Метод электрофореза в биотехнологии

Методы тонкой очистки веществ: виды хроматографии, двумерный электрофорез , ВЖХ, ультрацентрифугирование

Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами.

Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта).

По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул.

Можно разделять молекулы методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные молекулы проходят через колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями.

В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их:

заряду (ионообменная хроматография),

гидрофобности (гидрофобная хроматография),

размеру (хроматография гель-фильтрацией)

или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография).

При ионообменной хроматографии нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы: диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) — заряжена положительно; карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза — заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и рН элюирующего раствора.

Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи; в таких колонках задерживаются белки с обнаженными гидрофобными участками.

Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками; при использовании таких колонок происходит разделение белков по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза).

Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров.

Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок.

Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело-антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого рН. Однократная хроматография на такой колонке позволяет зачастую достигнуть очень высокой степени очистки препарата.

Разрешение обычной колоночной хроматографии ограничено негомогенностью матриксов (например, целлюлозы), что вызывает неравномерное протекание растворителя через колонку. Разработанные недавно хроматографические смолы (в основу которых обычно положен кремний) имеют форму мельчайших сфер от 3 до 10 мкм в диаметре, которые упакованы в специальный чехол и образуют гомогенную колонку. Такие колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ) обеспечивают высокий уровень разрешения. Поскольку частицы носителя в колонках для ВЖХ упакованы очень плотно, в отсутствие высокого давления скорость потока через них незначительна. По этой причине такие колонки обычно помещают в стальные цилиндры, соединенные со сложной системой насосов и шлангов, которые обеспечивают необходимое для высокой скорости протока давление.

В традиционной колоночной хроматографии скорость протекания через колонку может быть довольно низкой (примерно один объем колонки в час), таким образом, у разделяемых растворов достаточно времени для уравновешивания с внутренним содержимым крупных частиц матрикса. В условиях ВЖХ происходит быстрое уравновешивание растворов с внутренним содержимым крошечных сфер, так что растворы, обладающие различным сродством к матриксу, эффективно разделяются даже при высокой скорости потока. Таким образом, ранее для достижения плохого разделения с помощью колоночной хроматографии требовались часы, а в настоящее время благодаря ВЖХ качественное фракционирование занимает минуты. Вот почему именно этот метод чрезвычайно популярен сейчас для разделения и белков, и малых молекул.

Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их высокоскоростному центрифугированию. Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. Центрифугирование является, как правило, первым этапом фракционирования, с его помощью разделяются только значительно отличающиеся по размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций, необходимо гомогенат наслоить тонким слоем поверх солевого раствора.

При ультрацентрифугировании различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют отдельные полосы, которые можно выделить. Во избежание перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать инертный и хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно увеличивается сверху вниз, формируя градиент плотности. При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно выделить.

Скорость седиментации каждого из компонентов определяется его размерами и формой и обычно выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S. Скорость вращения до 80000 об/мин, так что на разделяемые частицы действуют силы, превосходящие силу тяготения более чем в 500000 раз. Под действием столь больших сил даже сравнительно небольшие макромолекулы, такие, как тРНК или простейшие ферменты, разделяются и распределяются в строгом соответствии со своими размерами. Измерение коэффициента седиментации макромолекулярных комплексов обычно используют для определения их общей массы и количества входящих в их состав субъединиц.

Ультрацентрифуга разделяет клеточные компоненты не только по массе, но и по плавучей плотности. В этом случае образец седиментирует в крутом градиенте, образованном высококонцентрированным раствором сахарозы или хлористого цезия. Компоненты клеток опускаются по градиенту до тех пор, пока не достигнут участка, плотность раствора в котором равна собственной плотности компонентов. Дальнейшей седиментации компонентов не происходит и они «застревают» на этом уровне. Таким образом в центрифужной пробирке возникает набор различных полос.

Метод центрифугирования в градиенте хлористого цезия был разработан в 1957 году для доказательства полуконсервативности репликации ДНК.

Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот.

Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется их суммарным зарядом, а также формой и размерами. В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе-полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе,содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент — додецил-сульфат натрия или ДСН (SDS).Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Каждая молекула белка связывает значительное количество молекул детергента, приобретая суммарный отрицательный заряд. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода.

Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку,во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие молекулы тормозятся значительно сильнее, чем малые, поэтому оказываются ближе к стартовой линии. Смесь молекул делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой.

Выявить эти полосы можно путем окрашивания соответствующим красителем. Например, белки индентифицируются красителем кумасси синим. Известно, что близко расположенные полосы в геле могут перекрываться. Этот эффект препятствует выявлению большого количества белков (не больше 50) с помощью одномерных методов их разделения.

При работе данным методом на первом этапе белки разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент-меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента-мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипептидных цепей; при этом изменения заряда цепей не происходит.

Диссоциированные полипептидные цепи разделяют затем методом изоэлектрического фокусирования, основанном на изменении заряда белковой молекулы при изменении рН окружающей среды. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлектрической точкой — значением рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, и, следовательно, белок не способен перемещаться под действием электрического поля. При изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в геле, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней.

Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза. На втором этапе гель, содержащий разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Неразделенными в результате остаются только те бели, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе; такое сочетание встречается очень редко.

источник

Что мы знаем о влиянии микроорганизмов? Ранее неизвестные науке мельчайшие существа, которые обладают биологической .

Особенности селекции микроорганизмов. В ряды микроорганизмов входят все прокариоты, и часть эукариот – грибы и водоросл.

Санитарное обследование, выбор точек отбора проб Основными объектами, территории которых подлежат контролю органов .

Вода является естественной средой обитания многих микробов. Основная масса микробов поступает из почвы. Количество мик.

Возбудитель бешенства относится к семейству Рабдови-русы. Семейство это включает вирусы бешенства, везикулярного стома.

Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот.

источник

В ходе создания носителей для аффинной хроматографии были проведены контрольные опыты, в которых изучалось поведение матриц, содержащих удлиняющие мостики, но без лиганда. Оказалось, что в некоторых случаях ферменты прочно связывались с гексаметиленовыми мостиками. Этот факт послужил основой для развития методов гидрофобной хроматографии, основанных на связывании белка в результате взаимодействия между алифатической цепью адсорбента и соответствующим гидрофобным участком на поверхности белковой глобулы.

Гидрофобные взаимодействия усиливаются с повышением концентрации соли. Максимальное усиление вызывают соли, проявляющие наибольшую активность при высаливании, такие как сульфат аммония. Это объясняется тем, что в основе обоих процессов лежат одинаковые механизмы. При высаливании основной причиной агрегации является усиление гидрофобных взаимодействий между белками. Следовательно, при высоких концентрациях соли большинство белков будут адсорбироваться на гидрофобных группах, связанных с матрицей. Элюцию проводят понижающимся градиентом концентрации соли. Белки, которые прочно адсорбируются, обычно удаляют с колонки, добавляя в элюирующий раствор этиленгликоль.

Наряду с хроматографией перспективными для биотехнологии методами разделения веществ служат электрофорез и его модификации.

Электрофорез — метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот. Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется их суммарным зарядом, а также формой и размерами.

В середине 60-х гг. был разработан модифицированный метод электрофореза — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе-полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул.

При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент — додецилсульфат натрия или ДСН (SDS). Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Каждая молекула белка связывает значительное количество молекул детергента, приобретая суммарный отрицательный заряд.

По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода. Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку, во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенному торможению.

В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие молекулы тормозятся значительно сильнее, чем малые, поэтому оказываются ближе к стартовой линии. Смесь молекул делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой. Выявить эти полосы можно путем окрашивания соответствующим красителем.

Например, белки идентифицируются красителем кумасси синим. Известно, что близко расположенные полосы в геле могут перекрываться. Этот эффект препятствует выявлению большого количества белков (не больше 50) с помощью одномерных методов их разделения.

Аппаратура для гель-электрофореза может различаться конструктивно при неизменности принципов разделения. Существует огромное количество фирм, поставляющих оборудование для электрофореза. Наиболее известна фирма Bio-Rad, небольшая часть продукции которой представлена на рис. 6.5.

Метод двумерного гель-электрофореза, в котором объединены две различные процедуры разделения, позволяет идентифицировать более 1 000 белков. Результаты при этом получают в виде «двумерной» белковой карты. При работе данным методом на первом этапе белки разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент — меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента — мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипептидных цепей; при этом изменения заряда цепей не происходит.

При изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в геле, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней. Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза. На втором этапе гель, содержащий разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении, перпендикулярном тому, что был на первом этапе.

В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН, и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецилсульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Неразделенными в результате остаются только те белки, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе; такое сочетание встречается очень редко.

Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их высокоскоростному центрифугированию. Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки.

Центрифугирование является, как правило, первым этапом фракционирования, с его помощью разделяются только значительно отличающиеся по размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций, необходимо гомогенат наслоить тонким слоем поверх солевого раствора.

При ультрацентрифугировании различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют отдельные полосы, которые можно выделить. Во избежание перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать инертный и хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно увеличивается сверху вниз, формируя градиент плотности. При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно выделить.

Скорость седиментации каждого из компонентов определяется его размерами и формой и обычно выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S. Скорость вращения до 80 000 об/мин, так что на разделяемые частицы действуют силы, превосходящие силу тяготения более чем в 500 000 раз. Под действием столь больших сил даже сравнительно небольшие макромолекулы, такие, как тРНК или простейшие ферменты, разделяются и распределяются в строгом соответствии со своими размерами. Измерение коэффициента седиментации макромолекулярных комплексов обычно используют для определения их общей массы и количество входящих в их состав субъединиц.

источник

Метод электрофореза является одним из самых распространенных, мощных и доступных методов исследования белков. Этот метод широко применяется как в научных исследованиях, так и при экспертизе качества продуктов питания и медицинских препаратах, а также в клинических лабораториях.

