Метод электрофореза нуклеиновых кислот

(практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.

В книге детально описана современная аппаратура, изложены практические приемы постановки экспериментов, проанализировано влияние на их результаты различных физико-химических параметров. Рассмотрены все варианты и модификации описываемых методов. Даны ссылки на оригинальные экспериментальные работы, опубликованные в ведущих журналах мира по декабрь 1980 г.

Книга рассчитана на биохимиков, медиков, фармакологов, работников пищевой промышленности. Табл. 4, илл. 77, библиогр. 294 назв.

Ответственный редактор член-корреспондент АН СССР Г. П. ГЕОРГИЕВ

Электрофорез занимает сейчас центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала (рис. 1, справа).

На рисунке, помимо рабочего канала (трубки), показаны некоторые необходимые компоненты системы. Во-первых, это два электрода, представленные спиральками из платиновой проволоки, а во-вторых, электродные резервуары. Через находящиеся в них буферные растворы и рабочий канал замыкается электрическая цепь между электродами.

Рабочий канал не случайно заштрихован. Дело не только в том, что, будь он просто заполнен жидкостью, изображенная Схема выглядела бы нелепо, так как буфер из трубки и верхнего резервуара должен был вылиться в нижний. Эту трудность можно обойти, если придать каналу с жидкостью U-образную форму. Такие приборы использовались на первых этапах развития метода (электрофорез в свободной жидкости). Хуже другое: в жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны. Поэтому в современных приборах рабочий канал заполняют гелем, что на схеме изображено штриховкой. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая (гидрофильная) пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Вместе с тем используемые гели содержат очень много жидкости (80—99,5%), в которой (т. е. в рабочем буфере) и мигрируют макромолекулы. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится.

В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.

Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серь езно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы белков и нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Однако проблема теплоотвода и, главное, его равномерности по всему гелю очень важна еще и потому, что скорость миграции макромолекул в электрическом поле зависит от температуры. Неравномерность нагревания геля неизбежно приведет к искажению зон и ухудшению их разделения.

В ходе электрофореза зоны растворенных макромолекул остаются невидимыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые макромолекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндрического ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы разделившихся компонентов исходной смеси белков.

Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат разделяется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. На фотографии такой пластины (рис. 3) хорошо видна серия параллельных «треков», исчерченных поперечными полосами окрашенных зон, в которых располагаются (в данном случае) олигонуклеотиды различной длины.

Вместо окрашивания или наряду с ним часто используют методы обнаружения разделенных зон по их радиоактивности. К ним относятся приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.

Преимущества пластин не ограничиваются экономией времени и места при обработке большого количества препаратов. Важнее другое: поскольку гель заливают в форму для полиме Рис. 2. Трубки с ПААГ после окончания электрофореза Горизонтальные полоски — окрашенные белковые зоны Рис. 3. Пластина агарозного геля после разделения фрагментов ДНК Окраска люминесцентным красителем (бромистым этидием) ризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содержание добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следовательно, плотность тока и напряженность электрического поля также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия фракционирования разных препаратов и дает возможность достоверного сопоставления их состава путем сравнения положения полос в параллельных треках. Если добавить к этому значительно более выгодные условия теплоотвода от тонкой пластинки геля по сравнению с цилиндром, то станет понятной исключительная популярность этой системы электрофореза в последние годы.

Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются современные методы электрофореза. В качестве «носителей» жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества, однако для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез, поэтому только он и будет подробно описан.

Рассмотрение начинается с характеристики исходных материалов и процессов их полимеризации. Затем, чтобы освободить дальнейшее изложение от повторений, будет описана техника приготовления гелей и соответствующая аппаратура. Гла ва 3 посвящена электрофорезу белков. После замечаний общего характера будут подробно рассмотрены различные современные приемы и варианты электрофореза. В отдельные разделы вынесены способы окрашивания, элюции из геля и регистрации радиоактивности фракционированных белков, поскольку эти приемы в большинстве своем одинаковы для всех вариантов электрофореза. Главу заключает описание способов препаративного разделения белков. Такая же структура изложения принята для рассмотрения электрофореза нуклеиновых кислот (глава 4). Замечания общего характера, изложенные в предыдущей главе, во многом относятся к фракционированию обоих типов биополимеров, поэтому здесь будут рассмотрены только специфические особенности электрофореза нуклеиновых кислот. В обеих последних главах для иллюстрации различных экспериментальных приемов электрофоретического разделения биополимеров разбираются многие новейшие работы. Разумеется, при этом приводятся только наиболее существенные данные. Более детальное описание следует искать в оригинальных публикациях, на которые будут даны ссылки.

Акриламид (СН2?=?СН?—?CONH2) представляет собой белый кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный препарат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный водный раствор должен иметь рН не ниже 5, а оптическая плотность 1%-ного раствора при 290 нм (А290) не должна превышать 0,15. Такой препарат можно использовать без дополнительной очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоду. В этих условиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воздействует на кожу и нервную систему), поэтому отвешивать и растворять его следует в перчатках и под тягой.

Недостаточно чистый препарат можно перекристаллизовать. Для этого 70 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при 50°, фильтруют при этой же температуре, затем охлаждают до —?20°, быстро промывают кристаллы холодным хлороформом и высушивают в вакуум-эксикаторе. Для освобождения от УФ-поглощающих примесей акриламид можно обработать активированным углем. Для этого в маточный 30?—?40%-ный водный раствор акриламида в смеси с метиленбисакриламидом добавляют активированный уголь (примерно 50 г/л), суспензию перемешивают в течение 30 мин и фильтруют сначала через бумажный, а затем через стекловолокнистый фильтр.

NN’-Метиленбисакриламид («Бис») – (CH2?=?CH?—?CONH)2?– СН2 — используют в качестве «сшивки» линейных полимеров акриламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02% акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке. В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из ацетона (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламид. Условия хранения и токсичность — такие же, как у акриламида.

В качестве «сшивки» иногда используют этилендиакрилат — СН2?=?СН?—?СО?—?O?—?СН2?—?СН2?—?О?—?СО?—?СН?=?СН2, а также NN’-диаллилтартардиамид (ДАТД) — CH2?=?CH?—?CH2?—?NH?— CO?—?CH(OH)?—?CH(OH)?—?CO?—?NH?—?CH2?—?CH?=?CH2. С их помощью получают «растворимые» гели. В первом случае эфирную связь можно разорвать обработкой геля щелочью или водным раствором пиперидина. Гели, сшитые ДАТД, растворяются за 20?—?30 мин при комнатной температуре в 2%-ной йодной кислоте. Использование растворимых гелей на основе акриламида будет рассмотрено ниже.

