Метод электрофореза белков в моче

Исследование, направленное на определение количественного соотношения основных белковых фракций мочи для выявления типа протеинурии, характерного для заболеваний почек или патологических процессов внепочечной локализации.

Электрофорез белков мочи; белковые фракции мочи; тип протеинурии.

Electrophoresis of urine proteins; protein electrophoresis; urine electrophoresis; the type of proteinuria.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Суточную мочу, среднюю порцию утренней мочи.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исключить из рациона алкоголь в течение 24 часов до исследования.
Исключить (по согласованию с врачом) прием мочегонных препаратов в течение 48 часов до сбора мочи.

Общая информация об исследовании

Повышение уровня белка в моче, или протеинурия, представляет собой состояние, которое может сопровождать патологический процесс в почках, а также иметь преренальное и постренальное происхождение. Электрофоретический метод — это способ пространственного разделения молекул, имеющих разный заряд и размеры, путем помещения их в электрическое поле. Данный метод позволяет оценить количественное соотношение основных белковых фракций мочи в зависимости от молекулярной массы, предположить и описать тип протеинурии, что помогает в дальнейшей диагностике заболеваний или назначении лечения.

В норме в результате процессов фильтрации и реабсорбции в почках количество белка, выделяемой с мочой, не превышает 100-150 мг/сут. При этом основное количество белка приходится на альбумин. Микроальбуминурия – это экскреция с мочой микроальбуминов в количестве от 30 до 300 мг/сут или от 20 до 200 мг/л в утренней моче. Она является ранним признаком нарушения функции клубочков почек. При выделении с мочой более 300 мг/сут белка развивается протеинурия.

Важно отметить, что протеинурия не всегда является признаком патологического процесса и только у 2 % населения служит причиной серьезного заболевания. В остальных случаях развиваются функциональные, или транзиторные, протеинурии. Эта разновидность протеинурии не связана с заболеванием почек, и потеря белка при ней незначительна (менее 2 г/сутки). У новорождённых детей может отмечаться физиологическая протеинурия в первые 4-10 суток, и количество белка не превышает 0,5 г/л. Транзиторные протеинурии могут возникать после повышенной физической нагрузки, при эмоциональном стрессе, лихорадке, остром инфекционном заболевании, после перегрева или переохлаждения организма, при потере жидкости, при приеме пищи, богатой белком. При устранении этиологического фактора такие протеинурии быстро проходят. Уровень белка в моче может достигать 3-5 г/л. Известен вариант ортостатической протеинурии, которая появляется, только когда человек стоит, и исчезает в горизонтальном положении. Данный вариант протеинурии наиболее характерен для детей дошкольного и школьного возраста и может быть связан с особенностями развития и роста. Существует вариант гиперлордотической протеинурии, когда концентрация белка в моче неизменна в положениях стоя и лежа. Такие варианты доброкачественных протеинурий могут исчезать, но часто могут являться предвестниками почечной патологии.

Преренальная протеинурия характеризуется появлением в плазме крови патологических белков в избыточном количестве и не связана с заболеваниями почек. Данные белки имеют низкую молекулярную массу, свободно проходят через неповреждённую почечную мембрану и обнаруживаются в моче. Отмечается увеличенное количество общего белка в моче, фракция альбумина в пределах нормы. Различают гемоглобинурию при гемолитической анемии, миоглобинурию при обширном поражении мышечной ткани, застойную протеинурию при сердечной недостаточности и нейрогенный вариант протеинурии.

Появление в крови патологических белков – парапротеинов характерно для множественной миеломы, амилоидоза, макроглобулинемии Вальденстрема, болезни тяжелых цепей и ряда других заболеваний. Для диагностики парапротеинемий необходим одновременный анализ как сыворотки крови, так и мочи. Это связано с большой вариабельностью результатов, полученных при исследовании данных биоматериалов. Фрагменты иммуноглобулинов — каппа- и лямбда-легкие цепи — из-за низкой молекулярной массы легко фильтруются через нормальный почечный фильтр, формируя агрегаты и образуя в моче белок Бенс-Джонса. При этом легкие цепи иммуноглобулинов не обнаруживаются в крови, а могут быть обнаружены только при электрофорезе белков в моче (белок Бенс-Джонса). Чувствительность данного метода лимитирована процессом реабсорбции легких цепей, то есть легкие цепи не могут быть обнаружены в моче до начала развития поражения почечных канальцев. При доброкачественных парапротеинемиях данный белок в моче не обнаруживается.

Ренальная протеинурия характерна для многих заболеваний почек и разделяется на клубочковую, тубулярную и смешанную. Клубочковая протеинурия возникает при повреждении базальной мембраны клубочков почек, а тубулярная – в результате нарушения функции реабсорбции белка в почечных канальцах.

Клубочковая (гломерулярная) протеинурия характерна для всех заболеваний почек, протекающих с поражением коркового вещества почек. К таким заболеваниям относятся острый и хронический гломерулонефрит, липоидный нефроз, идиопатический мембранозный гломерулонефрит, фокальный сегментарный гломерулярный склероз и другие первичные гломерулопатии, а также нефропатии при сахарном диабете, беременности, при болезнях соединительной ткани, опухолях почек.

Селективная гломерулярная протеинурия возникает в результате увеличения проницаемости клубочков для анионных белков средней молекулярной массы, в частности альбумина и трансферрина, с количеством белка около 0,03-0,3 г/сут. Картина электрофоретического разделения белков мочи не соответствует картине белков сыворотки крови, так как почечный фильтр остается непроницаем для высокомолекулярных белков – глобулинов. Данный тип протеинурии характерен для диабетической нефропатии, нефропатии беременных, при хроническом гломерулонефрите в стадии компенсации.

При неселективной гломерулярной протеинурии увеличивается проницаемость почечной мембраны как для низкомолекулярных, так и для высокомолекулярных белков массой более 100 кДа, в частности альбумина, иммуноглобулинов классов IgG, IgG. Белки с очень большой молекулярной массой — иммуноглобулин IgM и альфа-2-макроглобулин — не проникают через базальную мембрану и не обнаруживаются в моче. Электрофорез белков мочи идентичен электрофорезу белков крови. Этот тип протеинурии встречается при заболеваниях, сопровождающихся нефротическим синдромом и увеличением количества белка более 3 г/сут. К ним относятся различные варианты гломерулонефритов, в том числе волчаночного нефрита, а также тяжелые варианты нефропатий.

При тубулярной протеинурии нарушается реабсорбция белков в проксимальном отделе нефрона или усиливается продукция специфического белка клетками почечного эпителия дистального отдела нефронов (белка Тамма — Хорсфалла). В моче обнаруживаются низкомолекулярные белки: альфа-1-микроклобулин, бета-1-микроглобулин, бета-2-микроглобулин, цистатин С. Тубулярная протеинурия встречается при гипертензивном нефроангиосклерозе, интоксикации солями свинца и ртути, при синдроме Фанкони, врождённом дефекте почечных канальцев, интоксикации нефротоксичными препаратами, а также при применении нестероидных противовоспалительных препаратов и некоторых антибиотиков.

При смешанной протеинурии электрофореграммы белков мочи могут показывать как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные белки плазмы крови. Она может возникать при пиелонефрите, острой почечной недостаточности.

Причиной постренальной протеинурии является кровотечение или воспалительный процесс в мочевыводящих путях, а также она может наблюдаться при доброкачественных и злокачественных процессах мочевого пузыря. При электрофорезе белков мочи могут быть обнаружены плазменные белки: альбумин, иммуноглобулины, альфа-2-макроглобулин.

Для чего используется исследование?

Для выяснения типа протеинурии в зависимости от выявления белковых фракций мочи электрофоретическим методом;
для диагностики и подтверждения варианта парапротеинемий;
для описания типа протеинурии в целях предположения патологического процесса, заболевания, возможно, назначения дополнительных методов лабораторной диагностики и лечения.

Когда назначается исследование?

При симптомах поражения почек, сопровождающихся развитием нефротического синдрома;
при изменениях в общем анализе мочи, при повышении количества общего белка в моче;
при подозрении на функциональный тип протеинурии в зависимости от возраста обследуемого, протеинурии, возникающий после эмоционального стресса, физической нагрузки, инфекционно-воспалительных процессов, при чрезмерном употреблении белковой пищи;
для исключения типа протеинурии, не связанной с патологией почек, в частности при подозрении на заболевания, сопровождающиеся парапротеинемией, при гемолитической анемии, обширном повреждении мышц, при кровотечениях, воспалительных и опухолевых заболеваниях мочевыводящих путей;
в комплексной диагностике и для предположения типа протеинурии в зависимости от выявляемых белковых фракций в моче;
для комплексной диагностики заболеваний почек: гломерулонефритов, пиелонефритов, гломерулопатий, нефропатий, в том числе при беременности, сахарном диабете;
при назначении нефротоксичных препаратов: аминогликозидов, пенициллинов, циклоспорина, нестероидных противовоспалительных препаратов, диуретиков и некоторых других.

Белок в моче: не обнаружен.

