендованный в инструкции: «Эльф. НПФ ДНК-технология».
-Что бы вы посоветовали в качестве транс-иллюминатора (+защитные очки): тут конечно определенную роль играет тип красителя, но хотелось бы более менее универсальный прибор с возможностью адаптации к другим методикам проведения работ. В качестве фиксирования данных нам хватит пока чего-нибудь элементарного: фото+зарисовка.
-Автоматические дозаторы: биолот? По вашему мнению, хватит ли двух дозаторов с переменным объемом: на 1 мм и 100 мкл ?
2. реактивы (включая буферы, красители для внесения проб и проявления ДНК и т.д.)
Красители ДНК — альтернатива бромистому этидию — мутагену — имеется ли — или это единственный удобный метод прокраски?
Маркеры и исследуемые образцы: какие бы вы рекомендовали приобрести: как маркеры и «стандарты» для приготовления исследуемых смесей ДНК. (В будущем возможно — изучение влияние на электрофорез спирализаций-конформаций молекул, действие ферментов изменяющих их конформацию и т.д. — но это уже не в рамках данной работы).
условия хранения
-для длительного хранения
-«живущие» некоторое время при комнатной температуре
-готовящиеся непосредственно перед экспериментом
утилизация использованных реактивов или возможность их повторного использования (например, буфер для электрофореза) (в методиках данным вопросам уделяется не очень много внимания)
3. Сами методики проведения лабораторной-демонстрационной работы:
Какие-либо мелочи или проверенные приемы, которые могут быть упущены, но делают жизнь проще)).
Например когда и как лучше добавлять краситель нуклеиновых кислот: в некоторых методиках рекомендуют это делать и в гель и в буфер, некоторые рекомендуют выдерживать гель после электрофореза в буфере с красителям: что позволяет избежать некоторых негативных эффектов действия красителя на процесс электрофореза.
Если, допустим, мы хотим наблюдать электрофорез (реал-тайм): разумеется необходимо добавить краситель везде до запуска электрофореза — однако, при этом как бы вы рекомендовали производить освещение камеры: (возможно ли в этом случае использовать тот же транс-иллюминатор: поставить всю камеру по-просту говоря для электрофореза на него?)
PS Касаемо методик «учебных» работ по молекулярной биологии-генетики Вы бы какого автора советовали почитать? (можно и на английском). Маниатис и подобные книги — конечно классика — но они годятся только для «профессиональных» лабораторий с нормальным бюджетом.
За интернет ресурс-журнал тоже был бы признателен.
PSS Кстати я возможно не нашел: есть ли на сайте раздел посвященный именно таким бюджетным демонстрационным-лабораторным работам для студентов.
PSSS + производители и фирмы поставщики у которых вы бы рекомендовали приобретать оборудование/реактивы (в перспективы, с возможностью заключения долгосрочных договоров).
Сообщение было отредактировано rambler87 — 07.01.2015 23:26
| metrim Постоянный участник Москва А не рановато ли вы при столь глубоком знании вопроса решились обучать других? ЗЫ пишется PPS, PPPS etc.
|
| MMM Постоянный участник Для скубентов дозаторы ленпипет! Если вы собрались капать ПЦР , то настоятельно рекомендуется пипетка на 10 мкл со спец наконечником(не на 200мкл, а на 10). А так я и в лабе рекомендую набор из трех пипеток 2-20, 20-200, 100-1000. На самом деле для практикума понадобится не менее двух наборов. Транслюм. НУ, тульские транслюмы за 15 тыр почили в бозе, поэтому придется выложить суровую сумму за транслюм импортный от 800 до 2000 уе. Брать настоятельно рекомендую УФ- транслюм на 310нм. Можо конечно поискать советский хемископ для ТСХ на просторах родины или вместо транслюма купить маленькую лампу для свечения сверху, но фотографировать гели с таким прибором гораздо труднее, чем с транслюмом. Всякие голубые транслюмы для сибирской зелени не рекомендую. Потаму что сама лампа там ничего не стоит и можно собрать самому, но без фильтра на ней ничего не видно фильтр же получается дорогим и вся затея с дешевизной обламывается, так же если из геля что-то вырезать, то нужны очки с фильтром либо специальный фильтр на подставке в общем деньги на круг получатся те же, а возможности видеть этидий никакой. УФ же позволяет пользоваться любым красителем. Этидий можно добавлять и в гель, и в буфер, и красить после фореза, в пробы его добавлять бесполезно. Сибирский добавляют только в пробы иначе не напасешси. Согласен с предыдущими ораторами, что уровень ваших вопросов, говорит о том, что вам самому не мешало бы подучится, прежде чем учить других. У меня в Питере как раз в открывающемся после сессии семестре будет коротенький курс, а в июле 10 дневный практикум. Милости просим, если есть возможность где-то жить или если вы питерский.