Персульфат аммония производится в виде белого кристаллического порошка или гранул. Его используют в качестве инициатора процесса полимеризации. Гомолитический разрыв связи между атомами кислорода в молекуле персульфата аммония приводит к образованию двух достаточно долго живущих свободных радикалов с одним неспаренным электроном у атома кислорода:

Такой радикал стимулирует разрыв двойной связи в молекуле акриламида и присоединяется к ней таким образом, что снова образуется радикал с неспаренным электроном, но уже у атома углерода:

Этот радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи и присоединение следующей молекулы акриламида с образова нием нового радикала и т. д. Цепная реакция полимеризации идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой, не образуют обычную ковалентную связь. По тому же механизму в растущую цепочку линейного полимера может одной из своих концевых винильных групп встроиться и метиленбисакриламид. Второй его конец может точно так же оказаться в составе другой линейной полимерной цепочки, и образуется «сшивка».

Персульфат аммония в водном растворе постепенно разлагается, поэтому следует использовать только свежеприготовленные растворы. Сухой препарат хранится лучше, хотя и он медленно разлагается с выделением кислорода. Продажные препараты для электрофореза обычно достаточно хорошо очищены, но их следует проверять. Если 1%-ный раствор персульфата аммония в воде имеет рН?2, то он непригоден. Отметим попутно, что катион не играет роли в процессе инициации. Можно с успехом использовать, например, персульфат калия.

Рибофлавин представляет собой кристаллы в виде желтооранжевых игл. Он малорастворим в воде, но хорошо растворяется в слабощелочных водных буферах; растворы имеют желтозеленую окраску.

Рибофлавин также может служить инициатором полимеризации. При освещении его водного раствора видимым светом (445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лейкорибофлавина. Последний снова легко окисляется растворенным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет разложения перекиси продуцируются свободные радикалы (НО?), инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида.

К чистоте рибофлавина можно предъявлять не слишком строгие требования, так как он, являясь очень эффективным инициатором, используется в гораздо меньших концентрациях (

?0,005%), чем персульфат аммония.

Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) — (СН3)2N?—?CH2?—?CH2?— —?N(СН3)2 — представляет собой бесцветную жидкость с плотностью 0,78 г/см3. Концентрация неразбавленного ТЕМЕД — около 6,7 М.

ТЕМЕД не является, собственно говоря, инициатором полимеризации акриламида, но служит катализатором этого процесса, заметно ускоряя его протекание. Он эффективен только в своей неионизированной форме, поэтому при полимеризации акриламида в кислой среде содержание ТЕМЕД следует значительно увеличить. В нейтральной или щелочной средах ТЕМЕД можно вносить в количестве, эквимолярном по отношению к персульфату.

В качестве катализатора в последнее время нередко используют диметиламинопропионитрил — (CH3)2N?—?СН2?—?CH2?—?CN (M?=?102). Он более эффективен, чем ТЕМЕД, поэтому его вносят в три-четыре раза меньше, чем персульфата аммония.

При подготовке определенной серии опытов удобно заранее приготовить концентрированный (30?—?40%) водный раствор акриламида и метиленбисакриламида с определенным соотношением обоих мономеров. Такой раствор можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель. Так же хранят и маточный раствор буфера, например 10-кратной концентрации. ТЕМЕД хранится хорошо, а персульфат аммония растворяют в воде непосредственно перед началом опыта.

Для приготовления геля маточные растворы мономеров и буфера смешивают в такой пропорции, чтобы получить нужную конечную концентрацию акриламида и буфера, дополняют до расчетного объема водой и вносят ТЕМЕД. После этого раствор деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к водоструйному насосу, добавляют расчетный объем раствора персульфата и заливают в трубку или между стеклами для формирования пластин. При правильном выборе концентраций персульфата и ТЕМЕД полимеризация занимает 30?—?40 мин. Ее следует вести вдали от яркого источника света.

Рассмотрим некоторые факторы, влияющие на этот процесс. Наибольшую опасность для нормального протекания полимеризации акриламида представляет растворенный в воде кислород, молекула которого является определенного рода бирадикалом и потому способна оборвать цепную реакцию свободнорадикальной полимеризации акриламида. Деаэрация смеси растворов необходима именно для удаления из нее растворенного кислорода. Ее можно вести достаточно энергично и с перемешиванием — так, чтобы жидкость при пониженном давлении закипела, но как только интенсивное выделение пузырей газа закончится, деаэрацию следует прекратить, не допуская заметного испарения воды. Обычно эта процедура занимает несколько минут при комнатной температуре.

Кислород воздуха в контакте с раствором мономеров может помешать полимеризации, поэтому на поверхность раствора осторожно наслаивают до высоты 3?—?5 мм деаэрированную кипячением воду или изобутанол. Наслаивать следует по стенке формы через иглу от шприца с помощью перистальтического насоса. Им же удобно отсосать воду после окончания полимеризации геля. Вначале граница между гелем и водой исчезает, но затем вновь появляется, что указывает на окончание процесса полимеризации.

Если в качестве инициатора используют рибофлавин, то форму с раствором мономеров освещают люминесцентной лампой «дневного света» с расстояния около 5 см в течение 30?—?45 мин. Уже указывалось, что рибофлавин является более эффективным инициатором, чем персульфат. Кроме того, продукты его распада не опасны для белков и нуклеиновых кислот, в то время как ион персульфата может вступать в реакцию с белками, созда вая артефакты при их фракционировании. В тех случаях, когда это существенно, персульфат удаляют путем предварительного электрофореза («преэлектрофореза») геля до внесения в него препарата, однако полностью это сделать не удается. Тем не менее в последние годы в качестве инициатора предпочтение отдают персульфату, поскольку при работе с рибофлавином довольно трудно подобрать оптимальную степень деаэрирования растворов. С одной стороны, растворенный кислород препятствует полимеризации, а с другой — он необходим, хотя и в небольшом количестве, для самого процесса инициации с участием рибофлавина.

Полимеризация — экзотермический процесс, поэтому в случае высокой концентрации акриламида во избежание образования пузырей газа и нарушения однородности геля необходимо обеспечить отвод тепла. Вместе с тем скорость полимеризации увеличивается с ростом температуры за счет ускорения образования свободных радикалов. Этим можно воспользоваться для замедления полимеризации: при охлаждении геля на 1° ее продолжительность увеличивается примерно на 2 мин. Полимеризацию гелей, содержащих более 15% акриламида, лучше вести на холоду.

Гель получается наиболее однородным, если время полимеризации составляет 30?—?40 мин. Обычно этого добиваются эмпирически, подбирая оптимальную концентрацию персульфата. Она может варьировать в пределах от 0,02 до 0,2% в зависимости от концентрации акриламида и качества самого персульфата. С увеличением содержания акриламида концентрацию персульфата приходится уменьшать. Имеет смысл предварительно внести различные количества данного препарата персульфата в ряд пробирок с рабочим раствором мономеров акриламида, наблюдая продолжительность полимеризации в них.

