Меню Рубрики

Лидирующие красители в электрофорезе

Содержимое (Table of Contents)

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Электрофорез ОФС.1.2.1.0023.15

в полиакриламидном геле Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также в зависимости от конфигурации молекул. Изменяя концентрацию полимера, можно получать гели с широким диапазоном размеров пор, позволяющих проводить разделение белков и пептидов с молекулярными массами от 2 до 300 тыс. кДа. Можно также изменять электрический заряд макромолекул (путем вариации рН буферного раствора) и их конформацию за счет введения в буферный раствор денатурирующих агентов или детергентов.

Протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима с целью исключения изменений вязкости, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов.

Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними, причем скорость миграции наиболее подвижных макромолекул пробы должна быть несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда фронт красителя достигает противоположной границы геля, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и выдерживают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты фиксируются в том самом месте, где закончилась их миграция. После фиксации или одновременно с ней проводят окрашивание зон путем выдерживания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.

Вместо окрашивания или наряду с ним могут использоваться радиоактивные метки и приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.

Гель полиакриламида имеет ряд преимуществ, определяющих его широкое использование. Он прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей, и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос.

Разделяющие свойства полиакриламидных гелей (ПААГ) определяются трехмерной сетью волокон и пор, которая сформирована за счет бифункциональных бисакриламидных связей между смежными полиакриламидными цепями. Полимеризация катализируется системой, производящей свободные радикалы, составленной из аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина.

С увеличением концентрации акриламида в геле эффективный размер пор уменьшается. Эффективный размер пор геля определяет его разделяющие свойства, то есть сопротивление геля к перемещению макромолекул. Существуют пределы концентраций акриламида, которые могут использоваться. При высоких концентрациях акриламида гели становятся более ломкими и трудны в обращении. С уменьшением размера пор геля уменьшается скорость перемещения белка через гель. Регулируя размер пор геля путем изменения концентрации акриламида, можно оптимизировать разрешающую способность метода для конкретного анализируемого образца. Таким образом, физическое состояние ПААГ характеризуется по составу акриламида и бисакриламида. Обычно используются гели, в которых общая концентрация мономера и сшивающего агента находится в диапазоне от 3 до 30 %, а количество сшивающего агента обычно составляет от одной десятой до одной двадцатой от количества мономера. При этом содержание сшивающего агента тем меньше, чем выше общая концентрация геля.

Электрофорез в полиакриламидных гелях с использованием натрия додецилсульфата (SDS) – наиболее распространенный способ электрофореза, используемый для оценки подлинности и чистоты белковых продуктов. Денатурированные под воздействием высокой температуры полипептиды, связываясь с анионным детергентом SDS, становятся отрицательно заряженными и приобретают конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы независимо от типа белка. Поскольку количество связанного SDS почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от последовательности аминокислот в полипептиде, SDS-полипептидные комплексы мигрируют через полиакриламидные гели с подвижностью, прямо пропорциональной молекулярной массе полипептида.

Молекулярная масса белка может быть оценена по его относительной подвижности на прокалиброванном геле, и обнаружение отдельной полосы в таком геле является критерием чистоты.

Однако, наличие у полипептида радикалов типа N- или O-связанных гликозидов оказывает существенное влияние на оценку молекулярной массы белка, поскольку SDS не связывается с углеводной частью молекулы так же, как с полипептидной. Таким образом, пропорциональность отношения «заряд к массе» не выдерживается и электрофоретическая подвижность белков, подвергшихся посттрансляционным модификациям, не является истинным отражением молекулярной массы полипептидной цепи.

Трехмерная структура белков часто поддерживается за счет дисульфидных связей. Цель анализа SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить эту структуру путем расщепления дисульфидных связей. Денатурация и дезагрегация белков заключается в обработке их 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (DTT), в результате которой происходит разрыв S-S связей, разворачивание полипептидной цепи и последующее связывание с SDS. В этих условиях молекулярная масса полипептидных субъединиц может быть рассчитана методом линейной регрессии при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.

Без обработки восстанавливающими агентами типа 2-меркаптоэтанола или DTT дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Невосстановленные белки не могут полностью насыщаться SDS и, следовательно, не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Это делает определение молекулярных масс этих молекул методом SDS-ПААГ менее стандартизованным, чем исследование полностью денатурированных полипептидов. Однако, выявление одной полосы в таком геле (т.е. отсутствие любых компонентов, отличных от основного компонента) является показателем чистоты белка.

Электрофорез белков в полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом (SDS-PAGE), как правило, проводится в неоднородной буферной системе, которая описывается ниже.

Электрофорез в геле с неоднородной буферной системой (диск—электрофорез)

Метод диск-электрофореза, благодаря своей высокой разрешающей способности, рекомендуется для характеристики смесей белков и для обнаружения примесей, которые могут иметь подвижность, близкую к подвижности главного компонента.

Метод подразумевает использование прерывистой системы, состоящей из двух отличных гелей: разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего) геля. Эти два геля имеют различную пористость (верхний – крупнопористый, нижний – мелкопористый). Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. Пористость, длина и тип буфера для нижнего геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза.

Отличительной особенностью данного вида электрофореза является обязательное использование в составе электродного буферного раствора подвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки; например, применение иона Cl — для щелочных буферных растворов или иона K + – для кислых. В этом буферном растворе подвижность иона, мигрирующего в том же направлении, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для этого удобно использовать цвиттерионы: например, простые аминокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки лежат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97).