С помощью метода электрофореза производят:

1) анализ сложных смесей белков (в генетических исследованиях, при выделении и биотехнологической наработке белков)

2) обнаружение определенного белка (при проведении экспертизы, контроле биотехнологических процессов, клинических анализах)

3) определение молекулярной массы белков (в фундаментальных исследованиях)

4) исследование структуры белков (анализ расположения в биологических мембранах, взаимодействия с другими белками, изучение вопросов фолдинга белков)

В основе метода электрофореза лежит тот факт, что молекулы белков в водных растворах заряжены, то есть фактически представляют собой ионы. Как любая частица, несущая электрический заряд, молекулы белков способны перемещаться в электрическом поле. Таким образом, если к раствору белка приложить электрическое поле (опустить в него электроды и подать постоянное напряжение), то все молекулы белков начнут двигаться. Вследствие разницы в аминокислотном составе разные белки заряжены разноименно — положительно или отрицательно. По этой причине различные белки будут двигаться в разных направлениях: положительно заряженные – к катоду (отрицательный электрод), отрицательно заряженные – к аноду (положительный электрод). Кроме того, величина заряда белковых молекул также неодинакова – молекулы одних белков заряжены сильнее, других – меньше. Белки, молекулы которых имеют больший заряд, будут двигаться быстрее, чем те, что несут меньший заряд. Также на разделение белков методом электрофореза большое влияние оказывает размер молекул белков. Более крупные белки движутся медленнее, чем белки небольших размеров, вследствие того, что вода оказывает сопротивление перемещению (является вязкой средой).

По причине того, что аминокислотный состав белков и их масса различаются достаточно сильно, электрофорез позволят анализировать очень сложные смеси белков. Для решения различных исследовательских задач было предложено множество различных вариантов электрофореза.

4.9 Электрофорез по Леммли

Электрофорез по Леммли — один из методов электрофореза в геле, применяемый для анализа сложных белковых смесей. Данный метод позволяет разделять белки по их молекулярной массе. Также электрофорез по Леммли может быть использован для определения молекулярной массы белков.

Белки, подлежащие анализу методом электрофореза по Леммли, предварительно обрабатывают концентрированным 5%-ным раствором додецилсульфата натрия (рис. 15) при 100С в присутствии β-меркаптоэтанола. При этом белковые молекулы приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий её собственный. При последующем разделении в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофоре граммах в соответствие с логарифмом их молекулярной массы

Рис. 15. Додецилсульфата-анион, присутствует в растворах додецилсульфата натрия

В качестве геля для электрофореза по Леммли используются полиакриламидные гели, что позволяет достичь высокой разрешающей способности данного метода. Полиакриламидный гель представляет собой продукт сополимеризации акриламида (рис. 16)

и сшивающего агента N,N- метиленбисакриламда (рис. 17)

Рис. 17. N,N- метиленбисакриламид

В результате процесса сополимеризации образуется прочный, упругий, термостабильный гель, обладающий высокими механическими свойствами и химической инертностью. Пространственная структура геля представляет собой сетку со структурой (рис. 18). Пористость геля зависит от концентрации мономеров и её можно варьировать в значительных пределах от 40 до 0,1 нм (2-30% мономеров). Регулярно чередующиеся амидные группы делают гель гидрофильным. Отсутствие ионизирующихся групп существенно снижает эндосмос, а также взаимодействие белков со структурой геля.

Рис. 18. Структура полиакриламидного геля

В качестве катализатора реакции сополимеризации применяют источник свободных радикалов — персульфат аммония или калия. Катализатором реакции выступает N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин.

Полимеризацию геля ведут в стеклянных трубочках длиной 70-100 мм с внутренним диаметром 5 мм либо плоских пластинах. Для этого в одной трубке последовательно полимеризуют два геля для электрофореза, располагая их один под другим: 1) верхний – крупнопористый гель в котором образец сжимается в узкую полосу (концентрирующий гель), 2) нижний — мелкопористый гель, в котором происходит разделение белковой смеси на компоненты под действием эффекта «молекулярного сита».

Для проведения электрофореза гелевыми столбиками соединяют расположенные друг над другом резервуары с буферами, в которые введены электроды и подают на электроды напряжение 40-800 вольт.

В качестве отчета о проделанной работе:

1. Зарисуйте структурные формулы додецилсульфата натрия, акриламида, N,N- метиленбисакриламида, структуру полиакриламидного геля

2. Зарисуйте расположение белковых полос, полученных в результате электрофореза по Леммли, сделайте вывод о составе выданного вам раствора белка (количество компонентов, примерная доля главных компонентов и их число, примерная доля минорных компонентов и их число)

Подготовить пробу белка для электрофореза. Для этого в эппендорф объемом 2 мл поместить 100 мкл раствора белка с концентрацией 4 мг/мл и добавить 100 мкл буфера пробы. Содержимое перемешать инжектированием.