Общий белок мочи: 0 — 0,1 г/л.

первичные заболевания почек: липоидный нефроз, идиопатический мембранозный гломерулонефрит, фокальный сегментарный гломерулярный склероз, IgA-гломерулонефрит, мембранопролиферативный гломерулонефрит, пиелонефрит, синдром Фанкони, острый тубулоинтерстициальный нефрит;
поражения почек при других заболеваниях и патологических состояниях: сахарном диабете, артериальной гипертензии, системных заболеваниях соединительной ткани, амилоидозе, преэклампсии, эклампсии, злокачественных новообразованиях (легких, желудочно-кишечного тракта, крови);
поражение почек при лечении нефротоксическими препаратами: нестероидными противовоспалительными препаратами, диуретиками, аминогликозидами, пенициллинами, циклоспорином;
поражение почек при отравлении солями свинца и ртути.

множественная миелома, амилоидоз, макроглобулинемия Вальденстрема, болезни тяжелых цепей, лимфома, хронический лимфолейкоз;
гемоглобинурия при гемолитической анемии;
миоглобинурия при повреждении мышечной ткани;
застойная протеинурия при заболеваниях сердца в стадии декомпенсации, при асцитах, вызванным метастазами и онкологическими процессами в брюшной полости;
нейрогенная протеинурия при черепно-мозговых травмах, психоневрологических нарушениях.

3. Протеинурия в результате кровотечений или воспалительных процессов в мочевыводящих путях, при доброкачественных и злокачественных процессах мочевого пузыря.

4. Транзиторная (доброкачественная) протеинурия: дегидратация, стресс, диета с высоким содержанием белка, значительная физическая нагрузка, лихорадка, ортостатическая протеинурия.

уменьшение белковых фракций для определения типа протеинурии диагностически неинформативно. Возможно снижение одной белковой фракции при увеличении другой.

Что может влиять на результат?

[02-006] Общий анализ мочи с микроскопией осадка [06-114] Альбумин в моче (микроальбуминурия) [08-019] Бета-2-микроглобулин в моче [13-101] Белок Бенс-Джонса, количественно (иммунофиксация мочи)

Кто назначает исследование?

Терапевт, врач общей практики, нефролог, уролог, гематолог, онколог, ревматолог, иммунолог, педиатр.

Johnson DW. Global proteinuria guidelines: are we nearly there yet? / Clin Biochem // Rev. 2011 May;32(2):89-95.
McTaggart MP1, Lindsay J, Kearney EMReplacing urine protein electrophoresis with serum free light chain analysis as a first-line test for detecting plasma cell disorders offers increased diagnostic accuracy and potential health benefit to patients/Am J Clin Pathol. // 2013 Dec;140(6):890-7.
Fauci, Braunwald, Kasper, Hauser, Longo, Jameson, Loscalzo Harrison’s principles of internal medicine, 17th edition, 2009.
Долгов В.В., Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство. – Т. I. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 928 с.

источник

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

Профессор Батюшин Михаил Михайлович — Председатель Ростовского областного общества нефрологов, заместитель директора НИИ урологии и нефрологии, Руководитель нефрологической службы ГОУ ВПО РостГМУ, заведующий отделением нефрологии клиники РостГМУ.

Бова Сергей Иванович — Заслуженный врач Российской Федерации,заведующий урологическим отделением — рентгено-ударноволнового дистанционного дробления камней почек и эндоскопических методов лечения, ГУЗ «Областная больница №2», г. Ростов-на-Дону.

Галушкин Александр Алексеевич — кандидат медицинских наук, врач-нефролог, ассистент кафедры внутренних болезней с основами физиотерапии №1 РостГМУ.

Турбеева Елизавета Андреевна — редактор страницы.

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек.

Книга: «Протеинурия» (А.С. Чиж).

Еще Гофману и Сенатору (1874) было известно, что с мочой при заболеваниях почек выделяются не только альбумины, но и глобулины (цит. по: Н.Я.Червяковский, 1963). Позже это подтвердил A.Hiller (1927), а затем Е.М.Тареев и М.А.Благирева (1931).

С введением в клиническую практику метода электрофореза белков на бумаге появилась возможность более глубоко изучить механизм протеинурии и ее особенности при различных заболеваниях почек.

По мнению А.Я.Пытеля и С.Д.Голигорского (1968), электрофорез остается пока наиболее доступным методом определения качественных особенностей протеинурии и позволяет в известной мере уточнять некоторые стороны механизма ее происхождения. Белковый состав мочи при диффузных заболеваниях почек изучался методом электрофореза на бумаге многими исследователями.

В последние годы для исследования качественных и количественных особенностей белков мочи используют предложенный в 1955 г. O.Smithies метод электрофореза в крахмальном геле. По мнению Е.М.Тареева (1968), А.Я. Лытеля и С.Д.Голигорского (1968), этот метод является перспективным не только для изучения качественных особенностей протеинурии, но и для выяснения некоторых звеньев ее патогенеза.

К сожалению, работ с применением указанного метода пока еще очень мало (Д.БЛ.Дыкин, М.М.Щерба, 1969; Д.Б.Цыкини соавт., 1971, 1972; Т.Н.Александровская, 1972; Л.Р.Полянцева, 1972; J.Traeger и соавт., 1965,1966,1967).

С помощью электрофореза белков в крахмальном геле по сравнению с электрофорезом на бумаге удается обнаружить в сыворотке крови и в моче значительно большее число белковых фракций,а следовательно,получить и более ценную информацию о белковом спектре этих биологических жидкостей при различных заболеваниях почек.

Так, Д.Б.Цыкини соавт. (1969, 1971), используя данный метод для изучения состава уропротеинов при некоторых диффузных заболеваниях почек, выявили в моче обследованных ими 52 больных от 3 до 12 белковых фракций, в том числе по три фракции (преальбумины, альбумины, сидерофилин) при хроническом гломерулонефрите с изолированным мочевым синдромом, 11 (пре- и постальбумины, альбумины, «2-быстрые глобулины, сидерофилин, гаптоглобины и у-глобулин) — при смешанной форме хронического гломерулонефрита и 12 (кроме упомянутых, еще и «2-медленные глобулины) фракций при нефротическом синдроме на почве гломерулонефрита и амилоидоза почек.

Содержание каждой из глобулиновых фракций, выраженное в относительных показателях (%), было наибольшим в моче больных с нефротическим синдромом.

Как подчеркивают авторы, содержание «2-медленных глобулинов (макроглобулинов) было весьма незначительным (1,1 ±0,71%), и белки этой фракции выявлялись только при нефротическом синдроме и то лишь в единичных случаях. Однако в работе не указывается, как часто встречались другие глобулиновые фракции, в частности гаптоглобины и у-глобулины.

Кроме того, не проведен раздельно анализ уропротеинограмм при одинаковых клинических формах острого и хронического гломерулонефрита и при нефротическом синдроме в зависимости от его этиологии. На наш взгляд, это могло бы представить определенный интерес для дифференциальной диагностики диффузных заболеваний почек.

В работах J .Traeger и соавт.,(1965, 1966, 1967), материалы которых основаны на данных обследования больных (более тысячи) с различными врожденными и приобретенными заболеваниями почек, изучен белковый спектр мочи с одновременным использованием методов электрофореза на бумаге, в крахмальном геле и иммуноэлектрофореза.

В большинстве случаев полученные данные сопоставлялись с результатами прижизненной пункционной биопсии почек и эффективностью кортикостероидной терапии. При некоторых врожденных тубулопатиях упомянутые исследователи выявили так называемый канальцевый (тубулярный) тип протеинурии, для которого на электрофореграмме в крахмальном геле характерно наличие:

1) фракции преальбуминов в виде «шапки жандарма»;
2) небольшой фракции альбуминов и большой постальбуминов, широкой полосы быстрых (что, по мнению Е. Butler, является специфичным для тубулярной протеинурии) и еще более широкой (шире, чем сывороточного сидерофилина) у-глобулинов;
3) а2-медленных и b-глобулинов.

Тубулярный тип протеинурии в чистом виде либо с некоторыми изменениями обнаружен также при пиелонефрите, поликистозе почек, острой почечной недостаточности, отравлении фенацетином, витамином Д, при гипоксии. Однако необходимо отметить, что в упомянутых работах изучались лишь качественные особенности уропротеинограмм без их количественного анализа.

Анализируя литературные данные о качественном и количественном составе белков мочи при важнейших диффузных заболеваниях почек, следует отметить, что получены ОНИ в основном с помощью метода электрофореза на бумаге и в ряде случаев, существенно различаются между собой.

При этом наиболее исследован нефротический синдром, в меньшей мере — другие клинические формы гломерулонефрита и незначительно — пиелонефрит. Содержание в моче отдельных белковых фракций выражалось, как правило, лишь в относительных (%), а не в абсолютных (г/л) величинах, и в подавляющем большинстве результаты исследований не подвергались статистическому анализу.