|
| genseq Постоянный участник Кажется, голубые трансиллюминаторы появились у Силекса. У них же видел краску для фореза под синий свет. Но их сайт на праздники закрылся: Сообщение было отредактировано genseq — 08.01.2015 18:21
|
| genseq Постоянный участник Чуть не забыл . Для SE-1 можно использовать готовые гели ООО «ИзоГель». Маркёры на любой вкус можно приобрести в ООО «ИзоГен». ДНК фага лямбда и рестриктазы для развлечения школьников и студентов поставляет ООО «СибЭнзим». |
| Qzak Постоянный участник Для зеленых красителей мы опробовали прибор от IORodeo
|
| rambler87 Участник Спасибо за рекомендации. Кстати. Касаемо литературы: от теории до практики — вы бы кого порекомендовали? |
| rambler87 Участник Вы как заказ оформляли: и красители и оборудование можно заказывать? |
| MMM Постоянный участник Спасибо за рекомендации. Кстати. Касаемо литературы: от теории до практики — вы бы кого порекомендовали? Литература: да все тот же маниатис лучше английский трехтомник. Считается, что сибирская зелень чувствительней( как утверждает производитель раз в 50-100, но пользователи говорят 5-10 не более). Вторая польза-ДНК меньше повреждается при облучении, но только при использовании голубого, а не УФ- транслюма. По цене раз в 100(если не больше) дороже правда расход более экономный, опять же если его разводить в 10000 раз впробу получается фигня разводить приходится раз в 5 меньше. |
| MMM Постоянный участник А, да, биокраска транслюмами не торгует, только химия, хотя китайский синий фонарик продавали, только к нему очки нужны и фотки с него не сделаешь. Сообщение было отредактировано MMM — 08.01.2015 22:53 |
| rambler87 Участник MMM, Скажите. А когда, где и как, а также что требуется для записи в вашу школу-лабораторию по молекулярной биологии-генетике? + если у вас есть сайт |
| rambler87 Участник Кстати, касаемо литературы: Сообщение было отредактировано rambler87 — 09.01.2015 15:09 |
| rambler87 Участник И еще вопрос выбора «удобных» размеров фрагментов ДНК: Сообщение было отредактировано rambler87 — 09.01.2015 15:20 |
| MMM Постоянный участник Когда я уже сказал: лекции в грядущем семестре, раз в неделю 2 ак.часа примерно 10-11 лекций. —И еще вопрос выбора «удобных» размеров фрагментов ДНК: Обычный агарозный форез позволяет разделять от 50 до 20000 нп стандартно чаще всего используемая процентность 0.8-1% это для относительно больших размеров (килобазный маркер) и 1,5-2% агароза для мелких фрагментов (стобазный маркер). Что обычно соответствует плазмидной и ПЦР-ной ДНК. —Насколько критичен выбор концентрации (количества) днк или объем пробы для внесения её в буфер если вам необходимо только получить четкую картину электрофореза: без каких-либо последующих полуколичественных методов оценки днк или количественного выхода днк. Ну в общем не критичен но класть совсем мало не стоит. Чтоб с запасом не менее 100нг на пробу Если в пробе одна зона можно и поменьше 50нг. |
| R.J.Dio Постоянный участник . наблюдения какого-нибудь люминофорного свойства в фенотипе. Сообщение было отредактировано avor — 11.01.2015 13:18
|
| avor moderator В этом топике это не реклама, на мой взгляд. А вот треп по поводу «кто кого хуже» удалил Х34 делаю предупреждение за не соответствие теме и наезды. Наезды делайте в офисе компании или по телефону в общении с ее манагерами — здесь им не место. Тем более им не место в топике про МБ практикум. Могли например написать в личку, хотя бы. А вам R.J.Dio даю совет или замечание. Не следует так заводится по поводу genseq’a. Если бы вы дали просто свое сообщение без коментариев относительно предыдущих сообщений было бы гораздо спокойней всем.