Поместить пробирки в поплавок и поместить в водяную баню. Нагреть до кипения и кипятить 5 минут, затем охладить

Растворить навеску персульфата калия в 2,5 мл ДВ. Для этого внести автоматической пипеткой 2,5 мл ДВ и перемешивать инжектированием до полного растворения соли (растворение идет медленно)

Собрать трубку для электрофореза и поместить её вертикально в штатив

В центрифужной пробирке приготовить смесь для разделяющего геля

Раствор Мономеров 1250 мкл

1,5 М Трис-HCl рН8,8 167 мкл

р-ра Персульфата калия 20 мкл

После внесения раствора персульфата калия , содержимое пробирки перемешивают инжектированием и немедленно вносят в трубку для электрофореза

Смесь для разделяющего геля вносят в трубку для электрофореза тремя порциями по 800 мкл. Раствор вносят осторожно, по стенке трубки не вспенивая его.

После внесения в трубку раствора для разделяющего геля поверх него осторожно наслоить примерно 100 мкл ДВ

Оставить трубку на 15-20 мин для полимеризации. Об окончании полимеризации свидетельствует появление четкой границы между раствором для разделяющего геля и наслоенной водой.

По окончании полимеризации слить воду с геля, остатки жидкости убрать с поверхности геля фильтровальной бумагой, скрученной в трубочку

В центрифужной пробирке приготовить смесь для концентрирующего геля

Раствор Мономеров 340 мкл

0,5 М Трис-HCl рН6,8 125 мкл

р-ра Персульфата калия 20 мкл

250 мкл смеси для концентрирующего геля вносят в трубку для электрофореза. Раствор вносят осторожно, по стенке трубки не вспенивая его.

После внесения в трубку раствора для разделяющего геля поверх него осторожно наслоить примерно 100 мкл ДВ

Оставить трубку на 5-10 мин для полимеризации. Об окончании полимеризации свидетельствует появление четкой границы между раствором для разделяющего геля и наслоенной водой.

По окончании полимеризации геля с трубки снимаю заглушку и устанавливают трубки для электрофореза в катодную камеру прибора (рис. 19) так, чтобы граница концентрирующего и разделяющего геля была видна в верхней (катодной камере)

Рис. 19. Прибор для вертикального гель-электрофореза в трубках.

1- верхняя, анодная камера, 2 – нижняя, катодная камера, 3 – трубки с гелем для электрофореза, 4 – положительный электрод, анод, 5 — отрицательный электрод, катод.

Приготовить 1,2 л анодного буфера. Для этого разбавить исходный анодный буфер в 4 раза ДВ с помощью мерного цилиндра объемом 1 л.

Заполнить анодную камеру анодным буфером. Поместить в камеру анод (красный провод). Поместить катодную камеру над анодной и зафиксировать её винтами. При этом нижние концы трубок должны быть погружены в буфер в нижней камере (анодный буфер).

Приготовить 1,2 л катодного буфера. Для этого разбавить исходный катодный буфер в 4 раза ДВ с помощью мерного цилиндра объемом 1 л. заполнить катодную камеру катодным буфером. При этом концы трубок должны оказаться под слоем электродного буфера.

Промыть нижние и верхние концы трубок для удаления остатков растворов для полимеризации гелей и пузырьков воздуха.

60 мкл подготовленного раствора белка в эппендорфе смешивают со 180 мкл ДВ и перемешивают инжектированием. 200 мкл полученной смеси вносят в трубки для электрофореза, осторожно наслаивая на поверхность геля.

Включают напряжение 250 вольт, через 10 минут поднимают его до 300 вольт, а еще через 10 минут до 400.

Примерно через 40 минут, когда фронт бромфенолового синего пройдет практически всю трубку, напряжение выключают, внимают электрод из катодной камеры. Разбирают прибор и выливают катодный буфер. Затем вынимают трубки для электрофореза и выталкивают столбики геля из трубок стеклянным штоком. Концентрирующий гель отрезают скальпелем.

Разделяющий гель окрашивают коллоидным раствором кумасси бриллиантового голубого в течение 20 мин на кипящей водяной бане. Затем переносят окрашенный гель в кипящую воду и отмываю до проявления белковых полос.

Вопросы для самоподготовки

В чем практическое значение электрофореза?

Что можно установить с помощью электрофореза?

В чем суть метода электрофореза?

От каких параметров зависит скорость перемещения молекулы белка?

В чем особенность электрофореза по Леммли?

По какому параметру разделяются белки при проведении электрофореза по Леммли?

Вопросы к коллоквиуму по теме «Белки»

2. Элементный состав белков

3. Какие органические соединения называют аминокислотами, химические свойства аминокислот

4. Кислотно-основные свойства аминокислот (амфотерность аминокислот, биполярные ионы, кривые титрования)

5. Классификация аминокислот (биологическая, физико-химическая, химическая)

6. Физические свойства аминокислот, стереоконфигурация аминокислот

7. Специфические реакции на аминокислоты

8. Связь аминокислот в белках, пептидная связь – структура и свойства

9. Биуретовая реакция. Определение белка биуретовым методом.

10. Аминокислотный анализ. Методы хроматографии аминокислот.

11. Нингидриновая реакция. Практическое значение

12. Первичная структура белка. Методы установления первичной структуры белка

13. Вторичная структура белка, α-спираль, β-слой

14. Третичная и четвертичная структура белка

15. Химические связи, стабилизирующие структуру белка (первичную, вторичную, третичную и четвертичную)

16. Растворимость и осаждение белков. Силы удерживающие белок в растворе, условия осаждения белков.