Содержание общего белка, а тем более отдельных его фракций в моче, их качественные и количественные особенности в аспекте различных клинических форм важнейших диффузных почечных поражений до настоящего времени изучались весьма ограниченно.

Более полного представления о качественных и количественных особенностях уропротеинограмм при различных клинических вариантах почечных заболеваний можно достичь при помощи метода электрофореза белков в различных гелях, в частности в крахмальном геле.

Методом электрофореза в крахмальном геле нами изучен белковый спектр мочи у 288 больных от 16 до 65 лет, в том числе у 148 мужчин и 140 женщин. Среди них были 124 больных с различными клиническими формами хронического гломерулонефрита (22 — с острым гломерулонефритом с затянувшимся течением, 76 — с хроническим пиелонефритом, 9 — с интерстициальным нефритом, 3 — с амилоидозом почек, 26 — с хронической почечной недостаточностью, 21 — сострой почечной недостаточностью и 7 больных с застойной протеинурией). У части больных электрофорез белков проведен в динамике,в результате чего получено и проанализировано 336 уропротеинограмм.

Данные качественного и количественного анализа протеинограмм мочи в зависимости от нозологической формы заболевания и его клинической формы приводятся ниже.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Прежде чем перейти к изложению полученных данных и результатов их анализа, целесообразно дать краткое описание методики исследования. При этом метод электрофореза белков сыворотки крови и мочи в крахмальном геле описан более детально ввиду его меньшей известности и необходимости изложения некоторых дополнений и усовершенствований, внесенных нами при обработке этого метода.

Материалом для исследования являлись сыворотка крови и моча больных. Кровь (5—7 мм) брали из вены натощак. Получаемую после свертывания и центрифугирования сыворотку крови сливали в отдельную чистую пробирку и использовали для определения содержания общего белка, электрофореза белков и других исследований. Мочу брали у больных из утренней порции (сразу после сна), как это делали, например, М.А. Адо (1965) и другие. Предварительно ее подвергали диализу и концентрированию.

Диализ и концентрирование мочи. В литературе описаны различные методы диализа и концентрирования мочи. Так, Н.К.Лебедева и соавт. (1967), A. Afonso (1967) 10-20 мл мочи, помещенной в целлофановый мешочек, подвергали диализу вначале против водопроводной воды в течение 6 часов, а затем против дистиллированной воды в течение 16—20 часов.

Концентрирование осуществляли с помощью комнатного вентилятора до тех пор, пока в мешочке оставалось несколько капель мочи. М.П.Матвеев , Л.В.Шатунова (1969) диализ мочи проводили в целлофановых трубках против дистиллированной воды в течение двух дней,а концентрирование —в 16% растворе желатины. Дистиллированную воду в качестве диализирующей среды применяли и другие авторы (М.А.Адо, 1965; А.П. Пелещук и соавт., 1968 и др.).

Причем М.А.Адо для концентрирования мочи использовала комнатный вентилятор, добиваясь увеличения концентрации белка в 10 раз, а А.П.Пелещук и соавторы сгущение мочи проводили аналогично, но лишь в тех случаях, когда концентрация белка в моче была ниже 1 г/л. Другие рекомендуют добиваться концентрации белка в моче до 10 г/л и более (И.Тодоров, 1963; Т.Дочев, 1965).

Предложены методы диализа и концентрирования мочи в растворах высокомолекулярных веществ, например поливинилпирролидона, полиэтиленгликоля (В.Salle и соавт., 1967; J.Traeger и соавт., 1965, 1966 и др. ), гуммиарабика (И.Тодоров, 1963; Д.Дочев, 1965), а также с помощью особых фильтров под давлением, путем ультрафильтрации и т.п. (Ю.Я.Гофман, 1963; Г.В.Воскобойников, Н.Д.Сидорова, 1965; J.Traeger и соавт., 1966 и др.).

Мы проводили диализ мочи против дистиллированной воды в течение 8— 12 часов, а сгущение ее при помощи комнатного вентилятора в течение 4-6 часов, добиваясь увеличения концентрации белка в 20 раз. Для этого необходимое количество мочи (20 мл) в начале наших исследований помещали в целлофановый мешочек.

Однако в связи с рядом неудобств, связанных с приготовлением мешочков, внесением и взятием мочи из них, в дальнейшем для этих целей были использованы небольшие воронки. Широкую часть воронки обтягивали целлофаном, который в узкой ее части прочно обвязывали ниткой.

Концами последней затем подвешивали воронку к штативу (при концентрировании мочи) или к специальному приспособлению (при диализе). Исследуемую порцию мочи мерной пипеткой вводили в воронку через узкую ее часть.

Растекаясь относительно тонким слоем по целлофану, закрывающему широкую часть воронки, моча на сравнительно большой поверхности соприкасалась с ним, что способствовало более полному и быстрому проведению диализа и концентрирования.

Определение концентрации общего белка в сыворотке крови и в моче.

Содержание общего белка в сыворотке крови и в моче устанавливали биуретовым методом. Хотя этот метод определения белка был предложен давно (W.Autenriet, 1914; цит по: Л.А.Неделина и Н.А.Сентебова, 1971), однако для широкого использования его потребовались многочисленные дополнительные исследования (Л.Ф.Кельзон, 1952; Л.Г.Смирнова, Е.А.Кост, 1960; С.Г.Аптекарь, А.А. Покровский, 1969; G.Kingsley, 1939; R.Ardry, 1949; W.Bartosiewicz, 1956; M.Piscator, 1966 и др.).

В результате была разработана наиболее приемлемая модификация этого метода, которая в настоящее время предложена в нашей стране в качестве унифицированной методики определения общего белка в сыворотке крови (Л.А.Неделина, Н.А.Сентебова, 1971).

Биуретовый метод широко применяют и для количественного определения белка в моче (Л.Г.Смирнова, Е.А.Кост, 1960; Е.И.Кримкевич, 1972;

Н.Я.Мельман, 1972; А.П.Пелещук и соавт., 1972; A.Hiller, 1927; W.Foster и соавт., 1952 и др.). Однако предварительно моча должна быть сконцентрирована, так как при низких концентрациях белка снижается чувствительность метода (Л.А.Неделина, Н.А.Сентебова, 1971).

В наших исследованиях использована модификация метода, описанная Л.Г.Смирновой и Е.А.Кост (1960). Следует отметить, что в том количестве мочи, которое мы брали для исследований, существенной разницы в содержании общего белка не наблюдалось независимо от того, взята ли моча из суточного ее количества или из утренней порции.

У 23 обследованных больных (2 больных с острым гломерулонефритом, 12 — с хроническим гломерулонефритом, 7 — с хроническим пиелонефритом и 2 — с интерстициальным нефритом) концентрация общего белка в порции мочи, взятой для исследования из суточного ее количества и из утренней порции .соответственно была равна 0,072±.0,013 и 0,071±0,010 (Р>0,3). На уропротеинограмме выявлялось и в том и в другом случае одинаковое количество белковых фракций.

Содержание общего белка определяли у одного и того же больного одновременно в сыворотке крови и в моче (после ее диализа и концентрирования) . Для удобства дальнейших расчетов и проведения сравнительного анализа показателей общего белка и белковых фракций сыворотки крови и мочи применяли одни и те же величины (проценты и граммы на литр). Концентрацию белка в моче вычисляли по следующей формуле:

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

где X — концентрация белка в несконцентрированной моче, г/л; а — объем сконцентрированной мочи (обычно 1 мл); С — концентрация белка в сконцентрированной моче, определяемая по биуретовой реакции, г/л; А — объем мочи, взятой для концентрирования (обычно 20 мл).

Для определения концентрации белка в граммах на литр несконцентрированной мочи полученную величину умножают на 10.

Электрофорез белков в крахмальном геле. Исследованиями последних лет установлена высокая эффективность электрофоретического анализа белков при использовании в качестве поддерживающих сред различных мелкодисперсных гелей (агарового, полиакриламидного, крахмального), а также иммуноэлектрофореза.

Благодаря сравнительной простоте, доступности и высокой разрешающей способности в лабораторной практике последних лет широкое распространение получил метод электрофореза белков в крахмальном геле, который впервые был предложен в 1955 г. О.Smithies. Этот метод чаще всего используется для изучения различных белков крови, тканевых белков и некоторых ферментов.

Он позволяет выявить в сыворотке крови от 12 до 13—17—22 белковых фракций (С.М.Раппопорт, 1956; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Е.Д.Васильева, 1968; Ф.Гауровиц, 1965; Дж.Уилкинсон, 1968) ,а при использовании двухмерного электрофореза в сочетании с иммуноэлектрофорезом — до 30 фракций (Г.В.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966; В.Д.Успенская и соавт., 1968 и др.).

При этом каждую из пяти фракций, получаемых при электрофорезе на бумаге, можно разделить на ряд под фракций. Так, например, си-глобулин человека удалось разделить на 8 под- фракций (Дж.Уилкинсон, R68). С помощью этого метода выделены плазменные белки, обладающие индивидуальными различиями, а также установлен ряд наследственных типов гаптоглобина, трансферрина и некоторых других белков.