|
| rambler87 Участник ещё такой практический вопрос: А также, какие методы полезной утилизации и рециклизации (буферов) вы использовали бы? |
| MMM Постоянный участник —какие из буферов (концентратов) + гель агарозный: вообщем какие вещества могут быть подготовлены загодя и спокойно хранится при комнатной температуре или в холодильнике на +5. Все! 50х ТАЕ и 10хТВЕ никаких проблем — хранится месяцами на комнате и годами в холодильнике. —А также, какие методы полезной утилизации и рециклизации (буферов) вы использовали бы? Вы смеетесь! Педальное ведро — вот их утилизаия.
|
| rambler87 Участник но а красители, которые маркируются как потенциально возможные мутагены? — проводить ли их предворительное обезвреживание — химическое разрушение какое-либо? Ещё такой вопрос, касаемо красок: Касаемо трансиллюминатора и контроля протекания электрофореза: во время фореза вы обычно контролируете время прекращения электрофореза — периодической остановкой и освещением УФ (или чем-там — лампочкой уф какой-нибудь) или судите исключительно по динамике движения красителя добавленного в буфере для внесения? Спасибо. |
| MMM Постоянный участник —но а красители, которые маркируются как потенциально возможные мутагены? — проводить ли их предворительное обезвреживание — химическое разрушение какое-либо? Вы ищете геморроя? Их есть у меня — так как они мигрируют к положительно заряженному электроду (в отличае от бромистого этидия)? Не, они, по моему, лучше связываются с ДНК. —что иногда даже рекомендует красить гель после электрофореза — что по идеи должно уменьшить время нашего с ним контактом, а кроме того испарения и т.д. и т.п. Красьте после, все будет даже лучше краситься. Я не имею желание комментировать все эти фобии по поводу этидия — или судите исключительно по динамике движения красителя добавленного в буфере для внесения? Да! В 99,5% случаев по красителю. |
| rambler87 Участник а каким красителям для заливки образцов вы бы рекомендовали пользоваться? В инструкциях-методиках mol biol приводится несколько. Сообщение было отредактировано rambler87 — 12.01.2015 00:17 |
| R.J.Dio Постоянный участник четкий модератор. Спасибо на сей раз. С новым годом |
| rambler87 Участник Чем меньше толщина слоя проводящего буфера над агарозовым слоем — тем лучше? Если заливать камеру только на уровне агарозного геля не выше? Выбор напряжение на электродах — чем меньше напряжение (и сила тока, соответственно): тем лучше разделение и четче картинка, хотя времени требуется значительно больше. Однако, существует какой-то предел когда дальнейшее уменьшение напряжения приводит только к ухудшению электрофореза по всем показателям? (отдельно, касаемо электродов: рекомендуется конечно какой-то инертный материал типа платины, однако в принципе возможна ли замена при достаточной удаленности электродов от геля? — серебро например или графит). Вертикальный электрофорез: его конструкция сложнее — поэтому он у производителей идет по более высокой цени (на 30 % где-то)? В чем и как объясняются его преимущества (помимо того, что большая, так-сказать, симметрия распределения температур, что выражается в более четком разделении днк: на что ещё влияет «вертикальность камеры»? При электрофоретическом разделении белков — дополнительным преимуществом тут является отсутствие контакта с воздухом и кислородом — при электрофорезе же ДНК этот момент играет какое-либо значение? Торговля: в Санкт-Петербурге есть ли магазин (физический — не интернет под заказ) реактивов-реагентов где можно было бы закупить вещества для пробного электрофореза в н розницу? (от компонентов буферных смесей, красителей днк и буферов и до очищенных фрагментов днк и маркерных смесей)? В пределах 10 000 — 15 000 руб на какой трансиллюминатор можно рассчитывать Сообщение было отредактировано rambler87 — 12.01.2015 12:51 |