17. Реакции обратимого и необратимого осаждения белков, их практическое значение.

18. Белки как носители электрических зарядов, кислотно-основные свойства белков, изоэлектрическая точка

19. Диализ. Электрофорез. Изоэлектрическое фокусирование

21. Выделение белков из тканей. Методы выделения и очистки белков

Использованная литература

The protein protocols handbook, 2 nd edition – edited by Walker J.M. – Humana press, 2002

Петров К.П. – Методы биохимии растительных продуктов – Киев: Вища школа, 1978.

Шапиро Д.К. – Практикум по биологической химии, 2-е изд. перераб. и доп. – Минск: Высшая школа, 1976

Практикум по биохимии: учебное пособие, 2-е изд. пререаб и доп. – под ред. Северина — М.: МГУ, 1989

Р.Досон, Д.Элиот и др. – Справочник биохимика, пер. с англ. – М.: Мир, 1991

Скурихин И.М., Нечаев А.П. – Все о пище с точки зрения химика: справочное издание. — М.: высшая школа, 1991

Степин Б.Д. — Техника лабораторного эксперимента в химии: учеб пособи для ВУЗов – М.: Химия, 1999

Химическая энциклопедия ТТ.1-5., гл. ред. Кнунянц И.Л. – М.: Советская энциклопедия, 1988-1998

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2019 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.008 с) .

источник

Электрофорез оц- и дц-нуклеиновых кислот в неденатурирующих и денатурирующих условиях. Зависимость подвижности нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий электрофореза. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего образования

«НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МОРДОВСКИЙ

Факультет биотехнологии и биологии

Кафедра биотехнологии, биоинженерии и биохимии

«Электрофорез белков и нуклеиновых кислот»

202 группы направления подготовки 020501.65 Славкина О.А.

Проверил: канд., биол., наук, преподаватель кафедры биотехнологии, биоинженерии и биохимии И.В. Сюсин

Введение

1. Электрофорез нуклеиновых кислот
1.1 Электрофорез НК в неденатурирующих условиях. Зависимость подвижности оц — и дц — нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий э/ф (% и тип геля). Подвижность кольцевых молекул дц-ДНК, влияние на нееEtBr
1.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность
1.2.1 Щелочные гели
1.2.2 Денатурирующие гели с формамидом
1.2.3 Денатурирующие гели с формальдегидом.
1.2.4 Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем
1.3 Разделение цепей дц-ДНК электрофорезом: принцип и особенности электрофореза
1.4 Двумерный электрофорез нуклеиновых кислот
2. Электрофорез белков
2.1 Электрофорез в неденатурирующих условиях Параметр разделения
2.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. — Денатурация белка. Параметр разделения. — ПринципDISC-электрофореза (система буферов Орнштейна и Дэвиса, электрофорезSDS-денатурированных белков по Лэммли). Использование градиента концентрации геля, равноесный электрофорез
2.3 Изоэлектрофокусирование. — Принцип метода, параметр разделения. — Амфолины
2.4 Двумерный электрофорез белков
Заключение
Список использованных источников

Под действием электрического поля заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление носит название электрофореза. Скорость движения частицы (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность см 2 •с -1 •В -1 , а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ в аналитических или препаративных целях. Определение подвижности используется также для характеристики вещества.

Существуют три основных типа электрофоретических систем — электрофорез с подвижной границей (метод подвижной границы), зональный электрофорез и стационарный (или вытесняющий) электрофорез. В системах первого типа электрическое поле прикладывается к исходно резкой границе между раствором макромолекул и буфером. Скорость миграции заряженных частиц определяется путем наблюдения за перемещением этой границы. Если раствор содержит гетерогенную смесь ионизированных макромолекул, то можно увидеть множество движущихся границ. В такой системе индивидуальные компоненты нельзя разделить на отдельные зоны, так как наслоенный сверху буферный раствор имеет более низкую плотность по сравнению с находящимся под ним раствором макромолекул. Если бы и удалось достигнуть разделения зон, то все равно произошло бы их перемешивание, так как плотность раствора внутри этих зон была бы выше, чем между ними.

В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. Существует несколько способов получения стабильных зон. В свободном растворе зоны можно стабилизировать с помощью вращения или непрерывного потока тонкого слоя жидкости. В качестве среды для зонального электрофореза могут успешно применяться градиенты плотности. Но наиболее широко используемый вариант зонального электрофореза основан на применении пористой стабилизирующей среды, такой, как фильтровальная бумага, блоки гранулированного материала или различные гели.

Электромиграция третьего типа (стационарный, или вытесняющий, электрофорез) характеризуется тем, что через некоторое время после начала разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся два метода: изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т.е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза.

В составе нуклеиновых кислот имеется некоторое количество основных групп, эти соединения нельзя подвергать электрофорезу в виде катионов, так как при низких значениях pH высокомолекулярные нуклеиновые кислоты нерастворимы в воде. В нейтральной и щелочной средах молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, поскольку их заряд определяется диссоциацией фосфатных групп. Оливера и др. обнаружили, что в этом диапазоне значений pH электрофоретическая подвижность РНК и денатурированной ДНК в свободном растворе не зависит от их молекулярной массы. Такая закономерность объясняется постоянством отношения заряда молекулы к ее массе и указывает на то, что нуклеиновые кислоты невозможно разделить с помощью электрофореза с подвижной границей.