Под действием электрического поля ионы глицина, входящие в состав электродного буферного раствора, следуют за белками в концентрирующий гель. Область перемещающихся границ быстро формируется под действием высоко подвижных хлорид-ионов во фронте и относительно медленных замыкающих ионов глицина. Хлорид-ион из-за его небольшого размера мигрирует быстрее, чем любой из белков, присутствующих в образце. Величина рH образца и концентрирующих слоев выбирается так, чтобы быть приблизительно на 3 единицы ниже, чем верхнее значение pKa глицина. Поэтому, на пересечении этих слоев только около 0,1% глициновых молекул имеют отрицательный заряд. Таким образом, быстродвижущиеся хлорид-ионы постепенно замещаются ионами глицина, которые при рН 6,8 в концентрирующем геле нейтрализуются и перестают участвовать в проведении тока. Сопротивление верхней части концентрирующего геля резко возрастает, а вместе с ним возрастает и напряженность поля. Локализованные зоны высоковольтового градиента между передним и задним ионными фронтами вызывают относительно высокую скорость миграции белков в концентрирующем геле, которая не ограничивается благодаря крупнопористой структуре этого геля.

На границе концентрирующего и разделяющего гелей белки достигают высокоплотных слоев геля и замедляются из-за уменьшающегося размера пор разделяющего геля. Более высокое значение pH, с которым фронт электродного буферного раствора встречается в разделяющем геле, также заставляет глицинат мигрировать быстрее, и напряженность поля падает, что также снижает скорость движения белков. Таким образом, происходит концентрирование пробы и все компоненты образца, независимо от первоначальной высоты столбика пробы в лунке, входят в нижний гель практически одновременно в виде узкой зоны с высокой концентрацией белка.

В мелкопористом разделяющем геле начинается процесс медленной миграции белков и их фракционирования в зависимости от молекулярных масс, а то обстоятельство, что процесс разделения начинается с узкой исходной зоны, обеспечивает высокую разрешающую способность системы вцелом.

Прибор для электрофореза состоит из:

1) источника постоянного тока с регулируемым напряжением и со стабилизатором напряжения;

2) камеры для электрофореза, служащей для размещения пластинки или трубки геля и поддержания постоянных условий проведения анализа. Камера обычно имеет прямоугольную форму, изготовлена из стекла или твердой пластмассы с двумя изолированными буферными резервуарами (анодным и катодным), содержащими раствор электролита. В каждый резервуар погружен электрод (например, платиновый), подключенный к соответствующему полюсу источника тока. Должен поддерживаться одинаковый уровень электролитов в резервуарах, чтобы предотвратить поток жидкости и гидростатическое давление на гель. Камера для электрофореза оснащена крышкой, которая предотвращает испарение растворителей и обеспечивает равномерно насыщенную влагой атмосферу во время всего процесса. Предпочтительно использование предохранителя для отключения электропитания, когда крышка камеры снята. Если мощность тока, приложенного к электрофоретической пластинке, превышает 10 Вт, то рекомендуется применять охлаждение камеры.

3) устройства для заливки геля, представляющего собой стеклянную трубку, стеклянную пластину или пару прямоугольных пластин (ячейку), служащих для формирования поддерживающей среды, в которой непосредственно проводится процесс электрофоретического разделения. Пластины могут быть расположены в камере вертикально или горизонтально (вариант горизонтального электрофореза обычно применяется для агарозных гелей) и должны быть погружены или иметь контакт посредством фитилей с катодным и анодным изолированными буферными резервуарами, содержащими раствор электролита. Преимуществом пластин для проведения процесса является возможность сравнения образцов в одной общей ячейке геля, что более информативно по сравнению с набором гелей из ряда трубок. Преимущество горизонтальных пластин по сравнению с вертикальными заключается в отсутствии проблемы герметизации швов, а недостаток – в большой поверхности контакта с воздухом и, соответственно, риске испарения жидкости.

Сборку прибора и его очистку после использования проводят в соответствии с инструкцией производителя.

Перед заливкой геля основание и боковые стороны ячейки закрывают подходящими прокладками, толщина которых определяет толщину рабочего геля (при этом после полимеризации геля прокладку в основании убирают). Ячейку заполняют раствором мономера с поперечно-сшивающим агентом и катализатором. Растворы должны быть дегазированы перед полимеризацией и гели должны использоваться свежеприготовленными. Заливку растворов проводят таким образом, чтобы исключить попадание внутрь ячейки пузырьков воздуха.

Гребенку, имеющую зубцы соответствующего размера (в зависимости от объемов наносимого образца), устанавливают в верхнюю часть ячейки на разделяющий гель и оставляют там до окончания полимеризации геля. Формирование геля обычно занимает не менее 30 мин и может считаться законченным, когда между гелем и водным слоем появляется четкая граница. После удаления гребенки из геля, прошедшего полимеризацию, остается ряд лунок.

Заполняют нижний и верхний резервуары камеры предписанным электродным буферным раствором. Готовят испытуемый и стандартный растворы, содержащие краситель и сахарозу или другой плотный и вязкий растворитель. Наносят образцы шприцем или микропипеткой в основания лунок, сразу включают электрический ток и начинают электрофорез, соблюдая предписанные условия (температуру и величину напряжения).

После окончания процесса (когда краситель достигает нижней границы пластины) ток выключают, пластину удаляют из камеры, зоны фиксируют, окрашивают и при необходимости пластину высушивают.

Подготовка полиакриламидного геля для вертикального электрофореза с SDS в неоднородной буферной системе

Сначала готовят и заливают в подготовленную ячейку нижний разделяющий гель, а затем сверху наслаивают концентрирующий гель.