| MMM Постоянный участник —а каким красителям для заливки образцов вы бы рекомендовали пользоваться? В инструкциях-методиках mol biol приводится несколько. Если вы жадный или бедный достаточно пользоваться БФС, он фактически бежит с фронтом даже в белковом форезе, он бежит впереди 5кДа белков(а это примерно 8нп или 15н олиг) далее стандартной добавкой является КЦ(ксилен цианол) Он примерно в середине геля по отношению к фронту и соответственно в зависимости от % агарозы там будет разной длины ДНК. Иногда это неудобно потому что на транслюме полоса КЦ затемняет весь УФ и если там зоны то он их сильно ослабляет. В 99,5 % случаев краситель нужен просто для оценки насколько глубоко прошел форез, больше он ни для чего не используется. — Гель может хранится уже с добавленным красителем? Любой гель с красителем или без. Может достаточно долго хранится в герметичной таре при 0-10 градусах. Если там краситель сохранность улучшается в таре с ограниченным доступом света.
|
| rambler87 Участник а для заливки в форму геля с красителем: нагрев в микроволновке не разрушит краску? + при какой мощности Вы бы рекомендовали это делать — или лучше пользоваться термостатами и банями? |
| rambler87 Участник Можно ли пользоваться какой-либо ручной ультрафиолетовой лампой (освещение с верху) — если хотим периодически контролировать течение электрофореза? |
| Pharmaсol Постоянный участник краска (если об этидиуме речь) при нагревании не разрушается
|
| Guest IP-штамп: frvGveEk9h7B. гость как сделаете свой первый электрофорез, сразу отпадут большинство вопросов
|
| MMM Постоянный участник Мы идем по кругу, я уже писал выше, что можно. Только весьма желательно снять крышку. —а для заливки в форму геля с красителем: нагрев в микроволновке не разрушит краску? —+ при какой мощности Вы бы рекомендовали это делать — или лучше пользоваться термостатами и банями? ООО! Это из серии как отпускать педаль сцепления. На любой мощности, при которой еще не происходит выброс материала из емкости. Да, мне приятнее всего делать так. Кипятим буфер в микроволновке. Заливаем горячий буфер в термостойкую стеклянную коническую колбу с заранее взвешенной сухой агарозой, аккуратно встряхиваем колбу и ставим на горячую электроплитку следим за кипением и встряхиваем колбу до образование гомогенного вязкого раствора. Охлаждаем до температуры 40-45 градусов(на ощупь) и капаем этидий из стокового раствора, встряхиваем до равномерного распределения этидия по раствору, заливаем гель. Из колбы с застывшим гелем делаем так: На раскочегаренную электроплитку ставим кастрюлю на дно заливаем немного водопроводной воды(тонким слоем). Набираем в электрочайник(китайский ) воду, примерно такое количество, что бы эта вода в кастрюле со стоящей в ней колбой, покрывала 60-90 процентов высоты геля в колбе. Кипятим воду в чайнике заливаем в кастрюлю(в это время тонкий слой залитой предварительно воды либо кипит, либо почти кипит) ставим колбу в кастрюлю, кочегарим плитку пока вода в кастрюле не закипит, потом ставим плитку на поддерживающую мощность, периодически достаем колбу из кастрюли и встряхиваем для перемешивания не расплавленных кусков геля. Когда гель распустился полностью извлекаем колбу из кастрюли даем остыть до все тех же 40-45 градусов, заливаем гель. Преимущества этого метода: Недостатки: Для микроволновки нужно использовать тару типа дюран(шотт), симакс с завинчивающейся синей полипропиленовй крышкой. При этом крышку закручивать плотно нельзя. Преимущество плавления в микроволновке одно — скорость. Гель можно плавить прямо на элекроплитке в термостойкой(стекло) таре, но здесь неприятности связаны с тем, что агароза пригорает, возможны и пробросы с выбросами, а так же, если оператор про нее забыл, она сильно упаривается(меняется концентрация), в этом случае не помогает и прикатанная фольга.