Для электрофоретического разделения различных полинуклеотидов используют эффект молекулярного сита, присущий целому ряду гелей. Детальные исследования показали, что посредством электрофореза в гелях можно получить данные о некоторых характеристиках молекул нуклеиновых кислот. Так, например, методом электрофореза можно определить молекулярную массу того или иного полинуклеотида и установить, является ли он рибо- или дезоксирибонуклеотидом. Кроме того, можно выяснить, состоит ли данная молекула из одной или двух полинуклеотидных цепей, а в случае ДНК определить, какую форму имеет молекула — линейную или кольцевую. Несмотря на существование более точных физических и химических методов определения указанных свойств, электрофорез в некоторых отношениях имеет преимущество перед ними. Оно состоит в том, что электрофоретические методы относительно просты, требуют сравнительно недорогого оборудования и могут быть использованы в тех случаях, когда для анализа доступно лишь небольшое количество неочищенного материала. Некоторые физические параметры разделенных нуклеиновых кислот изучают, не прибегая к их элюции из гелей. Фрагменты геля, содержащие анализируемые зоны, вырезали, промывали соответствующим раствором, вставляли в кварцевые трубки и с помощью спектрофотометра определяли изменения оптической плотности, вызванные нагреванием.

Перечисленные выше факты позволяют понять, почему, начиная с момента своего появления, электрофорез нуклеиновых кислот находит все более широкое применение в биохимии, генетике, вирусологии, микробиологии и других областях биологии.

1.1 Электрофорез НК в неденатурирующих условиях. Зависимость подвижности оц — и дц — нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий э/ф (% и тип геля). Подвижность кольцевых молекул дц-ДНК, влияние на нее EtBr

Электрофорез в агарозном геле — стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности. Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем — бромистым этидием в низкой концентрации.

Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется пятью главными параметрами, рассмотренными ниже.

Размер молекул ДНК. Молекулы линейной двухцепочечной ДНК перемещаются в геле предположительно одним концом вперед со скоростями, обратно пропорциональными десятичному логарифму их молекулярных масс (Таблица 1)

Концентрация агарозы. Фрагменты ДНК данного размера перемещаются в геле, содержащем разные концентрации агарозы, с разными скоростями. Между логарифмом электрофоретической подвижности ДНК m и концентрацией геля t существует прямая зависимость. Таким образом, применяя гели разных концентраций, можно разделить большой набор фрагментов ДНК, различиающихся по размеру (Таблица 2).

Конформация ДНК. ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформации, например кольцевая неповрежденная (форма I), кольцевая с одноцепочечным разрывом (форма II) и линейная (форма III), движутся в агарозном геле с разными скоростями. Относительная подвижность трех указанных форм зависит главным образом от концентрации агарозы в геле, а также и от таких факторов, как сила тока, ионная сила буфера или плотность сверхспиральных витков в форме I. В одних условиях форма I перемещается быстрее, а в других — медленнее, чем форма III.

ДНК (одно — и двухцепочечные) и РНК при ЭФ движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные той же длины. Поскольку молекулярная масса НК пропорциональна их длине (в парах нуклеотидов или в тысячах пар нуклеотидов), можно построить стандартную кривую зависимости расстояния, на которое перемещается маркерный фрагмент, от десятичного логарифма длины этого фрагмента. С ее помощью можно определять размеры фрагментов нуклеиновых кислот в данном препарате по расстоянию, на которое они перемещаются при электрофорезе.

Одноцепочечные молекулы ДНК с мол. массой от 1,2 млн. до 40 млн. можно разделять в 0,6% -ном агарозном геле при условии, что разница в молекулярной массе между молекулами составляет не менее 5%.

Подвижность двухцепочечных молекул ДНК почти не зависит от их молекулярной массы. С помощью электрофореза в агарозном геле можно также разделять комплементарные цепи ДНК бактериофагов.

Описан простой метод отделения линейных ДНК от открытых кольцевых. Перед полимеризацией геля препарат ДНК смешивают с раствором агарозы. В процессе гелеобразования кольцевые молекулы захватываются гелем, тогда как линейные молекулы остаются свободными и могут быть затем выделены путем электрофореза.

Чтобы однозначно определить конформацию ДНК, необходимо провести ее электрофорез в присутствии возрастающих концентраций бромистого этидия. С увеличением концентрации красителя число его молекул, связанных с ДНК, растет. При этом отрицательные сверхспиральные витки в молекулах формы I постепенно исчезают, а скорость движения ДНК в геле уменьшается. При некоторой критической концентрации свободных молекул красителя, когда в ДНК больше не остается сверхспиральных витков, скорость движения формы I достигает минимальной величины. Последующее добавление новых порций бромистого этидия приводит к образованию положительных сверхспиральных витков, в результате чего подвижность формы I начинает быстро возрастать. Подвижность формы II и формы III в описанных условиях снижаются, хотя и по-разному, вследствие нейтрализации зарядов и увеличения жесткости молекул ДНК под влиянием бромистого этидия. Для большинства препаратов ДНК, находящейся в форме I, критическая концентрация бромистого этидия находится в области 0,1 — 0,5 мкг/мл.