источник

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например, стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала. В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.

Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат разделяется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. Вместо окрашивания или наряду с ним часто используют методы обнаружения разделенных зон по их радиоактивности. К ним относятся приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.

Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенные индивидуальные белки нужны для изучения их первичной структуры, получения кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией.

Некоторые очищенные индивидуальные белки используют в медицине как лекарственные препараты, например гормон инсулин применяют для лечения сахарного диабета, а пищеварительные ферменты поджелудочной железы назначают при нарушении её функций в качестве заместительной терапии. Кроме того, очищенные ферменты часто используют в биохимических исследованиях в качестве химических реактивов для определения веществ в биологических жидкостях.

Большинство методов, используемых для очистки индивидуальных белков, основано на различиях их физико-химических свойств, а также возможности специфично связываться с лигандом.

Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:

· дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;

· фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;

· экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);

· разделение смеси белков на индивидуальные белки.

Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.

Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

В результате попеременного замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.

Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.

При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.

Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их Особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.

Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков — их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.

источник

Электрофорез оц- и дц-нуклеиновых кислот в неденатурирующих и денатурирующих условиях. Зависимость подвижности нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий электрофореза. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего образования

«НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МОРДОВСКИЙ

Факультет биотехнологии и биологии

Кафедра биотехнологии, биоинженерии и биохимии

«Электрофорез белков и нуклеиновых кислот»

202 группы направления подготовки 020501.65 Славкина О.А.

Проверил: канд., биол., наук, преподаватель кафедры биотехнологии, биоинженерии и биохимии И.В. Сюсин

Введение

1. Электрофорез нуклеиновых кислот
1.1 Электрофорез НК в неденатурирующих условиях. Зависимость подвижности оц — и дц — нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий э/ф (% и тип геля). Подвижность кольцевых молекул дц-ДНК, влияние на нееEtBr
1.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность
1.2.1 Щелочные гели
1.2.2 Денатурирующие гели с формамидом
1.2.3 Денатурирующие гели с формальдегидом.
1.2.4 Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем
1.3 Разделение цепей дц-ДНК электрофорезом: принцип и особенности электрофореза
1.4 Двумерный электрофорез нуклеиновых кислот
2. Электрофорез белков
2.1 Электрофорез в неденатурирующих условиях Параметр разделения
2.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. — Денатурация белка. Параметр разделения. — ПринципDISC-электрофореза (система буферов Орнштейна и Дэвиса, электрофорезSDS-денатурированных белков по Лэммли). Использование градиента концентрации геля, равноесный электрофорез
2.3 Изоэлектрофокусирование. — Принцип метода, параметр разделения. — Амфолины
2.4 Двумерный электрофорез белков
Заключение
Список использованных источников

Под действием электрического поля заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление носит название электрофореза. Скорость движения частицы (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность см 2 •с -1 •В -1 , а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ в аналитических или препаративных целях. Определение подвижности используется также для характеристики вещества.

Существуют три основных типа электрофоретических систем — электрофорез с подвижной границей (метод подвижной границы), зональный электрофорез и стационарный (или вытесняющий) электрофорез. В системах первого типа электрическое поле прикладывается к исходно резкой границе между раствором макромолекул и буфером. Скорость миграции заряженных частиц определяется путем наблюдения за перемещением этой границы. Если раствор содержит гетерогенную смесь ионизированных макромолекул, то можно увидеть множество движущихся границ. В такой системе индивидуальные компоненты нельзя разделить на отдельные зоны, так как наслоенный сверху буферный раствор имеет более низкую плотность по сравнению с находящимся под ним раствором макромолекул. Если бы и удалось достигнуть разделения зон, то все равно произошло бы их перемешивание, так как плотность раствора внутри этих зон была бы выше, чем между ними.

В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. Существует несколько способов получения стабильных зон. В свободном растворе зоны можно стабилизировать с помощью вращения или непрерывного потока тонкого слоя жидкости. В качестве среды для зонального электрофореза могут успешно применяться градиенты плотности. Но наиболее широко используемый вариант зонального электрофореза основан на применении пористой стабилизирующей среды, такой, как фильтровальная бумага, блоки гранулированного материала или различные гели.

Электромиграция третьего типа (стационарный, или вытесняющий, электрофорез) характеризуется тем, что через некоторое время после начала разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся два метода: изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т.е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза.

В составе нуклеиновых кислот имеется некоторое количество основных групп, эти соединения нельзя подвергать электрофорезу в виде катионов, так как при низких значениях pH высокомолекулярные нуклеиновые кислоты нерастворимы в воде. В нейтральной и щелочной средах молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, поскольку их заряд определяется диссоциацией фосфатных групп. Оливера и др. обнаружили, что в этом диапазоне значений pH электрофоретическая подвижность РНК и денатурированной ДНК в свободном растворе не зависит от их молекулярной массы. Такая закономерность объясняется постоянством отношения заряда молекулы к ее массе и указывает на то, что нуклеиновые кислоты невозможно разделить с помощью электрофореза с подвижной границей.

Для электрофоретического разделения различных полинуклеотидов используют эффект молекулярного сита, присущий целому ряду гелей. Детальные исследования показали, что посредством электрофореза в гелях можно получить данные о некоторых характеристиках молекул нуклеиновых кислот. Так, например, методом электрофореза можно определить молекулярную массу того или иного полинуклеотида и установить, является ли он рибо- или дезоксирибонуклеотидом. Кроме того, можно выяснить, состоит ли данная молекула из одной или двух полинуклеотидных цепей, а в случае ДНК определить, какую форму имеет молекула — линейную или кольцевую. Несмотря на существование более точных физических и химических методов определения указанных свойств, электрофорез в некоторых отношениях имеет преимущество перед ними. Оно состоит в том, что электрофоретические методы относительно просты, требуют сравнительно недорогого оборудования и могут быть использованы в тех случаях, когда для анализа доступно лишь небольшое количество неочищенного материала. Некоторые физические параметры разделенных нуклеиновых кислот изучают, не прибегая к их элюции из гелей. Фрагменты геля, содержащие анализируемые зоны, вырезали, промывали соответствующим раствором, вставляли в кварцевые трубки и с помощью спектрофотометра определяли изменения оптической плотности, вызванные нагреванием.

Перечисленные выше факты позволяют понять, почему, начиная с момента своего появления, электрофорез нуклеиновых кислот находит все более широкое применение в биохимии, генетике, вирусологии, микробиологии и других областях биологии.

