Методом электрофореза на бумаге в сыворотке крови человека было обнаружено

Лабораторная работа №8

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ

Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 B.

Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),

Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза

через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 — 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, — уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.

Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 — 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 — 8,9) при градиенте потенциала 3 — 5 В/см (120 — 350 B для полос длиной 40 — 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 — 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге — прогорание бумаги

1. Буферный раствор. Можно использовать:

а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;

б) веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;

в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.

2. Растворы для окраски электрофореграмм:

а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) —0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) — 100 мл + метиловый спирт — 900 мл;

б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;

в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO₄·7H₂O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.

3. Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:

а) уксусная кислота — 2 %-й раствор;

б) уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.

4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:

а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;

б) для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.

Получение сыворотки крови. 2 — 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 — 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.

Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18×45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 —5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы —2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 —8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.

Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 — 0,02 мл (1 — 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 — 24 ч при напряжении 200 — 300 B

Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 — 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 — 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 — 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.

Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α₁-, α₂-, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 —5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.

Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций

Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.

Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат — соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

источник

Общие сведения. Электрофорезом называют движение заряженных коллоидных частиц в постоянном электрическом поле к противоположно заряженному электроду.

Явление электрофореза было открыто профессором Московского университета Ф. Ф. Рейссом в 1807 г.

В молекулах белковых веществ возникновение электрических зарядов зависит от группировок, обладающих кислотными и основными свойствами. Кислотные свойства обусловлены карбоксильными и сульфгидрильными группами, а также фенольными гидроксилами. Основные свойства характерны для амино-, имино- и гуанидиновых групп.

Как известно, белки и аминокислоты являются биполярными ионами.

Процесс диссоциации белков во многом зависит от их изоэлектрической точки. Чем дальше будет отстоять значение pH среды от изоэлектрической точки, тем макромолекулы белка будут обладать большим зарядом и с большей скоростью передвигаться к положительному или отрицательному полюсу. Если в растворе находятся несколько белков, которые различаются своими изоэлектрическими точками, то скорость их перемещения в электрическом поле будет неодинаковой. Это явление положено в основу метода электрофоретического исследования биологических жидкостей, который находит широкое применение при анализе свойств белков и аминокислот, а также для диагностических целей.

Для практических работ используют различные варианты метода электрофореза на бумаге.

Основу аппарата составляет ванна из толстого стекла, в которую помещены две кюветы (анодная и катодная) с электродами, приспособления для размещения и закрепления полосок хроматографической бумаги (рамка, лабиринт, пружины) и некоторые вспомогательные части (рис. 5). Применяются платиновые или угольные электроды. Кюветы разделяются перегородками на два отделения — наружное и внутреннее, чтобы предотвратить попадание продуктов электролиза (что связано с изменением pH) на полоски бумаги. В наружных отделениях кювет располагаются электроды, во внутренние погружаются концы полосок бумаги, на которые наносится исследуемая

жидкость. Внутреннее и наружное отделения каждой кюветы соединяются посредством кусочков фильтровальной бумаги, которые кладутся на перегородки. Кюветы заполняются буферным раствором (боратным, фосфатным, вероналовым) с определенным значением pH и ионной силы. Одинаковый уровень жидкости в кюветах поддерживают с помощью сифона.

Рис. 5. Камера аппарата для электрофореза на бумаге (по В. И. Добрыниной и Е. Я. Свешниковой): 1 — ванна из толстого стекла; 2 — стеклянная крышка, пришлифованная к ванне; 3 — электродные кюветы (свободно вынимаются); 4 — продольная перегородка, разделяющая кювету пополам; угольные электроды; — бумажные полосы, концы их опускаются во внутреннее отделение кюветы; 7 — съемные пластинки, на которых укрепляются электроды (присоединяются К вание при помощи двух пружинок); 8 — рамка, на которой укрепляются и натягиваются бумажные полосы; Р—лабиринт для укрепления бумажных полос; 10 — пружины для натягивания бумажных полос; 11 — подставка для ванны; на подставке; 13 — установочные винты.

Для предотвращения испарения жидкости камеру (ванну) закрывают пришлифованной стеклянной крышкой.

В комплект аппарата входит также стабилизатор и выпрямитель.

В Советском Союзе аппараты для электрофореза на бумаге выпускает фрунзенский завод «Физприбор».

Разделение глютамина и глютаминовой кислоты с помощью электрофореза на бумаге (по прописи В. И. Добрыниной и Е. Я. Свешниковой).

Если на полоску фильтровальной бумаги нанести раствор смеси глютамина и глютаминовой кислоты, то после электрофореза при pH 8,0 в течение 1,5-2 ч и последующей окраски электрофореграммы можно наблюдать, что глютамин остается на месте нанесения капли раствора, а глютаминовая кислота передвигаетя к аноду на 3—4 см. Это обусловлено

тем, что молекулы глютамина при pH 8,0 электронейтральны и не передвигаются в электрическом поле, а молекулы глютаминовой кислоты при указанном pH имеют преобладающую диссоциацию карбоксильных групп, несут отрицательные заряды и поэтому передвигаются к аноду.

Реактивы: а) раствор глютаминовой кислоты: в 10 мл воды растворяют 50 мг глютаминовой кислоты; б) раствор глютамина: в 10 мл воды растворяют 50 мг глютамина; в) фосфатная буферная система. Готовят два раствора: Для получения фосфатного буфера pH 8,0 смешивают 945 мл I раствора с 55 мл II раствора; г) нингидрин, 0,2%-ный раствор в этиловом или бутиловом спирте.

В обе кюветы аппарата наливают фосфатный буфер (pH 8,0, ионная сила 0,05). На перегородки между наружным и внутренним отделениями кюветы кладут по кусочку фильтровальной бумаги для установления электрической связи. Одинаковый уровень жидкости в обеих кюветах устанавливают при помощи резинового или стеклянного сифона, наполненного тем же буферным раствором. Полоску фильтровальной бумаги (лучше брать ватман № 2 или хроматографическую ленинградскую) размером см берут двумя пинцетами (во избежание загрязнения), помещают на лист бумаги и в центре проводят карандашом поперечную линию, вдоль которой штриховыми движениями наносят из микропипетки 0,02 мл смеси растворов глютамина и глютаминовой кислоты. Каждую новую порцию наносят после того, как подсохнет предыдущая. На другую полоску наносят 0,02 мл раствора глютаминовой кислоты, на третью — столько же раствора глютамина. Полоски поочередно смачивают буферным раствором (в чашечке). Избыток влаги удаляют, раскладывая полоски на листе фильтровальной бумаги. Полоски переносят в прибор и концы их погружают в кюветы. В камеру можно уложить 6 полосок. Они должны лежать горизонтально и не провисать.

Камеру для электрофореза закрывают крышкой, и зажимы электродов фиксируют на выпрямителе — стабилизаторе тока. Выпрямитель подключают к электросети и постепенно увеличивают напряжение. Электрофорез проводят при напряжении 200—300 В и силе тока 1,5-2 мА

в течение 1,5-2 ч, после чего снижают напряжение до нуля и выключают прибор.

Полоски электрофореграмм вынимают чистыми пинцетами и с концов, погруженных в буферный раствор, удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Полоски накалывают в горизонтальном положении на гвоздики рамы и помещают для фиксации в сушильный шкаф при температуре 100—105° С в течение 10—15 мин. Сухие полоски вынимают из шкафа и опрыскивают раствором нингидрина, после чего для проявления пятен снова помещают в тот же сушильный шкаф на 3—5 мин.

Кроме электрофореза на бумаге, в последнее время широкое распространение получили методы электрофоретического разделения веществ на полиакриламидном, агаровом, геле, крахмале и т. д.

источник

Этот анализ является исследованием, которое позволяет определить их количественные и качественные показатели по тому, как белки распределяются в электрическом поле. Исследование основано на том, что белковые молекулы несут заряды, положительные или отрицательные в зависимости от того, какой кислотностью будет обладать среда, в которой будет проводиться непосредственно электрофорез. Молекулы, которые окажутся положительно заряженными, будут адсорбироваться лучше, нежели чем те, которые несут отрицательный заряд.