Напряженность электрического поля. При низких напряженностях скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. Однако с увеличением напряженности электрического поля подвижность фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой дифференциально возрастает. Следовательно, с увеличением напряженности область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается. Максимальное разделение фрагментов происходит при напряженности, и не превышающей 5 В/см.

Состав оснований и температура. Электрофоретическое поведение ДНК в агарозных гелях слабо зависит от состава оснований ДНК (Thomas, Davis, 1975) или температуры геля. В агарозных гелях в области температур от 4 до 30 о С изменения относительной электрофоретической подвижности фрагментов ДНК разного размера не наблюдается. Обычно электрофорез в агарозных гелях ведут при комнатной температуре. Однако следует отметить, что гели, содержащие менее 0,5% агарозы, очень мягкие, поэтому с ними лучше работать при 4 о С — в этих условиях они становятся более плотными [2].

1.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность

Воспроизводимое фракционирование однонитевых молекул ДНК и РНК, а также определение их молекулярной массы по скорости миграции в геле оказываются возможными только при сохранении условий денатурации в ходе самого электрофореза. Поэтому во всех случаях, когда нет необходимости сохранить нативную структуру, нуклеиновые кислоты предпочитают фракционировать электрофорезом в денатурирующих условиях, или, как говорят, в «денатурирующих» гелях. Это означает, что внутри геля создается среда, препятствующая комплементарному спариванию одинарных нитей нуклеиновых кислот или их участков.

В некоторых случаях эта среда способствует распрямлению нитей, что делает зависимость скоростей миграции от значений длины полинуклеотидов более строгой, обеспечивает возможность их тонкого фракционирования и оценки молекулярной массы (сопоставлением с маркерами). Рассмотрим различные варианты электрофореза в денатурирующих гелях и их использование [1].

Вместо буфера в ПААГ и гелях агарозы можно использовать разбавленные водные растворы щелочи (0,02-0,03 М NaOH). Полимеризация акриламида в щелочной среде идет вполне успешно, но требует примерно трехкратного увеличения концентрации персульфата аммония и соответственно ТЕМЕД. На застывании раствора агарозы присутствие щелочи не сказывается. В щелочной среде благодаря электростатическому отталкиванию остатков фосфорной кислоты однонитевые ДНК и РНК не свертываются в клубки, а мигрируют в виде расправленных нитей. Жесткость таких нитей тем больше, чем они короче, подобно тому как это имеет место и для двунитевых молекул. При этом и скорость миграции однонитевых молекул оказывается приблизительно такой же, как у двунитевых, нативных молекул той же длины.

В щелочную среду обязательно надо вносить достаточное количество ЭДТА (2-3 мМ) для того, чтобы связать все остаточные Mg 2+ . В противном случае ионы магния «сшивают» нити нуклеиновых кислот и они даже могут выпадать в осадок.

Если исходный раствор нуклеиновых кислот был сильно забуферен, его надо предварительно подтитровать щелочью. Бромфеноловый синий в щелочной среде постепенно обесцвечивается, поэтому его следует вносить в исходный препарат непосредственно перед началом электрофореза. Еще лучше в качестве лидирующего красителя в этом случае использовать бромфеноловый зеленый. Он устойчив к воздействию щелочи, а по электрофоретической подвижности сходен с бромфеноловым синим.

Как и для нативной ДНК, при выбранной пористости геля скорость миграции денатурированной ДНК в щелочной среде становится независимой от молекулярной массы, если она превышает определенное значение. Это происходит тем раньше, чем мельче поры геля и чем выше напряженность электрического поля.

Электрофорез в щелочной среде, помимо оценки молекулярной массы, позволяет обнаружить однонитевые разрывы в исходных двунитевых структурах ДНК. Но в сильнощелочных значениях pH остатки гуанина и тимина приобретают отрицательный заряд. Это надежно обеспечивает невозможность ренатурации ДНК, но может сказаться на соотношении электрофоретических подвижностей разных молекул ДНК или двух комплементарных нитей одной молекулы, особенно если размеры — этих молекул невелики и различия нуклеотидного состава не усредняются [1].

Формамид является весьма сильным денатурирующим агентом. Он полностью разрушает вторичную структуру полинуклеотидов. Электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в гелях с формамидом зависит только от молекулярной массы, что открывает возможность ее определения С помощью маркеров и для высокомолекулярной РНК.

Акриламид хорошо полимеризуется в формамиде, давая несколько более мягкие гели, так что 4% -ный ПААГ в формамиде имеет примерно такие же механические свойства, как 2,5% -ный водный ПААГ. Вместе с тем и подвижность РНК в гелях на основе формамида выше, ием в обычном ПААГ такой же концентрации

Денатурацию нуклеиновых кислот успешно обеспечивает и более низкая концентрация формамида. Например, показано, что 3% -ный денатурирующий гель (С = 11) для электрофореза РНК можно готовить на 65% -ном водном формамиде. Электропроводность обеспечивал 0,02 М Na-фосфатный буфер, pH 7 [4].