1.1 Электрофорез НК в неденатурирующих условиях. Зависимость подвижности оц — и дц — нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий э/ф (% и тип геля). Подвижность кольцевых молекул дц-ДНК, влияние на нее EtBr

Электрофорез в агарозном геле — стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности. Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем — бромистым этидием в низкой концентрации.

Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется пятью главными параметрами, рассмотренными ниже.

Размер молекул ДНК. Молекулы линейной двухцепочечной ДНК перемещаются в геле предположительно одним концом вперед со скоростями, обратно пропорциональными десятичному логарифму их молекулярных масс (Таблица 1)

Концентрация агарозы. Фрагменты ДНК данного размера перемещаются в геле, содержащем разные концентрации агарозы, с разными скоростями. Между логарифмом электрофоретической подвижности ДНК m и концентрацией геля t существует прямая зависимость. Таким образом, применяя гели разных концентраций, можно разделить большой набор фрагментов ДНК, различиающихся по размеру (Таблица 2).

Конформация ДНК. ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформации, например кольцевая неповрежденная (форма I), кольцевая с одноцепочечным разрывом (форма II) и линейная (форма III), движутся в агарозном геле с разными скоростями. Относительная подвижность трех указанных форм зависит главным образом от концентрации агарозы в геле, а также и от таких факторов, как сила тока, ионная сила буфера или плотность сверхспиральных витков в форме I. В одних условиях форма I перемещается быстрее, а в других — медленнее, чем форма III.

ДНК (одно — и двухцепочечные) и РНК при ЭФ движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные той же длины. Поскольку молекулярная масса НК пропорциональна их длине (в парах нуклеотидов или в тысячах пар нуклеотидов), можно построить стандартную кривую зависимости расстояния, на которое перемещается маркерный фрагмент, от десятичного логарифма длины этого фрагмента. С ее помощью можно определять размеры фрагментов нуклеиновых кислот в данном препарате по расстоянию, на которое они перемещаются при электрофорезе.

Одноцепочечные молекулы ДНК с мол. массой от 1,2 млн. до 40 млн. можно разделять в 0,6% -ном агарозном геле при условии, что разница в молекулярной массе между молекулами составляет не менее 5%.

Подвижность двухцепочечных молекул ДНК почти не зависит от их молекулярной массы. С помощью электрофореза в агарозном геле можно также разделять комплементарные цепи ДНК бактериофагов.

Описан простой метод отделения линейных ДНК от открытых кольцевых. Перед полимеризацией геля препарат ДНК смешивают с раствором агарозы. В процессе гелеобразования кольцевые молекулы захватываются гелем, тогда как линейные молекулы остаются свободными и могут быть затем выделены путем электрофореза.

Чтобы однозначно определить конформацию ДНК, необходимо провести ее электрофорез в присутствии возрастающих концентраций бромистого этидия. С увеличением концентрации красителя число его молекул, связанных с ДНК, растет. При этом отрицательные сверхспиральные витки в молекулах формы I постепенно исчезают, а скорость движения ДНК в геле уменьшается. При некоторой критической концентрации свободных молекул красителя, когда в ДНК больше не остается сверхспиральных витков, скорость движения формы I достигает минимальной величины. Последующее добавление новых порций бромистого этидия приводит к образованию положительных сверхспиральных витков, в результате чего подвижность формы I начинает быстро возрастать. Подвижность формы II и формы III в описанных условиях снижаются, хотя и по-разному, вследствие нейтрализации зарядов и увеличения жесткости молекул ДНК под влиянием бромистого этидия. Для большинства препаратов ДНК, находящейся в форме I, критическая концентрация бромистого этидия находится в области 0,1 — 0,5 мкг/мл.

Напряженность электрического поля. При низких напряженностях скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. Однако с увеличением напряженности электрического поля подвижность фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой дифференциально возрастает. Следовательно, с увеличением напряженности область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается. Максимальное разделение фрагментов происходит при напряженности, и не превышающей 5 В/см.

Состав оснований и температура. Электрофоретическое поведение ДНК в агарозных гелях слабо зависит от состава оснований ДНК (Thomas, Davis, 1975) или температуры геля. В агарозных гелях в области температур от 4 до 30 о С изменения относительной электрофоретической подвижности фрагментов ДНК разного размера не наблюдается. Обычно электрофорез в агарозных гелях ведут при комнатной температуре. Однако следует отметить, что гели, содержащие менее 0,5% агарозы, очень мягкие, поэтому с ними лучше работать при 4 о С — в этих условиях они становятся более плотными [2].

1.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность

Воспроизводимое фракционирование однонитевых молекул ДНК и РНК, а также определение их молекулярной массы по скорости миграции в геле оказываются возможными только при сохранении условий денатурации в ходе самого электрофореза. Поэтому во всех случаях, когда нет необходимости сохранить нативную структуру, нуклеиновые кислоты предпочитают фракционировать электрофорезом в денатурирующих условиях, или, как говорят, в «денатурирующих» гелях. Это означает, что внутри геля создается среда, препятствующая комплементарному спариванию одинарных нитей нуклеиновых кислот или их участков.

В некоторых случаях эта среда способствует распрямлению нитей, что делает зависимость скоростей миграции от значений длины полинуклеотидов более строгой, обеспечивает возможность их тонкого фракционирования и оценки молекулярной массы (сопоставлением с маркерами). Рассмотрим различные варианты электрофореза в денатурирующих гелях и их использование [1].

Вместо буфера в ПААГ и гелях агарозы можно использовать разбавленные водные растворы щелочи (0,02-0,03 М NaOH). Полимеризация акриламида в щелочной среде идет вполне успешно, но требует примерно трехкратного увеличения концентрации персульфата аммония и соответственно ТЕМЕД. На застывании раствора агарозы присутствие щелочи не сказывается. В щелочной среде благодаря электростатическому отталкиванию остатков фосфорной кислоты однонитевые ДНК и РНК не свертываются в клубки, а мигрируют в виде расправленных нитей. Жесткость таких нитей тем больше, чем они короче, подобно тому как это имеет место и для двунитевых молекул. При этом и скорость миграции однонитевых молекул оказывается приблизительно такой же, как у двунитевых, нативных молекул той же длины.

В щелочную среду обязательно надо вносить достаточное количество ЭДТА (2-3 мМ) для того, чтобы связать все остаточные Mg 2+ . В противном случае ионы магния «сшивают» нити нуклеиновых кислот и они даже могут выпадать в осадок.

Если исходный раствор нуклеиновых кислот был сильно забуферен, его надо предварительно подтитровать щелочью. Бромфеноловый синий в щелочной среде постепенно обесцвечивается, поэтому его следует вносить в исходный препарат непосредственно перед началом электрофореза. Еще лучше в качестве лидирующего красителя в этом случае использовать бромфеноловый зеленый. Он устойчив к воздействию щелочи, а по электрофоретической подвижности сходен с бромфеноловым синим.