Носителями, которые будут применяться для электрофореза, могут быть хроматографическая бумага, агаровый гель, полиакриловой гель, ацетатцеллюлозная бумага или акриловый гель. Значительно реже применяется капиллярный электрофорез.

Во время анализа белки разделяют на 5 или 6 фракций, в зависимости от применяемого метода. Это будут гамма-глобулины, которые делятся на бета-1 и бета-2, альбумины — альфа-1 и альфа-2, а также бета-глобулины.

Имеются установленные нормы белковых фракций, которые должны присутствовать в крови. Отклонение их от показателей является признаком нарушения в организме, что требует проведения обследования для выявления причины.

Значения показателей, в зависимости от того какие реактивы применяются в конкретной лаборатории, могут несколько изменяться. Поэтому в бланке результатов исследования в каждом медицинском учреждении обязательно указываются значения нормы, которые приняты в нем. На них будет ориентироваться врач при расшифровке анализа.

Электрофорез белков крови назначают не очень часто, так как сегодня современные лабораторные исследования позволяют провести анализ на определенный белок, что ускоряет процесс диагностики. Абсолютным показанием к электрофорезу является наличие монолокальной гаммапатии. Также иногда анализ может быть показан в таких случаях:

• чрезмерно высокая скорость оседания эритроцитов, когда она превышает 50 мм/ч;
• значительно повышенный уровень гамма-глобулинов;
• скрининговое обследование для контроля эффективности лечения миеломной болезни;
• чрезмерно высокий общий белок в крови;
• ряд аутоиммунных заболеваний, поражающих печень и почки;
• слабость, для которой нет выраженной причины;
• развитие патологических переломов костей и постоянные боли в костях;
• частые рецидивы инфекционных заболеваний;
• нарушения, обнаруженные в прочих анализах, указывающие на то, что у человека могут развиваться анемии, лейкемии, гиперкальциемия или гипоальбуминемия.

При общей диспансеризации и получении медицинских справок для трудоустройства данное исследование крови не осуществляется. Не требуется оно и в процессе подготовки человека к хирургическому вмешательству.

Для получения наиболее точных результатов рекомендуется соблюдение правил подготовки к анализу. Они включают в себя голодную диету в течение 15 часов до того как будет взята кровь, когда пациент может употреблять только чистую не газированную воду. За 90 минут до проведения исследования необходимо полностью исключить нагрузки как эмоциональные, так и физические, и курение в активной или пассивной форме. Чтобы не допустить искажение данных, забор материала не проводят сразу после того, как был осуществлен гемодиализ или проведена процедура, при которой использовались радиоконтрастные составы. Важно также, чтобы за несколько дней до исследования полностью было исключено лечение пенициллином, так как он вызывает расщепление амбулина, что исказит результат.

Исказить показатели, кроме неправильной подготовки к проведению анализа, могут 2 фактора: недавно проведенная процедура гемодиализа, из-за которой произошло разрушение эритроцитов в крови, и повышенный уровень билирубина в организме. В любом из этих случаев потребуется пересдача анализа через некоторое время, которое определит врач.

источник

В плазме человеческой крови находится множество белковых компонентов. Они различны по своему составу, строению и подвижности в определенной среде, проводящей электрический ток. На этом и строится разделение общего белка, который локализуется в плазме, на различные белковые фракции. При проведении электрофореза сыворотки крови выясняют количественное отношение отдельных белковых составляющих и структур. Это необходимо для определения наличия у человека различных патологических явлений, например инфекций или онкологии. Именно электрофорез белков сыворотки крови имеет большое значение при проведении диагностики различных болезней.

Для расщепления белковых фракций применяют электрофорез сыворотки крови, принцип которого основан на разной подвижности белковых компонентов в созданном электрическом поле. Такой метод исследования является более точным и информативным, в отличие от стандартного общего анализа крови. Но при этом электрофорез показывает только количество определённой фракции белка, характер и степень патологического процесса в общей форме. Анализ проведенных исследований позволяет медицинским специалистам выяснить, какое именно соотношение белковых фракций наблюдается в организме человека, и определить специфику патологии, присущую конкретному заболеванию.

Большую часть основной биологической жидкости человека, или крови, составляют белки. В общем количестве их норма находится в пределах 60-80 г/л. Для получения точного анализа проводится электрофорез сыворотки крови на бумаге. Это исследование является самым распространенным способом анализа. Основной средой является особая фильтровальная бумага. Главная ее особенность – высокая гигроскопичность. Такая бумага может поглотить воды больше своего веса в 130-200 раз. В зависимости от применяемого оборудования электрофорез на бумаге длится 4-16 часов. Происходит подразделение белковых структур. Затем полосы бумаги обрабатывают специальными красками для получения анализа. Такая методика является самой распространенной в работе медицинских лабораторий. За счёт воздействия электрического тока белковые фракции, заряженные отрицательно, двигаются в сторону положительно заряженного электрода. Благодаря этому белковые составляющие крови подразделяются на 5 известных фракций:

Альбумины заряжены отрицательно, имеют маленькую, по сравнению с другими фракциями, молекулярную массу. За счет этого скорость их передвижения гораздо выше, чем у остальных фракций, и они дальше всех локализуются от участка старта. Первые три фракции глобулина передвигаются с более низкой скоростью из-за своей массы. Но самая маленькая скорость регистрируется у γ-глобулинов. Эти белки имеют большую массу и крупные, относительно других, размеры. Их заряд почти нейтрален, поэтому данная белковая фракция практически не сдвигается с линии старта.

В настоящее время электрофорез сыворотки крови часто проводимый анализ для постановки точного диагноза болезни. Этот анализ могут назначить как терапевты, так врачи узкого профиля. Показаниями по проведению исследований будут:

• различные воспаления;
• болезни хронической природы;
• патологические процессы в соединительной ткани;
• внутреннее кровотечение;
• злокачественные новообразования.

Для того чтобы полученные результаты поведенных исследований были верными, не менее чем за 8 часов до сдачи крови необходимо отказаться от приёма еды. Кроме того, необходимо согласовать прием лекарственных средств, если таковые имеются, с лечащим врачом.

Для того чтобы результаты не были по ошибке завышены, необходимо снизить до минимума возможность свертывания крови для определения показателя белковых фракций и общего белка. Электрофорез сыворотки крови проводится аккуратно, поскольку существует вероятность искажения полученных результатов из-за фибриногена. Он может прятать ненормальные белки или быть спутанным с ними.

В течение суток после сдачи пробы будет готов анализ на электрофорез белков сыворотки крови. Норма полученных показателей по категориям у взрослых людей:

1. Общий белок – 63-82 г/л.
2. Альбумины – 40-60 % от общего количества фракций.
3. α₁-глобулины – 2-5 %.
4. α₂-глобулины – 7-13 %.
5. β-глобулины – 8-15 %
6. γ-глобулины – 12-22 %.

Изменение количества любой белковой фракции в большую или меньшую сторону может свидетельствовать о развитии той или иной патологии. Для получения достоверной информации об этом необходим электрофорез белков сыворотки крови. Расшифровка результатов облегчит медицинским специалистам постановку диагноза и выбор лечения.

В самом начале при анализе полученных результатов определяют количество альбумина. Увеличение этой фракции может говорить об обезвоживании. Такое может произойти, если у больного отмечается затяжная рвота или нарушения в пищеварительной системе. Также увеличение альбумина происходит при ожогах большой площади кожного покрова.

Гораздо опаснее, если в организме снижается количество альбуминов, это может говорить о следующих патологиях:

1. Поражения почек и печени.
2. Патологии желудочно-кишечного тракта.
3. Инфекционные процессы.
4. Нарушения в деятельности сердечно-сосудистой системы.
5. Кровотечения.
6. Злокачественные новообразования.
7. Сепсис.
8. Ревматизм.