|
| rambler87 Участник Ясно, спасибо — очень помогают такие тонкости. |
| rambler87 Участник кстати: если необхдима стерильность: какие процедуры в случае электрофореза нуклеиновых кислот необходимо добавить: автоклавирование при 1 атм всех растворов и буферов? |
| MMM Постоянный участник -А вертикальный электрофорез нуклеиновых кислот Вы делали — результаты намного лучше — или зависит в большой степени от объекта исследований? Вертикальный форез обычно для коротких фрагментов. Он бывает разный денатурирующий обычно имеет хорошее разрешение в 1 нуклеотитд. Но это специфичная вещь с нестандартныой камерой и блоком питания. —кстати: если необхдима стерильность: какие процедуры в случае электрофореза нуклеиновых кислот необходимо добавить: автоклавирование при 1 атм всех растворов и буферов? Какая стерильность и для чего она необходима? |
| rambler87 Участник Касаемо стерильности: вот в этой методики нашел Сообщение было отредактировано rambler87 — 12.01.2015 20:02 |
| rambler87 Участник И еще раз, касаемо теории электрофоретических методов исследований в биологии (молекулярной биологии) вообще: от истории их открытия и внедрения в практику до современных типов методик и техник автоматизации: какой-нибудь автор есть на примете? (не Маниатис, который классик по методам в молекулярной биологии вообще, но исключительно по форезам). |
| vb Постоянный участник остермана уже советовали?
|
| rambler87 Участник Нет пока — спасибо — на какие работы его особенное внимание нужно обратить? |
| MMM Постоянный участник —И еще раз, касаемо теории электрофоретических методов исследований в биологии (молекулярной биологии) вообще: от истории их открытия и внедрения в практику до современных типов методик и техник автоматизации: какой-нибудь автор есть на примете? По ДНК агарозному форезу — нету такой книжки, потому что там нет ничего глубокого и исторического. Вся история и теория электрофореза изложена в книжках по белковому форезу. Но там 99% информации к ДНК отношения не имеет. |
| rambler87 Участник ясно — вообще это физхимия, коллоидная химия и т.д. и т.п. |
| genseq Постоянный участник http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=471970 |
| rambler87 Участник 2-3 mm, дать застыть» |
| R.J.Dio Постоянный участник столько вопросов, опасений, тонкостей и прочей ерунды- так вы никогда в практическую плоскость не перейдете. Будьте проще- и люди к вам потянутся. 90% написанного здесь справедливо в теории, а на практике не роляют |
| MMM Постоянный участник А в целом согласен. Многие вещи проще проверить руками, чем искать ответы в руководствах и учебниках. Очень многие вещи, которые при чтении книжек кажутся архиважными, в жизни не имеют такого значения.