Как и для нативной ДНК, при выбранной пористости геля скорость миграции денатурированной ДНК в щелочной среде становится независимой от молекулярной массы, если она превышает определенное значение. Это происходит тем раньше, чем мельче поры геля и чем выше напряженность электрического поля.

Электрофорез в щелочной среде, помимо оценки молекулярной массы, позволяет обнаружить однонитевые разрывы в исходных двунитевых структурах ДНК. Но в сильнощелочных значениях pH остатки гуанина и тимина приобретают отрицательный заряд. Это надежно обеспечивает невозможность ренатурации ДНК, но может сказаться на соотношении электрофоретических подвижностей разных молекул ДНК или двух комплементарных нитей одной молекулы, особенно если размеры — этих молекул невелики и различия нуклеотидного состава не усредняются [1].

Формамид является весьма сильным денатурирующим агентом. Он полностью разрушает вторичную структуру полинуклеотидов. Электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в гелях с формамидом зависит только от молекулярной массы, что открывает возможность ее определения С помощью маркеров и для высокомолекулярной РНК.

Акриламид хорошо полимеризуется в формамиде, давая несколько более мягкие гели, так что 4% -ный ПААГ в формамиде имеет примерно такие же механические свойства, как 2,5% -ный водный ПААГ. Вместе с тем и подвижность РНК в гелях на основе формамида выше, ием в обычном ПААГ такой же концентрации

Денатурацию нуклеиновых кислот успешно обеспечивает и более низкая концентрация формамида. Например, показано, что 3% -ный денатурирующий гель (С = 11) для электрофореза РНК можно готовить на 65% -ном водном формамиде. Электропроводность обеспечивал 0,02 М Na-фосфатный буфер, pH 7 [4].

Формальдегид легко реагирует с аминогруппами нуклеиновых оснований, давая их метоксипроизводные (Рисунок 1):

Эта реакция успешно конкурирует с образованием водородных связей по этим же аминогруппам, в результате чего формальдегид является сильным денатурирующим агентом для нуклеиновых кислот. Разумеется, нити нуклеиновой кислоты после денатурации формальдегидом оказываются модифицированными, однако эта реакция обратима — выдерживанием в воде при 60° можно удалить формальдегид и восстановить нормальную структуру нитей нуклеиновой кислоты, что видно, например, по восстановлению их способности к гибридизации.

Большую опасность представляет возможность образования прочных метиленовых мостиков между основаниями. Однако при 3% -ной концентрации формальдегида в рабочем буфере и сравнительно небольшой загрузке геля (4-5 мкг на трубку) метиленовые мостики не образуются. В цитируемой работе ПААГ, полимеризованный в 0,02 М Na-фосфатном буфере (pH 7) с 3% формальдегида, использовали для определения молекулярных масс фрагментов ДНК. В таком геле имеет место линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы ДНК и расстоянием ее миграции при электрофорезе. Использованный в этой работе 3% -ный (1 М) раствор формальдегида вполне обеспечивает денатурацию нуклеиновых кислот, хотя в последнее время нередко используют и вдвое большую концентрацию.

Ввиду его высокой концентрации формальдегид должен быть очень чистым. Следует работать со свежеприготовленным раствором формальдегида, без следов помутнения. Нейтрализовать раствор до pH 7 можно NaOH. Для приготовления денатурирующего геля на основе агарозы формальдегид добавляют к расплавленному водному раствору агарозы при 60° вместе с буфером [4].

Для полноты картины отметим, что нуклеиновые кислоты перед электрофорезом можно денатурировать и обработкой глиоксалем. При этом нет необходимости вносить глиоксаль в гель и вообще создавать в нем денатурирующие условия, так как денатурация глиоксалем в обычных условиях необратима. Глиоксаль прочно присоединяется по двум атомам азота гуанина (Рисунок 2):

электрофорез белок нуклеиновая кислота

Денатурацию глиоксалем ведут в пластмассовых пробирках с крышками в 0,01 М растворе Na-фосфата (pH 7), содержащем 1 М глиоксаль в 50% -ном диметилсульфоксиде, при 50° в течение 1часа [4].

Так, в работе [Garel et al., 1977] двумерным электрофорезом разделяли до 40 индивидуальных тРНК из суммарного препарата. В первом направлении (пластина 20X40X0,15 см) фракционирование вели в 9,6% -ном ПААГ, полимеризованном в обычном 0,089 М Трис-боратном буфере (pH 8,2) с 7 М мочевиной. Разделение происходило по длине молекул, полностью утративших свою вторичную структуру. Гель второго направления полимеризовали в таком же буфере, но мочевину добавляли лишь до концентрации 4 М. По-видимому, вторичная структура тРНК при этом частично восстанавливалась — в различной степени для разных индивидуальных тРНК. Концентрацию ПААГ во втором направлении соответственно увеличивали до 20%.

Особенности применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Исследование методом ЯМР комплексов нуклеиновых кислот с протеинами и биологических мембран. Состав и структура полисахаридов.

курсовая работа [3,5 M], добавлен 26.08.2009

Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).

презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014

Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая — ДНК, рибонуклеиновая — РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.

реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014

Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.

презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014

История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.

контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012

Распад нуклеиновых кислот, гидролиз. Классификация нуклеаз по месту и специфичности действия. Экзодезоксирибонуклеазы, рестриктазы. гуанилрибонуклеазы. Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Образование 5-фосфорибозиламина, присоединение глицина.

презентация [8,7 M], добавлен 13.10.2013

История изучения нуклеиновых кислот как биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды, функции и значение в жизнедеятельности организма. Правила Чаргаффа. Первичная и вторичная структура ДНК. Особенности репликации у эукариот, ее разновидности.

презентация [533,6 K], добавлен 05.11.2014

Механизм действия и модификация антисмысловых олигонуклеотидов. Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени. Буферные растворы, использовавшиеся в работе. Электрофорез нуклеиновых кислот. Проведение полимеразной цепной реакции.

курсовая работа [1,3 M], добавлен 18.01.2013

Электрофорез как один из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии. Электрофорез белков в полиакриламидном и агарозном геле. Оборудование для проведения капиллярного электрофореза.

реферат [25,5 K], добавлен 31.08.2014

Клетка как элементарная единица строения и жизнедеятельности организмов. Молекулярная масса белков, методы ее определения. Классификация белков по степени сложности. Виды нуклеиновых кислот, их биологическая роль. Витамины в питании человека и животных.