В конической колбе готовят рассчитанное в зависимости от объема ячейки количество раствора для разделяющего геля, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в Таблице 1. Смешивают компоненты в указанном порядке. В тех случаях, где требуется, перед добавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (TEMED) раствор фильтруют, и, если необходимо, дегазируют раствор через мембрану из ацетата целлюлозы (с диаметром пор
0,45 мкм) под вакуумом при перемешивании. Добавляют соответствующие количества раствора аммония персульфата и TEMED как указано в табл. 1, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки. Оставляют достаточное место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя суженную стеклянную пипетку, тщательно наслаивают на гель сверху воду или изобутанол. Оставляют гель в вертикальном положении при комнатной температуре до завершения полимеризации.

После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.

Читайте также:  Электрофорез с магния сульфат применение

В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл.2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.

Компоненты раствора Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема
5 мл 10 мл 15 мл 20 мл 25 мл 30 мл 40 мл 50 мл
1 2 3 4 5 6 7 8 9
4% акриламида
Вода очищенная 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,6
Раствор акриламида 1) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0
1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04 8% акриламида Вода очищенная 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2 Раствор акриламида 1) 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03 10% акриламида Вода очищенная 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8 Раствор акриламида 1) 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 12% акриламида Вода очищенная 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5 Раствор акриламида 1) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 14% акриламида Вода очищенная 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8 Раствор акриламида 1) 2,3 4,6 7,0 9,3 11,6 13,9 18,6 23,2 1,5 М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 15% акриламида Вода очищенная 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5 Раствор акриламида 1) 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02
Компоненты раствора Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема
1 мл 2 мл 3 мл 4 мл 5 мл 6 мл 8 мл 10 мл
Вода очищенная 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8
Раствор акриламида 1) 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7
1,0М Трис

(рН 6,8) 6)

0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1,25 100 г/л SDS 3 ) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1 100 г/л APS 4 ) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1 TEMED 5 ) 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01

1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1)

2) 1,5М Трис (рН 8,8): 1,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 8,8

3) 100 г/л SDS: раствор натрия додецилсульфата 100 г/л

4) 100 г/л APS: раствор аммония персульфата 100 г/л. Аммония персульфат является источником свободных радикалов, которые управляют полимеризацией акриламида и бисакриламида. Таким образом, раствор аммония персульфата должен добавляться медленно.

5) TEMED: тетраметилэтилендиамин.

6) 1,0М Трис (рН 6,8): 1 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 6,8

Гель со вставленной гребенкой оставляют в вертикальном положении при комнатной температуре до окончания полимеризации.

Если в фармакопейной статье нет других указаний, то определение молекулярных масс проводят при нагрузке на лунку 10 мкг общего белка, а определение чистоты – при нагрузке 40 мкг при окрашивании Кумасси бриллиантовым R250, а при окрашивании нитратом серебра достаточно 2–5 мкг белка на лунку.

Толщина гребенки выбирается точно в соответствии с толщиной используемых прокладок, а размер зубцов – в соответствии с предполагаемым объемом образцов. Необходимый и достаточный объем формируемой лунки определяется как произведение длины, ширины и высоты (в микрометрах) одного зубца гребенки: V = L ∙ D ∙ H.

Объем наносимого образца вычисляют следующим образом:

где: k – коэффициент разбавления пробы буферным раствором для образца;

Х – требуемое для нанесения на гель количество белка в зависимости от целей анализа, в мкг;

С – концентрация общего белка, определяемая по методу Лоури, в мкг/мл.

После окончания полимеризации аккуратно удаляют гребенку, немедленно ополаскивают лунку водой, чтобы удалить любые остатки неполимеризованного акриламида. Если необходимо, выправляют зубцы концентрирующего геля при помощи тупой подкожной иглы, насаженной на шприц.

Устанавливают гель в прибор для электрофореза согласно инструкциям изготовителя оборудования. Добавляют электродный буферный раствор в верхнюю и нижнюю буферные емкости. Обычно, если нет других указаний в фармакопейной статье, в качестве электродного буферного раствора используется трис-глициновый буферный раствор с рН 8,3-8,4.

Удаляют любые пузыри, которые могут появиться у основания геля между стеклянными пластинами. Не следует включать электрический ток до внесения образцов, так как это уничтожит неоднородность буферных систем.

Готовят испытуемый раствор и раствор сравнения в рекомендованном буферном растворе для образцов в соотношении, указанном в фармакопейной статье или нормативной документации.

Обычно для обеспечения полной денатурации образец в смеси с буферным раствором подвергают дополнительно температурной обработке, режим которой должен быть указан в фармакопейной статье или нормативной документации.

Наносят соответствующие объемы каждого из растворов в лунки концентрирующего геля. Начинают электрофорез, используя условия, рекомендуемые изготовителем оборудования.

Изготовители оборудования для SDS-ПААГ могут обеспечивать применение гелей различной площади и толщины. Соответственно продолжительность электрофореза и сила тока (или напряжение) могут быть изменены, как описано изготовителем прибора, чтобы достичь оптимального разделения, что проверяют по скорости перемещения фронта индикатора в разделяющем геле.

Когда индикатор достигает основания геля, электрофорез останавливают. Удаляют ячейку с гелем из прибора и отделяют стеклянные пластины. Удаляют прокладки, отрезают и удаляют концентрирующий гель и немедленно проводят процедуру окрашивания. Для того, чтобы можно было выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель рекомендуется обрезать не полностью, оставляя 2–3 мм.

Так называемые, «готовые к использованию» коммерческие гели и наборы реактивов к ним могут быть применены при условии, что они дают результаты, отвечающие валидационным критериям, приведенным ниже в разделе «Оценка пригодности системы».

