Меню Рубрики

Метод капиллярного электрофореза cdt

Сравнительные характеристики методов оценки CDT и обоснование целесообразности использования метода капиллярного электрофореза для проведения диагностических исследований на хроническое злоупотребление алкоголем

К настоящему времени разработан широкий спектр методов определения уровня CDT, среди которых практическое применение нашли методы непрямой и прямой иммунонефелометрии, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и капиллярный электрофорез.

Сравнительная оценка, обзор литературных источников, анализ текущих положений и рекомендаций международной рабочей группы IFCC по стандартизации CDT показали, что, несмотря на относительную экономичность, иммунологические методы не являются приемлемыми для реализации диагностического механизма, взятого за основу в Методических рекомендациях, утвержденных 3 ноября 2013 г. («Диагностика, мониторинг хронического злоупотребления алкоголем и скрининг наиболее распространенных патологических состояний, вызванных злоупотреблением»), т.к. обладают рядом существенных ограничений.

Основным из них является несоответствие оцениваемого иммунологическими методами аналита текущему (до завершения международной стандартизации CDT) и/или новому определению CDT, выдвинутого рабочей группой IFCC по стандартизации CDT в 2007 г. Так, методы непрямой иммунонефелометрии не позволяют полностью разделить низкосиалированные изоформы от высокосиалированных изоформ трансферрина, в т.ч. от трисиалотрансферрина, что противоречит текущему определению аналита, негативным образом отражается на аналитической специфичности маркера и повышает риск ложноположительных результатов.

Метод прямой нефелометрии, представленный коммерческим тестом N Latex CDT, использует антитела к углевод-дефицитным изоформам трансферрина (асиало, моносиало-, дисиало-). Данный тест не позволяет изолированно детектировать изоформу дисиалотрансферрина, что вносит существенные ограничения к использованию данного метода в рамках грядущей международной стандартизации CDT, в соответствии с которой первичным аналитом CDT будет утвержден дисиалотрансферрин.

Более того, иммунологические методы требуют дополнительного измерения общей концентрации трансферрина для выражения результатов в рекомендованных IFCC единицах измерения %CDT, предоставляют результат в виде числового значения, что не позволяют визуализировать возможные факторы интерференции (генетические варианты трансферрина и пр.) и требуют обязательного подтверждения результатов при помощи разделительных методов.
В связи с неэффективностью такого подхода иммунологические методы были исключены из диагностического механизма оценки CDT.

Разделительные методы – ВЭЖХ и капиллярный электрофорез – лишены недостатков иммунологических методов и позволяют детектировать, проводить визуальную и количественную оценку изоформ CDT как суммарно по всем углевод-дефицитным фракциям, так и изолированно по дисиалотрансферрину. В дополнение к этому разделительные методы позволяют выявлять возможные генетические варианты трансферрина, тем самым сводя к минимуму риск ложной трактовки результатов исследования.

Сравнительный анализ коммерческих производителей анализаторов и тест-систем определения CDT разделительными методами показал, что доступные российскому пользователю и разрешенные для диагностики in vitro ВЭЖХ системы не удовлетворяют критериям отбора в части технических характеристик. Основными ограничениями ВЭЖХ анализаторов являются длительная пробоподготовка, обусловливающая продолжительность исследования 1 образца свыше 60 минут, что делает метод непригодным для задач скрининга, а также необходимость индивидуальных пользовательских настроек и адаптаций в случае использования ВЭЖХ анализаторов различных производителей, что негативным образом отражается на такой характеристике, как воспроизводимость результатов и повышает межлабораторную вариабельность.

Наиболее приемлемыми с практической точки зрения являются анализаторы CDT методом капиллярного электрофореза. В настоящее время оценка CDT возможна при помощи коммерческих анализаторов трех производителей: Beckman Coulter (системы P/ACE 5000 и P/ACE MDQ), SEBIA (системы Minicap и Capillarys-2 Flex Piercing), Helena Bioscience (система V8). Исходя из данных Государственного реестра медицинских изделий и организаций, осуществляющих производство и изготовление медицинских изделий, размещенных в открытом доступе сети интернет на сайте Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения по состоянию на 30 декабря 2013 г. системы капиллярного электрофореза производства Beckman Coulter не зарегистрированы и, таким образом, не могут использоваться в целях in vitro диагностики на территории РФ.

Системы капиллярного электрофореза SEBIA и Helena Bioscience, а также расходные материалы к ним зарегистрированы и потому были допущены к оценке по вышеприведенным критериям.

Оценка метода определения CDT, лежащего в основе анализатора V8 производства Helena Bioscience, показала, что метод имеет ограничения по измерению такой углевод-дефицитной фракции, как асиалотрансферрин, что вызывает затруднения с последующей гармонизацией метода с международной системой стандартизации CDT, т.к. асиалотрансферрин рассматривается IFCC в качестве перспективного вторичного аналита.

Проведенный мета-анализ литературных источников показал, что метод оценки CDT в исполнении системы V8 производства Helena Bioscience не был включен ни в одно из опубликованных и/или находящихся в печати многоцентровых, валидационных или демонстрационных исследований, проведенных в период с 2007 по 2013 гг. Более того, в последней публикации «Toward standardization of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) measurements: III. Performance of native serum and serum spiked with disialotransferrin proves that harmonization of CDT assays is possible», размещенной от имени рабочей группы IFCC по стандартизации CDT в 2013 г. в журнале Clinical Chemistry, равно как и в предыдущих публикациях рабочей группы, метод капиллярного электрофореза Helena Bioscience не фигурирует.

В полученных на наш запрос письмах-заключениях ведущих мировых экспертов по проблемам диагностики хронического алкоголизма отзывы о методе капиллярного электрофореза Helena Bioscience также отсутствуют.
Очевидным недостатком анализатора V8 является также его высокая рыночная стоимость и ограниченное меню тестов (анализатор не позволяет проводить оценку маркера сахарного диабета).

Таким образом, отсутствие доказательной базы и ограниченные функциональные характеристики не позволяют рекомендовать анализатор V8 производства Helena Bioscience для практического использования в диагностических программах по выявлению хронического злоупотребления алкоголем на территории Российской Федерации.

Оценка метода определения CDT, лежащего в основе анализаторов Minicap и Capillarys-2 Flex Piercing производства SEBIA, показала отсутствие ограничений как в отношении критериев, относящихся к системе международной стандартизации CDT, так и в отношении технических характеристик приборов. Метод SEBIA позволяет разделять, визуализировать и проводить суммарную или пофракционную количественную оценку всех углевод-дефицитных фракций.

Такой подход позволяет использовать данный метод в полном соответствии с текущим и рекомендованным определением аналита. Оценка результатов CDT проводится в относительных единицах (% CDT), что также соответствует выдвинутым рекомендациям IFCC и позволяет избежать интерференции со стороны колебаний общей концентрации трансферрина.

Технические характеристики метода капиллярного электрофореза SEBIA также полностью соответствуют выдвинутым критериям оценки. Оба анализатора обеспечивают полную автоматизацию исследования, включая пробоподготовку; обеспечивают полную прослеживаемость образца от момента взятия пробы до выдачи результата исследования (работа с первичной штрих-кодированной пробиркой), позволяют проводить визуальную оценку генетических вариантов трансферрина и выявлять состояния, при которых применение маркера CDT должно быть ограничено (2-3-сиало блок) или требуется специальная подготовка образца для снятия возможной интерференции со стороны иммуноглобулинов. Время исследования одного образца, включая этап пробоподготовки, не превышает 13-15 минут, наличие двух анализаторов средней (Minicap) и высокой (Capillarys-2 Flex Piercing) производительности позволяет оптимизировать рабочие потоки в зависимости от условий конкретной лаборатории и масштабов скрининга.

Проведенный мета-анализ литературных источников показал, что метод оценки CDT в исполнении систем капиллярного электрофореза SEBIA имеет положительный опыт участия в крупнейших многоцентровых, валидационных или демонстрационных исследованиях, включая публикации рабочей группы IFCC по стандартизации CDT, где подтверждаются высокие аналитические характеристики данной технологии. Немаловажным преимуществом является участие систем SEBIA в крупном эпидемиологическом исследовании на российской выборке, пилотное трехлетнее испытание систем на базе Московского научно-практического центра наркологии, а также положительный опыт использования анализаторов на базе наркологических диспансеров субъектов Российской Федерации.

В предоставленных на наш запрос письмах-заключениях ведущих мировых экспертов по проблемам диагностики хронического алкоголизма были получены положительные отзывы о методе капиллярного электрофореза SEBIA.

Уникальным преимуществом рассмотренных анализаторов SEBIA является возможность сочетания в одном приборе нескольких диагностически значимых скрининговых тестов, таких как оценка белковых фракций с возможностью выявления профилей хронического поражения печени и определение гликированного гемоглобина – ключевого маркера при диагностике и мониторинге сахарного диабета. Мультифункциональность данного метода позволяет оптимизировать экономические затраты на оборудование и расширить диагностическую панель, в т.ч. по таким социально-значимым и нередко алкоголь-ассоциированным нозологиям, как сахарный диабет и болезни гепатобилиарной системы.

Таким образом, для достижения наибольшей диагностической эффективности, минимизации рисков неспецифического ответа и оптимизации экономической составляющей процедуры обследования рекомендовано использование систем капиллярного электрофореза Minicap и Capillarys-2 Flex Piercing производства SEBIA.

источник

Процедура анализа карбогидрат-дефицитного трансферрина методом капиллярного электрофореза

Анализ карбогидрат-дефицитного трансферрина позволяет диагностировать употребление высоких доз алкоголя, эквивалентных 50 – 80 г и более абсолютного этилового спирта в день, на протяжении продолжительного периода времени (неделя и более) [108, 111], что согласно классификации ВОЗ соответствует хроническому злоупотреблению алкоголем с высоким риском тяжелых психических и физических нарушений и развития или наличием алкогольной зависимости.

Процедура анализа состоит из следующих этапов:

— Информирование, опрос пациента и заполнение опросника (Приложение 7);

— Взятие образца крови, маркировка и оформление сопроводительной документации (Приложение 8);

— Транспортировка образцов и документации в лабораторию для проведения анализа маркера CDT (Приложение 9);

— Получение сыворотки крови (Приложение № 10);

— Проведение качественной и количественной оценки маркера CDT методом капиллярного электрофореза и учет результатов;

— Оформление заключения о результатах анализа (Приложение № 6).

В случае несогласия освидетельствуемого с положительным результатом исследования, а также в случае получения положительного результата, количественные значения которого соответствуют «серой зоне» (1,3% ≤ CDT ≤ 1,6%), следует повторно внимательно рассмотреть возможные факторы интерференции на результат анализа (пп. 6.5-6.6) и назначить повторное исследование со свежим образцом сыворотки через 3-4 недели.

По результатам анализа врачом психиатром-наркологом оформляется «Заключение медицинского учреждения о прохождении обследования на предмет хронического злоупотребления алкоголем» (Приложение № 11).
7.1. Информирование, опрос пациента и заполнение опросника

В соответствии со ст. 31 Основ законодательства РФ об охране здоровья граждан от 22.07.1993 № 5487-1 до реализации анализа необходимо в полном объеме провести разъяснительную работу о целях и порядке осуществления тестирования с оформлением добровольного информированного согласия лиц старше 15 лет и родителей и/или иных законных представителей лиц в возрасте до 15 лет (Приложение 1). При отказе от обследования оформляется письменный отказ по форме, приведенной в Приложении 2.

Для выявления возможных интерферирующих факторов и ограничений к исследованию, а также с целью получения данных по употреблению алкоголь-содержащих веществ проводится опрос обследуемого и заполняется опросник в соответствии с Приложением 7. При этом обследуемому в доступной форме доводится до сведения о важности предоставления полной и достоверной информации для интерпретации результатов анализа.
7.2 Взятие образца крови, маркировка и оформление сопроводительной документации

Для проведения лабораторного тестирования осуществляют взятие и подготовку проб крови в соответствии с требованиями ГОСТ Р 53079.4 – 2008.

7.2.1. Требования к условиям и процедуре взятия, приема и утилизации образцов крови

Кровь отбирается из поверхностной вены открытым или закрытым способом в пластиковую одноразовую пробирку с плотно завинчивающейся крышкой без антикоагулянтов. Не допускается использование пробирок с ЭДТА или цитратом. Объем образца достаточный для исследования составляет 2-4 мл.

При взятии образца крови оформляется «Направление на исследование образца крови методом капиллярного электрофореза на предмет злоупотребления алкоголем» (Приложение 8), а также «Справка о доставке биологических объектов на исследование методом капиллярного электрофореза» (Приложение 9).

После взятия образцов крови осуществляется их кодирование с целью последующей надежной идентификации и исключения подмены. Наиболее целесообразно применение штрих-кодов, в которых отражены идентификационные признаки обследуемого. Штрих-коды изготавливают в месте взятия образца или в лаборатории, выполняющей анализ. Допустимо ручное кодирование образцов в соответствии с требованиями ГОСТ Р 53079.4 – 2008.

Контейнер с биопробой должен находиться под наблюдением ответственного за процедуру лица до тех пор, пока не будет кодирован и опечатан защитной самоклеющейся пленкой или отправлен на тестирование.

Прием образцов крови для тестирования осуществляется уполномоченным лицом.

Образцы не принимаются к исследованию в случае выявления несоответствия требованиям их взятия, хранения и транспортировки.

Образцы биопроб считают потенциально опасными и утилизируют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями после истечения сроков хранения и проведения аналитических исследований согласно СанПиН 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений».

7.2.2. Требования к условиям хранения и транспортировки образцов крови

Образцы требуется как можно скорее доставлять в лабораторию, где будет проводиться дальнейшее исследование. Хранение образов крови до отправки в лабораторию и их последующая транспортировка должны осуществляться в холодильнике или специальных термоконтейнерах, поддерживающих температуру среды не выше 2-8 о С. Не допускается хранение и транспортировка образцов при комнатной температуре.

Транспортировку образцов и документации осуществляет лицо, уполномоченное медицинским учреждением.

При необходимости длительного транспортирования в лабораторию (более часа) образцы свернувшейся крови (обычно свертывание происходит в течение 30 мин.) должны быть отцентрифугированы для получения сыворотки не позднее, чем через 1 час после взятия образца. Процедура получения сыворотки крови приведена в Приложении 10.

Свежая сыворотка крови пригодна для исследования без дополнительной пробоподготовки.

К анализу допускается сыворотка при хранении ее в условиях холодильника при температуре 2- 8°C не более 10 дней. При необходимости более длительного хранения образцы сыворотки крови должны быть заморожены (-18-24 о С) в течение 8 часов с момента их взятия. Замороженная сыворотка пригодна для исследования в течение месяца.
7.3. Проведение качественной и количественной оценки маркера CDT методом капиллярного электрофореза

Проведение качественного и количественного анализа CDT методом капиллярного электрофореза осуществляется в соответствии с Инструкциями по применению наборов реагентов для определения CDT на системах Capillarys или Minicap [10, 12] и предусматривает выполнение следующих этапов:

— Настройка прибора для выполнения аналитических операций;

— Помещение пробирок с образцами в штатив(ы);

— Считывание штрих-кодов с пробирок с образцами и штативов для образцов (выполняется автоматически);

— Разведение образцов из первичных пробирок в сегменте для разведения (выполняется автоматически);

— Промывка капилляров и инжекция в них разведенных образцов (выполняется автоматически);

— Разделение фракций CDT и их прямая детекция в капиллярах (выполняется автоматически);

Читайте также:  Методика электрофореза грудного отдела

— Учет и интерпретация результатов;

— Завершение работы на приборе.
7.4. Учет и интерпретация результатов

После проведения анализа результаты качественного и относительного количественного определения изоформ трансферрина генерируются автоматически при помощи программного обеспечения прибора.

7.4.1. Учет результатов качественного анализа

Результаты качественной оценки представляют собой электрофоретические кривые, отображающие фракции трансферрина, присутствующие в анализируемом образце сыворотки и располагающиеся в следующем порядке (слева направо): пентасиалотрансферрин, тетрасиалотрансферрин, трисиалотрансферрин, дисиалотрансферрин и асиалотрансферрин (Приложение 5, пример 1).

Учет результатов качественного анализа включает обязательную визуальную оценку полученной ЭФ кривой с целью выявления на профиле аномальных помех или генетических вариантов трансферрина, присутствие которых может влиять на результаты количественной оценки CDT.

Протокол исследования, содержащий графическую кривую с изображением профилей изоформ трансферрина, является обязательным приложением к заключению о результатах исследования (Приложение 6). Заключение о результатах исследования без протокола качественной оценки считаются недействительными.

При наличии интерферирующих помех проведение количественной оценки фракций CDT недопустимо до их полного устранения (пп. 3.5-3.6).

7.4.2. Учет результатов количественного анализа

Результаты относительной количественной оценки представляют собой автоматически скалькулированные относительные (%) концентрации изоформ трансферрина, полученные посредством прямой денситометрии фракций при 200 нм.

Полученные результаты количественной оценки по каждой изоформе трансферрина, выраженные в процентах, отображаются в виде таблицы справа от графической кривой. Цвет, присвоенный той или иной фракции трансферрина в таблице, всегда соответствует цвету этой же фракции, выраженной графически (Приложение 5, пример 1).

Для подсчета относительной концентрации изоформ CDT согласно текущему определению аналита программное обеспечение прибора производит суммирование значений карбогидрат-дефицитных фракций (ди-, моно- и асиалотрансферрина) и приводит итоговый результат количественного анализа в виде процентного содержания изоформ CDT слева от графической кривой (Приложение 5, пример 1). Это же значение импортируется в Протокол исследования и служит показателем наличия или отсутствия хронического злоупотребления алкоголем.

Исследования Schellenberg и Wielders [109] на статистически достоверной выборке, а также клинические испытания теста, проведенные с 2011 по 2013 гг. в МНПЦ наркологии, показали, что верхнее референсное значение концентрации карбогидратдефицитного трансферрина (CDT) составляет 1,3 %. Пороговое значение, основанное на приведенном выше верхнем референсном значении с учетом погрешности измерений, составляет 1,6 %. Таким образом, в отсутствии интерферирующих факторов, значение CDT 1,6 % следует расценивать как показатель хронического алкогольного злоупотребления (положительный результат) (Приложение 5, пример 4). Значение CDT 7 8 9 10 11

источник

Капиллярный электрофорез

Цель работы

Изучение возможностей метода капиллярного электрофореза при определении неорганических анионов в водопроводной воде.

Основные сведения о методе капиллярного электрофореза

Метод капиллярного электрофореза основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (

2 нл) вводят в кварцевый капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером — электролитом. После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей, в первую очередь, от заряда и массы (точнее, величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой; качественной характеристикой вещества является время миграции, а количественной — высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества.

Для того чтобы получить более подробное представление о методе, необходимо рассмотреть ряд процессов, происходящих в капилляре, заполненном электролитом и помещенном в продольное электрическое поле.

Находящиеся на поверхности плавленного кварца силоксановые группы при контакте с водой или водными растворами гидролизуются с образованием удвоенного количества силанольных групп, которые затем гидратируются.

Скорость и степень гидролиза зависят от температуры и pH водных растворов и, в меньшей степени, от концентрации солевого фона раствора. В водном растворе силанольные группы способны к кислотной диссоциации. Константа первой ступени имеет величину Ка1 = 2,5×10 3 . Это означает, что при pH водного раствора больше 2,5 поверхность кварца приобретает некоторый отрицательный заряд, который возрастает при увеличении pH раствора. Наоборот, при pH

2 и меньше диссоциация сила- нольных групп практически полностью подавлена, и поверхность кварца становится нейтральной.

Диссоциация силанольных групп вызывает на границе раздела кварц—водный раствор электролита образование двойного электрического слоя (ДЭС), рис. 1. Первую его обкладку составляют неподвижные отрицательно заряженные силанольные группы. Вторую обкладку двойного слоя составляют положительно заряженные катионы, существующие в растворе. Диэлектриком, разделяющим обкладки этого конденсатора, являются молекулы воды, гидратирующие как силанольные группы, так и катионы.

Положительная часть ДЭС, в свою очередь, делится на две части: первую (или неподвижную), непосредственно примыкающую к поверхности кварца, и вторую (или диффузную), располагающуюся на некотором удалении от поверхности. В неподвижной части количество положительных зарядов меньше, чем отрицательных зарядов на поверхности кварца из-за увеличения размеров катионов вследствие гидратации. В результате в диффузной части ДЭС образуется некоторая избыточная концентрация катионов. Между этими двумя слоями проходит т. н. граница скольжения — при наложении вдоль капилляра электрического поля неподвижная часть остается на месте, в то время как диффузная часть начинает мигрировать к катоду, увлекая за собой в силу межмолекулярного сцепления всю массу жидкости в капилляре. Возникает электроосмотический поток (ЭОП), который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра. Скорость ЭОП в сильной степени зависит от pH раствора: в сильнокислых растворах ЭОП отсутствует, в слабокислых — его скорость незначительна, а при переходе в нейтральную и щелочную область pH скорость ЭОП возрастает до максимально возможной. С другой стороны, эта величина зависит от концентрации электролита в ведущем буфере: чем она больше, тем выше становится доля катионов в неподвижной части ДЭС, а толщина диффузной части уменьшается и, соответственно, уменьшается скорость электроосмотического потока.

Рис. 1. Строение двойного электрического слоя.

В приборах для капиллярного электрофореза капилляр, заполненный раствором электролита, своими концами опущен в два содержащих тот же электролит сосуда, в которые введены электроды. Электролит должен обладать буферными свойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изменению состава раствора в приэлектродных пространствах, а с другой — стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа. При подаче на электроды высокого напряжения в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через капилляр протекает постоянный электроосмотический поток, на который накладывается взаимно противоположная электромиграция катионов и анионов.

Если в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить эту зону к катоду (в область детектирования), и зона некоторое время сможет находиться в капилляре под воздействием электрического поля высокого напряжения. В течение этого времени заряженные компоненты пробы будут перемещаться в соответствии с их электрофоретическими подвижностями.

Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток (рис. 2). Скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионы появляются первыми и тем раньше, чем больше их электрофоретическая подвижность.

Нейтральные компоненты пробы способны перемещаться только под действием электроосмотического потока, тогда как анионные будут перемещаться к аноду со скоростями меньшими, чем скорость ЭОП. Медленно мигрирующие анионы появятся на выходе после ЭОП, а те, чья скорость электромиграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, будут выходить из капилляра в прианодное пространство.

Рис. 2. Электрофоретическая миграция ионов в присутствии электроосмотического потока.

Если время нахождения пробы в капилляре (которое можно регулировать изменением напряжения, величины pH и концентрации ведущего электролита) достаточно, чтобы проявились различия в подвижности ионов, то на выходе капилляра вблизи катода можно наблюдать зоны раствора, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы.

Ведущий электролит (его называют также рабочим буферным раствором) должен иметь такую концентрацию, при которой электрическое сопротивление раствора в капилляре будет достаточно велико. Это требование связано с тем, что при прохождении электрического тока в проводнике выделяется тепло. Если ток достаточно велик, то жидкость в капилляре может даже закипеть.

Основные варианты капиллярного электрофореза

Наиболее распространенными вариантами метода капиллярного электрофореза являются капиллярный зонный электрофорез и мицеллярная электрокинетическая хроматография.

Самым простым вариантом КЭ является капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ). Компоненты сложной смеси движутся в среде электролита с разными скоростями, образуя дискретные зоны. Отличительная особенность КЗЭ состоит в том, что он пригоден для разделения только ионогенных компонентов пробы, тогда как нейтральные соединения, не обладающие собственной электрофоретической подвижностью, движутся со скоростью ЭОП и выходят в зоне нейтральных компонентов, зоне маркера ЭОП.

В приборах капиллярного электрофореза, в которых используется кварцевый капилляр, полярность входного конца чаще всего положительная (анод), и ЭОП переносит зону пробы к катоду. Вблизи катодного выхода установлен детектор. При этих условиях катионные компоненты пробы, тоже мигрируя к катоду, обгоняют ЭОП и первыми достигают детектора в виде отдельных зон, которые на электрофореграмме регистрируются индивидуальными пиками. Через некоторое время детектора достигает и зона исходного раствора, в которой остались нейтральные компоненты пробы. В зависимости от того, поглощают они или нет, на электрофореграмме регистрируется прямой (в некоторых случаях обратный) пик, который часто называют системным. Иногда для идентификации системного пика в пробу добавляют специальные вещества — маркеры ЭОП, например, бензиловый спирт. Что касается анионных компонентов пробы, то их поведение зависит от соотношения скоростей ЭОП и электромиграции анионов. Если скорость миграции аниона превышает скорость ЭОП, то такой анион рано или поздно выйдет из капилляра в прианодное пространство (это нежелательно, т. к. некоторые анионы, например хлорид, попадая в рабочий буферный раствор, будут, разряжаясь на аноде, вызывать коррозию платинового электрода). Если же скорость электромиграции аниона меньше скорости ЭОП, то такой анион может быть зарегистрирован на той же электрофореграмме после выхода системного пика. В этом варианте КЗЭ с положительной полярностью могут определяться катионные компоненты проб и большинство органических анионов.

Чтобы методом КЗЭ можно было определять анионные компоненты проб (в основном, неорганического происхождения) необходимо изменить полярность прикладываемого напряжения. Однако в этом случае изменится не только направление миграции анионов, но также направление ЭОП. Для преодоления этого противоречия необходимо модифицировать поверхность кварцевого капилляра так, чтобы знаки зарядов двойного электрического слоя поменялись на обратные. Это достигается введением в рабочий буферный раствор катионного поверхностно-активного вещества, например, бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ). Катион ЦТА + активно сорбируется на кварцевой поверхности, занимая при достаточной его концентрации все вакансии в ближайшем к поверхности слое. Поверхность как бы «ощетинивается» длинными цетильными (С16Н33—) цепочками. Ставшая гидрофобной поверхность при дальнейшей промывке рабочим буферным раствором сорбирует еще один слой поверхностно-активного катиона, ориентированного аммонийным концом наружу (сорбция «щетка в щетку»). В результате первый слой двойного электрического слоя становится положительным, а второй, в том числе и диффузная его часть, — отрицательным, и ЭОП снова движется от входного конца к детектору, несколько отставая от мигрирующих быстрее анионов.

Основным достоинством КЗЭ является высокая эффективность (сотни тысяч теоретических тарелок), при этом селективность, определяемая механизмом разделения внутри одной фазы, в КЗЭ недостаточна. Повышение селективности может быть достигнуто за счет изменения pH ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок: поверхностно-активных веществ, макроциклов, органических растворителей и т. д.

Мицеллярная электрокинетическая хроматография объединяет электрофорез и хроматографию. МЭКХ получила наиболее широкое распространение среди других вариантов капиллярного электрофореза, в первую очередь, за счет способности разделять как ионогенные, так и незаряженные компоненты пробы. Разделение нейтральных соединений стало возможным благодаря введению в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ (ПАВ) — мицеллообразователей. Чаще всего используют анионные ПАВ (например, додецилсульфат натрия — ДДСН, англ. SDS) в концентрациях, превышающих критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ), которая, например, для ДДСН в водном растворе составляет 8 мМ. В этом случае в растворе электролита находятся преимущественно мицеллы и небольшая доля мономерной формы ПАВ. Мономеры состоят из гидрофобного «хвоста» и гидрофильной (в случае анионного по- верхностно-активного вещества отрицательно заряженной) «головы». При формировании прямых мицелл мономерные фрагменты агрегируются неполярными концами внутрь, а внешняя сферическая поверхность мицеллы становится отрицательно заряженной. Каждая мицелла окружена собственным двойным электрическим слоем, внешнюю диффузную часть которого формируют катионы, присутствующие в растворе ведущего электролита. Число мономеров, образующих мицеллу, может колебаться от 60 до 100 молекул, однако общий заряд мицеллы существенно меньше из-за наличия в неподвижной части второго слоя ДЭС гидратированных катионов. Ни мицеллярная, ни мономерная форма АПАВ не взаимодействуют со стенкой кварцевого капилляра, но при подаче на капилляр высокого напряжения обе формы мигрируют к аноду, в то время как ЭОП направлен к катоду. Если в капилляр на анодной стороне ввести пробу, содержащую нейтральные и заряженные компоненты, то ЭОП будет переносить их к катоду, а навстречу будет двигаться поток отрицательно заряженных мицелл АПАВ. Нейтральные компоненты пробы могут распределяться между фазой раствора и мицеллярной фазой, причем константа этого распределения специфична для каждого сорта молекул пробы. В результате на выходе капилляра регистрируется электрофореграмма нейтральных компонентов, а также медленно мигрирующих анионов пробы.

Общее устройство систем КЭ

Минимальный состав системы, реализующей метод капиллярного электрофореза, должен включать следующие узлы: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и систему сбора, обработки и вывода информации (рис. 3).

Дополнительными устройствами в системах капиллярного электрофореза являются, например, автосемплер и блок жидкостного охлаждения капилляра, которые позволяют:

► автоматизировать подачу образцов,

► осуществить эффективный отвод тепла от капилляра.

Рис. 3. Устройство системы капиллярного электрофореза.

В системах капиллярного электрофореза используют, как правило, капилляры из высокочистого плавленого кварца, прозрачного в УФ-области спектра, с внешним полимерным, чаще полиимидным, защитным покрытием. В случае детектирования внутри капилляра (on-line) полиимидное покрытие в зоне детектирования снимают, оставляя для прохождения света зону чистого кварца. Внутренний диаметр капилляров может варьироваться от 20 до 100 мкм, но чаще всего используют 50 и 75 мкм. Внешний диаметр составляет 365 мкм, длина капилляров 20—100 см.

Читайте также:  Электрофорез при миозите шеи

Доминирующее число разделений в КЭ ведут на непокрытых изнутри капиллярах, так называемых немодифицированных. Их подготовка к анализу начинается, как правило, с промывки раствором щелочи для обеспечения диссоциации силанольных групп кварца и возникновения ЭОП.

Анализ методом КЭ можно проводить только тогда, когда капилляр находится в кондиционном состоянии. С точки зрения анализа кондиционное состояние капилляра следует понимать так, что выполняемые последовательно анализы должны быть воспроизводимы как по временам миграции пиков, так и по площадям пиков. При подготовке к работе капилляр обычно промывают раствором кислоты, водой и раствором щелочи. Цель первой операции заключается в удалении с поверхности примесей, в частности, многовалентных катионов, и первичном гидролизе силокса- новых групп. Промывка водой способствует удалению кислоты и дальнейшему гидролизу поверхности. Наконец, щелочная промывка предназначена для удаления примесей, не реагирующих с кислотой, и максимальной диссоциации образовавшихся силанольных групп. Финишная промывка водой имеет целью удалить из капилляра щелочь.

Источники высокого напряжения

В первую очередь, источники напряжения должны обеспечивать регулируемую подачу напряжения в диапазоне от —25 до +25 кВ и при заданной величине напряжения поддерживать постоянство этого значения. Максимально допустимый ток в капилляре при этом не должен превышать 200 мкА.

Как правило, переключение полярности происходит в ручном режиме, что сопровождается сменой высоковольтных блоков.

Типичный объем вводимой пробы в капиллярном электрофорезе составляет 1—20 нл. Общепринято заполнять пробой не более 2 % объема капилляра с тем, чтобы изначально, до анализа, не создавать широкую зону компонентов и обеспечить достаточное время нахождения зоны пробы в капилляре для установления значимых различий в электрофоретических подвижностях.

Непосредственно перед вводом пробы капилляр промывают рабочим буферным раствором, удаляя остатки пробы от предыдущего ввода.

Различают три способа ввода пробы:

Первые два способа реализованы во всех коммерческих системах капиллярного электрофореза, гидростатический, напротив, не нашел широкого применения.

Ввод пробы давлением (гидродинамический, пневматический) обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для пробы и выходным концом капилляра, при этом давление либо повышается в сосуде для пробы, либо снижается на конце капилляра.

Электрокинетический ввод пробы. При этом способе ввод пробы осуществляется путем подачи высокого напряжения на электроды, когда на входе установлена пробирка с раствором пробы, а на выходе — с рабочим буфером. За счет возникающего при этом ЭОП компоненты пробы перемещаются в капилляр. Количество введенной пробы при этом способе зависит от величины приложенного напряжения, времени, в течение которого приложено напряжение, и подвижности компонентов пробы.

Гидростатический ввод пробы. В этом способе для ввода пробы используют разницу в высоте между буферным сосудом и сосудом для проб.

Детектирование в системах капиллярного электрофореза может осуществляться различными способами:

► непосредственно в капилляре в части, близкой к выходному концу, в режиме реального времени (on-capillary). В зоне детектирования с внешней стенки капилляра снимают защитное полиимидное покрытие. Этот способ характерен для большинства коммерческих систем капиллярного электрофореза;

► непосредственно на выходном конце капилляра (end-capillary)’,

► вне системы КЭ (off-capfflary, при этом, как правило, детектор представляет собой отдельный самостоятельный прибор (например, масс-спектрометр) и соединен с системой капиллярного электрофореза специальным интерфейсом).

Основными принципами детектирования в КЭ являются:

► фотометрическое в УФ-видимой области спектра (прямое и косвенное),

► флуориметрическое (прямое и косвенное),

► амперометрическое (прямое и косвенное),

Наиболее распространенным вариантом детектирования продолжает оставаться фотометрическое, основанное на поглощении веществом УФ или видимого света. Фотометрические детекторы в КЭ, подразделяют на:

► Детекторы с фиксированной длиной волны: источники света с линейчатым спектром (ртутная лампа (254 нм), кадмиевая лампа (229 нм) и цинковая лампа (214 нм). В приборах «Капель-104» фотометрический детектор работает на длине волны 254 нм (строго 253,7 нм), поэтому отклик детектора будет наблюдаться только в том случае, если определяемый компонент имеет заметное поглощение на указанной длине волны

► Детекторы с изменяемой длиной волны: источниками света служат дейтериевые и вольфрамовые лампы (рабочий диапазон длин волн 190—350 нм и 340—850 нм, соответственно). Необходимая спектральная селекция достигается применением монохроматоров или узкополосных светофильтров.

► Детекторы на диодной матрице (ДМД). В таких детекторах световой поток, прошедший через капилляр, разлагается в спектр с помощью высококачественного светосильного монохроматора, а матрица фотодиодов постоянно регистрирует сигналы в ультрафиолетовой и видимой частях спектра (УФ-В-детекторы), обеспечивая запись в режиме сканирования. Данные, полученные одновременно на различных длинах волн (до 5), обрабатываются с помощью компьютеров, выделяющих сигнал на оптимальной длине волны и вычитающих фон. Применение детекторов на диодной матрице обеспечивает получение аналитических данных с гораздо большей степенью достоверности.

Для соединений, анализируемых с помощью КЭ и не поглощающих в УФ-диапазоне, существует возможность регистрации методом косвенного УФ-детектирования. В этом случае в состав ведущего электролита вводят небольшое количество хромофора — вещества, поглощающего на требуемой длине волны. Так, в случае определения анионов поглощающий ион тоже должен быть анионом, например, хромат-ион, фталат-ион, а при определении катионов чаще всего используют катионы ароматических аминов или гетероциклов, в частности, ион протонированного бензимидазола. Так как ионная сила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне, где находится непоглощающий ион, уменьшается концентрация поглощающего иона. Обмен происходит строго эквивалентно, на электрофореграмме наблюдаются обратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациям определяемых ионов. Косвенное УФ-детектирование является универсальным вариантом детектирования, т. к. позволяет регистрировать все присутствующие в анализируемом растворе компоненты.

Капиллярный электрофорез относится к группе комбинированных методов анализа, в которых объединены два основных процесса: предварительное разделение компонентов сложной смеси и их определение/детектирование. Важными характеристиками разделения являются разрешение, эффективность и селективность. Для конечного определения наиболее актуален параметр чувствительности, в первую очередь зависящий от типа используемого детектора.

Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью.

Несмотря на высокую эффективность, достигаемую в капиллярном электрофорезе, селективность разделения, особенно в зонном варианте может быть недостаточна, в первую очередь, из-за осуществления процесса разделения внутри одной фазы. Задача повышения селективности разделения в том или ином варианте КЭ требует знания факторов, ее определяющих, и может быть решена за счет изменения pH ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок, например, ПАВ, макроциклов, органических. Следует иметь в виду, что все эти факторы будут сказываться также на скорости ЭОП, однако, сам по себе электроосмотический поток не ответственен за изменение селективности разделения и определяет лишь изменение времени миграции (на равную величину для всех компонентов пробы).

Выбор ведущего электролита является чрезвычайно важной задачей для успешного разделения в любом варианте КЭ. Величина pH ведущего электролита определяет как скорость течения жидкости в капилляре (величину ЭОП), так и форму нахождения компонента в растворе (заряд). Чувствительность ЭОП к изменению pH раствора заставляет использовать ведущие электролиты с высокой буферной емкостью, при этом диапазон pH, как правило, имеет значения рКа±1. Благодаря высокой стабильности кварцевого капилляра при электрофоретическом разделении можно использовать буферные системы с pH от 2 до 12.

Идеальный буфер для капиллярного электрофореза должен обладать следующими свойствами:

► достаточная буферная емкость в выбранном диапазоне pH,

► малое поглощение на длине волны детектирования,

► низкая подвижность ведущего иона.

Список так называемых «подходящих» буферов возглавляют боратный буфер и TRIS, так как они могут использоваться в широком диапазоне концентраций без существенного увеличения тока, что позволяет, в свою очередь, применять максимально высокие напряжения в ходе анализа.

Среди используемых в капиллярном электрофорезе добавок наиболее популярны поверхностно-активные вещества. Их введение в состав буферных растворов позволяет в разной степени влиять на селективность, причем определяющими факторами являются тип ПАВ и его концентрация. В КЭ могут быть использованы как ионогенные (катионные (КПАВ) и анионные (АПАВ), а также цвиттер-ионные), так и нейтральные поверхностно-активные вещества.

При концентрации ниже ККМ мономерные формы ионогенных ПАВ могут выступать как ион-парные добавки (различные АПАВ, КПАВ), а также влиять на растворимость гидрофобных компонентов смеси и модифицировать стенки капилляра (например, ЦТАБ). Возможные при этом механизмы взаимодействий поверхностноактивного вещества и пробы — ионные и/или гидрофобные. Добавки ПАВ в ведущий электролит влияют не только на поведение зоны пробы в капилляре, но и на стенки самого капилляра, модифицируя ЭОП (уменьшая, увеличивая или обращая).

Органические растворители (метанол, ацетонитрил, изопропанол и др.), которые вводят в буферный раствор в концентрации от нескольких долей процента до 30 % (об.) могут, с одной стороны, повышать растворимость анализируемых соединений, делая капиллярный электрофорез пригодным для анализа веществ с ограниченной растворимостью в водных средах. С другой стороны, органические добавки могут уменьшать гидрофобные взаимодействия между анализируемым компонентом и мицеллой в МЭКХ, а также влиять на подвижность ЭОП и собственную электрофоретическую подвижность аналита. Макроциклические реагенты как компоненты ведущих электролитов широко распространены в КЭ.

Обработка результатов в капиллярном электрофорезе. Качественный и количественный анализ

Целью любого анализа является получение ответов на вопросы: какие компоненты присутствуют в анализируемом образце и какова величина их концентраций? Первый из вопросов есть задача качественного анализа, второй — количественного. Для решения обеих задач в КЭ перед анализом пробы обязательно проводят процедуру градуировки системы путем измерения одной или нескольких смесей с известным качественным и количественным составом. Результатом градуировки являются формирование таблицы компонентов (содержит времена миграции и имена определяемых компонентов) и построение градуировочной зависимости (показывает зависимость сигнала детектора от концентрации/содержания вещества).

В капиллярном электрофорезе используют те же принципы интегрирования пиков, методы градуировки, способы формирования отчетов, как в газовой хроматографии и ВЭЖХ. По аналогии с ВЭЖХ большинство детекторов в капиллярном электрофорезе являются концентрационными, для которых высота или площадь пика прямо пропорциональны концентрации вещества, образующего пик.

Качественный анализ. Характеристики миграции/удерживания

Качественный анализ обычно состоит в сравнении времен миграции (в случае капиллярного зонного электрофореза) или времен удерживания (в случае мицеллярной электрокинетической хроматографии), полученных для стандарта и пробы, измеренных в одинаковых условиях. Если эти времена совпадают с заданной точностью (обычно окно идентификации не превышает 5 %), то считают, что искомое вещество в пробе найдено и переходят к количественному анализу. Тем не менее, такой способ идентификации вещества не всегда надежен, особенно в случае анализа проб со сложной матрицей.

Несмотря на высокую разделительную способность капиллярного электрофореза, качественный анализ близкорасположенных пиков может вызывать некоторые трудности. В этом случае можно рекомендовать использование метода добавок. В пробу, для которой затруднена идентификация анализируемого вещества, вносят это вещество и проводят повторный анализ. Если на электрофореграмме появляется новый пик, это означает, что анализируемый компонент ранее в пробе отсутствовал. Если же один из бывших пиков увеличился по высоте (площади), то можно утверждать, что это и есть анализируемый компонент. Величину добавки обычно выбирают так, чтобы высота (площадь) интересующего нас пика увеличилась не более чем в 2—3 раза.

Зачастую приходится сталкиваться с ситуацией, когда время миграции компонента не стабильно от анализа к анализу, что связано, в том числе, с нестабильностью электроосмотического потока. Причин этому несколько, от недостаточно кондиционного состояния капилляра, использования модификации внутренней поверхности капилляра или введения добавок в состав буферного электролита до температурных эффектов и влияния матричных и сопутствующих компонентов. Использование в таких ситуациях маркера ЭОП (например, ацетона) как в растворе стандарта, так и в пробе, позволит вычислить исправленные времена миграции, представляющие собой разность времен миграции анализируемого вещества и метки ЭОП.

Еще одним из вариантов повышения достоверности идентификации анализируемого компонента является введение в стандартный раствор и раствор пробы маркера — внутреннего стандарта. Это должно быть вещество, заведомо отсутствующее в анализируемых пробах, но имеющее схожие с определяемым веществом физико-химические свойства. Для стандарта и пробы вычисляют относительные времена миграции (можно арифметически поделить время миграции компонента на время миграции ЭОП и, наоборот, но для пробы и для стандарта это должно быть сделано одинаково) и находят в пробе близкие по численному значению результаты.

Наиболее полную и достоверную идентификацию вещества на сегодняшний день можно получить при использовании диодно-матричного детектора, который по результату одного анализа может предоставить информацию:

по сопоставлению времени миграции вещества и его спектра в пробе и стандартном растворе (при этом дополнительно будет дана оценка чистоты пика пробы, например, по наложению спектров, снятых в трех точках пика: на обоих склонах и в максимуме);

по отношению откликов пика (например, площади) на двух разных длинах волн, полученных для стандарта и пробы. Для одного и того же вещества на двух разных длинах волн при неизменном времени миграции отношение площадей в стандартном растворе и растворе пробы должно быть постоянным. Длины волн выбирают так, чтобы компонент имел при этом разное поглощение, т. е. высота или площадь пика при двух разных длинах волн были бы различными.

Количественная обработка результатов анализа

В основе количественного анализа лежит прямо пропорциональная зависимость высоты (площади) пика от концентрации вещества при использовании концентрационных детекторов, какими являются, например, фотометрические и флуориметрические детекторы.

Суть количественного определения сводится к следующему: сначала выбирают метод градуировки (внешнего стандарта (абсолютной градуировки), внутреннего стандарта, метод добавок и т. д.); определяют какую величину отклика детектора — высоту пика или площадь пика — будут использовать; затем анализируют стандартные растворы с известными концентрациями веществ и для каждого компонента строят градуировочную зависимость отклика детектора от концентрации вещества; после чего анализируют пробу неизвестного состава и по градуировочному графику находят концентрацию определяемых веществ.

Читайте также:  Электрофорез с лидазой на уши для чего

Основным методом градуировки является метод внешнего стандарта (абсолютной градуировки), для которого необходимо иметь ГСО или химически чистые стандарты всех определяемых компонентов. Градуировка может быть одноточечной и многоточечной. Одноточечная означает, что для градуировки компонента используется только один градуировочный раствор, зависимость носит строго линейный характер и, как правило, выходит из начала координат. Это частный случай многоточечной градуировки, для построения которой анализируют несколько специально подобранных по концентрациям градуировочных растворов, после чего с помощью метода наименьших квадратов рассчитывают коэффициенты прямой, наилучшим образом описывающей экспериментальные данные. Правильное и тщательное проведение градуировки является необходимым условием точности получаемых количественных результатов анализа.

Основными областями применения метода КЭ являются:

· Анализ объектов окружающей среды: природные, питьевые, сточные воды и почвы (анионы, катионы, гербициды).

· Контроль качества пищевой продукции и продовольственного сырья: (неорганические катионы и анионы, консерванты, органические кислоты, подсластители, синтетические красители, антиоксиданты, аминокислоты, витамины, углеводы, белки).

· Анализ показателей качества кормов, комбикормов и сырья для их производства: (аминокислоты, белки, витамины).

· Фармация: технологический контроль и анализ готовых лекарственных форм, разделение оптических изомеров.

· Клиническая биохимия: определение неорганических катионов и анионов, аминокислот, белков в биологических жидкостях, определение фармакокинетики лекарственных препаратов.

· Криминалистическая экспертиза: обнаружение остаточных количеств взрывчатых веществ, анализ наркотических средств.

· Химическая промышленность: технологический контроль, определение состава сырья и полупродуктов.

источник

Описание метода капиллярного электрофореза и технологии определения карбогидрат-дефицитного трансферрина

Согласно вышеописанным критериям в качестве метода, наиболее подходящего для рутинных скрининговых исследований, был выбран метод капиллярного электрофореза в исполнении автоматических капиллярных систем Minicap или Capillarys производства Sebia и наборов реагентов к ним.

Данный метод основан на разделении заряженных молекул в жидкой среде внутри сверхтонкого кварцевого капилляра под действием электрического тока. Белковые молекулы при этом разделяются согласно своему электрическому заряду. На разделение также оказывают влияние рН электролита и электроэндоосмотический поток. Метод не требует предварительной обработки образцов и позволяет осуществлять как качественную, так и количественную оценку фракций трансферрина. Расчетная формула CDT полностью соответствует текущему определению аналита (суммарное значение углевод-дефицитных фракций трансферрина), и одновременно с этим программное обеспечение прибора дает возможность производить количественную оценку каждой карбогидрат-дефицитной фракции в отдельности, что позволит использовать данные системы после утверждения международных рекомендаций по стандартизации CDT без каких-либо ограничений [13, 14].

Разделение изоформ трансферрина методом капиллярного электрофореза основано на разнице их электрического заряда, величина которого прямо пропорциональна количеству остатков сиаловой кислоты. Аналитический этап на системах Capillarys/ Minicap полностью автоматизирован и включает в себя разведение образца и его инъекцию в анодную часть капилляра. Под действием высокого напряжения образец, мигрируя по всей длине капилляра, разделяется на фракции, каждая из которых, достигая катодной части капилляра, последовательно регистрируется путем измерения поглощения пептидных связей, определяемого при 200 нм. Детекция изоформ трансферрина осуществляется в следующем порядке: асиало-, дисиало-, трисиало-, тетрасиало- и пентасиалотрансферрин. После завершения миграции капилляры немедленно промываются моющим раствором и подготавливаются к разделению следующего образца, заполняясь буфером для электрофореза [10, 12].

После детекции результаты обрабатываются программным обеспечением прибора и отображаются на экране монитора в виде процентного содержания фракций (количественный анализ) и денситометрической кривой (качественный анализ) (Приложение 5, Пример 1). Результаты качественной и количественной оценки импортируются в протокол исследования, служащий приложением к заключению о результатах анализа (Приложение 6).

Оборудование и тест-системы для капиллярного электрофореза Sebia

В качестве систем для определения карбогидрат-дефицитного трансферрина могут использоваться оба варианта анализаторов капиллярного электрофореза — Minicap или Capillarys и наборы реагентов к ним (Приложение 3).

Оба анализатора идентичны по принципу действия и отличаются только своей пропускной способностью [13, 14].

Система Capillarys имеет 8 встроенных капилляров, функционирующих параллельно, позволяя выполнять 8 анализов по определению уровня CDT одновременно. Пропускная способность системы Capillarys составляет 38 образцов в час, благодаря чему она может быть рекомендована для оснащения крупных скрининговых центров, выполняющих от 50-100 анализов CDT в день.

Система Minicap имеет 2 встроенных капилляра, функционирующих параллельно, позволяя выполнять 2 анализа по определению уровня CDT одновременно. Пропускная способность системы Minicap составляет 10 образцов в час, что оптимально для лабораторий со средним потоком CDT исследований – 20-50 тестов в день.

Перечень реагентов и расходных материалов для определения маркера CDT на приборах Capillarys и Minicap приведен в Приложении 3.

Системы Capillarys/ Minicap обеспечивают полную автоматизацию аналитического этапа, высокую пропускную способность, возможность проведения анализа из первичной пробирки и использование функции считывания штрих-кода. Программное обеспечение систем полностью русифицировано и позволяет хранить и обрабатывать большие массивы данных.

Аналитические характеристики метода Sebia подтверждены в испытаниях на статистически достоверной выборке российской популяции, проведенных в ГУЗ МНПЦ в период с 2011 по 2012 гг., а также в крупном популяционном исследовании российской выборки в рамках международного исследования, опубликованного в статье “Comparative performance of biomarkers of alcohol consumption in a population sample of working-aged men in Russia: the Izhevsk Family Study” группой авторов из Лондонской школы гигиены и тропической медицины Лондонского Университета, Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Ижевской государственной медицинской академии, Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова и Департамента лабораторной медицины Каролинского института [1, 97].

Системы капиллярного электрофореза Capillarys/ Minicap, наборы реагентов и расходные материалы к ним зарегистрированы как изделия медицинского назначения и разрешены к использованию для in vitro диагностики на территории Российской Федерации.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Только сон приблежает студента к концу лекции. А чужой храп его отдаляет. 8806 — | 7522 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Злоупотребление алкоголем является одной из основных причин низкой продолжительности жизни в РФ. От трети до более половины смертей мужчин трудоспособного возраста составляют прямые и непрямые алкогольные потери [1, 2]. Помимо анализа социально-экономических и психологических факторов большое значение имеет исследование алкоголизма, позволяющее выявить молекулярные механизмы развития заболевания и нарушений, связанных с злоупотреблением алкоголем. В настоящее время во всем мире проводится исследование диагностических маркеров потребления алкоголя. Их используют при профессиональной диспансеризации, при возврате водительского удостоверения, изъятого по причине вождения в состоянии алкогольного опьянения, при наблюдении за ходом лечения больных алкоголизмом, при подготовке к хирургическому вмешательству. Наиболее специфичным и перспективным из таких маркеров для клинической практики является карбон-дефицитный трасферрин (CDТ) [3]. Среди существующих методик выявления граждан, страдающих хроническим алкоголизмом, наиболее распространенными являются способы позволяющие проводить анкетирование. К ним относятся тесты: CAGE, AUDIT, Сетка LeGo. Они просты для заполнения больными, легко и быстро оцениваются врачом, и в наибольшей мере учитывают национальные особенности « российского менталитета» и отношение к алкоголю [4, 5, 6].

Мировой опыт свидетельствует, что краткое анкетирование и элементарный врачебный осмотр являются качественным диагностическим инструментарием. Необходимо дополнительное использование тестов, которые повышают вероятность распознавания хронической алкогольной интоксикации (ХАИ). В первую очередь к ним относятся биохимические анализы, определяющие повышение активности гамма-глутамилтранспептидазы (GGT), аминотрансферазы [7]. В последние годы для объективной лабораторной диагностики хронической алкогольной интоксикации применяют качественное и количественное определение маркера карбогидрат-дефицитного трансферрина (CDT) в сыворотке крови больного [8].

Среди маркеров потребления алкоголя наиболее специфичным является карбондефицитный траснферрин. Трансферрин-белок, переносящий в клетки всех тканей тела ионы железа при их абсорбции в кишечнике или высвобождении из эритроцитов. Различие изоформ трасферрина определяется гликозилированием. Основная фракция трансферрина представлена изоформной с 4 остатками сиаловой кислоты. При потреблении значительных количеств алкоголя (40-60 г в день на протяжении нескольких дней, или больших разовых доз) возрастает доля карбонгидрат-дефицитного трансферрина (CDT) –изоформ с двумя, одним остатком или полностью десиализированный трансферрин (0-форма). В норме фракция CDT не превышает 1.3 % – 1.7 %, тогда как при потреблении указанных количеств алкоголя уровень CDT превышает эти границы и может возрастать до 10-15 раз. Выбор данного маркера основан на его диагностической возможности отражать как раннее и скрытое злоупотребление алкоголем, так и обеспечивать мониторинг эффективности проводимой терапии посредством объективного отражения ремиссии или возникновения рецидива.

Цель работы заключалась в установлении диагностической значимости сравнительного определения маркеров хронического употребления алкоголя, методами капиллярного электрофореза и биохимического анализа при обследовании различных групп больных алкоголизмом.

Материалы и методы исследования

Исследование проведено на базе Московского научно-практического центре наркологии ДЗ города Москвы в группе мужчин, которое исключает влияние гендерных различий.

Клиническое исследование выполняли в группе больных состоящей из 250 пациентов в возрасте от 23 до 72 лет с установленным диагнозом хронический алкоголизм. Анализ сыворотки крови на содержание маркера карбогидрат-дефицитного трансферрина проводили в динамике, осуществляя забор венозной крови на 1-ый, 7, 14 и 21-ый день лечения. Контрольную группу составили 1000 здоровых доноров. Комплексная оценка больных хроническим алкоголизмом включали данные, о возраст, поле и длительности заболевания. Анализируемые группы пациентов были однородны по всем перечисленным выше характеристикам.

Для установления диагностической значимости маркеров хронического употребления алкоголем проводили определение в сыворотке крови пациентов изоформ гликозилированного трансферрина (CDT) и биохимические показатели содержания печеночных ферментов аланинаминотрансфераза (ALT), аспартатаминотрансфераза (АST), глутаминаминотранспептидазой (GGТ).

Кровь в количестве 5мл забирали в моноветы. Далее пробирки центрифугировали на центрифуге ELMI СМ-6М (Латвия) 5 мин., при скорости 3 тыс. об. мин. После чего сыворотку делили на аликвоты по 1,5 мл в пробирки eppendorf для определения содержания биохимических маркеров и трансферрина. Определение белка CDT проводили на приборе Minicap (Франция). Для определения биохимических маркеров показания крови ALT, AST и GGT по 1 мл сыворотки закапывали в кюветы биохимического анализатора HORIBA ABX Pentra 400 (Франция). Статистический анализ проводили стандартными методами с помощью пакета WinSTAT 2003.1, интегрированного в Excel. При оценке отношения шансов (OR) и значимости отличий частот по точному тесту Фишера использовали свободно распространяемый пакет программ WinPepi: http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html

Результаты исследования и их обсуждение

При хроническом злоупотреблении алкоголя гликозилирование трансферрина нарушается, что приводит к изменению процентного соотношения его изоформ в сторону повышения уровня низкосиалированных вариантов, называемых также карбогидрат-дефицитными, или CDT. Патомеханизм повышения уровня CDT в ответ на хроническое злоупотребление алкоголем заключается, главным образом, в том, что этанол и/ или его метаболит – ацетальдегид влияют на синтез цепей N-гликанов в аппарате Гольджи, ингибируя активность галактозилтрансферазы и N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и одновременно с этим повышая активность сиалидазы в плазматических мембранах печени. Этанол также вызывает дестабилизацию и снижение концентрации м-РНК ?-2,6-сиалилтрансферазы и снижение синтеза ?-2,6-сиалилтрансферазы, обусловленное снижением активности сиалилтрансферазы, и, как следствие, уменьшение сиалирования молекул трансферрина [3,8,9]. Нами были выполнены исследования, направленные на определение диагностической значимости результатов, полученные двумя независимыми методами при обследовании группы лиц с хронической алкогольной зависимостью. Определения маркера CDTпроводили в образцах крови в 1-й, 7, 14 и 21-й дни лечения. Для анализа на биохимические маркеры ALT, AST и GGT использовали образцы 1-й и 21-й дни. При анализе полученных усредненных результатов были выявлены зависимости, представленные на рис. 1, 2.

Как видно из рис. 1, концентрации CDT составляет в среднем 4,31 % при поступлении пациента, на 7 день лечения она уменьшается до 2,27 %. К 14 дню составляла 1,48 %, к 21 дню лечения 1,14 %. Полученные данные свидетельствуют о том, что при полном отказе от алкоголя у пациента происходит снижение концентрации белка и значение CDT приходит в норму за 2-3 недели.

Рис. 1. Зависимость значений CDT от времени

Рис. 2. Зависимость биохимических показателей от времени

На рис. 2 представлена динамика изменения биохимических маркеров. Концентрация ферментов с течением времени так же уменьшается. Однако, даже через 2-3 недели эти значения не нормализуются и остаются высокими. Полученные данные и их значения не позволяют в эти сроки подтвердить полный отказ пациента от алкоголя. Таким образом, сравнивая в динамике уменьшение числового ряда значений CDT и биохимических показателей, характеризующих содержание ферментов, можно заметить, что данные CDT являются более информативными по сравнению с такими маркерами, как ALT,AST и GGT. В отличие от содержания ферментов повышение гликозилированного трансферрина в наименьшей степени ассоциировано с органическим поражением печени или других органов (как алкогольного, так и неалкогольного генеза) или повышенным синтезом микросомальных ферментов. В отличие от других гликопротеинов, недостаток сиалирования изоформ трансферрина никак не связан с клиренсом печени или почек.

Проведены сравнительные исследования маркеров хронического злоупотребления алкоголем характеризующих изменения в содержании ферментов и гликозилированного трансферрина. При этом использовали методы биохимического анализа и капиллярного электрофореза. Установлено, что наиболее важными для диагностики ранних состояний алкоголизма являются данные определения CDT.

Таким образом, маркер CDT является универсальным диагностическим инструментом для реализации профилактической и медико-реабилитационной стратегии при заболеваниях зависимости от алкоголь-содержащих веществ. Ключевой составляющей при использовании маркера CDT является объективизация факта злоупотребления алкоголя методами лабораторной диагностики. Представленный маркер CDT на сегодняшний день является единственным маркером оценки хронической алкогольной нагрузки, имеющий опыт практического использования.

Результаты, полученные на основе анализа данных о пациентах с алкоголизмом, послужат основой для разработки стратегий мониторинга рисков, оптимальных терапевтических и профилактических стратегий, а также поиска новых фармакологических мишеней с применением новых методов диагностики такого социально значимого заболевания, как алкоголизм.

источник