Формальдегид легко реагирует с аминогруппами нуклеиновых оснований, давая их метоксипроизводные (Рисунок 1):

Эта реакция успешно конкурирует с образованием водородных связей по этим же аминогруппам, в результате чего формальдегид является сильным денатурирующим агентом для нуклеиновых кислот. Разумеется, нити нуклеиновой кислоты после денатурации формальдегидом оказываются модифицированными, однако эта реакция обратима — выдерживанием в воде при 60° можно удалить формальдегид и восстановить нормальную структуру нитей нуклеиновой кислоты, что видно, например, по восстановлению их способности к гибридизации.

Большую опасность представляет возможность образования прочных метиленовых мостиков между основаниями. Однако при 3% -ной концентрации формальдегида в рабочем буфере и сравнительно небольшой загрузке геля (4-5 мкг на трубку) метиленовые мостики не образуются. В цитируемой работе ПААГ, полимеризованный в 0,02 М Na-фосфатном буфере (pH 7) с 3% формальдегида, использовали для определения молекулярных масс фрагментов ДНК. В таком геле имеет место линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы ДНК и расстоянием ее миграции при электрофорезе. Использованный в этой работе 3% -ный (1 М) раствор формальдегида вполне обеспечивает денатурацию нуклеиновых кислот, хотя в последнее время нередко используют и вдвое большую концентрацию.

Ввиду его высокой концентрации формальдегид должен быть очень чистым. Следует работать со свежеприготовленным раствором формальдегида, без следов помутнения. Нейтрализовать раствор до pH 7 можно NaOH. Для приготовления денатурирующего геля на основе агарозы формальдегид добавляют к расплавленному водному раствору агарозы при 60° вместе с буфером [4].

Для полноты картины отметим, что нуклеиновые кислоты перед электрофорезом можно денатурировать и обработкой глиоксалем. При этом нет необходимости вносить глиоксаль в гель и вообще создавать в нем денатурирующие условия, так как денатурация глиоксалем в обычных условиях необратима. Глиоксаль прочно присоединяется по двум атомам азота гуанина (Рисунок 2):

электрофорез белок нуклеиновая кислота

Денатурацию глиоксалем ведут в пластмассовых пробирках с крышками в 0,01 М растворе Na-фосфата (pH 7), содержащем 1 М глиоксаль в 50% -ном диметилсульфоксиде, при 50° в течение 1часа [4].

Так, в работе [Garel et al., 1977] двумерным электрофорезом разделяли до 40 индивидуальных тРНК из суммарного препарата. В первом направлении (пластина 20X40X0,15 см) фракционирование вели в 9,6% -ном ПААГ, полимеризованном в обычном 0,089 М Трис-боратном буфере (pH 8,2) с 7 М мочевиной. Разделение происходило по длине молекул, полностью утративших свою вторичную структуру. Гель второго направления полимеризовали в таком же буфере, но мочевину добавляли лишь до концентрации 4 М. По-видимому, вторичная структура тРНК при этом частично восстанавливалась — в различной степени для разных индивидуальных тРНК. Концентрацию ПААГ во втором направлении соответственно увеличивали до 20%.

Особенности применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Исследование методом ЯМР комплексов нуклеиновых кислот с протеинами и биологических мембран. Состав и структура полисахаридов.

курсовая работа [3,5 M], добавлен 26.08.2009

Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).

презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014

Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая — ДНК, рибонуклеиновая — РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.

реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014

Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.

презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014

История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.

контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012

Распад нуклеиновых кислот, гидролиз. Классификация нуклеаз по месту и специфичности действия. Экзодезоксирибонуклеазы, рестриктазы. гуанилрибонуклеазы. Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Образование 5-фосфорибозиламина, присоединение глицина.

презентация [8,7 M], добавлен 13.10.2013

История изучения нуклеиновых кислот как биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды, функции и значение в жизнедеятельности организма. Правила Чаргаффа. Первичная и вторичная структура ДНК. Особенности репликации у эукариот, ее разновидности.

презентация [533,6 K], добавлен 05.11.2014

Механизм действия и модификация антисмысловых олигонуклеотидов. Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени. Буферные растворы, использовавшиеся в работе. Электрофорез нуклеиновых кислот. Проведение полимеразной цепной реакции.

курсовая работа [1,3 M], добавлен 18.01.2013

Электрофорез как один из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии. Электрофорез белков в полиакриламидном и агарозном геле. Оборудование для проведения капиллярного электрофореза.

реферат [25,5 K], добавлен 31.08.2014

Клетка как элементарная единица строения и жизнедеятельности организмов. Молекулярная масса белков, методы ее определения. Классификация белков по степени сложности. Виды нуклеиновых кислот, их биологическая роль. Витамины в питании человека и животных.

контрольная работа [1,1 M], добавлен 17.10.2015

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

источник