|
| -Ъ- Постоянный участник Москва Я б сделал так: |
| -Ъ- Постоянный участник Москва МММ — это же настоящий Маниатис! |
| AVS Постоянный участник UK — Russia Данная рекомендация обеспечивает большую прочность гелиевой пластинки — по сравнению с методом, когда заливаем агарозным гелем одной концентрации (менее 0,3%)? Если мы используем такую подложку — она должны быть также приготовлена на основании используемого буфера + (если надо) красителя — или можно этот гель-фундамент сделать только на агарозе без добавления буферов и красителей? |
| MMM Постоянный участник Если вы хотите подготовить обезьяну-технишена так можно сделать. если вдумчивого исследователя категорически нельзя так делать. Так это было отмечено в первых же постах и даже предложено пройти курс обучения |
| MMM Постоянный участник Что бы пульс-форез не ставить. |
| -Ъ- Постоянный участник Москва MMM, Скажите. А когда, где и как, а также что требуется для записи в вашу школу-лабораторию по молекулярной биологии-генетике? + если у вас есть сайт Сообщение было отредактировано -Ъ- — 13.01.2015 16:36 |
| -Ъ- Постоянный участник Москва да, чтобы историю тоже заодно изучали. |
| rambler87 Участник что да то да) Всегда был очень знудным именно с точки зрения теоретических наук, теорий и формализаций-абстракций — быть практиком с таким характером конечно же сложновато-то))) И опять, вернемся к практике: поскольку цена на рекомендованные источники питания типа «эльф»ов выходит за грани всякой фантазии нашего бюджета — какой бы альтернативой (надежной и относительно «гибкой» в плане подстройки процесса) Вы бы воспользовались? источник Что такое клинические исследования и зачем они нужны? Это исследования, в которых принимают участие люди (добровольцы) и в ходе которых учёные выясняют, является ли новый препарат, способ лечения или медицинский прибор более эффективным и безопасным для здоровья человека, чем уже существующие. Главная цель клинического исследования — найти лучший способ профилактики, диагностики и лечения того или иного заболевания. Проводить клинические исследования необходимо, чтобы развивать медицину, повышать качество жизни людей и чтобы новое лечение стало доступным для каждого человека. У каждого исследования бывает четыре этапа (фазы): I фаза — исследователи впервые тестируют препарат или метод лечения с участием небольшой группы людей (20—80 человек). Цель этого этапа — узнать, насколько препарат или способ лечения безопасен, и выявить побочные эффекты. На этом этапе могут участвуют как здоровые люди, так и люди с подходящим заболеванием. Чтобы приступить к I фазе клинического исследования, учёные несколько лет проводили сотни других тестов, в том числе на безопасность, с участием лабораторных животных, чей обмен веществ максимально приближен к человеческому; II фаза — исследователи назначают препарат или метод лечения большей группе людей (100—300 человек), чтобы определить его эффективность и продолжать изучать безопасность. На этом этапе участвуют люди с подходящим заболеванием; III фаза — исследователи предоставляют препарат или метод лечения значительным группам людей (1000—3000 человек), чтобы подтвердить его эффективность, сравнить с золотым стандартом (или плацебо) и собрать дополнительную информацию, которая позволит его безопасно использовать. Иногда на этом этапе выявляют другие, редко возникающие побочные эффекты. Здесь также участвуют люди с подходящим заболеванием. Если III фаза проходит успешно, препарат регистрируют в Минздраве и врачи получают возможность назначать его; IV фаза — исследователи продолжают отслеживать информацию о безопасности, эффективности, побочных эффектах и оптимальном использовании препарата после того, как его зарегистрировали и он стал доступен всем пациентам. Считается, что наиболее точные результаты дает метод исследования, когда ни врач, ни участник не знают, какой препарат — новый или существующий — принимает пациент. Такое исследование называют «двойным слепым». Так делают, чтобы врачи интуитивно не влияли на распределение пациентов. Если о препарате не знает только участник, исследование называется «простым слепым». Чтобы провести клиническое исследование (особенно это касается «слепого» исследования), врачи могут использовать такой приём, как рандомизация — случайное распределение участников исследования по группам (новый препарат и существующий или плацебо). Такой метод необходим, что минимизировать субъективность при распределении пациентов. Поэтому обычно эту процедуру проводят с помощью специальной компьютерной программы.