контрольная работа [1,1 M], добавлен 17.10.2015

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

источник

Часть 3. Современные вопросы генных технологий

Методы исследования нуклеиновых кислот. Методы выделения ДНК из растительных и животных тканей и её очищение. Ферменты, используемые для генно-инженерных исследований. Рестриктазы. ДНК-зонды. Электрофорез ДНК. Идентификация фрагментов ДНК и РНК методами гибридизации. Саузерн-, Норзерн-, Вестерн-блоттинг. Клонирование фрагментов нуклеиновых кислот in vitro. Полимеразная цепная реакция. Секвенирование ДНК.

Методы ДНК-диагностики. Показания к ДНК-диагностике. Прямые и непрямые методы. ДНК-чипы. Молекулярно-генетические методы исследования в судебной медицине.

Методы исследования нуклеиновых кислот.Молекулярно-генетические методы — большая и разнообразная группа методов, в конечном счете, предназначенных для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат «манипуляции» с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70—80-х годах и последующего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы широко вошли в медико-генетическую практику.

Чтобы познакомить с сутью и терминологией молекулярно-генетических методов, ниже схематично описаны их основные этапы и варианты. Освоение этих методов, как и других методов лабораторной диагностики, требует специальной подготовки в соответствующих лабораториях.

Получение образцов ДНК (или РНК) является исходным этапом всех методов. Этот этап реализуется в двух вариантах: а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток; б) накопление определённых фрагментов, которые предполагается анализировать, с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма, поэтому такие образцы называют геномной ДНК. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК. Для этого требуется действительно небольшое количество биологического материала, например 20—40 мг хориона, 1 мл крови, 5—10 мг культуры клеток. Для осуществления некоторых методов достаточно иметь 1 каплю крови, соскоб эпителия со щеки или несколько волосяных луковиц. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов названной группы. К этому ещё можно добавить, что выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов методов и может долго сохраняться в замороженном виде.

Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

Иногда бывает достаточно прокипятить образец в течение 5-10 мин., однако в большинстве случаев требуются более сложные методы.

Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК по Мармуру. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента — гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и.т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, т.к. возможна перекрестная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, возможно использование простых методов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время, использование подобных методов пробоподготовки для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам, вследствие использования в реакционной смеси некачественного препарата ДНК.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

Образцы тканей, получаемые при хирургических операциях, обычно фиксируют формалином и заливают в парафин. Такие фиксированные препараты также могут использоваться для проведения ПЦР.

Ферменты, используемые для генно-инженерных исследований. Рестриктазы. Одним из важнейших инструментов генной инженерии являются эндонуклеазы — ферменты, расщепляющие ДНК по специфическим последовательностям нуклеотидов внутри цепи. Эти ферменты получили название рестриктаз. Рестриктазы расщепляют ДНК на относительно небольшие фрагменты в участках строго определенных последовательностей. Этим их воздействие отличается от большинства других ферментативных, химических или физических воздействий, приводящих к случайным разрывам цепей ДНК. Рестриктазы (уже открыто более 200 типов ферментов этого класса) являются частью защитной системы бактерий, охраняющих собственный геном от чужеродной, главным образом вирусной ДНК. Рестриктазы принято именовать по названию бактерий, из которых их выделяют. Так, название EcoRI свидетельствует о том, что этот фермент из Esherichia coli, ВатН1 — из Bacillus amilolquefacientsi. Каждый фермент узнает определенную 4-7-членную последовательность в двухцепочечной ДНК. Разрезание ДНК по этим сайтам приводит к образованию либо «тупых» (например, при действии рестриктаз Hpal), либо «липких», то есть перекрывающихся (например, ВатН1), концов. Для конструирования гибридных молекул особенно удобны липкие концы. Любой фрагмент ДНК обладает характерным расположением сайтов узнавания различных рестриктаз, что позволяет строить так называемые рестриктазные карты. При расщеплении ДНК какой-либо одной рестриктазой получают смесь фрагментов, каждый из которых имеет одни и те же концевые участки. Такие фрагменты можно разделить и идентифицировать методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

Часть ферментов, применяемых для исследования ДНК, представлена в таблице 10.

ДНК-зонды. Информация обо всем многообразии организма заключена в его генетическом материале. Так патогенность бактерий определяется наличием в них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК детерминирующий данный биологический признак имеет строго определенную последовательность и может служить диагностическим маркером.

В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот — спаривание двух комплиментарных сегментов разных молекул ДНК.

Табл.10. Основные ферменты, используемые в генной инженерии

Фермент	Реакция	Область приложениия
Рестриктазы	Расщепляют ДНК по специфическим последовательностям нуклеотидов	Получение фрагментов ДНК, создание химерных молекул ДНК
Нуклеаза	Деградация как 5′-, так и 3 ‘-концов ДНК	Образование концевых делеций в молекулах ДНК
ДНК-лигаза	Катализирует образование связей между молекулами ДНК	«Сшивание» фрагментов ДНК
ДНК-полимераза I	Синтез двухцепочечной ДНК по ДНК-матрице	Синтез двухцепочечной ДНК
ДНКаза1	Вносит одноцепочечные разрывы в ДНК	Картирование участков в ДНК
Экзонуклеаза-Ш	Удаляет нуклеотиды с 3 ‘-концов ДНК	Секвенирование ДНК
Экзонуклеаза	Удаляет нуклеотиды с 5-концов ДНК.	Секвенирование ДНК
Обратная транскриптаза	Синтезирует ДНК по РНК-матрице	Синтез кДНК по мРНК: картирование ДНК

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала.

Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.

Чтобы обеспечить адекватность диагностического теста гибридизационные ДНК- и РНК-зонды должны быть высокоспецифичнными. Другими словами необходимо, чтобы зонд гибридизовался только с искомой нуклеотидной последовательностью. Если есть вероятность получения ложноположительного (наличие гибридизационного сигнала в отсутствии последовательности мишени) или ложноотрицательного (отсутствие сигнала при наличии последовательности — мишени) результата, то целесообразность применения теста значительно снижает специфичность зондов, которая может проявляться на разных уровнях: они могут «различать» два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК и РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представляют собой продукт химического синтеза, клонированные интактнные гены или их фрагменты.

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифических зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК- мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифициравать с помощью ПЦР.