Незначительное уменьшение количества альбуминов может быть также:

1. У будущих матерей.
2. При превышении дозы лекарственных препаратов.
3. При длительной лихорадке.
4. У заядлых курильщиков.

Уменьшение количества a1-глобулинов регистрируется при недостатке α₁-антитрипсина. Увеличение же отмечают при обострении воспалений в организме, нарушениях в работе печени, при тканевом распаде.

Регистрируют его при сахарном диабете, воспалительных процессах в поджелудочной железе, у новорожденных детей при желтухе, при гепатитах токсического происхождения. Свидетельствует оно и о неправильном, несбалансированном питании.

Происходит при наличии следующих заболеваний:

1. Воспаления, особенно с присутствием гнойного экссудата (воспаление легких и другие процессы с наличием гноя).
2. Поражения соединительной ткани (например, ревматизм).
3. Злокачественные новообразования.
4. Периоды восстановления после ожогов.
5. Поражение почек.

Кроме того, такое явление характерно для гемолиза крови в пробирке во время проведения исследования.

Проявляется при гиперлипопротеидемии (увеличении количества липидов в крови), патологиях печени и почек. Можно обнаружить при открытой язве желудка, а также гипотиреозе (нарушение работы щитовидной железы). Снижение фракции регистрируют при гипобеталипопротеинемии (повышение в крови компонента беталипопротеин).

Эта фракция включает в свой состав иммуноглобулины. Поэтому увеличение γ-глобулинов регистрируется при сбоях в иммунитете. Обычно это происходит при различных инфекциях, развитии воспалительного процесса, изменениях ткани и ожоговых поражениях. Рост γ-глобулинов отмечают у больных хронической формой гепатита. Практически такая же картина характерна для цирроза печени. При запущенных случаях данного заболевания количество белковой фракции γ-глобулинов значительно выше показателя альбуминов. При определенных болезнях могут возникать сбои в образовании γ-глобулинов, и происходит развитие измененных протеинов в крови – парапротеинов. Для выяснения характера такого развития производится дополнительное исследование – иммуноэлектрофорез. Такая картина характерна для миеломного заболевания и патологии Вальденстрема.

Увеличение количества γ-глобулинов также присуще следующим патологиям:

• красной волчанке;
• эндотелиоме;
• ревматоидной форме артрита;
• остеосаркоме;
• хронической форме лимфолейкоза;
• кандидомикозу.

Снижение показателя γ-глобулинов подразделяют на 3 вида:

1. Физиологический (характерен для детей в возрасте от трех до пяти месяцев).
2. Врожденный (развивается с момента рождения).
3. Идиопатический (когда причину развития установить не удается).

Вторичное снижение регистрируется при развитии заболеваний, которые вызывают истощение иммунной системы. В последнее время в медицинской практике все чаще проводится анализ на определение количества преальбуминов. Обычно такое исследование проводят больным, находящимся в реанимации.

Уменьшение количества преальбуминов очень важный и точный тест на определение недостаточности белковых структур в организме пациента. При проведении анализа на преальбумины выполняют коррекцию белкового метаболизма у таких пациентов.

Принцип проведения подобного анализа схож с технологией выполнения электрофореза сыворотки крови. Проводят его для более точной постановки диагноза или обнаружения других патологий. Кроме того такой анализ поможет выявить у больного наличие протеинурии.

Электрофорез сыворотки крови и мочи – важные методы в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря методике исследования и высокой точности они помогают определить вид патологии. Точный диагноз – верный путь к правильному лечению и полному выздоровлению.

источник

Электрофорез белков сыворотки крови (протеинограмма) является лабораторным исследованием, позволяющим определить количественные и качественные изменения основных белковых фракций. Данное исследование позволяет выявить острые и хронические воспаления инфекционной и неинфекционной природы, онкологические (моноклональные гаммапатии) и многие другие патологии, а также контролировать их лечение.

Благодаря ультрасовременной аппаратуре Юсуповской больницы и огромному опыту наших высококвалифицированных диагностов, грамотно интерпретирующих результаты исследования, обеспечиваются максимально точные результаты анализа в короткие сроки. Комплексным обследованием занимается мультидисциплинарная команда врачей, которые, в целях уточнения диагноза, назначают электрофорез белков сыворотки крови и другие высокотехнологичные лабораторные и инструментальные исследования, позволяющие выявить патологию на ранних стадиях развития, благодаря чему каждому пациенту подбирается наиболее эффективная индивидуальная схема лечения.

В состав общего белка сыворотки крови входят альбумины и глобулины, которые в норме находятся в определенных качественных и количественных соотношениях. Для оценки соотношения альбумина и глобулина в крови проводится электрофорез белков с применением агарозного геля.

Изменение качественного и количественного соотношения в протеинограмме может свидетельствовать о наличии в организме самых различных заболеваний (от вирусного гепатита до хронической сердечной недостаточности).

Для постановки точного диагноза, кроме результатов электрофореза белков крови, специалисты Юсуповской больницы назначают дополнительные клинические, лабораторные и инструментальные исследования.

Электрофорез белков крови позволяет точно оценить качественное и количественное соотношение основных белковых фракций у пациентов, страдающих следующими патологиями:

• острые и хронические инфекционные заболевания;
• заболевания печени (например, хронический вирусный гепатит);
• аутоиммунные состояния;
• почечные патологии (нефротический синдром);
• моноклональные гаммапатии (моноклональная гаммапатия неясного происхождения и множественная миелома);
• синдром иммунодефицита (агаммаглобулинемия Брутона).

Электрофорез белков сыворотки крови является довольно информативным исследованием, которое назначается пациентам Юсуповской больницы при подозрении на следующие заболевания и состояния:

• острые и хронические инфекционные заболевания, определенные заболевания печени и почек, аутоиммунные состояния;
• немотивированная слабость, множественная миелома, персистирующая лихорадка, патологические переломы или боли в костях, рецидивирующие инфекционные заболевания;
• подозрение на недостаточный уровень альфа-1-антитрипсина, синдром Брутона и другие иммунодефицитные состояния;
• отклонения в других лабораторных исследованиях, которые могут свидетельствовать о множественной миеломе: гиперкальциемия, гипоальбуминемия, лейкопения, анемия.

Нормальными значениями общего белка у детей считаются 44-80 г/л, в зависимости от возраста ребенка, у взрослых людей – от 64 до 83 г/л.:

• альбумина – от 55,8 до 66,1 %;
• альфа-1-глобулина – от 2,9 до 4,9%;
• альфа-2-глобулина – от 7,1 до 11,8%;
• бета-1-глобулина – от 4,7 до 7,2%;
• бета-2-глобулина – от 3,2 до 6,5%;
• гамма-глобулина – от 11,1 до 18,8%.

Изменение баланса тех или иных белковых фракций крови может сигнализировать о наличии в организме каких-либо патологических процессов.

Фракция альбумина может быть повышена при:

Фракция альбумина понижается при:

• остром холецистите;
• воспалительных и опухолевых заболеваниях ЖКТ;
• лейкозе;
• язвенной болезни;
• острой ревматической лихорадке;
• нефротическом синдроме;
• макроглобулинемии;
• сахарном диабете;
• саркоидозе;
• множественной миеломе;
• пневмонии;
• хронической сердечной недостаточности;
• остеомиелите;
• неспецифическом язвенном колите;
• системной красной волчанке;
• лимфоме;
• приеме глюкокортикоидов.

Фракция альфа-1-глобулина повышается при:

• лимфогранулематозе;
• острых или хронических воспалительных заболеваниях;
• язвенной болезни;
• циррозе печени;
• стрессе;
• беременности;
• приеме гормональных контрацептивов.

Фракция альфа-1-глобулина понижается при:

• остром вирусном гепатите;
• недостаточности альфа-1-антитрипсина;

Фракция альфа-2-глобулина повышается при:

• хроническом гломерулонефрите;
• острой ревматической лихорадке;
• сахарном диабете;
• циррозе печени;
• саркоидозе;
• лимфогранулематозе;
• узловатом полиартериите;
• нефротическом синдроме;
• системной красной волчанке;
• остеомиелите;
• ревматоидном артрите;
• пневмонии;
• диспротеинемии;
• стрессе;
• язвенной болезни;
• пожилом и младенческом возрасте;
• мальабсорбции;
• неспецифическом язвенном колите.

Фракция альфа-2-глобулина понижается при:

• гипогаптоглобинемии;
• остром вирусном гепатите;
• гипертиреозе;
• интраваскулярном гемолизе;
• мальабсорбции.

Фракция бета-глобулина повышается при:

• сахарном диабете;
• гломерулонефрите;
• острых воспалительных заболеваниях;
• гиперхолестеринемии;
• диспротеинемии;
• саркоидозе;
• макроглобулинемии;
• подпеченочная желтуха;
• железодефицитной анемии;
• нефротическом синдроме;
• ревматоидном артрите;
• беременности;
• приеме гормональных контрацептивов.

Фракция бета-глобулина понижается при:

• лейкозе;
• аутоиммунных заболеваниях;
• системной склеродермии;
• циррозе печени;
• лимфоме;
• нефротическом синдроме;
• системной красной волчанке;
• стеаторее;
• неспецифическом язвенном колите.

Фракция гамма-глобулина повышается при:

• циррозе печени;
• хроническом лимфолейкозе;
• амилоидозе;
• множественной миеломе;
• муковисцидозе;
• моноклональной гаммапатии неясного генеза;
• ювенильном ревматоидном артрите;
• синдроме Шегрена;
• системной склеродермии;
• системной красной волчанке;
• тиреоидите Хашимото;
• криоглобулинемии;
• саркоидозе;
• ревматоидном артрите;
• макроглобулинемии Вальденстрема.

Фракция гамма-глобулина понижается при:

• агаммаглобулинемии;
• остром вирусном гепатите;
• склеродермии;
• мальабсорбции;
• лейкозе;
• нефротическом синдроме;
• стеаторее;
• лимфоме;
• гломерулонефрите;
• неспецифическом язвенном колите.

За 12-15 часов до исследования рекомендуется отказаться от приема пищи.

Минимум за час-полтора до забора крови для анализа необходимо избегать физического и эмоционального перенапряжения, исключить курение.

Во избежание получения искаженных результатов не стоит проводить электрофорез белков сыворотки крови сразу после процедуры гемодиализа и процедур с использованием радиоконтрастных веществ. Необходимо также исключить прием пенициллина, который может привести к расщеплению полосы альбумина.

Электрофорез белков сыворотки крови является важной частью комплексного обследования пациентов в Юсуповской больнице. Данное исследование назначается при подозрении на наличие в организме той или иной из вышеперечисленных патологий.

Узнать стоимость услуг лабораторной диагностики и записаться на проведение исследования можно по телефону или онлайн на сайте Юсуповской больницы.

источник

Белки – высокомолекулярные органические азотсодержащие полимеры, структурной единицей которых являются аминокислоты, и имеющие высокий уровень структурной организации, что в конечном итоге и определяет их важные биологические функции (в процессе свертывания крови, реакциях гуморального иммунитета, регуляции КЩР, устойчивости эритроцитов и лейкоцитов в кровотоке и ряд других). Современные физико – химические и иммунохимические методы исследования позволяют выявить в плазме крови более 100 белковых фракций.

В условиях клинических лабораторий для разделения белков сыворотки крови наибольшее распространение получил метод электрофореза.

Амидошварц 1% раствор (1г амидошварца растворить в 100мл 2% уксусной кислоты); агар (агароза) 1,2% (к 12гр агарозы добавить 1л раствора мединало – вероналового буфера pH 8,6 при нагревании на водяной бане); буфер веронал – мединаловый pH8,6 (8,76г мединала и 1,38г веронала поместить в колбу на 1л, добавить 750мл воды; растворить при нагревании на водяной бане, довести водой до метки, при необходимости pH довести до 8,6).

Штатив с пробирками, пипетки на 5 и 10 мл, предметные стекла, прибор для электрофореза, денситометр, СФ или ФЭК, термостат.

Сыворотка крови (или другая биологическая жидкость).

Принцип метода – различные по молекулярной массе, заряду и изоэлектрической точке в постоянном электрическом поле перемещаются с различной скоростью, что и положено в основу их разделения и последующего количественного определения.

Провести в электрофоретической камере с крышкой, внутренние кюветы которой заполнены агаром и буферным раствором с pH 8,6. внутренние кюветы камеры залить горячим раствором агара и оставить до застывания. В наружные ввести мединал – вероналовый буферный раствор. Подготовить пластины с носителем агаром – на рамку, предварительно помещенную на горизонтальном столике, поместить предметные стекла 3*4см, залить горячим агаром с толщиной слоя 3мм, выровнять горизонтальный уровень и оставить для застывания (пузырьки воздуха, попавшие в агар, должны быть удалены до застывания). Пользоваться гелем рекомендуется не ранее, чем через сутки после заливки. В геле с помощью специального шаблона (или обломком лезвия безопасной бритвы) сделать канавки размером 5*0,3мм, агар из них удалить кусочком плотной фильтровальной бумаги (канавки не должны доходить до стекла, в то же время они должны быть такого размера, чтобы в них поместилось нужное количество (1 – 3 мкл) анализируемой белковой смеси). Хорошие результаты дает также другой способ – внесение разделяемой смеси в кусочки плотной хроматографической бумаги соответствующего размера, вставляемой в гель.

Рамку с пластинами поместить в электрофоретическую камеру. Для создания контакта между гелем кювет и агаром пластин создать перемычку путем внесения расплавленного геля.

Подготовленную электрофоретическую камеру подключить к источнику питания и проводить электрофорез (режим работы – при градиенте потенциала порядка 15V/см при 25 – 35 мА в течение 30 минут).

После отключения прибора стекла с рамкой извлечь и зафиксировать в 12% растворе уксусной кислоты на этаноле в течение 12 часов, а затем 24 часа в дистиллированной воде с добавлением антисептика, с последующим отмыванием антисептика. Затем стекла завернуть в фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой и выдержать 24 часа в термостате при 37°С. По истечении времени стекла осторожно отмыть от бумаги и поместить на 2 часа в раствор амидошварца, затем пластины отмыть 10% уксусной кислотой при комнатной температуре в вертикальном положении. При этом выступают различной интенсивности окраски пятна, соответствующие определенным белковым фракциям.

Для количественного определения окрашенных фракций применяют как денситометрию, так и элюцию красителя. В последнем случае пятна вырезают и элюируют в 5мл 0,01N растворе NaOH. Интенсивность элюированной окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 595нм или на ФЭКе с зеленым светофильтром. Исходя из показателей экстинкции, строят кривую распределения фракции белков на электрофореграмме. Для каждой пробы ставят два параллельных исследования и вычисляют среднее значение. Процентное содержание фракций вычисляют по формуле С_фр=(Е_фр*100)/Е_{всех фр}

Для большей точности рекомендуется в пробирки для элюции вносить следующие количества элюирующего раствора: альбумина – 20мл, α₁-глобулинов-5мл, α₂-, β-, γ-глобулинов – 10мл, что делается для того, чтобы сделать более близкими величины экстинкций при фотометрировании. После фотометрирования полученные величины экстинкций умножают на соответствующий фактор – для альбумина – 4, α₁-глобулина – 1, α₂-, β-, γ- 2 и ставят эти величины в формулу для определения соотношения фракций.

В норме содержание белковых фракций в процентном отношении следующее: α₁-глобулина – 2,5 – 5, α₂-глобулина – 7 – 13, β-глобулина 8 – 14, γ-глобулина – 12 – 22, альбумина – 50 – 61.

При различных патологических состояниях происходит изменение протеинограммы. Острый воспалительный процесс характеризуется уменьшением содержание альбуминов и возрастанием количества α-глобулинов; а в более поздние сроки – увеличением концентрации γ-глобулинов. Для хронического воспаления более типично выраженное повышение уровня α_2- и γ-глобулинов и умеренное снижение альбуминов в сыворотке крови. При злокачественных новообразованиях резко снижается содержание альбуминов с одновременным существенным увеличением всех глобулиновых фракций. Поражения печени (гепатиты, цирроз) сопровождаются снижением альбуминов, которые синтезируются в печеночной ткани, и относительным увеличением γ-глобулинов. Вследствие увеличения IgA, происходящего при некоторых формах цирроза печени, отмечается слияние β- и γ-фракций.

Методом электрофореза может быть выявлена недостаточность α₁-антитрипсина. Этот белок является основным компонентом полосы α₁-глобулинов и у пациентов с недостаточностью α₁-антитрипсина (гомозиготных) эта полоса может быть очень неотчетливой, но у гетерозиготных пациентов полоса может казаться нормальной.

При электрофорезе иммуноглобулины ведут себя в большей степени как γ-глобулины, хотя IgA и IgM могут двигаться с β- или α₂-глобулинами. Поскольку концентрация IgG в нормальной плазме существенно превышает содержание других иммуноглобулинов, полоса γ-глобулинов, получаемая при электрофорезе нормальной сыворотки, в значительной степени представлена IgG. Уменьшение или увеличение концентрации иммуноглобулинов в плазме могут иметь как физиологический, так и патологический характер.

источник

Государственное бюджетное образовательное учреждение

«Красноярский государственный медицинский университет

имени профессора -Ясенецкого»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра биологической химии с курсами медицинской,

сборник ситуационных задач с эталонами ответов

для студентов, обучающихся по специальности

Статическая биохимия : сб. ситуац. задач с эталонами ответов для студентов, обучающихся по специальности 060301 – Фармация / сост. , – Красноярск : тип. КрасГМУ, 2013. – 23 с.

Ситуационные задачи с эталонами ответов полностью соответствуют требованиям Федерального государственного образовательного стандарта по специальности 060301 – Фармация.

молекулярно-клеточной физиологии и патологии

НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН,

к. б.н., доцент кафедры фармакологии

с курсами клинической фармакологии

и фармацевтической технологии

Утверждено к печати ЦКМС (протокол № 3 от «15» ноября 2012 г.)

Химия аминокислот, пептидов и белков ………………………………………4

Биохимия межклеточного матрикса и соединительной ткани ………………..10

Химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот.…………………………………..11

Биохимия нервной системы ……………………………………………………15

Химия аминокислот, пептидов и белков

1. Массовая доля азота в серине составляет 13,3%. Вычислите относительную молекулярную массу аминокислоты, если известно, что в её молекуле содержится один атом азота

2. По аналитическим данным гемоглобин лошади содержит: Fe – 0,335%, S – 0,390%; гемоглобин свиньи: Fe – 0,400%, S – 0,390%.

Определите минимальные относительные молекулярные массы гемоглобинов двух видов животных

3.Содержание меди в белке гемоцианине, выделенном из разных видов животных, таково:

рак – 0,32%, омар – 0,34%, осьминог – 0,38%, улитка – 0,29%, мечехвост – 0,173%.

Рассчитайте и сравните минимальные относительные молекулярные массы гемоцианинов разного происхождения

4. Гемоглобин быка содержит 0,336% железа, 0,48% серы и 4,24% аргинина. Вычислите минимальную относительную молекулярную массу гемоглобина быка, число атомов Fe и S, а также остатков аргинина в нём.

ИЭТ и заряды аминокислот, пептидов и белков

Чтобы ответить на вопросы задач №№ 1-4 необходимо вспомнить понятие изоэлектрической точки (ИЭТ) аминокислоты, пептида, белка; от чего зависит суммарный заряд таких молекул и как влияет на него изменение рН раствора.

1. Смесь аминокислот, содержащая валин, лейцин, аспарагиновую кислоту, лизин, гистидин и серин, была подвергнута разделению методом электрофореза на бумаге при рН 6,2. Какие из указанных аминокислот будут передвигаться к катоду, аноду, или останутся на старте?

2. Укажите направление миграции – к катоду, аноду, или останутся на линии старта – следующих пептидов в процессе электрофореза на бумаге при рН 1,6; 6,5 и 11,0:

а) арг-гли-ала-ала; б) лиз-ала-гли-асп; в) гис-гли-ала-глу; г) асп-гли-ала-глу; д) глн-гли-ала-арг

3. Укажите направление перемещения (катод, анод или линия старта) при электрофорезе следующих белков: а) тропомиозин – в буферной системе с рН 5,1; б) гемоглобин – рН 4,8; в) рибонуклеаза – рН 4,2; 9,5 и 11,3, учитывая, что изоэлектрическая точка тропомиозина – 5,1, гемоглобина – 6,8, рибонуклеазы – 9,45.

4. Миоглобин кашалота имеет следующий аминокислотный состав:

Ала – 5, Глн – 5, Лей – 18, Сер – 6,

Арг – 4, Глу – 14 Лиз – 19, Тре – 5,

Асн – 2, Гли – 11, Мет – 2, Три – 2,

Асп – 6, Гис – 12, Фен – 6, Тир – 3

Цис – 0, Иле – 9, Про – 4, Вал – 8.

а) Определите общий заряд миоглобина при рН 2, 7 и 9

б) Определите изоэлектрическую точку миоглобина.

1. Методом электрофореза на бумаге при рН 8,0 в сыворотке крови человека было обнаружено 5 белковых компонентов: сывороточный альбумин, α1-, α2-, β- и γ-глобулины. Изоэлектрическая точка сывороточного альбумина равна 5,2, γ-глобулина – 7,3. У трёх остальных компонентов значение этого показателя промежуточное. Укажите направление миграции названных белков и степень их подвижности при указанном значении рН.

2. При каком значении рН будет достигнуто наиболее эффективное разделение методом электрофореза следующих белковых смесей:

а) сывороточный альбумин и гемоглобин, б) миоглобин и химотрипсиноген, в) яичный альбумин, сывороточный альбумин и уреаза. Для ответа используйте следующие данные:

Сывороточный альбумин – ИЭТ 4,9

3. При каких значениях рН наиболее целесообразно электрофоретическое фракционирование следующих белковых смесей: а) миозина и гемоглобина; б) уреазы и гемоглобина; в) щелочной фосфатазы сывороточного альбумина и уреазы; г) цитохрома с и гемоглобина, если

изоэлектрическая точка миозина – 5,4

4. Как изменится электрофоретическая подвижность белка (его изоэлектрическая точка равна 6,8, фракционирование ведётся при рН 7,0), если в его молекуле: а) глу заменён на вал; б) лиз заменён на глу; в) глу заменён на лиз; г) вал заменён на глу; д) гис заменён на арг?

5. Ниже показана электрофоретическая подвижность ряда мутантных гемоглобинов А при рН 8,6.

Как распределяются места a, b, c и d между гемоглобинами следующего состава:

HbD (в α-цепи в положении 68 вместо аргинина лизин);

HbJ (в β-цепи в положении 69 аспартат вместо глицина);

HbN (в β-цепи в положении 95 глутамат вместо лизина);

HbC (в β-цепи в положении 6 лизин вместо глутамата)

6. На рисунке представлен результат разделения белков сыворотки крови человека методом гель-электрофореза на бумаге. Относительные количества фракций белков, полученных этим методом, составляют:

альбумины 54-56%, α1-глобулины 6-7%, α2-глобулины 8-9%, β-глобулины 13%, γ-глобулины 11-12%.

При некоторых болезнях соотношение фракций белков в сыворотке меняется (явление диспротеинемии).

На рисунке представлены электрофоретические профили разделения белков плазмы крови здорового (а) и больного (б) человека. Обозначения фракций белков следующие: I – γ-глобулины, II – β-глобулины, III – α2-глобулины, IV – α1-глобулины, V – альбумины.

Какие свойства белка положены в основу метода электрофореза? От чего зависит электрофоретическая подвижность белков? Основываясь на результатах электрофореза, приведённых на рисунке, сделайте вывод о молекулярной массе и суммарном заряде разных белков плазмы крови. Сделайте предположения о заболевании, для которого характерен электрофоретический профиль на рисунке б, воспользовавшись данными из таблицы.

Заболевания, вызывающие изменения соотношения белковых фракций

Хронические воспаления, цирроз печени, миелоз ↑

Опухоли, болезни печени ↑, респираторные болезни ↓

7. Смесь содержала белки А, В и С с молекулярной массой 160000, 80000 и 60000 Да, соответственно. Эту смесь пропускали через колонку, наполненную набухшим гелем с порами, проницаемыми для белков с молекулярной массой 70 000. В каком порядке будут выходить белки из колонки? Какой график правильно отражает результаты гель-фильтрации? На чём основан метод гель-фильтрации?

Химические свойства аминокислот

1. Напишите уравнения реакций взаимодействия аланина:

2. В обмене веществ большая роль принадлежит реакциям переноса метильных групп (трансметилирование). В этих реакциях участвует активная форма аминокислоты метионина – S-аденозилметионин. Напишите уравнения реакций, протекающих по схеме: метионин→ S-аденозилметионин →холин

3. В клетках человека из аминокислоты триптофана может синтезироваться регулятор серотонин. Его химическое название – 5-гидрокситриптамин. Сравните формулы триптофана и серотонина и напишите реакции, с помощью которых можно превратить триптофан в серотонин

4. Суточная потребность человека в триптофане составляет 1 г. Рассчитайте массу серотонина, образовавшегося из суточной дозы триптофана у здоровых и страдающих злокачественными новообразованиями людей, если установлено, что в первом случае на это расходуется 1% триптофана пищи, а во втором – 60%

Свойства белков и структуры белков

1. Вы знаете, что все белки построены из аминокислот. Известно более 150 различных аминокислот. Однако для синтеза белков используется только 20. Назовите признаки таких 20 аминокислот и приведите примеры из разных подклассов белковых аминокислот

2. Существуют тысячи разных белков, все они построены из 20 одинаковых мономеров (аминокислот). Чем отличаются друг от друга разные белки? Как соединяются отдельные мономеры в белках? Все ли 20 мономеров обязательно присутствуют в разных белках? Где в клетке находится информация о различиях отдельных белков?

источник

Основные требования к технологическим системам и процедуре осуществления зонального электрофореза (на хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозной пленке, гелях) белков плазмы (сыворотки) крови

Принцип фракционирования ( электрофореза) основан на том, что в электростатическом поле белки сыворотки крови движутся по смоченной буферным раствором хроматографической бумаге (ацетатцеллюлозной пленке, крахмаловому, агаровому гелям) со скоростью, зависящей в основном от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются обычно на 5 основных фракций: альбумины, α₁-глобулины, α₂-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины, содержание которых определяется с помощью фотометрии или денситометрии. При обработке красителями белки связываются с ними пропорционально своей концентрации. Определив интенсивность окрашивания, можно вычислить концентрацию белковых фракций.

Основные требования к приборам, реагентной базе и процессу осуществления электрофореза

Система для электрофореза. Блок питания должен давать стабилизированный ток силой 50—100 мА при напряжении 180— 600 В.

Электрофоретическая камера . Для предохранения полосы носителя от высыхания в камере должна поддерживаться определенная влажность воздуха. При нагревании бумаги уси­ ленно испаряется буферный раствор в середине полосы и с краев ленты, что обусловливает его движение (реофорез) и вследствие этого изменение формы пятен фракций белков в процессе их электрофоретического разделения; поэтому отдельные конструк­ ции электрофоретических камер располагают системой охлажде­ ния полосок носителя.

В разных отделах камеры буферный раствор должен иметь одинаковый уровень, чтобы избежать его перелива через ленту в результате сифонного действия. Концы полосок носителя не сле­дует погружать в буферный раствор, в котором находятся элек­троды. Электрическую связь между лентами и электродами уста­навливают посредством фитильков из бумажных полосок (ваты, марли), смоченных буферным раствором; этим устраняется пере­дача изменений рН буфера в то пространство, в которое погруже­ ны ленты.

Поскольку полоса ацетатцеллюлозной пленки (бумаги) может быть расположена как горизонтально, так и под углом к горизон­тали (вертикально), соответственно различают горизонтальный и вертикальный электрофорез. Первый из них позволяет получить более точные результаты. Важно, чтобы полоска носителя (хроматографической бумаги, ацетатцеллюлозной пленки) была хо­рошо натянута. Желательно, чтобы она располагалась как бы в «подвешенном» состоянии, поддерживаемая вертикально распо­ложенной перегородкой, системой натянутых капроновых нитей, а связывающий обе ванны мостик имел шипы для укладывания на них полосок. Это предотвращает образование тонкого капил­лярного слоя буферного раствора между полоской ацетатцеллю­лозной пленки, хроматографической бумаги и пластиной; капил­лярный слой буферного раствора в значительной мере ухудшает качество электрофоретического разделения.

Большое значение имеют свойства носителя , исполь­ зуемого для электрофореза. Ацетатцеллюлозная пленка, как и хроматографическая бумага, должна быть однородной и плотной. Поскольку в отдельных лабораториях все еще используют хроматографическую бумагу, в отношении ее как носителя необходимо отметить следующее.

Избранный сорт бумаги: «хроматографическая быстрая» или «хроматографическая медленная» — нельзя менять, так как от этого в определенной мере зависят получаемые результаты. Если хроматографическая бумага подлежит денситометрии, то реко­ мендуется быстро впитывающий сорт, в остальных случаях пред­ почтительнее пользоваться бумагой для медленного впитывания (марки «М»). Бумага марки «М» имеет гладкую лицевую и рубча­ тую обратную стороны. При внимательном рассмотрении обрат­ной стороны можно заметить грубые и крупные штрихи, идущие параллельно более длинной стороне листа. Эти штрихи отражают ход волокон целлюлозы. Применяемые для электрофореза бу­мажные полоски, размером 3,5 х 40 см (или другого формата, со­ответствующего габаритам электрофоретической камеры), наре зают таким образом, чтобы волокна целлюлозы шли вдоль поло­сок. Благодаря этому каждая полоска бумаги представляет собой систему продольно идущих капилляров, что способствует прод­вижению белков (и других веществ) и препятствует их растека­нию к краям полоски. Кроме того, полученная лента, в отличие от аналогичной с поперечным ходом волокон целлюлозы, мень­ше деформируется при увлажнении и высыхании. На одном из концов каждой полоски простым карандашом отмечают номер анализа и дату взятия крови для исследования.

Направление хода волокон целлюлозы в бумаге можно опре­ делить и по растеканию на ней капли воды, принимающей форму эллипса, длинник которого и соответствует распространению во­локон целлюлозы.

Подготовка к электрофорезу и процедура его проведения. Пе ред электрофорезом камеру устанавливают строго горизонталь­но. Кюветы заполняют буферным раствором таким образом, что­ бы уровень жидкости в них был одинаков. Оба отделения каждой кюветы соединяют друг с другом полоской фильтровальной бу­маги. Полоски ацетатцеллюлозной пленки (хроматографической бумаги) равномерно натягивают между кюветными отделениями. Необходимо, чтобы концы увлажненных буфером полос (мем­бран) были погружены в буферный раствор внутренних отделе­ний (если таковые имеются) электродных кювет. Затем на зара­ нее отмеченные у катода участки полосы носителя наносят сыво­ ротку (иногда на расстоянии 2 см от середины полоски в сторону катода).

Наилучшие результаты дает метод пропитывания хроматогра­фической бумаги буферным раствором. Однако на практике в це­лях экономии времени ленты обычно смачивают в буфере и слег­ ка высушивают, отжимая между листами фильтровальной бумаги.

Нанесение на полоску носителя биологического матери­ала осуществляется с помощью аппликатора (специального или импровизированного) либо микропипетки (автоматической, обычной). При первом способе на узкий край шлифованного стекла (покровного, предметного) или полоски отмытой рентге­новской пленки наносят 0,1-миллилитровой микропипеткой 10 мкл (0,01 мл) свежеполученной (негемолизированной) сыворот­ ки.

Этот импровизированный аппликатор приставляют нижним ребром к увлажненной бумаге и после впитывания сыворотки сразу же отнимают (нужно следить за тем, чтобы между боковыми гранями аппликатора и краями полос оставался промежуток ши­ риной 5—6 мм). Наносить сыворотку на бумагу можно и непос­ редственно из пипетки — таким образом, чтобы след сыворотки составил поперечную (по отношению к длиннику бумаги) полоску.

В том и другом случаях нужно соблюдать следующие правила: если используют микропипетку на 0,1 мл, в нее насасывают сы­воротку до метки 0,085. Пипетку зажимают между пальцами в вертикальном положении, причем верхнее ее отверстие не следу­ ет закрывать пальцем. Небольшое количество сыворотки, нахо­ дящееся в пипетке, не вытекает из нее, так как жидкость удержи­ вается капиллярными силами. Слегка касаясь бумаги (материала ацетатцеллюлозной пленки) нижним краем пипетки, ее переме­щают по полосе в поперечном направлении (не доводя пипетку на 2 мм до каждого края), пока мениск сыворотки не опустится до метки 0,095. Удобно пользоваться и автоматической микропи­ петкой.

Допустимо окрашивание сыворотки перед ее нанесением на полосу хроматографической бумаги. Для этого к 0,5 мл сыворот­ки добавляют несколько крупинок (проще всего на кончике стек­ лянной иглы) порошка бромфенолового синего. По перемеще­нию пятна красителя, связывающегося, прежде всего с альбуми­ном, можно визуально следить за миграцией пятен.

Затем крышку камеры плотно закрывают и включают прибор.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови осуществляют при комнатной температуре и градиенте потенциала от 3 до 8 В на 1 см длины полоски носите­ля. Сила тока, зависящая от величины подаваемого напряжения, разновидности, особенностей состава и рН буферного раствора, толщины полоски носителя (хроматографической бумаги или ацетатцеллюлозной пленки), температуры, при которой происхо­дит разделение, не должна превышать 0,1—0,3 мА на 1 см попе­речного сечения хроматографической бумаги или ацетатцеллю­лозной пленки . Оптимальное время электрофореза подбирают опытным путем. Обычно оно составляет 20—40 мин при электрофорезе на ацетатцеллюлозной пленке и 7—12 ч при электрофорезе на хроматографической бу­маге. По окончании электрофореза отключают источник посто­янного тока, из камеры извлекают бумажные полоски и прикрепляют их на деревянные рамки или развешивают на стеклянных палочках, затем бумажные полоски помещают в горячий сушиль­ ный шкаф так, чтобы они не касались ни друг друга, ни металли­ческих стенок и деталей шкафа (это предохраняет электрофореграммы от смазывания фракций).

Бумажные ленты высушивают в шкафу при 95—105 0 С в тече­ ние 10—15 мин, но не более 20—30 мин. Поскольку связывание индикатора (красителя) белками при последующей обработке за­ висит от условий фиксации (температуры, времени прогрева­ния), необходимо строго соблюдать их постоянство.

Полоски ацетатцеллюлозной пленки (мембраны) не высушивают и далее обрабатывают влажными.

Для окраски электрофореграмм сухие бумажные ленты или увлажненные буферным раствором ацетатцеллюлозные пленки кладут в развернутом виде на дно плоских эмалиро­ванных кювет и осторожно, медленно приливают красящий рас­твор. В процессе обработки реагентами электрофореграммы нельзя накладывать друг на друга и сворачивать.

1. Буферные растворы. На электрофоретическое фракционирование белков большое влияние оказывает рН бу­ ферных растворов, состав и концентрация составляющих их реа­гентов, так как от кислотности (щелочности) среды, ионной силы буферной смеси и некоторых других факторов во многом зависят знак и величина электрического заряда молекул белков.

В качестве электролита чаще всего применяют веронал-мединаловый, веронал-ацетатный, мединаловый, трис-буфер. Реже используют боратный и фосфатный буфер.

Наиболее хорошо зарекомендовали себя следующие буфер­ные растворы:

ü Вероналовый (веронал-мединаловый) буфер с рН 8,6.

ü Веронал-ацетатный буфер с рН 8,6.

ü Мединаловый буфер с рН 7,6.

ü Трис-буфер с рН 8,9 (о чень хорошо разделяются белки сыворотки крови (с выделе нием до 9 фракций) при использовании трис-буфера с рН 8,9).

2. Окрашивающие реагенты. Основным их компонентом явля­ ются индикаторы (бромфеноловый синий, кислотный сине-чер­ ный, амидо черный 10 В и некоторые другие), представляющие собой красители, характерно связывающиеся с белком.

Сухие бумажные ленты выдерживают в этих красителях в те­ чение 30 мин. Входящие в состав красящих растворов сулема, сульфат цинка и уксусная кислота выступают в роли фиксаторов, способствующих улучшению связывания красителя с белком.

3. Отмывающие растворы. Для удаления не связавшегося с б елком красителя электрофореграммы обрабатывают в несколь­ких (обычно 3—5) сменах отмывающего раствора — до тех пор, пока фон лент не сделается светлым (белым), а промывная жид­ кость не перестанет окрашиваться в желтый цвет. Состав отмыва­ ющего раствора во многом зависит от природы применявшегося для окрашивания белков индикатора. Так, при окраске бромфе­ ноловым синим используют раствор уксусной кислоты, получае­мый добавлением к 20 мл ледяной уксусной кислоты 980 мл дис­ тиллированной (или водопроводной) воды; в случае применения амидо черного 10 В или кислотного сине-черного не связавшиеся с белком красители отмывают смесью следующего состава: уксус­ ной кислоты (ледяной) — 100 мл, фенола (расплавленного) — 40 мл, воды водопроводной — 860 мл.

Подготовка электрофореграмм к учету результатов способами денситометрии и фотометрии. Бумажные ленты, отмытые от избытка красителя, высушивают на воздухе при комнатной температуре, притом в затемненном месте, если в качестве красителя использовался бромфеноловый синий. Сухие и окрашенные электрофореграммы хранятся в темноте.

Дальнейшая количественная обработка электрофореграмм состоит либо в элюции (извлечении) красителя из участков бумаги с располагающимися на них окрашенными белковыми фракциями с последующим фотометрическим измерением оптической плотности растворов, либо непосредственной записи электрофореграмм с помощью денситометра – прибора, позволяющего регистрировать (сканировать) картину разделения фракций анализируемых веществ в отраженном или проходящем монохроматическом световом потоке.

При денситометрии в проходящем свете предварительно обесцвечивают фон ацетатцеллюлозных пленок и бумажных лент (последние для этого пропитывают просветляющей жидкостью либо обесцвечивают материал носителя другим способом). Полосу располагают в перемещающем ее устройстве таким образом, чтобы против щели освещения находился неокрашенный участок. Записанная прибором кривая позволяют судить о числе фракций и о содержании в них белка. С помощью интегрального устройства осуществляется количественная обработка картины разделения фракций белков, осуществляемая в автоматическом режиме.

Количественную обработку денситограмм можно выполнить и ручным способом. Для этого кривую делят на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству красителя, соединившегося с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют, например, по массе вырезанных участков бумаги, определенной на торсионных весах. Общую массу всех участков принимают за 100% (1,0) или же за содержание общего белка в плазме (в г/л) и вычисляют, какой процент по отношению к нему составляет масса каждого участка (фракции).

Для просветления электрофореграмм (перед «сканированием» в проходящем свете на денситометре) применяют: вазелиновое масло и раствор альфа-бромнафталина в вазелиновом масле – для обесцвечивания фона бумажных лент, а также смеси: ледяная уксусная кислота – ацетон (1:1); пропиловый (изопропиловый) спирт – ледяная кислота – глицерин (85:12:3) – используют для просветления материала ацетатных полос.

Метод элюирования состоит в том, что сначала электрофореграммы разрезают по числу фракций, ориентируясь на самый светлый участок между ними. Каждую фракцию помещают в отдельную пробирку и заливают, например, 3 мл элюирующего раствора. К альбуминовой фракции добавляют двойной (или тройной) его объем, на основании чего величину оптической плотности для альбуминовой фракции умножают на 2 (или на 3). Контролем служит участок фореграмм, не содержащий белка. Пробирки осторожно встряхивают и оставляют в затемненном месте на 30 минут (лучше на 40 минут – 1 час). Плотность испытываемых растворов определяют на фотоэлектроколориметре любого типа с зеленым (красным) светофильтром. В качестве контрольного используют элюирующий раствор, по которому устанавливают «электрический нуль» прибора.

При использовании способа элюирования находят величину абсорбции каждой фракции и общую сумму значений оптической плотности, которую принимают за 100% (либо 1,0) или величину содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови, представленную в размерности г/л. В первом случае результаты выражают в относительных, во втором – в абсолютных единицах.

Состав элюирующих растворов, применяемых для извлечения красителя из окрашенных фракций электрофореграмм (эстрагирующие реагенты), во многом зависит от природы используемого индикатора. Так, для извлечения бромфенолового синего применяют 0,01Н раствор едкого натра. Для извлечения кислотного сине-черного красителя используют 0,1Н раствор едкого натра.

Приняв сумму показателей оптической плотности отдельных элюатов за 100% (1,0), по простому тройному правилу рассчитывают относительное содержание альбумина и фракций глобулинов.

Пример . Абсорбция фракции альбумина – 0,52, α₁-глобулины – 0,02, α₂-глобулины -0,05, β-глобулины-0,10, γ-глобулины-0,15. В сумме оптическая плотность отдельных растворов равна 0,84; это значение принимается за 100% (или 1,0).

Тогда содержание альбумина, выраженное в относительных единицах, составит: (0,52 • 1,0)/0,84 = 0,62. Подобным же образом рассчи­тывают относительное содержание всех остальных белковых фракций, выражая его в долях от единицы или процентах. Следу­ ет стремиться к представлению результатов не в относительных, а в абсолютных единицах. Для этого сумму показателей абсорбции всех фракций достаточно отнести к концентрации об­ щего белка сыворотки крови. Тогда, пользуясь аналогичным рас­ четом, легко найти действительную концентрацию альбумина и всех глобулинов.

Пример . Общее количество белка в сыворотке крови — 82 г/л. Сумма абсорбции всех фракций — 0,84. На долю абсорбции фракции альбумина приходится 0,52 ед. Если показатель А, рав­ ный 0,84 ед, соответствует 82 г/л, то 0,52 (А) — х. Отсюда: концен­ трация альбумина в сыворотке крови равна (82 • 0,52)/0,84 = 50,7 (г/л).

Зная содержание общего белка сыворотки (плазмы) крови, легко перевести относительные единицы в абсолютные: 100% со­ответствует 82 г/л, 62,0% — х. Тогда х = (62,0 • 82)/100 = 50,8 (г/л).

Для лучшего запоминания отмечаемых в норме показателей процентного (долевого от единицы) содержания альфа-1 -, альфа- 2-, бета- и гамма-глобулинов сыворотки крови можно ориенти­роваться на следующие средние величины и варианты отклоне­ний: 1 (0,04 + 0,01), 8± 1 (0,08 ±0,01), 10 ± 2 (0,10 ± 0,02), 16 + 4 (0,16 + 0,04) — соответственно. Относительное содержание аль­ бумина составляет, по данным А.А.Покровского (1969), 56—66% (0,56—0,66), многих других авторов: 50—61% (0,50—0,61). У прак­ тически здоровых взрослых людей концентрация альбумина, аль­ фа-1-, альфа-2-, бета- и гамма-глобулинов, выраженная в абсо­лютных единицах, составляет соответственно: 42,0—51,0, 2,0— 5,0, 4,0-7,0, 5,0-9,0, 8,0-17,0 г/л.

Краткая характеристика других носителей.

В последние годы электрофорез на бумаге практически полностью вытеснен предложенным Коном (1958) электрофорезом на ацетатцеллюлозе. Ацетатцеллюлозная пленка в отличие от бумаги лишена эндоосмоса, способности к поглощению отдельных белковых фракций поверхностью волоконец. В результате получается четкое фрак­ ционирование со светлыми промежутками между «пятнами» бел­ ков, а время электрофореза сокращается обычно до 30 мин.

Для разделения фракций белков и липопротеинов широко ис­пользуется метод электрофореза на агаре (агарозе), предложен­ный Гордоном и др. в 1949 г.

Способ электрофореза в крахмальном геле (Смитис, 1955) позволяет получить до 20 фракций вместо пяти, обычно выделя­емых методом электрофоретического фракционирования на бу­маге.

Введенный Грабаром и Вильямсом в 1953 г. иммуноэлектро форез представляет собой комбинацию электрофоретического и иммунологического фракционирования белков. После передви­ жения белковых фракций в геле агара в узкий желобок помешают перпендикулярно к фракционным линиям сыворотку лошади, иммунизированной белковыми компонентами сыворотки чело­века (антисыворотка). Антисыворотке дают возможность диф­ фундировать в геле агара. В месте контакта содержащихся в них антител с электрофоретически разделенными белковыми фрак­циями образуются преципитационные дуги, характерные для со­ ответствующих фракций. При помощи этого метода обнаружива­ ется не менее 25 различных белков.

Структура агарового и крахмального геля такова, что размеры пор в этих носителях, как и в материале бумаги, ацетатцеллюлозной пленки, значительно превосходят размеры макромолекул: белков, липопротеинов и др. Лишь в полиакриламидном геле, формируемом из золя с концентрацией около 7,5%, размеры пор примерно соответствуют размерам молекул белков. Благодаря этому создается молекулярно-фильтрующий эффект, в значительной мере улучшающий качество электрофоретического разделения, с помощью которого выделяется обычно около 30 фрак­ций белков. К тому же перед началом электрофоретического Фракционирования белков все они стартуют с весьма узкой линии, будучи как бы сконцентрированы на ней. Формирование многослойного полиакриламидного геля, отдельные зоны в кото ром отличаются размерами пор, дает возможность эффективно разделять липопротеины разных классов (по Е.Я. Маграчевой, 1979). К тому же полиакриламидный гель отличается большой прозрачностью, термостабильностью. Широкое применение в клинической практике метода электрофореза в полиакриламид­ном геле сдерживается трудностью идентификации и количественного учета отдельных выявляемых фракций.

Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы.

Принцип метода: белки сыворотки крови разделяют методом электрофореза с использованием в качестве носителя пленки из ацетата целлюлозы.

Реактивы: 1) барбитал-натриевый буферный раствор (рН 8,6) (иногда применяются другие буферные смеси); 2) бромфеноловый синий (при приготовлении раствора добавляют сульфат цинка и уксусную кислоту для фиксации белков); 3) отмывающий раствор – уксусная кислота, 50 г/л; 4) просветляющий раствор: вазелиновое масло, смесь ледяной уксусной кислоты с ацетоном (1:1).

Ход определения : смачивают пленки буферным раствором (помещают в буферный раствор на 5 минут). Удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Закрепляют пленку в камере матовой стороной кверху (пленки должны располагаться параллельно друг к другу и строго параллельно стенкам прибора, не должны свисать). Закрывают камеру крышкой и пропускают ток напряжением 150В в течение 5 минут, после чего выключают ток.

источник