Количество белковых фракций сыворотки крови, полученных с помощью электрофореза в крахмальном геле, так велико, что не все они идентифицированы, и в полной мере не установлено, какую сыворотку следует принимать за нормальную, так как у каждого здорового человека она может иметь свои индивидуальные особенности (Е.М.Саминский, 1966).

Что касается применения метода электрофореза в крахмальном геле для исследования белкового состава мочи при заболеваниях почек, то по этому вопросу в литературе имеется сравнительно немного работ (Е.М.Тареев, 1968; Д.Б.Цыкин и соавт., 1969; 1972; P.Milliez и соавт., 1960; M.Debray -Sachs, 1966; J.Traeger и соавт., 1965, 1966, 1967 и др.).

Между тем изучение качественного и количественного состава белков мочи с помощью упомянутого метода является перспективным как в отношении диагностики заболеваний почек, так и для выяснения некоторых сторон механизма протеинурии.

Метод электрофореза в крахмальном геле чаще всего используется для изучения качественного состава белков, однако в настоящее время доказана возможность применения его и для количественного определения отдельных белковых фракций, хотя при этом встречаются довольно значительные трудности, о чем будет сказано ниже.

Основные принципы и особенности метода. Поскольку трактовку результатов фракционного анализа белков сыворотки крови и мочи, полученных методом электрофореза в крахмальном геле, необходимо связывать с особенностями разделения белковых фракций при миграции их через гель, целесообразно кратко остановиться на основных принципах электрофореза белков в гелевых средах.

При электрофорезе гели в качестве поддерживающей среды обладают рядом важных особенностей и преимуществ по сравнению с другими средами. Главная особенность гелей — малые размеры их пор, которые, кроме того, могут изменяться в зависимости от концентрации геля.

По своему диаметру поры в геле можно сравнить с размером белковых макромолекул. Вот почему гель схож с молекулярным ситом, в котором скорость движения белковых молекул зависит от их размера: крупные молекулы (диаметр их равен или почти равен диаметру пор) движутся медленнее, чем мелкие, легко проникающие через гель (Э.Г.Ларский, 1971; Г.Маурер, 1971 и др.).

Таким образом, электрофоретическое разделение белков в гелях зависит не только от электрического заряда молекул, но и от их размеров и формы (Е.М.Саминский, 1966; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Дж.Хаггис и соавт., 1967). Кроме того, адсорбционные явления в гелях выражены очень слабо (Г.В.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966).

По этим причинам электрофорез в гелях обладает чрезвычайно высокой разрешающей способностью, которая наиболее выражена в крахмальном и полиакриламидном гелях. Агаровый гель, хотя и обладает малой адсорбционной способностью, но в связи с относительно большими размерами пор дает несколько худшее разделение белковых молекул (Е.М.Саминский, 1966).

Считают, что электрофорез в мелкодисперсных гелях является единственным видом электрофореза, при котором происходит разделение белков с одинаковой электрической подвижностью, но с различными молекулярными массами (В.Д.Успенская и соавт., 1968).

Аппаратура и другие принадлежности, необходимые для проведения электрофореза белков в крахмальном геле. Электрофорез белков в крахмальном геле можно проводить в обычном аппарате, предназначенном для электрофореза белков на бумаге, например типа ПЭФ, но описаны и специальные аппараты для проведения этого метода исследования (В.Д.Успенская, 1959; В.М.Родионов и соавт.; 1960; В.А.Давыдова, Н.И.Макаревич, 1964; М.Д.Луцик, 1968; S.Boyer, R.Hiner, 1963). Нами использован аппарат УЭФ (универсальный прибор для электрофореза).

Для получения определенных размеров гелевой пластинки и проведения электрофореза необходима специальная кювета с крышкой. Предложены и описаны различные варианты плексигласовых кювет (Г.В.Троицкий, 1962; И.М.Маркелов, 1964; Н.Н.Старостин, 1966; А.А.Стрекалов, 1966 и др.).

На наш взгляд, наиболее простой и удобной является конструкция кюветы, описанная В.Д.Успенской и соавт. (1968). Мы пользовались плексигласовой кюветой аналогичного типа, но несколько иных размеров: длина ее рабочей площади составляла 16,5 см, ширина 7,0 см и высота бортиков (от этого зависит толщина гелевой пластинки) 6 мм. Крышка кюветы имела те же размеры, за исключением меньшей высоты бортиков (3 мм), так как она одновременно использовалась в качестве лотка для разделения гелевой пластинки на две равные части одинаковой толщины.

Формовочная пластинка (гребенка), необходимая для образования поперечного ряда щелей в геле, куда вносится исследуемый материал (сыворотка крови и моча), изготовлена нами из пластмассовой пластинки толщиной 0,5 мм и шириной 6,5 см; длина (высота) ее не имеет практического значения.

На одном из концов пластинки вырезались прямоугольные зубцы высотой 6,5 мм, шириной 8 мм; расстояние между зубцами 2,8 мм. Таким образом,всего было шесть зубцов,что сразу позволило сделать в геле шесть насечек (щелей) и вносить в гель для проведения электрофореза такое же количество проб исследуемого материала. Гелевую пластинку обычно рекомендуется разрезать нихромовой проволокой диаметром 0,1 мм.

Гидролиз крахмала. Успешное разделение белковых фракций во многом зависит от качества крахмального геля, который должен обладать определенной степенью дисперсности, эластичности и прочности. Это имеет существенное значение не только в процессе проведения электрофореза, но и при дальнейших манипуляциях с гелем (окрашивание, отмывка, фотографирование, сушка и т.п.). Качество же крахмального геля во многом зависит от сорта крахмала, тщательности и особенностей проведения его гидролиза.

Процесс приготовления гидролизного крахмала — один из наиболее трудных и в то же время наиболее важных и ответственных моментов в методике получения крахмального геля. Описан ряд модификаций приготовления гидролизованного крахмала (Г.Ф.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966; Н.Н.Старостин, 1966; Ю.Н.Берг и соавт., 1967; Е.Д.Васильева, 1968; В.Д.Успенская и соавт., 1968).

Однако общий принцип гидролиза такой, каким его описал О.Smithies (1955): крахмал гидролизуют соляной кислотой в среде ацетона при строго определенной температуре и в течение определенного промежутка времени для каждого сорта крахмала. Мы пользовались гидролизованным крахмалом, который получали из лаборатории линейных животных Белорусского научно-исследовательского института животноводства.

Гидролиз картофельного крахмала высшего сорта проводился в среде ацетона с добавлением соляной кислоты (из расчета на 300 г крахмала 600 мл ацетона и 9 мл соляной кислоты плотности 1,18) при температуре 38,6°С в течение двух часов.

Приготовление крахмального геля. Предварительно необходимо приготовить буферные растворы двух видов:

1) для разведения гидролизованного крахмала (крахмальный буфер) и
2) для заливки электродных кювет (электродный буфер).

Для электрофореза в крахмальном геле можно применять обычные буферные растворы с колебаниями pH от 2,0 до 11,0 (В.Д.Успенская и соавт., 1968). Наибольшее распространение получили боратные растворы, предложенные О.Smithies, различные модификации которых были в дальнейшем использованы многими авторами (Н.Н.Старостин, 1966; Ю.Н.Берг и соавт., 1967; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Дж.Уилкинсон, 1968 и др.). Весьма эффективны комбинированные буферные системы, например трисцитратный буфер (Г.В.Троицкий,1962; M-Poulak, 1957 и др.).

Нами использованы боратные буферные растворы следующего состава:

1) для разведения крахмала — 1,86 г борной кислоты (Н^ВО^) и 0,48 г гидроксида натрия (NaOH) на 1000 мл дистиллированной воды;

2) для заливки кювет — 18,6 г борной кислоты и 2,4 г NaOH на 1000 мл дистиллированной воды.

При подготовке крахмального геля обычно оптимальной считают концентрацию крахмала,равную 12—15% (В.Г.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966) или 12-17 (В.Д.Успенскаяи соавт., 1968), 12-13% (Дж.Уилкинсон, 1968), 12—16 (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) и даже 18% (Д.БДыкин, М.М.Щерба, 1969).

Следовательно, чтобы получить гель 12—18% концентрации,на 100 мл буферного раствора требуется 12—18 г гидролизованного крахмала. При этом описаны два варианта приготовления геля.

Первый вариант — вся навеска крахмала растворяется в соответствующем количестве крахмального буфера, затем полученная суспензия, помещенная в круглодонную колбу с длинным горлом, нагревается на открытом пламени горелки при энергичном вращении до получения геля.

Однако в таком случае не всегда удается установить точно момент, когда следует прекратить нагревание, а от этого зависит качество получаемого геля и его пригодность для электрофореза. Чтобы избежать погрешностей, даются различные рекомендации (Е.М.Саминский, 1966; Ю.Н.Берг и соавт., 1967; В.Д.Успенская и соавт., 1968 и др.).

Однако полностью устранить упомянутые дефекты не всегда удается. Учитывая это, предложен второй вариант приготовления геля, сущность которого заключается в следующем (Н.Н.Старостин,1966).