В качестве примера использования ДНК-зонда для диагностики заболеваний можно привести процедуру обнаружения Plasmodium falciparum. Этот паразит вызывает малярию, заболевание, которое угрожает примерно трети всего населения Земли. Он инфицирует эритроциты и разрушает их, что приводит к развитию лихорадки, а в тяжелых случаях к поражению мозга, почек и других органов. Чтобы выявить источники инфекции, оценить эффективность мер по их ликвидации и обеспечить раннюю диагностику и лечение, необходимо достаточно чувствительные, простые и недорогие методы. В настоящее время малярию диагностируют с помощью микроскопического исследования мазков крови — эффективного, но трудоемкого и занимающего много времени процесса. Иммунологические методы обнаружения Plasmodium, такие как ELISA, достаточно быстрые и их легко автоматизировать, но с их помощью нельзя отличить текущую инфекцию от прошедшей, поскольку при этом определяются только наличие антител к Plasmodium в крови больного. Для избирательной ДНК-диагностики текущей инфекции, т.е. для выявления ДНК-возбудителя, в качестве основы используют высокоповторяющиеся последовательности ДНК Plasmodium falciparum. Сначала с помощью ДНК-зонда проводят скрининг библиотеки геномной ДНК паразита. Затем отбираются клоны дающие наиболее интенсивный гибридизационный сигнал, поскольку именно они предположительно содержат высокоповторяющиеся последовательности. ДНК каждого из отобранных клонов проверяют на способность к гибридизации с ДНК видов Plasmodium, не вызывающих малярию. В качестве специфического зонда выбирается последовательность гибридизующейся ДНК с Plasmodium falciparum, но не с ДНК Plasmodium vivax, Plasmodium cynomolgi или с ДНК человека. С его помощью можно обнаружить всего 10 пг очищенной ДНК Plasmodium falciparum или 1 нг той же ДНК в крови больного.

Получено и охарактеризовано более 100 различных ДНК-зондов,
позволяющих обнаруживать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. Так имеются зонды для диагностики бактериальных инфекций человека, вызываемых Legionella рheumoniae (респираторные заболевания), Salmonella typhimurium (пищевое отравление), Campylobacter hyointestinalis (racтриты), a также для выявления энтеротоксичного штамма Escherichia coli (гастроэнтериты) однако это лишь «верхушка айсберга»; в принципе с помощью гибридизации можно выявлять практически любые патогенные микроорганизмы.

В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего 32 Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошие отношение сигнал / шум. Радиоактивный меченый зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии.

Однако 32 Р является короткоживущим изотопом, испускающим высокоэнергетическое излучение; при работе с ним необходимо использовать специальное оборудование и обеспечить безопасную утилизацию отходов. Чтобы обойти эти трудности, были созданы не радиоактивные системы детекции. Для усиления гибридизационного сигнала в этом случае используется ферментативное превращение хромогенного или хемилюминесцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяют окраску, а второй — испускает свет.

Один из недавно разработанных нерадиоактивных методов детекции основан на использовании зонда — «молекулярного маяка».

Такой зонд состоит из 25 нуклеотидов. К 5′ концу присоединен флуоресцентный хромофор, а к 3′ концу — не флуоресцентный хромофор, на который передается энергия возбуждения флуорофора. В растворе при комнатной температуре маяк имеет такую конфигурацию, при которой флуорофор и тушитель находиться в тесном контакте и флуоресценция флуорофора тушится. Когда 15 средних нуклеотидов зонда гибридизуется с комплементарной последовательностью ДНК- и РНК-мишени, происходит пространственное разделение флуорофора и тушителя и зонд испускает свет. Необходимо также, чтобы все 15 нуклеотидов зонда были комплементарными соответствующей последовательности ДНК- и РНК-мишени.

Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещённом в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определённое положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путём сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.

Идентификация фрагментов ДНК и РНК методами гибридизации в геле является либо конечным этапом диагностики, либо необходимым элементом дальнейшего анализа. Для идентификации и выделения, интересующих исследователя клонов бактерий с химерной ДНК разработан метод гибридизации в бактериальных колониях. Для этого на многочисленные колонии бактерии, выращенные на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Часть бактерий прилипает к фильтру. После лизиса клеток, денатурации и фиксирования ДНК фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченым зондом. По окончании гибридизации фильтр отмывают от избытка зонда и выявляют образовавшийся меченый гибридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту из них, которая дала положительный сигнал.

Все разновидности методов гибридизации базируются на комплементарных взаимодействиях азотистых оснований разных цепей нуклеиновых кислот. Точное соответствие последовательностей гибридизующихся фрагментов приводит к быстрому образованию прочного устойчивого комплекса.

В целом методы гибридизационного анализа можна разделить на два типа:

· методы гибридизационного анализа, проводимые в растворе (гомологичные);

· методы гибридизационного анализа, проводимые на твердом носителе (гетерогенные).

Метод гибридизации в растворе. При гибридизации в растворе искомая нуклеиновая кислота и зонд свободно взаимодействуют в водной реакционной смеси, что повышает скорость процесса гибридизации. Детекцию результатов гибридизации в растворе осуществляют путем нуклеазного гидролиза одноцепочечных ДНК и выделения оставшихся двухцепочечных гибридов, содержащих меченый зонд.

Для успешного проведения реакции гибридизации в растворе необходимо применять одноцепочечные зонды, неспособные к самогибридизации. Метод хорош еще и тем, что требует минимальных объемов и количеств биологического и клинического образцов, поэтому может быть использован в диагностических целях. В то же время этот метод имеет один существенный недостаток — на его основе можно создать диагностические тест-системы для выявления специфических фрагментов небольших участков ДНК при условии достаточно высокой концентрации искомых фрагментов или участков в исследуемом образце. Это снижает порог чувствительности до уровня иммуноферментного анализа и даже ниже.

Метод гибридизации на твердом носителе. Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверхности. В качестве твердой поверхности чаще всего используют полимерный мембранный фильтр, например, нейлоновую мембрану.

В большинстве случаев процедуру проведения анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образца (в том числе экстракция и выделение ДНК), фиксация пробы на носителе, предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание не связавшихся продуктов, детекция.

Для подготовки пробы, может быть, необходимо предварительное «подращивание» исследуемого материала для идентификации отдельных колоний бактерий или увеличение концентрации вирусов в клеточной культуре. Проводится и непосредственный анализ образцов клеток, мочи, уретральных соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие инфекционных агентов. Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т.е. переход в одноцепочечную форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец нуклеиновой кислоты фиксируют на носителе — нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 ч при 80°С в вакууме. Далее в процессе предгибридизации достигается инактивация свободных мест связывания для уменьшения неспецифического взаимодействия зонда с мембраной. После чего искомые фрагменты ДНК (РНК) комплементарно связываются со специфическим зондом, и тогда данный метод называют ДНК-зондовой диагностикой. Далее осуществляют детекцию одним из возможных методов (авторадиографическим, ферментативно-гибридизационным и т.д.).

Метод «сэндвич»- гибридизации. Метод является одной из разновидностей зондовой технологии (DNA-probe). При его использовании применяются два зонда, гомологичные различным участкам искомой нуклеиновой кислоты. Один зонд фиксируют на мембране для того, чтобы связать искомую нуклеиновую кислоту, присутствующую в исследуемом образце. После осуществления гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий второй зонд, который имеет определенную метку. Процесс гибридизации проводят повторно, и при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым участком ДНК (РНК).