Главные отличия клинических исследований от некоторых других научных методов: добровольность и безопасность. Люди самостоятельно (в отличие от кроликов) решают вопрос об участии. Каждый потенциальный участник узнаёт о процессе клинического исследования во всех подробностях из информационного листка — документа, который описывает задачи, методологию, процедуры и другие детали исследования. Более того, в любой момент можно отказаться от участия в исследовании, вне зависимости от причин. Обычно участники клинических исследований защищены лучше, чем обычные пациенты. Побочные эффекты могут проявиться и во время исследования, и во время стандартного лечения. Но в первом случае человек получает дополнительную страховку и, как правило, более качественные процедуры, чем в обычной практике. Клинические исследования — это далеко не первые тестирования нового препарата или метода лечения. Перед ними идёт этап серьёзных доклинических, лабораторных испытаний. Средства, которые успешно его прошли, то есть показали высокую эффективность и безопасность, идут дальше — на проверку к людям. Но и это не всё. Сначала компания должна пройти этическую экспертизу и получить разрешение Минздрава РФ на проведение клинических исследований. Комитет по этике — куда входят независимые эксперты — проверяет, соответствует ли протокол исследования этическим нормам, выясняет, достаточно ли защищены участники исследования, оценивает квалификацию врачей, которые будут его проводить. Во время самого исследования состояние здоровья пациентов тщательно контролируют врачи, и если оно ухудшится, человек прекратит своё участие, и ему окажут медицинскую помощь. Несмотря на важность исследований для развития медицины и поиска эффективных средств для лечения заболеваний, для врачей и организаторов состояние и безопасность пациентов — самое важное. Потому что проверить его эффективность и безопасность по-другому, увы, нельзя. Моделирование и исследования на животных не дают полную информацию: например, препарат может влиять на животное и человека по-разному. Все использующиеся научные методы, доклинические испытания и клинические исследования направлены на то, чтобы выявить самый эффективный и самый безопасный препарат или метод. И почти все лекарства, которыми люди пользуются, особенно в течение последних 20 лет, прошли точно такие же клинические исследования. Если человек страдает серьёзным, например, онкологическим, заболеванием, он может попасть в группу плацебо только если на момент исследования нет других, уже доказавших свою эффективность препаратов или методов лечения. При этом нет уверенности в том, что новый препарат окажется лучше и безопаснее плацебо. Согласно Хельсинской декларации, организаторы исследований должны предпринять максимум усилий, чтобы избежать использования плацебо. Несмотря на то что сравнение нового препарата с плацебо считается одним из самых действенных и самых быстрых способов доказать эффективность первого, учёные прибегают к плацебо только в двух случаях, когда: нет другого стандартного препарата или метода лечения с уже доказанной эффективностью; есть научно обоснованные причины применения плацебо. При этом здоровье человека в обеих ситуациях не должно подвергаться риску. И перед стартом клинического исследования каждого участника проинформируют об использовании плацебо. Обычно оплачивают участие в I фазе исследований — и только здоровым людям. Очевидно, что они не заинтересованы в новом препарате с точки зрения улучшения своего здоровья, поэтому деньги становятся для них неплохой мотивацией. Участие во II и III фазах клинического исследования не оплачивают — так делают, чтобы в этом случае деньги как раз не были мотивацией, чтобы человек смог трезво оценить всю возможную пользу и риски, связанные с участием в клиническом исследовании. Но иногда организаторы клинических исследований покрывают расходы на дорогу. Если вы решили принять участие в исследовании, обсудите это со своим лечащим врачом. Он может рассказать, как правильно выбрать исследование и на что обратить внимание, или даже подскажет конкретное исследование. Клинические исследования, одобренные на проведение, можно найти в реестре Минздрава РФ и на международном информационном ресурсе www.clinicaltrials.gov. Обращайте внимание на международные многоцентровые исследования — это исследования, в ходе которых препарат тестируют не только в России, но и в других странах. Они проводятся в соответствии с международными стандартами и единым для всех протоколом. После того как вы нашли подходящее клиническое исследование и связались с его организатором, прочитайте информационный листок и не стесняйтесь задавать вопросы. Например, вы можете спросить, какая цель у исследования, кто является спонсором исследования, какие лекарства или приборы будут задействованы, являются ли какие-либо процедуры болезненными, какие есть возможные риски и побочные эффекты, как это испытание повлияет на вашу повседневную жизнь, как долго будет длиться исследование, кто будет следить за вашим состоянием. По ходу общения вы поймёте, сможете ли довериться этим людям. Если остались вопросы — спрашивайте в комментариях. источник |