Приготовленную навеску крахмала помещают в отдельную колбу и добавляют туда примерно одну треть соответствующего количества буфёрного раствора; при взбалтывании получают суспензию крахмала. Остальные две трети буфера,находящегося в круглодонной колбе или другом сосуде достаточной емкости, нагревают до кипения, и затем при энергичном помешивании через воронку равномерной струей добавляют в него суспензию крахмала. В результате получается крахмальный гель заданной концентрации.

Нами использован второй вариант приготовления крахмального геля, только кипящий буфер вливали в суспензию крахмала, находящегося в колбе Бунзена, что снижало потерю крахмала, остающегося на стенках колбы, и затем переходили к деаэрации геля. Колбу Бунзена, закрытую притертой пробкой, подключали к водоструйному насосу. Отсасывание воздуха продолжали до тех пор, пока не прекращалось выделение пузырьков.

После этого колбу отсоединяли от водоструйного насоса и еще горячий гель медленно выливали в заранее подготовленную кювету, которая закрывалась крышкой таким образом,чтобы под ней не оставалось пузырьков воздуха, и поверх нее накладывали груз (обычно кирпич, обернутый в полиэтиленовую пленку). В таком виде крахмальный гель оставляли на два часа при комнатной температуре до образования плотной и эластичной гелевой пластинки.

Крахмальный гель готовили непосредственно перед электрофорезом. В проводимых опытах концентрация его составляла 15%. Охлаждать гель можно при комнатной температуре, как это делала, например, Е.Д.Васильева (1968), либо в холодной комнате в течение 2-2,5 часов, либо в рефрижераторе в течение 30—60 минут (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) или нескольких часов (Е.М.Саминский, 1966).

Внесение в гель исследуемого материала. После того как гель остынет, необходимо аккуратно снять с кюветы крышку, тщательно очистить ее и борта кюветы от избытка геля (нами крышка промывалась водой и высушивалась) . С обоих концов гелевую пластинку осторожно отделяют скальпелем, от стенок кюветы,чтобы легче было подвести под нее мостики из фильтровальной бумаги.

Последние готовят из двух-трех слоев фильтровальной бумаги днирина которой соответствует ширине гелевой пластинки,а длина на 5—7 см превышает расстояние от кюветы до поверхности электродного буфера, в наших условиях она составляет 12—15 см.

Мостики из фильтровальной бумаги осторожно с помощью формовочной пластинки подводят на 1,5—2 см под гелевую пластинку с обоих ее концов.

Затем приступают к внесению в гель проб исследуемого материала. Насечки или щели в геле, в которые вносятся образцы исследуемой биологической жидкости, готовят заранее различными способами — скальпелем (Н.Н.Старостин, 1966), лезвием бритвы (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) или пластмассовой гребенкой (В.Д.Успенская и соавт., 1968). Последний способ, на наш взгляд, наиболее удобен: он позволяет сделать сразу необходимое количество одинаковых по размеру и расположенных строго на одной линии щелей (линия старта).

Используя формовочную пластинку (гребенку), мы делали насечки в геле по линии, отстоящей на 2—3 см от края подведенной под гелевую пластинку полосы фильтровальной бумаги. В образованные таким образом отверстия с помощью пинцета и кусочков фильтровальной бумаги, размеры которых соответствовали размерам зубцов формовочной пластины, вносили пробы исследуемой сыворотки крови и концентрированной мочи.

Кусочки фильтровальной бумаги перед внесением в стартовую выемку предварительно смачивали сывороткой крови или мочой. Некоторые авторы (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) рекомендуют вносить в гель образцы исследуемых биологических жидкостей с помощью пастеровской пипетки. Однако этот способ неточен, так как в различные щели может вноситься неодинаковое количество исследуемого материала.

В одну кювету было внесено сразу шесть проб: три—сыворотки крови и три—мочи.Причем сыворотку крови и мочу одного и того же больного помещали в рядом расположенные стартовые выемки, что представлялось удобным при идентификации белковых фракций мочи и сравнении их с аналогичными фракциями сыворотки крови.

По окончании внесения образцов в крахмальный гель кювету закрывали крышкой, предварительно смазав ее тонким слоем вазелинового масла (для предотвращения высыхания геля), и помещали в аппарат для электрофореза. Переходные мостики смачивали электродным буферным раствором и свободные концы их опускали в электродные кюветы, заполненные буферным раствором. Затем аппарат для электрофореза включали в сеть.

Условия для электрофореза. Большинство авторов электрофорез белков в крахмальном геле рекомендуют проводить при напряжении от 4-5 (Г.В.Троицкий, 1962; В.Д.Успенская и соавт., 1968) до 6—8 В/см (Ю.Н.Берг и соавт., 1967)и силе тока 2—2,5 тА на 1 см ширины кюветы или гелевой пластинки (Ю.Н.Берг и соавт., 1967; В.Д.Успенская и соавт., 1968).

Другие электрофорез проводили при общем напряжении до 200 В и более и силе тока 0,5—2 тА на 1 см ширины кюветы (Д.БДыкин, М.М.Щерба, 1969; В.А.Давыдова, Н.И.Макаревич, 1964; Дж.Уилкинсон, 1968). Длительность электрофореза при комнатной температуре составляет от 4—6 до 18—2U часов (Н.К.Лебедева и соавт., 1968; В.Д.Успенская и соавт., 1968) и даже до нескольких суток (Ю.Н.Берг и соавт., 1967 и др.).

Нами проведен электрофорез при силе тока 2,0—2,5 тА на 1 см ширины гелевой пластинки (14-16 тА) и напряжении 375—380В. Длительность электрофореза составляла 4 часа. При таких условиях проведения электрофореза, которые соблюдают большинство исследователей, было получено от 9 до 15 белковых фракций в сыворотке крови обследованных лиц.

Кроме того, при данных условиях можно в течение рабочего дня полностью закончить весь процесс подготовки и проведения исследования, в том числе и окрашивание электрофореграмм.

Окрашивание, проявление и фотографирование электрофореграмм. Окрашивание и проявление электрофореграмм в крахмальном геле выполнялось в соответствии с рекомендациями Ю.Н.Берг и соавт. (1967), В.Д.Успенской и соавт. (1968) и других. Поэтому отметим, что для приготовления раствора краски нами был использован растворитель, состоящий из метанола, дистиллированной воды и ледяной уксусной кислоты в соотношении 5:5:1.

В качестве красителя взят амидошварц 10В (Чехословакия) и кислотный сине-черный краситель, применяемый на ткацких фабриках. Последний лучше и более интенсивно окрашивает белковые фракции.

Раствор красителя готовили из расчета 10 г на 1000 мл растворителя. Окраска гелевых пластинок продолжалась 5-7 минут, после чего красящий раствор сливали, а гелевые пластинки 2-3 раза промывали в течение 5 — 10 минут растворителем. Затем кюветы с гелевыми пластинками заполняли этим же растворителем и, плотно закрыв стеклом, оставляли на ночь.

Утром, слив растворитель, электрофореграммы промывали от оставшихся излишков краски дистиллированной водой и оставляли их в ней на несколько часов. После окраски и отмывки белковые фракции четко вырисовывались на бледном фоне крахмального геля, особенно под тонким слоем чистой дистиллированной воды.

В таких условиях проводили фотографирование электрофореграмм аппаратом ’’Зенит-ЗМ” на пленку чувствительностью 130 единиц при искусственном освещении одной и той же интенсивности. Затем, отпечатав снимки на контрастной бумаге размером 9×12 см, получали фотоэлектрофореграммы (ФЭФГ).

Последние можно сохранять длительное время и использовать для количественного определения (при необходимости — многократно) величины отдельных белковых фракций методом денситометрии в отраженном свете. Кроме того, по ним можно проводить точную идентификацию каждой из белковых фракций сыворотки крови и мочи.

Для просветления фона гелевой пластинки и получения большей «выразительности» белковых фракций предложены различные методы дополнительной обработки гидролизованного крахмала, в частности ацетилированием (Е.Д.Васильева, 1968; В.Х.Панкина, 1971) и другими способами (Ю.Н.Берг, Е.А.Маркина, 1968).

В наших исследованиях такие методы не применялись, так как гидролизованный крахмал получали уже в готовом виде, гель которого после окраски и отмывки давал сравнительно светлый тон.

Для сохранения крахмальные гелевые пластинки с электрофореграммами на них высушивали следующим образом: после фотографирования гелевую пластинку помещали на 12—24 часа в специальный раствор, состоящий из двух частей метанола и одной части глицерина.

Затем пластинку покрывали с обеих сторон фильтровальной бумагой и, расположив между стеклянными пластинками соответствующих размеров, вносили в термостат для сушки при температуре 50-60°С (сушку лучше проводить в потоке проходящего воздуха при температуре 40-50 С).

Обработанная и высушенная гелевая пластинка становится эластичной и прочной. В таком виде электрофореграм- ма в крахмальном геле может долго сохраняться, не теряя четкости контуров и интенсивности окраски полученных в ней белковых фракций. Этот способ более прост и удобен, чем некоторые другие (А.В.Азявчик, 1969 и др.).

Таким образом, в качестве документа можно хранить как гелевые пластинки (их заворачивают в целлофан, а затем в бумагу с необходимыми подписями на ней) ,так и снятые с них на фотопленку электрофореграммы. Кроме того, на бумаге можно делать схематические зарисовки полученных в геле протеинограмм сыворотки крови и мочи.

Количественный анализ электрофореграмм в крахмальном геле. Для количественного определения белковых фракций предложено несколько методов (элюирование с последующим фотокалориметрированием элюатов, фотометрирование в проходящем свете с последующей обработкой электрофореграмм гравиметрическим либо планиметрическим методом, денситометрия в проходящем свете и др.). Однако о выборе метода количественной оценки электрофореграмм существуют разные мнения.

Большинство исследователей считают метод денситометрии наиболее простым по технике выполнения, достаточно точным и поэтому наиболее перспективным (А.А.Соколов и соавт., 1956; А.Е.Гуревич, 1960; Е-А.Чуркин, 1965; Ат.Илков, Т.1 Николаев, 1959; Р.Даневев, Д.Стойнов, 1964 и др.), но отдельные авторы (О.А.Васильева, Г.Е.Барковская, 1960 и др.), признавая несомненную ценность денситометрии, отмечают, что метод элюирования дает меньше погрешностей.

При помощи прямого денситометрирования можно точно определить количественные соотношения отдельных фракций без их предварительного элюирования, которое часто трудно осуществить на практике из-за его сложности (Р.Цаневев, Д.Стойнов, 1964).

При этом количественный анализ электрофореграмм в агаровом геле чаще устанавливают методом прямой (или непосредственной) денситометрии в проходящем свете, так как пластинки агарового геля получаются достаточно прозрачными (В.А.Вайчювенас, 1963; A. Вилейшис и соавт., 1965; Р.А.Гуляева, В.А.Савран, 1967; Р.Протокалэ, B. Боеру, 1959 и др.).

Таким же образом считают возможным проводить количественное определение белковых фракций в полиакриламидном и крахмальном гелях (Г.В.Троицкий, 1962; Р.Цаневев, Д.Стойнов, 1964; Е.М.Саминский, 1966; Э.Г.Ларскийи соавт., 1967 и др.).

Однако гель крахмала по сравнению с агаровым и полиакриламидным менее прозрачен, что затрудняет деноитометрию, поэтому требуется предварительное просветление его, для чего, как уже указывалось, предложен ряд методов (Е. Д.Васильев а, 1968; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Ю.Н.Берг, Е.А.Маркина, 1968; В.Х.Панкина, 1971 и др.).

Кроме того, гелевую пластинку необходимо предварительно высушить, что также требует дополнительного времени, навыка и реактивов. Все это существенно усложняет процесс количественной оценки электрофореграмм в крахмальном геле методом прямой денситометрии в проходящем свете, не удовлетворяет полностью исследователей и заставляет искать новые, более простые, доступные, но не менее точные пути количественного анализа белковых фракций.

Учитывая это, для количественной характеристики белковых фракций в крахмальном геле нами использован метод денситометрии с фотографий элекрофореграмм (ЭФГ), т.е. фотоэлектрофореграмм (ФЭФГ) в отраженному не проходящем свете (рис. 2).

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

Для сравнительной оценки точности применявшегося нами варианта денситометрии предварительно был проведен параллельный количественный анализ 19 электрофореграмм белков сыворотки крови, полученных методом электрофореза на бумаге, с помощью денситометра ERL10 (Карл Цейсс, Иена, DDR) путем прямой денситометрии, т.е. в отраженном свете непосредственно с элекрофореграмм и методом непрямой денситометрии также в отраженном свете, но с фотоэлектрофореграмм.

Средние показатели величины каждой из пяти белковых фракций, полученные двумя параллельно проводимыми методами денситометрии и подвергнутые статистическому анализу в целях установления достоверности их различий, представлены в табл.3.

Как видно из табл. 3, количественные показатели величины белковых фракций, полученных при денситометрии с ФЭФГ, статистически значимо не отличаются от аналогичных показателей, полученных путем прямой денситометрии с ЭФГ (Р> 0,3). Это свидетельствует о том, что метод денситометрии с ФЭФГ в отраженном свете не уступает по своей точности методу прямой денситометрии с ЭФГ.

Содержание белка в каждой фракции выражали в относительных (%) и абсолютных (г/л) величинах. Зная относительную величину белковой фракции и содержание общего белка сыворотки крови и мочи (г/л), расчет искомой фракции проводили по следующей формуле:

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

где у — величина искомой фракции, г/л; М — содержание общего белка, г/л; х — величина искомой фракции, %.

Как уже отмечалось, с помощью электрофореза в крахмальном геле в сыворотке крови здорового человека можно выделить до 12—20 и более белковых фракций.

Терминология этих фракций окончательно еще не установлена, но большинство исследователей (Ю.Н.Берг и соавт. 1967; И.И.Иванов, И.А.Пелишенко, 1969; Дж.Уилкинсон, 1968; О.Smithies, 1955, 1959; J.Traeger и соавт., 1965, 1966) пользуются следующими их обозначениями: на электрофореграмме белков в крахмальном геле обычно выявляются две фракции преальбуминов (Pr j, Р), за которыми следует широкая гомогенная фракция альбуминов (А) , затем две-три фракции постальбуминов, за ними фракция с-быстрых глобулинов, обозначаемая чаще р-глобулинов, следующие три (иногда и больше) фракции являются гаптоглобинами (Нр) или обозначаются как ф-фракции; далее расположена фракция медленно движущихся а1-макроглобулинов и фракция b-липопротеинов и, наконец, по другую сторону стартовой линии расположена фракция b-глобулинов.

Схема расположения упомянутых фракций и их количество представлены на рис. 3.

Статистический анализ. Полученные результаты исследования подвергаются статистическому анализу в целях определения достоверности различий сравниваемых абсолютных и относительных величин (Л.С.Каминский, 1964; П.Ф.Рокицкий, 1967; Б.С.Бессмертный, 1967; Д.Сепетлиев, 1968).

Критерий t для абсолютных показателей находим по формуле

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

а для относительных — по формуле:

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

источник

Почечная (истинная) протеинурия бывает функциональной и органической. Среди функциональной почечной протеинурии наиболее часто наблюдаются следующие ее виды:

— физиологическая протеинурия новорожденных, которая исчезает на 4— 10-й день после рождения, а у недоношенных несколько позже;
— ортостатическая альбуминурия, которая характерна для детей в возрасте 7—18 лет и появляется только в вертикальном положении тела;
— транзиторная (инсультная) альбуминурия, причиной которой могут быть различные заболевания органов пищеварения, тяжелая анемия, ожоги, травмы или физиологические факторы: тяжелая физическая нагрузка, переохлаждение, сильные эмоции, обильная, богатая белком пища и др.

Органическая (почечная) протеинурия наблюдается вследствие прохождения белка из крови через поврежденные участки эндотелия почечных клубочков при заболеваниях почек (гломерулонефрит, нефроз, нефросклероз, амилоидоз, нефропатия беременных), расстройствах почечной гемодинамики (почечная венная гипертензия, гипоксия), трофических и токсических (в том числе лекарственных) воздействиях на стенки капилляров клубочков.

Большинство качественных и количественных методов определения белка в моче основаны на его коагуляции в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты).

Среди качественных методов определения бедка в моче наибольшее распространение получили унифицированная проба с сульфосалициловой кислотой и кольцевая проба Геллера.

Унифицированная проба с сульфасалициловой кислотой проводится следующим образом. В 2 пробирки наливают по 3 мл профильтрованной мочи. В одну из них прибавляют 6—8 капель 20 % раствора сульфасалициловой кислоты. На темном фоне сравнивают обе пробирки. Помутнение мочи в пробирке с сульфасалициловой кислотой указывает на наличие белка. Перед исследованием необходимо определить реакцию мочи, и если она щелочная, то подкислить 2—3 каплями 10 % раствора уксусной кислоты.

Проба Геллера основана на том, что при наличии белка в моче на границе азотной кислоты и мочи происходит его коагуляция и появляется белое кольцо. В пробирку наливают 1—2 мл 30 % раствора азотной кислоты и осторожно по стенке пробирки наслаивают точно такое же количество профильтрованной мочи. Появление белого кольца на границе двух жидкостей указывает на наличие белка в моче. Следует помнить, что иногда белое кольцо образуется при наличии большого количества уратов, но в отличие от белкового кольца оно появляется несколько выше границы между двумя жидкостями и растворяется при нагревании [Плетнева Н.Г., 1987].

Из количественных методов наиболее часто применяются:

1) унифицированный метод Брандберга—Робертса—Стольникова, в основу которого положена кольцевая проба Геллера;
2) фотоэлектроколориметрический метод количественного определения белка в моче по помутнению, образующемуся при добавлении сульфасалициловой кислоты;
3) биуретовый метод.

Выявление белка в моче упрощенным ускоренным методом проводят колориметрическим методом с помощью индикаторной бумаги, которую выпускают фирмы «Lachema» (Словакия), «Albuphan», «Ames» (Англия), «Albustix», «Boehringer» (Германия), «Comburtest» и др. Метод заключается в погружении в мочу специальной бумажной полоски, пропитанной тетрабромфеноловым синим и цитратным буфером, которая меняет свой цвет от желтого до синего в зависимости от содержания белка в моче. Ориентировочно концентрацию белка в исследуемой моче определяют с помощью стандартной шкалы. Для получения правильных результатов необходимо соблюдать следующие условия. рН мочи должна быть в пределах 3,0—3,5; при слишком щелочной моче (рН 6,5) будет получен ложноположительный результат, а при слишком кислой моче (рН 3,0) — ложноотрицательный.

Бумага должна находиться в контакте с исследуемой мочой не дольше, чем указано в инструкции, в противном случае тест даст ложноположительную реакцию. Последнюю также наблюдают и при содержании в моче большого количества слизи. Чувствительность различных видов и серий бумаги может быть различной, поэтому к количественной оценке белка в моче этим методом следует относиться осторожно. Определение его количества в суточной моче при помощи индикаторной бумаги невозможно [Плетнева Н.Г., 1987]

Существует несколько способов определения количества белка, выделившегося с мочой за сутки. Наиболее простым является метод Брандберга —Робертса—Стольникова.

Методика. 5-10 мл тщательно перемешанной суточной мочи наливают в пробирку и осторожно по стенкам ее добавляют 30 % раствор азотной кислоты. При наличии белка в моче в количестве 0,033 % (т.е. 33 мг на 1 л мочи) через 2-3 мин появляется тонкое, но четко видимое белое кольцо. При меньшей его концентрации проба отрицательная. При большем содержании белка в моче его количество определяют путем многократных разведений мочи дистиллированной водой до тех пор, пока не перестанет образовываться кольцо. В последней пробирке, в которой еще видно кольцо, концентрация белка будет составлять 0,033 %. Умножив 0,033 на степень разведения мочи, определяют содержание белка в 1 л неразведенной мочи в граммах. Затем рассчитывают содержание белка в суточной моче по формуле:

где К — количество белка в суточной моче (г); х — количество белка в 1 л мочи (г); V — количество мочи, выделенное за сутки (мл).

В норме в течение суток с мочой выделяется от 27 до 150 мг (в среднем 40—80 мг) белка.

Указанная проба позволяет определить в моче только мелкодисперсные белки (альбумины). Более точные количественные методы (колориметрический метод Кьельдаля и др.) довольно сложны и требуют специальной аппаратуры.

При почечной протеинурии с мочой выделяются не только альбумины, но и другие виды белка. Нормальная протеинограмма (по Зейцу и соавт., 1953) имеет следующее процентное содержание: альбуминов — 20 %, α₁-глобулинов — 12 %, α₂-глобулинов — 17 %, γ-глобулинов — 43 % и β-глобулинов — 8 %. Отношение альбуминов к глобулинам изменяется при различных заболеваниях почек, т.е. нарушается количественное соотношение между белковыми фракциями.

Наиболее распространенными методами фракционирования уропротеинов являются следующие: высаливание нейтральными солями, электрофоретическое фракционирование, иммунологические методы (реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини, иммуноэлектрофоретический анализ, преципитационный иммуноэлектрофорез), хроматография, гель-фильтрация, а также ультрацентрифугирование.

В связи с внедрением методов фракционирования уропротеинов, основанных на изучении электрофоретической подвижности, вариабильности молекулярной массы, размеров и формы молекул уропротеинов, появилась возможность выделять характерные для того или иного заболевания типы протеинурии, изучать клиренсы индивидуальных плазменных белков. К настоящему времени в моче идентифицировано свыше 40 плазменных белков, В том числе в нормальной моче 31 плазменный белок [Berggard, 1970].

В последние годы появилось понятие селективности протеинурии. В 1955 г. Hardwicke и Squire сформулировали понятие «селективная» и «неселективная» протеинурия, определив, что фильтрация плазменных белков в мочу подчиняется определенной закономерности: чем больше молекулярная масса белка, экскретируемого в мочу, тем меньше его клиренс и тем ниже концентрация его в окончательной моче. Протеинурия, соответствующая этой закономерности, является селективной в отличие от неселективной, для которой характерным является извращение выведенной закономерности.

Обнаружение в моче белков с относительно большой молекулярной массой свидетельствует об отсутствии избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении. В этих случаях говорят о низкой селективности протеинурии. Поэтому в настоящее время широкое распространение получило определение белковых фракций мочи с использованием методов электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле. По результатам этих методов исследования можно судить о селективности протеинурии.

По данным В.С.Махлиной (1975), наиболее оправданным является определение селективности протеинурии путем сравнения клиренсов 6—7 индивидуальных белков плазмы крови (альбумина, транеферрина, α₂ — макроглобулина, IgA, IgG, IgM) с использованием точных и специфичных количественных иммунологических методов реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини, иммуноэлектрофоретического анализа и преципитального иммуноэлектрофореза. Степень селективности протеинурии определяют по индексу селективности, представляющего собой отношение сравниваемого и эталонного белков (альбумина).

Изучение клиренсов индивидуальных плазменных белков позволяет получить достоверные сведения о состоянии фильтрационных базальных мембран клубочков почки. Связь между характером экскретируемых в мочу белков и изменениями базальных мембран клубочков настолько выражена и постоянна, что по уропротеинограмме можно косвенно судить о патофизиологических изменениях в клубочках почек. В норме средний размер пор гломерулярной базальной мембраны составляет 2,9—4 А° НМ, которые могут пропускать белки, имеющие молекулярную массу до 10 4 (миоглобулин, кислый α₁ — гликопротеин, легкие цепи иммуноглобулинов, Fc и Fab — фрагменты IgG, альбумин и трансферрин).

При гломерулонефрите, нефротическом синдроме размеры пор в базальных мембранах клубочков увеличиваются, в связи с чем базальная мембрана становится проницаемой для белковых молекул большого размера и массы (церулоплазмин, гаптоглобин, IgG, IgA и др.). При крайней степени повреждения клубочков почек в моче появляются гигантские молекулы белков плазмы крови (α₂-макроглобулин, IgM и β₂-липопротеин).

Определяя белковый спектр мочи, можно сделать заключение о преимущественном поражении тех или иных участков нефрона. Для гломерулонефрита с преимущественным поражением гломерулярных базальных мембран характерно наличие в моче крупно- и среднемолекулярных белков. Для пиелонефрита с преимущественным поражением базальных мембран канальцев характерны отсутствие крупномолекулярных и наличие повышенных количеств средне- и низкомолекулярных белков.

Концентрацию этого белка в плазме крови и моче определяют радиоиммунологическим методом с помощью стандартного набора «Phade-bas β₂-mikroiest» (фирма «Pharmaсia», Швеция). В сыворотке крови здоровых людей содержится в среднем 1,7 мг/л (колебания от 0,6 до 3 мг/л), в моче — в среднем 81 мкг/л (максимально 250 мкг/л) β₂-микроглобулина. Превышение его в моче свыше 1000 мкг/л — явление патологическое. Содержание β₂-микроглобулина в крови увеличивается при заболеваниях, сопровождающихся нарушением клубочковой фильтрации, в частности при остром и хроническом гломерулонефрите, поликистозе почек, нефросклерозе, диабетической нефропатии, острой почечной недостаточности.

Концентрация β₂-микроглобулина в моче повышается при заболеваниях, сопровождающихся нарушением реабсорбционной функции канальцев, что приводит к увеличению экскреции его с мочой в 10—50 раз, в частности, при пиелонефрите, ХПН, гнойной интоксикации и др. Характерно, что при цистите в отличие от пиелонефрита не наблюдается увеличения концентрации β₂-микроглобулина в моче, что может быть использовано для дифференциальной диагностики этих заболеваний. Однако при интерпретации результатов исследования надо учитывать, что любое повышение температуры всегда сопровождается увеличением экскреции β₂-микроглобулина с мочой.

Средние молекулы (СМ), иначе называемые белковыми токсинами, представляют собой вещества с молекулярной массой 500—5000 дальтон. Физическая структура их неизвестна. В состав СМ входят по меньшей мере 30 пептидов: окситоцин, вазопрессин, ангиотензин, глюкагон, адренокортикотропный гормон (АКТГ) и др. Избыточное накопление СМ наблюдается при снижении функции почек и содержании в крови большого количества деформированных белков и их метаболитов. Они обладают разнообразным биологическим действием и нейротоксичны, вызывают вторичную иммунодепрессию, вторичную анемию, угнетают биосинтез белка и эритропоэз, тормозят активность многих ферментов, нарушают течение фаз воспалительного процесса.

Уровень СМ в крови и моче определяют скрининговым тестом, а также путем спектрофотометрии в ультрафиолетовой зоне по длине волны 254 и 280 мм на спектрофотометре ДИ-8Б, а также динамической спектрофотометрии с компьютерной обработкой в диапазоне волн 220—335 нм на том же спектрометре фирмы Beckman. За норму принимают содержание СМ в крови, равное 0,24 ± 0,02 усл. ед., а в моче — 0,312 ± 0,09 усл. ед.
Будучи нормальными продуктами жизнедеятельности организма, они удаляются из него в норме ночками путем гломерулярной фильтрации на 0,5 %; 5 % их утилизируется другим путем. Все фракции СМ подвергаются канальцевой реабсорбции.

Кроме белков плазмы крови, в моче могут быть неплазменные (тканевые) протеины. По данным Buxbaum и Franklin (1970), неплазменные белки составляют приблизительно 2/3 всех биоколлоидов мочи и значительную часть уропротеинов при патологической протеинурии. Тканевые белки попадают в мочу непосредственно из почек или органов, анатомически связанных с мочевыми путями, или попадают из других органов и тканей в кровь, а из нее через базальные мембраны клубочков почки — в мочу. В последнем случае экскреция в мочу тканевых протеинов происходит аналогично выведению плазменных белков различной молекулярной массы. Состав неплазменных уропротеинов чрезвычайно разнообразен. Среди них гликопротеины, гормоны, антигены, ферменты (энзимы).

Тканевые протеины в моче выявляют с помощью обычных методов белковой химии (ультрацентрифугирование, гель-хроматография, различные варианты электрофореза), специфических реакций на ферменты и гормоны и иммунологических методов. Последние позволяют также определить концентрацию неплазменного уропротеина в моче и в ряде случаев определить тканевые структуры, ставшие источником его появления. Основным методом выявления в моче неплазменного белка является иммунодиффузионный анализ с антисывороткой, полученной иммунизацией экспериментальных животных мочой человека и истощенной (адсорбированной) в последующем белками плазмы крови.

При патологическом процессе наблюдаются глубокие нарушения жизнедеятельности клеток, сопровождающиеся выходом внутриклеточных ферментов в жидкостные среды организма. Энзимодиагностика базируется на определении ряда ферментов, выделившихся из клеток пораженных органов и не свойственных сыворотке крови.
Исследования нефрона человека и животных показали, что в отдельных его частях имеется высокая ферментативная дифференциация, тесно связанная с функциями, которые выполняет каждый отдел. В клубочках почки содержится относительно небольшое количество различных энзимов.

Клетки почечных канальцев, особенно проксимальных отделов, содержат максимальное количество энзимов. Высокая их активность наблюдается в петле Генле, прямых канальцах и собирательных трубочках. Изменения активности отдельных энзимов при различных заболеваниях почек зависят от характера, остроты и локализации процесса. Они наблюдаются до появления морфологических изменений в почках. Поскольку содержание различных ферментов четко локализовано в нефроне, определение того или иного фермента в моче может способствовать топической диагностике патологического процесса в почках (клубочки, канальцы, корковый или мозговой слой), дифференциальной диагностике почечных заболеваний и определению динамики (затухание и обострение) процесса в почечной паренхиме.

Дли дифференциальной диагностики заболеваний органов мочеполовой системы применяют определение активности в крови и моче следующих ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), лейцинаминопептидазы (ЛАП), кислой фосфатазы (КФ), щелочной фосфатазы (ЩФ), β-глюкуронидазы, глютамино-щавелевоуксусной трансаминазы (ГЩТ), альдолазы, трансамидиназы и др. Активность ферментов в сыворотке крови и в моче определяют с помощью биохимических, спектрофотометрических, хроматографических, флуориметрических и хемилюминесцентных методов.

Энзимурия при заболеваниях почек более выражена и закономерна, чем энзимемия. Она особенно сильно выражена в острой стадии заболевания (острый пиелонефрит, травма, распад опухоли, инфаркт почки и т.д.). При этих заболеваниях обнаруживается высокая активность трансамидиназы, ЛДГ, ЩФ и КФ, гиалуронидазы, ЛАП, а также таких неспецифических энзимов, как ГЩТ, каталаза [Полянцева Л.Р., 1972].

Селективная локализация ферментов в нефроне при обнаружении ЛАП и ЩФ в моче позволяет с уверенностью говорить об острых и хронических заболеваниях почек (острая почечная недостаточность, некроз почечных канальцев, хронический гломерулонефрит) [Шеметов В.Д., 1968]. По данным А.А.Карелина и Л.Р.Полянцевой (1965), трансамидиназа содержится лишь в двух органах — почке и поджелудочной железе. Она является митохондриальным ферментом почек и в норме в крови и моче отсутствует. При различных заболеваниях почек трансамидиназа появляется в крови и в моче, а при поражении поджелудочной железы — только в крови.

Дифференциальным тестом в диагностике гломерулонефрита и пиелонефрита Krotkiewski (1963) считает активность ЩФ в моче, повышение которой более характерно для пиелонефрита и диабетического гломерулосклероза, чем для острого и хронического нефрита. Нарастающая в динамике амилаземия при одновременном снижении амилазурии может указывать на нефросклероз и сморщивание почки, ЛАП имеет наибольшее значение при патологических изменениях в клубочках и извитых канальцах почки, поскольку содержание ее в этих отделах нефрона более высокое [Шепотиновский В.П. и др., 1980]. Для диагностики волчаночного нефрита рекомендуется определение β-глюкуронидазы и КФ [Приваленко М.Н. и др., 1974].

При оценке роли энзимурии в диагностике заболеваний почек следует учитывать следующие положения. Энзимы, будучи по своей природе белками, при малой молекулярной массе могут проходить через неповрежденные клубочки, определяя так называемую физиологическую энзимурию. Среди этих энзимов постоянно определяются в моче α-амилаза (относительная молекулярная масса 45 ООО) и уропепсин (относительная молекулярная масса 38000).

Наряду с низкомолекулярными энзимами в моче здоровых лиц могут быть обнаружены в небольшой концентрации и другие энзимы: ЛДГ, аспартат- и аланинаминотрансферазы, ЩФ и КФ, мальтаза, альдолаза, липаза, различные протеазы и пептидазы, сульфатаза, каталаза, рибонуклеаза, пероксидаза [King, Воусе, 1963].

Высокомолекулярные энзимы с относительной молекулярной массой больше 70000-100000, по мнению Richterich (1958) и Hess (1962), могут проникать в мочу лишь при нарушении проницаемости клубочкового фильтра. Нормальное содержание ферментов в моче не позволяет исключить патологический процесс в почке при окклюзии мочеточника. При эпзимурии возможен выход энзимов не только из самих почек, но и из других паренхиматозных органов, клеток слизистых оболочек мочевых путей, предстательной железы, а также форменных элементов мочи при гематурии или лейкоцитурии.

Большинство энзимов неспецифично по отношению к почке, поэтому откуда происходят энзимы, обнаруженные в моче здоровых и больных, установить трудно. Однако степень энзимурии даже дли неспецифичных энзимов при поражении почек бывает выше нормы или той, которая наблюдается при заболеваниях других органов. Более ценную информацию может дать комплексное исследование в динамике ряда ферментов, особенно органоспецифичных, таких как трансаминаза.

В решении вопроса о почечном происхождении энзима в моче помогает исследование изоэнзимов с выявлением фракций, типичных для изучаемого органа. Изоэнзимы — это энзимы, изогенные по действию (катализируют одну и ту же реакцию), но гетерогенные по химической структуре и другим свойствам. Каждая ткань имеет характерный для нее изоэнзимный спектр. Ценными методами разделения изоэнзимов являются электрофорез в крахмальном и полиакриламидном геле, а также ионообменная хроматография.

При миеломной болезни и макроглобулинемии Вальденстрема в моче обнаруживают белок Бенс-Джонса. Метод обнаружения названного белка в моче основан на реакции термопреципитации. Применявшиеся ранее методы, с помощью которых оценивают растворение этого белка при температуре 100 °С и повторное осаждение при последующем охлаждении, ненадежны, так как не все белковые тела Бенс-Джонса обладают соответствующими свойствами.

Более достоверно выявление этого парапротеина путем осаждения его при температуре 40 -60 °С. Однако и в этих условиях осаждения может не произойти в слишком кислой (рН 6,5) моче, при низкой ОПМ и низкой концентрации белка Бенс-Джонса. Наиболее благоприятные условия для его осаждения обеспечивает методика, предложенная Patnem: 4 мл профильтрованной мочи смешивают с 1 мл 2 М ацетатного буфера рН 4,9 и согревают 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белка Бенс-Джонса в течение первых 2 мин появляется выраженный осадок.

При концентрации белка Бенс-Джонса меньше 3 г/л проба может быть отрицательной, но на практике это встречается крайне редко, поскольку его концентрация в моче, как правило, более значительна. На пробы с кипячением нельзя вполне полагаться. С полной достоверностью он может быть обнаружен в моче иммуно-электрофоретическим методом с использованием специфических сывороток против тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.

источник