Окрашивание Кумасси бриллиантовым R250 – наиболее распространенный метод окрашивания белков с пределом обнаружения порядка от 1 до 10 мкг белка в полосе. Окрашивание нитратом серебра – более чувствительный метод окрашивания белков в гелях, позволяющий выявлять до 1 нг белка.

Для селективного окрашивания гликозилированных белков или липопротеидов иногда применяют другие красители или их смеси, о чем должно быть сделано дополнительное указание в фармакопейной статье или нормативной документации.

Все процедуры окрашивания геля проводят, как правило, при комнатной температуре и при слабом перемешивании в любом удобном контейнере. При окрашивании геля следует использовать одноразовые перчатки, иначе на геле могут быть прокрашены отпечатки пальцев.

Погружают гель в большой избыток красящего раствора Кумасси раствора и выдерживают, по крайней мере, 1 ч. Поскольку кислотно-спиртовой состав окрашивающего раствора не позволяет полностью фиксировать белки на геле, это может приводить к потерям некоторых низкомолекулярных белков во время окрашивания и обесцвечивания тонких гелей. Полная фиксация возможна при выдерживании геля в 10 % растворе трихлоруксусной кислоты в течение 1 ч перед погружением в окрашивающий Кумасси раствор.

Для ускорения процедуры окрашивания допускается подогрев геля в окрашивающем растворе в микроволновой печи. Режим подогрева должен быть описан в фармакопейной статье или нормативной документации. Затем окрашивающий раствор удаляют и гель промывают водой.

Обесцвечивают гель избытком обесцвечивающего раствора. Заменяют порции обесцвечивающего раствора несколько раз до тех пор, пока окрашенные полосы белка не станут ясно различимы на прозрачном фоне. Чем более полно обесцвечен гель, тем меньшие количества белка могут быть обнаружены этим методом. Обесцвечивание может быть ускорено при добавлении в обесцвечивающий раствор нескольких граммов анионобменной смолы или маленького кусочка пористого материала.

После обесцвечивания гель промывают водой и либо высушивают, либо оставляют в воде для хранения при температуре от 2 до 8 °С.

Погружают гель в большой избыток фиксирующего раствора и выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий раствор сливают, добавляют новую порцию того же раствора и инкубируют, по крайней мере 1 ч или оставляют на ночь. Сливают фиксирующий раствор и промывают гель в большом избытке воды в течение 1 ч. После этого пропитывают гель в течение 15 мин в 1 % растворе глутарового альдегида. Промывают гель дважды по 15 мин большим количеством воды. Выдерживают гель в темноте в свежеприготовленном 2 % растворе серебра нитрата в течение 15 мин. Промывают гель три раза по 5 мин в большом количестве воды. Погружают гель приблизительно на 1 мин в проявляющий раствор, пока не будет достигнуто удовлетворительное окрашивание. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в треке с минимальным количеством препарата (например, 0,001 мкг). Останавливают развитие окраски погружением в стоп-раствор на 15 мин. Ополаскивают гель водой.

Целесообразно использовать готовые наборы реактивов для окрашивания гелей серебра нитратом.

В зависимости от используемого метода окрашивания подготовку геля к высушиванию проводят различными способами:

– при окраске Кумасси после процедуры обесцвечивания гель выдерживают в смеси 10,0 г глицерина и 92 мл воды очищенной не менее 2 ч (возможна инкубация «на ночь»);

– при окраске нитратом серебра гель после заключительной процедуры ополаскивания выдерживают в течение 5 мин в смеси 2,0 г глицерина и 98 мл воды очищенной.

Погружают два листа пористой целлюлозной пленки в воду и выдерживают в течение 5–10 мин. Растягивают один из листов на рамке для высушивания. Аккуратно помещают пропитанный в глицериновом растворе гель на натянутую целлюлозную пленку. Удаляют все случайно попавшие воздушные пузыри, и заливают вокруг граней геля несколько миллилитров воды. Помещают второй лист пленки сверху и снова удаляют все воздушные пузыри. Заканчивают сборку рамки для сушки геля и помещают ее в сушильный шкаф или оставляют при комнатной температуре до полного высыхания.

Молекулярные массы белков определяют по сравнению их подвижностей с подвижностью нескольких белков-маркеров известной молекулярной массы. Готовые смеси белков с точно известными молекулярными массами (маркеры) для калибрования гелей предлагаются производителями материалов и оборудования для электрофореза в различных диапазонах молекулярных масс. Концентрированные исходные растворы полипептидов известной молекулярной массы готовят в соответствующем буферном растворе для образцов и наносят на гель одновременно с образцом испытуемого белка.

Сразу после того, как электрофорез завершен, следует отметить положение полосы красителя бромфенолового синего, которая соответствует электрофоретическому ионному фронту. Это может быть сделано при помощи меток-надрезов в геле или путем прокола геля в зоне окрашенного фронта иглой, предварительно обмакнутой в черную тушь или другой подходящий контрастный краситель.

После окрашивания геля измеряют расстояния пробега для каждой полосы белка (маркеров и испытуемого образца) от вершины разделяющего геля. Вычисляют отношение расстояния пробега каждого белка к расстоянию пробега фронта красителя. Нормализованные расстояния пробега, вычисленные таким образом, называются относительными подвижностями белков (относительно фронта красителя) и обозначаются как Rf.

где: R – расстояние пробега белка;

RS – расстояние пробега красителя

Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс стандартов белка (Мr) от значения Rf. Неизвестные молекулярные массы могут быть оценены методом линейной регрессии или интерполяцией кривых зависимости logMr от Rf в том случае, если значения, полученные для испытуемых образцов, находятся в линейной части графика.

В тех случаях, когда в фармакопейной статье указан предел примесей, то перед анализом должен быть приготовлен раствор сравнения, соответствующий этому уровню примеси, путем разбавления испытуемого раствора. Например, в случае 5 % предела, раствор сравнения должен быть приготовлен разведением испытуемого раствора в соотношении 1:20. При этом примесь (полоса, отличная от главной полосы) на электрофореграмме с испытуемым препаратом не должны быть интенсивнее, чем полоса, полученная с раствором сравнения. При наличии нескольких полос примесей должно быть предусмотрено требованию к содержанию каждой из них и к содержанию суммы примесей.

Читайте также:  Электрофорез с карипазимом осложнения

Приемлемым условием определения примесей может считаться метод количественной нормализации с использованием денситометрического интегрирования. В этом случае предварительно должна быть показана линейность отклика прибора.

Результаты анализа считаются достоверными только в том случае, если:

  • белки маркера молекулярных масс распределены приблизительно на 80 % длины геля и охватывают весь требуемый диапазон разделения (например, диапазон молекулярных масс продукта и его димера или продукта и родственных примесей);
  • зависимость логарифма молекулярной массы белков-маркеров и Rf – линейна в необходимом диапазоне.

Дополнительные требования приемлемости результатов анализа должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.

1) Приготовление 30% раствора акриламида/бисакриламида. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 29,2 г акриламида и 0,8 г N,N’-метиленбисакриламида, растворяют в воде очищенной при перемешивании, доводят объем раствора водой до 100 мл и вновь перемешивают (при необходимости раствор фильтруют, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации). Раствор хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4–6 °С не более 1 мес.

2) Приготовление раствора натрия додецилсульфата. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде очищенной при аккуратном перемешивании, избегая вспенивания, доводят объем раствора до 100 мл и вновь перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре.

3) Приготовление раствора аммония персульфата. Растворяют 100,0 мг аммония персульфата в 1,0 мл воды очищенной. Раствор используют свежеприготовленным.

4) Приготовление 1,5М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 8,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 90,8 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 8,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.

5) Приготовление 1,0 М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 60,6 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 6,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.

6) Приготовление электродного буферного раствора (10×) (рН 8,3). В мерный стакан, вместимостью 1000 мл помещают 30,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 144,0 г глицина и 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Фильтруют и измеряют рН раствора, который должен быть 8,3 — 8,4. Доводить рН раствора кислотой или щелочью до необходимого значения не допускается.

Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.

Непосредственно перед анализом 1 часть приготовленного раствора смешивают с 9 частями воды очищенной.

7) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанавливающих условиях с 2-меркаптоэтанолом. В химическом стакане смешивают 4,7 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,4 мл 2-меркаптоэтанола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.

8) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанвливающих условиях с дитиотреитолом. В химическом стакане тщательно перемешивают 5,0 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,06 г 1,4-дитиотреитола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор используют свежеприготовленным.

9) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в невосстанвливающих условиях. В химическом стакане тщательно смешивают 5,1 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 3 мес.

10) Приготовление красящего раствора Кумасси. Раствор готовят по одному из способов приготовления (№ 1 или № 2):

Раствор № 1. Растворяют 0,3 г Кумасси бриллиантового R250 в смеси 100 мл спирта метилового или этилового и 100 мл воды очищенной. Перемешивают до полного растворения (в течение 1 ч). Добавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 250 мл и перемешивают. Хранят окрашивающий раствор в темной бутыли при комнатной температуре. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.

Раствор № 2. 1,0 г Кумасси ярко-голубого R-250 помещают в химический стакан, доводят до объема 250,0 мл этиловым спиртом, перемешивают не менее 3,5 часов до полного растворения красителя, добавляют 100,0 мл кислоты ледяной уксусной и доводят объем деионизованной водой до 1000,0 мл. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.

11) Приготовление обесцвечивающего раствора. К 400 мл спирта метилового или этилового добавляют 100 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора до 1000 мл и перемешивают.

12) Приготовление фиксирующего раствора. К 250 мл спирта метилового или этилового добавляют 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.

13) Приготовление 1 % раствора глутарового альдегида. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 4 мл 25 % глутарового альдегида или 2 мл 50 % глутарового альдегида, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают.

14) Приготовление раствора серебра нитрата. Смешивают 2,75 мл 25 % раствора аммиака и 40 мл 1 М раствора натрия гидроксида, прибавляют по каплям при постоянном перемешивании 8 мл 20 % раствора серебра нитрата, доводят объем раствора водой очищенной до 200 мл и перемешивают.

15) Приготовление 20 % раствора серебра нитрата. Растворяют в воде очищенной 2,0 г (точная навеска) серебра нитрата, доводят объем раствора водой до 10 мл и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

16) Приготовление проявляющего раствора. Смешивают 2,5 мл 2,0 % раствора лимонной кислоты и 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.

17) Приготовление стоп-раствора. К 50 мл воды прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 100 мл и перемешивают.

В случае использования других реактивов и растворов они должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.

источник

Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями.


    в плашку для электрофореза залить «подложку» — слой агарозы 1.5-2.0% толщиной

2-3 mm, дать застыть;

  • на этой подложке закрепить гребенку так, чтобы между зубцами и подложкой было расстояние 1-2mm;
  • залить 0.3% агарозу (лучше в холодной комнате);
  • гребенку удалять только под слоем буфера, иначе ячейки слипнутся.

    • ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля. Низкопроцентные гели особенно чувствительны к перегрузке по количеству DNA на дорожку.

    Разделение линейных молекул

    Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с различной концентрацией агарозы:

    % агарозы 0.3 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.2 1.5 2.0
    Размер DNA [kbp] 5-60 1-30 1-20 0.8-12 0.6-10 0.5-8 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2

    Меньший предел определяется (в основном) диффузией полосы в геле. Т.е. в гелях с низкой концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы не четкие.

    Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более длинные молекулы можно эффективно разделить.

    Разделение суперскрученных и кольцевых молекул

    К сожалению относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий фореза: % геля, скорость фореза (в частности, это означает, что нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул).

    Приведенная таблица дает некоторое представление о соотношении подвижностей при умеренной (

    6V/cm) скорости фореза (в скобках — при более быстром разгоне):

    Размер суперскруч. DNA [kbp] Размер линейной DNA [kbp] для различных % агарозного геля
    0.7% 1% 1.5% 2%
    2 1.2 1.3 1.3 (1.6) 1.5 (1.0)
    3 1.7 1.8 2 (2.4) 2.9 (1.8)
    4 2.2 2.3 2.7 (3.7) —
    5 2.7 2.9 3.5 (5.5) —
    6 3.2 3.5 5 (8.5) —
    7 3.9 4.2 8.5 (>12) —
    8 4.4 5.0 >12 —
    9 5.1 5.9 — —
    10 5.8 6.8 — —
    12 7 8.7 — —

    В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию EtBr.

    На 1% агарозном форезе ssDNA бежит чуть быстрее (

    10%), чем dsDNA того же размера. ssDNA окрашивается EtBr заметно слабее, чем ds (разница в

    4-5 раз). Tо есть, чтобы полосы имели одинаковую интенсивность окраски, требуется взять

    Чтобы разделить цепи, нужно либо непосредственно перед форезом прогреть

    1′ 100 o C, либо добавить к образцу NaOH до 0.1 М, 5-10′ (NT или 37 o C);

    При оценке напряженности поля для горизонтального фореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.

    На рисунке показана схема форезов, при разном напряжении. Форезы проводились разное время, так, чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля.

    Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для высококачественных или препаративных форезов:

    2V/cm(можно меньше для ON форезов). Для аналитических форезов приемлемое качество сохраняется до

    DNA особенно легко теряет EtBr при повышенной температуре (что обычно случается, если гонять форезы при высоком напряжении).

    EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.

    Количество DNA, которое можно наносить на дорожку

    Нижний предел определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то не стоит надеяться увидеть 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере

    0.005-0.02%) могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. По нашему опыту, элюция фрагмента в РEG вместе с любым из этих красителей не оказывает заметного влияния на меченье, лигирование и трансформацию.
    Cresol red (Na соль) — (стоковый раствор 50mM в H 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере

    0.1mM) совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV.
    OrangeG — (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере

    0.01-0.05%) наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV.

    Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле. Обычно приводимые в методиках

    0.025% для бромфенолового синего и ксиленцианола (в 1х буфере) по нашему мнению слишком большое количество.

    * буфера с различными красителями.
    * различные разведения буфера для внесения (10х, 2х, 1х). При этом образец любого объема собирается из двух компонентов (буфер+образец), а не из трех (буфер+ вода + образец).
    1x если объем образца 25-75%;
    10x ==> 75%

    Смотри также:
    /ссылки на сетевые ресурсы/

      Дополнения, комментарии, вопросы

      Для оптимального разделения не очень больших фрагментов, можно пользоваться буфером для внесения по рецепту, указанному в каталоге MBI Fermentas:

      6x Orange Loading Dye Solution (#R0631)
      0.2% orange G
      0.05% xylene cyanol FF
      60% glycerol
      60 mM EDTA

      При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. Такой подход позволяет оптимизировать рабочее напряжение, а, соответственно, и разделение.

      И еще — я человек в мол.биологии непросвещенный, а потому да простят меня профессионалы, если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки.

      Люди, хелп! Если кто-нибудь знает что-то про технологию внесения биополимеров в гель под названием Shark Teeth, напишите, пожалуйста!

      А почему бы заодно не добавить в текст, что рабочая концентрация бромистого этидия, например, 0,5 мкг/мл и что его можно добавлять прямо в гель, что гель с добавленным в него EthBr спокойно стоит ночь под электродным буфером без заметного вымывания из него краски? Полезные, вобшем-то факты, хоть и мелкие, но, с моей точки зрения, вполне не лишние.

      Акульи зубы — не гель. а гребенка в виде этих самых зубок. Втыкается в гель, и не вынимается, а образец наносится тонким-тонким носом в дырки между зубами. См. инструкцию к Макрофору. Только это не про агарозный форез.

      2Re: что это гребенка такая, я знаю. Только сейчас вижу, что по формулировке моего вопроса кажется, будто это гель так называется:) Все, спасибо, уже поздно:) Только по моим данным, это имено про форез. Не знаю уж, про агарозный или ПААГ, по-моему, в данном случае не суть важно

      Народ, а какова длина волны для визуализации ПЦР-фрагментов?
      Я так понял, если окрашивают этидиум бромидом — то и Агарозный или ПААГ гель-электрофорез — всё равно?

      народ, а как точно называется маркер мол веса (лестница)? и куда, как ее наносить?

      а почему в гел Этьбромид а не GelStar ? GelGreen ? GelRed ? SYBRSafe ?

      а почему ТБЕ ТАЕ а не SB (sodium borate) ?

      а почему UV а не Blue ( Safe Imager , Dark Reader , FlashGel)

      А ПОКОЧАНУ ))))

      ответ от радио Molbiol — Не выпендрюйся Василий Иваныч-слушай свои «Валенки»

      1: Biotechniques. 2004 Feb;36(2):214-6. Links

      Erratum in:
      Biotechniques. 2005 Jan;38(1):60.
      Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.

      Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA.

      PMID: 14989083 [PubMed — indexed for MEDLINE]

      All: 1
      Review: 1
      [Click to change filter selection through My NCBI.]

      1: Electrophoresis. 2001 Mar;22(5):814-28.Click here to read Links
      A whole new way of looking at things: the use of Dark Reader technology to detect fluorophors.

      Clare Chemical Research, Inc, Denver, CO 80206, USA. mseville@clarechemical.com

      The Dark Reader optical system (Clare Chemical Research, Denver, CO, USA) uses relatively low intensity broad-band visible blue light in combination with broad-band optical filters to detect fluorescence with a level of sensitivity that often surpasses that of UV transilluminators and can rival that of laser-based scanners. Applications of DR (Clare Chemical Research) devices include the detection of DNA and SYBR-stained protein samples following, and also during, electrophoresis. Unlike laser-based imaging systems, the fluorescence is directly visible to the user as well as being fully compatible with charge-coupled device (CCD) and Polaroid camera-based detection and imaging. Additionally, the DR optical system functions well in multicolor fluorophor environments. Because the Dark Reader does not emit any UV light, the extent of DNA damage incurred when visualizing DNA samples is drastically reduced compared to the damage produced by a UV device and this can have a significant benefit on downstream cloning protocols. Furthermore, dye photobleaching is minimal, extending the length of time that a fluorescent sample is visible. The inherent flexibility of the DR optical system allows many different configurations of the Dark Reader to be constructed such as transilluminators, hand lamps and integrated transilluminator-electrophoresis units.

      PMID: 11332748 [PubMed — indexed for MEDLINE]

      Today’s Featured Review
      Biotium GelRed

      Until recently Sybr green had been our labs nucleic stain of choice. We have, however, recently migrated to Biotium’s GelRed. GelRed is a newer nucleic acid gel stain that is safer and more temperature stable than other dyes. GelRed is safer because it is non mutagenic and is diluted in water. It is more thermostable than Sybr dyes because it does not degrade with repeated freeze-thaws or long storage (couple months at RT) and can be stored at room temperature, and sensitivity seems to at least equal if not exceed Sybr green when visualized with UV transilluminator.

      The dye is used similarly to Sybr dyes with staining (available at 10,000X ) or direct sample additions. The technology is not particularly ground breaking or new but the safety profile of this product makes it a viable alternative to potentially more dangerous dyes.

      Review by Vitelli
      Join Today
      Scientific & Medical Experts Needed!

      Using GelGreen ‘In-Gel’
      GelGreen DNA used in-agarose and viewed on a Dark Reader transilluminator Save Time.
      GelGreen can be added to the agarose just before pouring a gel. DNA bands are stained almost immediately and there is no need to incubate in a bath of stain after electrophoresis.

      Save even more Time.
      Because GelGreen is very stable in aqueous solution, it is possible to make up and store agarose containing GelGreen for immediate use at a later date. Left; DNA samples separated using agarose containing GelGreen and viewed on a Dark Reader transilluminator.

      GelGreen Safety
      GelGreen is among the safest of the nucleic acid stains. Based on the Ames test, GelGreen shows no mutagenic effects on bacterial strains TA98 and TA1537 both with and without metabolic activation. Download the Biotium safety report here.
      GelGreen versus SYBR Safe
      GelGreen is more sensitive than SYBR Safe GelGreen is 2 — 3 times more sensitive than SYBR Safe. Using GelGreen in-agarose, it is possible to detect about 0.5 ng of dsDNA by eye and about 0.2 ng using a CCD camera.

      FlashGel™ DNA System
      Home > Research Products > Electrophoresis > Nucleic Acid Electrophoresis > FlashGel™

      The FlashGel System is the fastest way to separate DNA and the only way to watch DNA migration as it happens. This revolutionary new tool separates DNA in 2 – 7 minutes. Monitor gel runs right at the bench, without UV light. The highly sensitive system allows a 5X reduction in DNA levels – saving both time and money.

      * Get results in 5 minutes or less.
      * Watch DNA migrate at your bench, in real-time without UV light.
      * Enjoy outstanding resolution and exquisite sensitivity.

      The FlashGel System consists of enclosed, disposable, precast agarose gel cassettes and a combination electrophoresis and transilluminator unit.

      * FlashGel Cassettes contain precast, prestained agarose gels and buffer – no need for gel preparation, buffer addition or gel staining.
      * The FlashGel Dock is an electrophoresis apparatus with a built-in transilluminator that provides both separation and detection.

      это все называется «ДНК технология» — не путайте с одноименной фирмой

      всем привет.
      вопрос: какие установки нужны для источника питания Эльф кроме вольтажа на см ванночки. Т.е. какие цифры в Амперах и Ваттах надо устанавливать.
      спасибо

      Здравствуйте!
      Есть ли у кого-нибудь что-то по типу таблицы, выражающей зависимость подвижности красителей(бромфеноловый синий и ксилен цианол) от процентности агарозного геля? Какому размеру фрагментов они соответствуют при разделении в 0,7%, 0,8%, 1%, 2% и 3% геле? Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно

      «. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. «

      а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит

      Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации. Скорее всего малая концентрация? Спасибо

      —Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно

      —. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. «

      —а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит.

      Вроде красители в агарозе мигрируют на одно и тоже Rf не зависимо от процентности.

      А вот фрагменты сильно зависимо от процентности.

      Берете 2 маркера 100b и 1000b и в разных процентностях агарозы гоните с красителями и очень хорошо определяете, что с чем бежит.

      3 процентный агароз вам уже трудно будет растворить. Я так дУмаю-у

      Мне кажется это лишняя работа элюировать ДНК из геля для последующей амплификации. Срез геля в воду, заморозить-разморозить и 1-2 мкл на ПЦР. Вы реамплифицируете кг.

      Спасибо, попробую на следующей неделе. А что если уже выделил из геля с помощью QG и при исходнике с приблизительной количеством 50 нг получил 40 мкг в 40 мкл. На форезе 1,2% в 10 мкл пробы ясен перец ничего не видно, агароза супер. Поставил на ПЦР, отправил 20 мкл в смесь, жду результатов. Сколько приблизительно может быть продукта? Спасибо

      Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка??
      Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода. ), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу. и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов. и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества. Спасибо

      1% агарозу (в 2% линейная ДНК идет очень близко к суперскрученной, в 0.7% — близко к релаксированной).

      Если требуется проконтролировать циклизацию 3kbp фрагмента, то надо использовать 2% агарозу.

      если у Вас не нарабатывается большое кол-во продукта (20 нг в мкл и выше), дело уж конечно не в пирофосфатах- откуда бы им взяться, коли буквы не включились в амплификат (его мало)? Скорее всего проблемы с праймерами- посмотрите, нет ли «бомбы» (димер праймеров) внизу, или полимераза дохнет, что вря ли. Если проблема не лечится «в лоб», то просто замешайте исходно большой объем смеси, грубо говоря, накопите продукт экстенсивным путем, и всех делов.

      Я наверное перегрелся на солнцепёке (отпуск все-таки) — не понимаю в чем проблема плазмида или вставка, одна пара праймеров. По классике в ПЦР сильнее амплифицмруется всегда более короткий фрагмент. Без бутылки не разберешься, дождусь вечера.

      Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? И на какой стадии (до или после фиксирования в кислоте). Обязательно ли сушить?
      Спасибо

      -Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза?

      Бромий этидием или сибирским зеленым и иже с ними

      -до или после фиксирования в кислоте.
      После нейтрализации
      -Обязательно ли сушить?
      нет

      «если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки»

      Чем тогда думали в Сигма, если сделали столик в камере для фореза из белого пластика, к тому же скользкого

      в первом случае можно наклеить синей изоленты под место, где карманы)) Но от скольжения избавиться сложно — гель частенько уплывает от любых дуновений во время фореза. хоть гвоздями прибивай

      Можно ли заменить ТВЕ-буфер на Трис-СІ+EDTA для фореза ДНК, и какой молярности?

      За Трис.НСI в форезном буфере ставлю кол.

      Борная кислота испорчена у нас.
      Мож трис-ацетат тогда приготовить? Только порошок все равно 2в1 — Трис-СІ, других Трисов нет.

      Похоже, это ко мне . Поставляем наборы готовых гелей для электрофореза ДНК, рассчитанные на использование в ПЦРных лабораториях. В каждый комплект входит пузырёк ТАЭх20 (50 мл) для приготовления литра электрофоретического буферного раствора (EtBr 0,5 мкг/мл). Если нужно, то эти пузырёчки можно продавать и без гелей . Если интересно, то пишите. Ели реклама здесь неуместна, то удалите.

      &nbspГОТОВЫЕ_ГЕЛИ_05.pdf
      Размер:: 19.19к
      кол-во скачиваний: 1724

      Ну как может испортиться борная кислота? Купите тогда в аптеке.
      Только ТРИС.ОН. Никаких CI- и Na+ в буфере для фореза.
      5 mM борат тоже годится в качестве буфера для агарозного фореза. Читайте выше или поищите по форуму.

      Борная кислота старая и «Ч.» по квалификации чистоты. Надо заказывать новые реактивы.

      Могу отсыпать сухой (белый порошок) ТВЕ. И дам пропись как самому готовить. Но про Трис.НСI для фореза — забудь. Лучше водопроводную воду.

      Забудьте и про Трис-HCl, и про все прочие буферы на основе Триса. Наиболее продвинутые пользователи за бугром переходят на Li-борат и Li-ацетат. Давно хотел попробовать карбонатный буфер, но всё руки не доходили. Недавно дошли. Приготовили Li-карбонатный буфер. Форезы получаются отлично! При 10V/см ни перегрева, ни закисления или защелачивания. Очень рекомендую!

      * ubMed will retrieve 2 records.

      J Virol Methods. 2010 May 13. [Epub ahead of print]Fast short-fragment PCR for rapid and sensitive detection of shrimp viruses.

      Mrotzek G, Haryanti, Koesharyani I, Tretyakov AN, Sugama K, Saluz HP.

      Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute, Beutenbergstrasse 11a, 07745 Jena, Germany; Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany.
      Abstract

      This article describes a fast short-fragment PCR method for the detection of white spot syndrome virus (WSSV), infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and monodon baculovirus (MBV). Fast two-temperature (95 degrees C denaturation and 60 degrees C annealing/extension) PCRs were performed in 5-10mul volume samples in miniaturized microplates using a fast Peltier thermal cycler. 40 cycles were completed in 25-30min. Rapid high-resolution agarose gel electrophoresis of 70-150bp PCR fragments was performed in 10min. High sensitivity of PCR product detection (50-100pg) was obtained using ultra sensitive dyes such as GelStar(®) and a gel documentation system equipped with a blue-light transilluminator. This novel method is faster and more sensitive than its TaqMan(®) real-time PCR counterparts. Copyright © 2010. Published by Elsevier B.V.

      да уж сам себя не похвались как оплеванный ходишь. ©
      Такие времена. ©

      источник