Методы блот-гибридизации. Идентификация конкретных фрагментов в геле среди геномной ДНК является более сложной задачей. Из-за больших размеров генома человека после рестрикции образуется настолько большое число рестриктных фрагментов, что агарозный гель после электрофореза и окраски этидия бромидом при ультрафиолетовом облучении выглядит как более или менее равномерно окрашенная поверхность. Задача генетика — выявить специфические фрагменты ДНК.

ДНК, разделенную гель-электрофорезом, можно перенести с геля на нитроцеллюлозный фильтр. Для этого ее денатурируют в геле щелочью, нейтрализуют гель, и затем прикладывают к нему нитроцеллюлозный фильтр, обеспечивая медленный ток буфера через гель и фильтр. Денатурированная ДНК диффундирует и задерживается на фильтре, после нагревания, которого в вакууме она «запекается» и иммобилизуется, т. е. обездвиживается на фильтре. Ее распределение на плоскости фильтра точно такое же, как и на плоскости геля. Однако в отличие от геля фильтр с ДНК можно использовать для последующей гибридизации с меченой пробой, т. е. с мечеными ДНК и РНК. Для этого инкубируют фильтр с раствором, содержащим меченую пробу, при повышенной температуре, затем тщательно отмывают его и, наконец, подвергают авторадиографии, т. е. выдерживают с рентгеновской фотопленкой. При проявлении последней на ней выявляются полосы, соответствующие полосам ДНК на фильтре, сгибридизовавшимся с радиоактивной пробой.

Процедура переноса ДНК с геля на фильтр обозначается английским термином blotting (промокание). Поэтому для таких фильтров с ДНК используется термин «блот» (blot). По имени автора Э. Саузерна эти блоты называются «блотами Саузерна» (Southern blots).

Вместо ДНК можно перенести на фильтры с геля РНК. Такие фильтры называют Норзерн-фильтрами [игра слов: фамилия Саузерн означает «южный»; фильтры с ДНК по Саузерну — южные блоты; фильтры с РНК шутливо обозначили как северные блоты (Northern); фильтры с белками— как западные (Western)].

Чтобы проводить гибридизацию с Саузерн- и Норзерн- фильтрами, содержащими весьма малые количества индивидуальных ДНК и РНК, были нужны очень высокомеченные пробы. Их научились делать путем энзиматического введения метки в выделенные препараты нуклеиновых кислот. Наиболее распространенный метод — это так называемая ник-трансляция (nick-translation). ДНК инкубируют с двумя ферментами, ДНК-полимеразой I и ДНКазой I (последняя берется в ничтожных количествах вместе с высокомеченными предшественниками ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфатами). ДНКаза вносит в двухцепочечную ДНК одноцепочечные разрывы. На эти места садится ДНК-полимераза и разрушает одну из цепей ДНК, одновременно заново ее застраивая, но используя при этом меченые предшественники. Таким образом, большая часть ДНК замещается радиоактивной, сохраняя при этом свою нуклеотидную последовательность. Есть и другие методы включения метки в ДНК и РНК.

Рассмотрим блот-гибридизацию по Саузерну (1975). Эта методика состоит из нескольких этапов этапов (рис.49).

После окончания электрофореза гель помещают в раствор основания (щелочи), в котором двухцепочечные фрагменты ДНК теряют связи и становятся одноцепочечными.

Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр производится в буферном растворе. Непосредственно на поверхность геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. Из-за капиллярного эффекта создаётся ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. После переноса одноцепочечные нити фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.

Для того чтобы визуально выявить нужные фрагменты (фиксированная на фильтре ДНК не видна), проводят гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченым радионуклидом или флюоресцентной

Рис.49. Блот-гибридизация по Саузерну

меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом (16—30 пар нуклеотидов) либо клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геномной ДНК.

При инкубации фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, происходит гибридизация комплементарных цепей ДНК-зонда и фрагмента на фильтре. Неспецифически связанные молекулы зонда отмываются с помощью специальной процедуры. Радиоактивно меченые участки выявляют путём экспонирования фильтра с рентгеновской плёнкой (авторадиография). После проявления на плёнке видны полосы меченной зондом ДНК. Нерадиоактивные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител. Блот-гибиридизация — высокочувствительный, но дорогостоящий и трудоемкий метод выявления специфических последовательностей ДНК.

Метод норзерн-блот-гибридизации — Northern-blot. Метод используется для определения уровня экспрессии гена путем количественной оценки иРНК. Метод сложный и длительный по выполнению (5—7 суток). Трудности связаны с необходимостью блокировать при выделении РНК так называемые РНКазы, которые чрезвычайно стабильны и устойчивы по отношению ко многим химическим процедурам, применяемым при экстракции РНК. Процедуры блот-гибридизации по Э. Саузерну и нозерн-блот-гибридизации не нашли применения в клинической микробиологии, поскольку они трудоемки. Точками приложения данных методов явились задачи, связанные с проведением научных исследований и задач по изучению геномной структуры ДНК (РНК), а также для выявления точечных мутаций.

Метод гибридизации in situ (ISH — in situ hybridization). Метод основан на проведении процессов гибридизации непосредственно на срезе или в мазке с использованием любых зондов. Частная методика гибридизации in situ — FISH (fluorescent in situ hybridization), позволяет установить наличие патогена в препаратах, фиксированных в формалине, и залитых парафином срезах и пунктатах ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе. Метод гибридизации in situ базируется на основных принципах гибридизации твердофазной и гибридизации в растворе. Чувствительность метода гибридизации in situ ограничена возможностью проникновения зондов внутрь клеток для связывания с искомой мишенью. Процесс гибридизации проходит в тканях, при этом зонд снабжен флуоресцентной меткой. После промывки материала и удаления несвязавшихся молекул осуществляется детекция, для чего мазок или срез просматривают в флуоресцентном микроскопе. Метод ISH сложен для осуществления и по сравнению с другими молекулярными методами малочувствителен. Метод наиболее удобен для определения мишеней, например, вирусов в инфицированных клетках, которые представлены большим числом копий.

Метод разветвленной ДНК (branch-DNA). Искомая нуклеиновая кислота связывается с улавливающим зондом, один конец которой комплементарен мишени, а другой — определенному концу усиливающего зонда. При этом усиливающий зонд может быть комплементарен следующему зонду и т.д. Количество зондов может быть велико, и все они связаны с несколькими (от одного до нескольких десятков) люминофорами, которые по мере увеличения количества связанных зондов усиливают (хеми-, флуоро-) люминесценцию. Преимуществом данного метода является возможность использования в одной реакции нескольких улавливающих и связывающихся с мишенью зондов, что обеспечивает выявление агентов, характеризующихся значительной геномной гетерогенностью, например, вирус иммунодефицита человека.

Дата добавления: 2014-11-29 ; Просмотров: 2645 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник