Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК,таккак выделение, рестрикция,полимеразная цепная реакция(ПЦР),молекулярное клонирование, наиболее частоиспользуютэлектрофорез.
Электрофорез — метод разделения макромолекул (в том числе
молекул и фрагментов ДНК) в геле по размеру и заряду в постоянном электрическом поле. Существует два вида электрофореза: горизонтальный и вертикальный.
Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя ДНК, например бромида этидия.
На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов.
Концентрация агарозы в геле.Агарозный гель — пористая струк-
тура, причем увеличение концентрации агарозы в геле приводит к
уменьшению размеров его пор. Это позволяет при помощи геля с
разной концентрацией агарозы разделять линейные молекулы
ДНКв широком диапазоне их размеров, вплоть до 60 тыс. пар
нуклеотидов (п. н.).
Существует зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК
от концентрации агарозы в геле;
Концен- 0,3 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,2 1,5 2,0
Длина 5-60 1-30 1-20 0,8-12 0,6-10 0,5-8 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2
Заряд молекулы.Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы
ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной
среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода (отрицательный электрод) к аноду (положительный электрод). Электрофоретическая подвижность молекулы ДНК существенно снижается с увеличением ее длины.
Напряженность электрического поля.На скорость движения заряженных молекул ДНК в геле влияет напряженность электрического поля, определяемая напряжением постоянного электрического поля, подаваемого на электроды. Данные, приведенные на
рисунке 1, свидетельствуют о наличии обратно пропорциональной зависимости между длиной пробега ДНК в геле и напряженностью электрического поля. Число полученных электрофореграмм различно, поэтому разделение фрагментов ДНК для
аналитических целей (только с целью детекции ДНК) с максимальным разрешением рекомендуют проводить при напряжении 10—15 В/см, а для препаративных (если ДНК будет в дальнейшем выделена из геля и использована, например, для клони-
рования) — при
Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с
одинаковой скоростью. Однако подвижность суперспирализованных и кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера. Таким образом, методом элект-рофореза можно фракционировать три формы молекул ДНК бактерий:
• суперспирализованную (нативная молекула, стабилизированная белками);
•линейную (расщепленная рестриктазой кольцевая молекула).
Разделение трех типов молекул ДНК в одном геле выглядит следующим образом (по подвижности от катода к аноду):
Кольцевая молекула ДНК
Линейная молекула ДНК
Суперспирализованная молекула ДНК
При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в одну из лунок геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с
известными значениями молекулярных масс).
Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза.
Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания
электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 ч, гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254—400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм), при этом
становится видна ДНК.
Внимание! Используемый в качестве красителя бромид этидия является мутагенным веществом. При работе с ним необходимо использовать резиновые или латексные перчатки.
Методы вертикального и горизонтального электрофореза
принципиально сходны, однако в последнем случае вместо агарозного используют полиакриламидный гель (ПААГ) и процесс электрофореза проходит вертикально. Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью.
Кроме того,акриламид является токсичным веществом. Приготовить ПААГ
значительно сложнее, чем агарозный гель. В связи с этим в работе
с ДНК преимущественно используют метод горизонтального
электрофореза в агарозном геле.
Цель работы. Ознакомиться с методом горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле.
Оборудование и материалы.1. Прибор для горизонтального электрофореза.
2. Источник постоянного тока. 3. Электрическая плитка или СВЧ-печь. 4. Гельдокументирующая видеосистема. 5. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 6. Колба мерная вместимостью 1 л. 7. Колба коническая
вместимостью 0,5 л. 8. Цилиндр мерный вместимостью 250 мл. 9. Кристаллизатор.
10. Набор реагентов для электрофореза (например, производимый ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ»)включает: смесь для приготовления электродного буфера;
навеску агарозы; раствор бромида этидия; раствор краски-лидера (бромфеноловый синий). 11. Проба исследуемой плазмидной ДНК. 12. ДНК-маркер молекулярных масс. 13. Перчатки резиновые или латексные неопудренные. 14. Теплоизолирующая рукавица. 15. Вода дистиллированная.
Ходработы.Приготовлениерабочегобуферногораствора для электрофореза. Содержимое пакета «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мерную колбу, раство-ряют в 600—800 мл дистиллированной воды (для более быстрого
растворения следует подогреть раствор до 40—45 «С при постоян-
ном помешивании) и доводят объем полученного раствора до 1 л
дистиллированной водой.
Подготовка прибора для электрофореза к работе. Пользуясь встроенными уровнями и винтовыми ножками,
прибор устанавливают строго горизонтально. В рабочую камеру
наливают буфер для электрофореза. Для формирования гелевой
пластины собирают кювету, в нее помещают аппликатор (гребенку) для формирования лунок в толще геля (рис. 2). Регулируемую
высоту аппликатора выставляют таким образом, чтобы расстояние
от дна кюветы до каждого из зубцов составляло 1—2 мм. В зависимости от числа анализируемых проб одновременно можно установить одну, две или три гребенки.
Приготовление агарозного геля. Навеску агарозы,
необходимую для приготовления 1%-ного геля, полностью переносят в коническую стеклянную колбу вместимостью 250—500 мл,
добавляют 150 мл рабочего раствора буфера для электрофореза и
перемешивают. Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в
СВЧ-печи или на электроплитке, периодически помешивая (колбу
держать, только надев на руку теплоизолирующую рукавицу). Продолжают нагревание до тех пор, пока содержимое колбы не станет
совершенно прозрачным (обычно еще 1 мин). Расплав охлаждают
до 55—60 °С, добавляют 10 мкл раствора бромида этидия, перемешивают (работу проводят в латексных или резиновых перчатках) и
наливают на столик для заливки геля (см. описание к прибору для
электрофореза), не допуская образования воздушных пузырьков,
так, чтобы толщина слоя была не менее 5 мм, а зубцы гребенок
были погружены в гель не менее чем на 4 мм. Гель полностью застывает через 15—20 мин. Столик с готовым агарозным гелем и гре-
бенками переносят в камеру для электрофореза, в которую нали-
вают рабочий раствор буфера для электрофореза так, чтобы по-
крыть гелевую пластину слоем в 2—3 мм. Извлекают гребенки из
агарозного геля легким и плавным движением вверх, стараясь не
повредить образовавшиеся лунки.
Проведение электрофореза. В лунки застывшего агарозного геля осторожно вносят по 3 мкл раствора исследуемых образцов ДНК. В соседнюю лунку геля вносят 3 мкл маркера молекулярных масс фрагментов ДНК. В одну или
две (по краям пластины геля) свободные лунки вносят 2—3 мкл
краски-лидера. Закрывают крышку прибора для электрофореза и
подключают его к источнику постоянного тока, строго соблюдая
полярность электродов и учитывая, что движение фрагментов
ДНК происходит в направлении от катода к аноду (от «минуса» к
«плюсу»). На вольтметре источника постоянного тока устанавли-
вают напряжение 120—150 В. В таком режиме процесс электрофо-
реза продолжают около 30 мин, ориентируясь на фронт пробега
краски-лидера (приблизительно на 3 см). По окончании электро-
фореза источник напряжения отключают, снимают крышку при-
бора, пластину агарозного геля осторожно переносят на свето-
фильтр (просмотровый столик) УФ-трансиллюминатора для де-
текции Включают трансиллюми-
натор. Зоны ДНК, окрашенные бромидом этидия, светятся при
УФ-облучении.
Внимание! Во избежание повреждения сетчатки глаз ультрафиолетовым излучением наблюдать зоны ДНК следует только через за-щитное стекло из комплекта трансиллюминатора или защитные (стеклянные) очки. Полученные результаты регистрируют визуально или с использованием гель-документирующей видеосистемы,пользуясь инструкцией к ней.
Контрольные вопросы.1. Какой принцип лежит в основе метода электрофоре-
за? 2. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2,5%-ного геля?
3. Какой концентрации агарозный гель нужно использовать для разделения мето-
дом электрофореза фрагментов ДНК размером 350 и 150 п.н.? 4. В каком направ-
лении и почему движутся молекулы ДНК при проведении электрофореза? 5. От
каких факторов зависит скорость движения молекул ДНК в агарозном геле в про-
цессе электрофореза? 6. Почему нужно избегать образования в геле пузырьков
воздуха? 7. За счет чего происходит визуализация ДНК в геле? 8. Каким образом
можно контролировать движение молекул ДНК в геле во время электрофореза?
9. На каких этапах проведения электрофореза необходимо работать в перчатках и
почему?
Задания.1. Поместить схему или фотографию электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Определить и подписать размеры фрагментов ДНК-маркера (согласно описанию к нему). 3. По электрофореграмме определить электрофоретическую подвижность и рассчитать примерную молекулярную массу исследуемой плазмидной ДНК, используя маркеры молекулярных масс. 4. Определить, какой из ДНК нижеперечисленных плазмид соответствует исследуемая ДНК, если ДНК плазмиды РСЕМ-2Гимеет размер 3000 п.н.ДНК плазмиды рВК322 — 4361,а ДНК плазмидыр РСУ002—8560 п.н.
источник
Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.
Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.
Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.
Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.
Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.
источник
• В основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК.
• — позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.
• Начальным этапом любого молекулярно-генетического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты.
• чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их.
• Анализировать огромные молекулы ДНК в том виде, в котором они существуют в клетке, невозможно. Поэтому их необходимо разделить на части, обработать разными рестриктазами — бактериальными эндонуклеазами.
• Эти ферменты способны разрезать двойную спираль ДНК, причем места разрыва строго специфичны для данного образца.
• Фракционирование (т.е. разделение) фрагментов ДНК по размеру и длине проводится с помощью электрофореза на поверхности агарозного или полиакриламидного геля.
• Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.
• После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.
Визуализация гелей с результатами электрофореза ДНК
• Для ДНК электрофореза обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.
• Фотография агарозного геля после ДНК-электрофореза.
• Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР-реакции. Агарозный гель окрашен бромистым этидием. Визуализация посредством облучения ультрафиолетом с длинной волны 312нм
Молекулярно-генетические методы: блот-гибридизация.
• В основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК.
• — позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.
• Начальным этапом любого молекулярно-генетического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты.
• чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их.
• Для выявления специфических фрагментов ДНК используется метод блот-гибридизации по Саузерну. Эта методика состоит из следующих этапов:
• после окончания электрофореза гели помещают в щелочной раствор для денатурации фрагментов ДНК — получают одноцепочечные ДНК;
• одноцепочечные ДНК вымывают из геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтры перпендикулярным поверхности геля током буфера; одноцепочечные фрагменты ДНК фиксируют на фильтре;
• для визуального выявления нужных фрагментов проводят гибридизацию исследуемого образца со специфическим по нуклеотидной последовательности меченным радиоактивно или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом;
• радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография);
• флюоресцентные метки выявляют в люминесцентном микроскопе.
• Этот метод позволяет обнаружить единственный ген среди десятков тысяч.
• С помощью метода Саузерна можно составить рестрикционную карту генома в участке исследуемого гена и установить, несет ли данный ген какие-либо дефекты.
Молекулярно-генетические методы: секвенирование ДНК.
• В основе лежат современные методики работы с ДНК или РНК.
• — позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.
• Начальным этапом любого молекулярно-генетического анализа является получение образцов ДНК или РНК. Для этого используют геномную ДНК (вся ДНК клетки) или отдельные ее фрагменты.
• чтобы получить достаточное количество таких фрагментов, необходимо, амплифицировать (размножить) их.
• определение первичной нуклеотидной последовательности (от англ. sequence — последовательность).
• В результате секвенирования получается линейное символьное описание, которое сжато резюмирует атомную структуру молекулы ДНК.
• Для секвенирования применяются методы Эдмана, Сэнжера и другие;
• в настоящее время для секвенирования нуклеиновых кислот обычно применяется метод Сэнжера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP).
• Обычно до начала секвенирования при помощи ПЦР производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить.
• Методология секвенирования была разработана в конце 1970-х гг. английским биохимиком Фредериком Сэнжером.
Секвенирование ДНК по Сэнжеру
• Перед секвенированием молекулу ДНК разрезают на фрагменты и клонируют в Escherichia coli. Выделенные из бактериальных клеток фрагменты многократно амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
• Раствор с одноцепочечными фрагментами и праймерами распределяют по четырём пробиркам, в каждую из которых добавлены четыре разные dNTP и один из флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Удлинение гибридизовавшегося с ДНК-фрагментом праймера происходит до тех пор, пока в цепь не включится ddNTP. В этом месте синтез останавливается, и в результате в каждой из пробирок образуется уникальный набор отрицательно заряженных фрагментов разной длины, оканчивающихся одним из меченых ddNTP.
• Фрагменты разделяют по размеру с помощью капиллярного электрофореза. Когда фрагменты определённой длины проходят через окно детектора, освещаемое лазерным лучом, ddNTP начинают флуоресцировать. Длина волны флуоресценции зависит от того, какой именно ddNTP находится у них на конце, так что на выходе получается цветная картинка, которую можно трансформировать в нуклеотидную последовательность.
Автоматическое секвенирование ДНК
• Особенно перспективным для массового секвенирования в автоматическом режиме оказалось применение меченых различными флуорохромами дидезоксинуклеотидов. В этом варианте секвенирования каждому из нуклеотидов соответствует свой цвет полосы в геле, что хорошо распознается в автоматическом режиме.
• Этот метод нашел широкое применение в реализации программы «Геном человека».
• Во время работы автоматического секвенатора нуклеотиды проходят последовательно, в определенном порядке, через миллион микроскопических лунок специального планшета, где находятся частицы с иммобилизованными на них копиями одноцепочечных фрагментов ДНК из библиотеки фрагментов образца ДНК.
• При прохождении нуклеотидов происходит одновременное секвенирование уникальных одноцепочечных ДНК на каждой частице, в каждой лунке планшета.
• Если через лунку проходит нуклеотид, комплементарный матрице, полимераза удлиняет цепь, встраивая этот нуклеотид.
• Добавление нуклеотида приводит к высвобождению пирофосфата и далее к реакции, генерирующей световой сигнал.
• Этот сигнал регистрируется CCD-камерой прибора.
• Интенсивность сигнала пропорциональна количеству нуклеотидов, встроенных в цепь ДНК за время одного прохода нуклеотидов.
Последнее изменение этой страницы: 2016-09-13; Нарушение авторского права страницы
источник
Сущность метода электрофореза. В настоящее время фракционирование и детекция флуоресцентно меченых продуктов ПЦР проводятся в автоматизированных системах (секвенаторах или генетических анализаторах). В этих системах автоматизированы этапы электрофореза, детекции флуоресцентно меченых фрагментов ДНК и учета результатов электрофореза (рис. 4.11). 
4. В « В Е F Й
Рис. 4.11. Электрофорез различных фрагментов ДНК
Используя метод электрофореза, фрагменты ДНК различной длины могут быть фракционированы. Этот метод является важнейшим методом исследования ДНК и широко используется в криминалистическом ДНК-анализе.
Средой для электрофореза служит среда на основе полиакриламида, формирующая сетчатую структуру с величиной ячеек, соизмеримой с величиной молекулы ДНК. Исследуемые пробы ДНК вносят в среду для электрофореза и накладывают электрическое поле. Фрагменты ДНК (имеющие отрицательный заряд) начинают перемещаться к аноду (положительно заряженному электроду), испытывая сопротивление сетчатой среды геля. Чем короче фрагмент, тем меньшее сопротивление он испытывает и тем быстрее он движется (скорость миграции обратно пропорциональна логарифму
длины фрагмента). В результате электрофореза в среде образуются участки, содержащие фрагменты ДНК. Те области, которые располагаются ближе к аноду, соответствуют меньшим по длине фрагментам, а те, которые дальше, — большим (см. рис. 4.11).
В автоматизированных приборах электрофорез проводят до тех пор, пока все фрагменты ДНК не пересекут область детекции, которая располагается со стороны анода (рис. 4.12). В этой области среда электрофореза освещается лазером, который возбуждает свечение флуоресцентных меток продуктов ПЦР. Цифровая камера фиксирует свечение меток, которое сохраняется на компьютере.
Электрофорез 
Энергия , Г Возбужденный Компьютер ‘ |’ свет
’S-
РИС. 4.12. Схема электрофореза ДНК с автоматизированной детекцией флуоресцентных меченных продуктов П11Р
В результате фракционирования продуктов ПЦР STR-локусов ДНК на приборах получают первичные графические данные элек- трофореграмм. Эти данные представляют собой график измерений детектором интенсивности свечения флуоресцентных меток (рис. 4.13).
Для определения длины исследуемых фрагментов ДНК перед электрофорезом каждую исследуемую пробу смешивают с денатурирующим реагентом формамидом и специальным маркером — внутренним стандартом, содержащим смесь фрагментов известной длины (рис. 4.14).
Рис. 4.13. Первичные данные электрофореза продуктов ПЦР STR-локусов ДНК
alt=»Рис. 4.14. Электрофорез фрагментов внутреннего стандарта» />
Рис. 4.14. Электрофорез фрагментов внутреннего стандарта
Фрагменты внутреннего стандарта содержат флуоресцентную метку, отличающуюся от флуоресцентных меток продуктов ПЦР.
После электрофореза по расположению исследуемых фрагментов относительно фрагментов внутреннего стандарта, используя специальный компьютерный анализ, имеется возможность с высокой точностью установить величины исследуемых фрагментов ДНК.
Виды автоматизированных систем для электрофореза ДНК. В настоящее время существует два основных варианта автоматизированных систем: для электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле; для электрофорез в капилляре в среде специального полимера при денатурирующих условиях (капиллярный электрофорез).
Примером прибора, позволяющего проводить фракционирование и детекцию флуоресцентно меченых продуктов секвенирую- щих реакций по первому варианту является секвенатор ABI Prism 377 DNA Sequencer, производства фирмы Applied Biosystems, США. Примером приборов, работающих по второму варианту — ABI Prism 310 Genetic Analyzer, 3100 и 3130 Genetic Analyzer, производства фирмы Applied Biosystems, США (рис. 4.15). 
Рис. 4.15. Генетический анализатор ABI Prism 3130 Genetic Analyzer
Достоинством первого варианта электрофореза являются меньшие требования, предъявляемые к чистоте и качеству реактивов, меньшая стоимость анализа, проведение традиционных для ручного исследования процедур (приготовление полиакриламидного геля, подготовка образцов, их нанесение и т.д.)- Недостатком этого варианта является необходимость проведения значительного количества ручных операций, цикличность работы, требующая накопления объектов исследования.
Приборы капиллярного электрофореза лишены вышеприведенных недостатков, однако для них характерна более высокая стоимость анализа. Важным достоинством этих приборов является значительно более высокая скорость проведения электрофореза, что позволяет оперативно проводить анализ исследуемых объектов. Кроме этого, приборы капиллярного электрофореза могут быть встроены в единую автоматизированную линию исследования ДНК.
В настоящее время в отличие от традиционных систем электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле происходит активное развитие систем капиллярного электрофореза. Их следует рассматривать как основные приборы для криминалистических лабораторий ДНК-анализа.
Расшифровку первичных электрофореграмм проводят с помощью компьютерной программы GeneMapper ID, производства фирмы Applied Biosystems.
Интерпретация результатов электрофореза с помощью программы GeneMapper ID. Интерпретация результатов электрофореза с помощью программы GeneMapper ID заключается в установлении аллелей исследуемых STR-локусов.
Для установления аллелей при электрофорезе продуктов ПЦР исследуемых проб используют также пробу специального аллельного маркера или лэддера. Эта проба содержит фрагменты ДНК, соответствующие по последовательности и размерам всем встречающимся аллелям исследуемых локусов (рис. 4.16). Аллельный лэддер является внешним стандартом исследования. Аллельные лэддеры производятся изготовителями реактивов для амплификации.
Рис. 4.16. Электрофорез фрагментов аллельного маркера
С помощью компьютерной программы GeneMapper ID общая электрофореграмма пробы разделяется на электрофореграммы по отдельным флуоресцентным красителям. Сначала величина исследуемых фрагментов определяется по их расположению относительно фрагментов внутреннего стандарта. Далее полученные величины сравниваются с величинами фрагментов аллельного лэдде- ра. Допустимое отклонение исследуемых фрагментов от фрагментов аллельного лэддера не должно превышать ± 0,5 нуклеотида. При наличии совпадений фрагмент обозначается в соответствии с принятой номенклатурой аллелей, при отсутствии — обозначается как неопределенный.
Все фрагменты, обозначенные как неопределенные или локализующиеся выше и ниже крайних аллелей лэддера, должны быть проанализированы. При необходимости электрофорез повторяют.
При воспроизводимости результатов фрагменты, не совпадающие с фрагментами аллельного лэддера обозначают вручную в соответствии с принятой номенклатурой аллелей. В случае отсутствия воспроизводимости выявленные первоначально фрагменты являются неспецифическими и дальнейшему анализу не подлежат.
При анализе электрофореграмм могут быть обнаружены и другие неспецифические фрагменты, которые необходимо отличать от истинных аллелей. Часто выявляют так называемые статтеры (рис. 4.17) — фрагменты, которые короче истинного аллеля на одну повторяющуюся единицу (т.е. по уровню расположения соответствуют фрагменту лэддера, предшествующему истинному аллелю).
Для статтера характерны два признака, по которым его отличают от истинных аллелей, а также отличают гомозиготный профиль со статтером от гетерозиготного профиля: если появляется статтер, то он всегда ассоциирован с истинным аллелем (он короче истинного аллеля на одну повторяющуюся единицу); интенсивность статтера обычно не превышает 15 % интенсивности истинного аллеля, с которым он ассоциирован.
Другими, часто выявляемыми неспецифическими фрагментами являются так называемые N-фрагменты (рис. 4.18). Их появление связано с тем, что ДНК-полимераза обладает свойством достраивать во вновь синтезированную цепь ДНК один лишний нуклеотид.
200 210 230 2» 240 290 2U /> 
ogt;
О) 
117 (N+Tj]ll8 W-nil
Рис. 4.18. Неспецифические явления — N-фрагменты
В результате этого свойства на основе матричной цепи ДНК синтезируются два типа фрагментов: N+1-фрагменты, которые длиннее на один нуклеотид, и N-фрагменты, соответствующие истинной длине исходной ДНК. Интенсивность N-фрагментов всегда ниже, чем N+1-фрагментов. Присутствие N-фрагментов обычно не усложняет установление истинных аллелей, однако следует особенно внимательно анализировать электрофореграммы локусов, аллели которых могут отличаться на одну пару оснований (например, аллели 9.3 и 10 локуса ТН01).
Особые неспецифические сигналы возникают в случае электрофореза проб с избыточным количеством продуктов ПЦР. В этом случае детекционная система прибора (цифровая камера) оказывается перенасыщенной, и становится невозможно корректно разделить флуоресцентные сигналы, получаемые в результате свечения разных флуоресцентных меток. В итоге на электрофореграммах отдельных флуоресцентных красителей детектируются фрагменты, равные по размеру (рис. 4.19).
Рис. 4.19. Неспецифические явления, возникающие в случае электрофореза проб с избыточным количеством продуктов ПЦР
Истинным фрагментом является только тот, у которого интенсивность свечения (высота пика) является большей. Сигналы других флуоресцентных красителей, равные по размеру, но меньшие по интенсивности следует считать неспецифическими. При неясных случаях следует повторить электрофорез с внесением меньшего количества продуктов ПЦР.
Фрагменты, которые были определены как статтеры или иные неспецифические фрагменты, в дальнейшем исследовании не учитывают.
Экспертный анализ результатов электрофореза начинают с изучения электрофореграмм контролей реакции амплификации и кон- тролей выделения ДНК.
Данные считаются достоверными, если: а) в отрицательных контролях реакции амплификации и контролях выделения ДНК отсутствуют амплифицированные фрагменты; б) профиль ДНК, выявленный в положительном контроле реакции амплификации, соответствует генотипу контрольной ДНК.
После оценки электрофореграмм контролей проводят анализ электрофореграмм исследуемых проб ДНК.
Сравнение установленных генетических признаков по STR- локусам и их интерпретация зависит от задач исследования. При исследовании объектов, содержащих ДНК одного лица, и сравнении их генетических признаков с генетическими признаками определенных лиц возможны два варианта: генетические признаки исследуемых объектов полностью совпадают. генетические признаки исследуемых объектов имеют различия.
В первом случае это означает, что исследуемые объекты могут иметь общий источник происхождения (один и тот же индивидуум или его однояйцовый близнец). Однако не исключается случайное совпадение генетических признаков неродственных лиц.
Контрольные вопросы Перечислите основные этапы исследования ядерной ДНК. Охарактеризуйте объекты исследования.
68
Что влияет на выбор того или иного метода выделения ДНК? С какими основными методами выделения ДНК вы познакомились? Что такое ПЦР? Охарактеризуйте три фазы цикла амплификации. Какие компоненты нужны, чтобы поставить ПЦР? Что такое праймеры? Что такое амплификатор? Какие амплификационные системы используются в настоящее время? Особенности мультипликационных систем. Каков принцип метода RT-PCR? Что такое зонд TaqMan? В каких целях применяют RT-PCR в судебно-генетических исследованиях? Что представляет собой калибровочный график для определения концентрации ДНК? Перечислите возможные варианты контроля ПЦР. Охарактеризуйте метод электрофореза. Что является средой для электрофореза? Как происходит электрофорез в автоматизированных приборах? Что такое внутренний стандарт? Какие варианты автоматизированных систем для электрофореза ДНК существуют в настоящее время? Перечислите достоинства и недостатки каждого варианта. Для чего нужна программа GeneMapper ID? Что такое лэддер? Охарактеризуйте термины статтеры, N-фрагменты. Когда полученные данные считаются достоверными? Как оценивают достоверность события?
источник
Большим достижением в развитии судебно-экспертной идентификации человека стало внедрение новейших методов молекулярной биологии, ДНК-анализа в судебно-экспертную практику. Это открыло возможности идентифицировать человека практически по всем следам его тканей и выделений, используя такие микроколичества вещества, которые ранее не считались пригодными для экспертизы. Метод ДНК-анализа — это инструментальный метод, однако, как и любой метод исследования биологически активного материала, он является достаточно трудоемким и требует глубоких специальных знаний и очень высокой квалификации эксперта. Последующее развитие судебного ДНК-анализа в рамках молекулярно-генетической экспертизы связано с техническим совершенствованием инструментального и методического сопровождения его проведения [1] .
Методы ДНК-анализа в судебно-экспертных исследованиях применяют для решения задач по установлению:
генетического индивидуально-конкретного тождества; генетического родства; видовой принадлежности объектов; половой принадлежности объектов.
По прогнозам ученых, в перспективе станет возможным по результатам ДНК-анализа устанавливать цвет волос, глаз, величину ушной мочки и, возможно, полный портрет человека.
Наибольшее распространение в экспертной практике в настоящее время имеет метод анализа ДНК, находящейся в ядрах (ядерной) и митохондриях (митохондриальной) клеток, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этим методом удается исследовать даже мелкие фрагменты ДНК, чаше всего обнаруживаемые на изымаемых с мест происшествий объектах. Рассмотрим последовательно особенности, связанные с применением данного метода, а также другие подсобные и сопряженные с ним приемы и методы.
Строение молекулы ДНК. Структура ДНК индивидуальна для каждого живого организма и неизменна на протяжении всей жизни человека. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) является носителем генетической информации обо всех признаках организма и представляет собой сложное высокомолекулярное соединение, состоящее из последовательности химически связанных между собой нуклеотидов. ДНК за возможность создавать практически не ограниченное количество вариантов получила название беспредельно варьирующего полимера.
Молекула ДНК представляет собой очень длинную двойную спираль, состоящую из отдельных «кирпичиков» — нуклеотидов (рис. 8.17). Нуклеотидов всего четыре типа: аденин (А), гуанин (G), цитозин (С) и тимин (Т). Информация в ДНК записана в виде последовательности этих нуклеотидов. Разнообразие молекул ДНК обусловлено возможным разнообразием комбинаций расположения нуклеотидов, количество которых в молекуле ДНК человека достигает трех миллиардов [2] , они несут информацию о программе развития организма. В этой записи можно различить отдельные «слова» — гены (от греч. genos — происхождение), определяющие особенности (признаки) индивидуума.
Рис. 8.17. Фрагмент структуры ДНК с образующими ее нуклеотидами
Размер молекул ДНК, как и любых других полимерных соединений, может сильно изменяться. Так как мономеры в ДНК — это нуклеотиды, а ДНК — двухцепочечная структура, то размер молекул ДНК принято измерять в парах нуклеотидов или парах оснований.
Общая длина молекулы ДНК клетки человека превышает 1,5 метра. Чтобы длинные молекулы ДНК не запутались, они свернуты в более плотные структуры, называемые хромосомами. Каждая хромосома содержит одну линейную молекулу ДНК, поддерживаемую белками (рис. 8.18).
Любой изучаемый экспертами генетический признак (ген) у одного индивидуума представлен двумя аллелями (так как в геноме каждая хромосома представлена парой гомологичных хромосом). Если аллели одинаковые, то такой генетический признак имеет гомозиготное состояние, если разные — то гетерозиготное. Совокупность аллельных вариантов полиморфных локусов является индивидуальной для каждого человека. Таким образом, аллели (от греч. &A,A,f|A,cov — друг друга, взаимно) — различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом и определяющие альтернативные варианты развития одного и того же признака.
Рис. 8.18. Укладка ДНК в хромосоме
Метод полиморфизма длины фрагментов рестрикции ДНК. Предложенный английским ученым А. Джеффрисом метод основан на способности бактериальных ферментов распознавать строго определенные последовательности в молекуле ДНК и разрезать ее по областям распознавания. А. Джеффрис обнаружил, что длина образующихся фрагментов различается у разных людей, отсюда и принятое название данного метода — полиморфизм длины фрагментов рестрикции (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism). Это открытие легло в основу внедрения методов молекулярной генетики в практику судебно-генетической экспертизы, позволяющих проводить идентификационные исследования с использованием объектов биологического происхождения. Такими объектами в судебно-генетической экспертизе служат любые ткани и выделения человека, которые содержат ДНК: жидкая кровь и пятна высохшей крови, слюна, сперма, пот, мышечные и костные ткани, корневые концы волос с луковицей.
В криминалистическом ДНК-анализе используют два основных методических подхода. Один из них — так называемая прямая идентификация — состоит в непосредственном сравнении идентифицирующих характеристик (в нашем случае это профили ДНК) объекта идентификации с идентифицирующими характеристиками объектов сравнения из базы данных.
Применение прямого сравнительного исследования генетических признаков изучаемого объекта и генетических признаков образца крови лица, от которого предполагается происхождение объекта, обычно проводится по делам, когда на месте происшествия обнаруживаются и изымаются следы биологического происхождения человека и определено лицо или круг лиц, от которых данные следы предположительно происходят.
Другой метод ДНК-идентификации не прямой, а опосредованный. Судебно-генетическая экспертиза в отличие от любых других экспертиз позволяет решать задачу идентификации объекта, не применяя прямого сравнительного исследования, а проводя сравнение с генетическими признаками ближайших родственников. Это идентификация, осуществляемая посредством установления факта кровного родства. Расчетные алгоритмы данного метода опираются на закономерности наследования признаков от родителей к детям.
Подобные исследования очень часто проводятся при идентификации останков неопознанных трупов, которые не могут быть идентифицированы традиционными и антропометрическими методами. В этих случаях задача идентификации может быть решена путем сравнения генетических признаков останков с генетическими признаками предполагаемых родителей или детей погибшего.
Эта задача может быть решена также путем сравнения генетических признаков митохондриальной ДНК (мтДНК) останков с генетическими признаками предполагаемых сестер или братьев, а также родственников по материнской линии (бабушкой, родными братьями и сестрами матери или бабушки).
Кроме задач по идентификации объектов, генетическая экспертиза может решить задачу установления родства, в частности отцовства или материнства. Такие исследования проводятся как по уголовным делам, связанным с детоубийствами или подменой детей, так и в гражданских делах по разрешению спорного отцовства.
Последней задачей, решаемой генетической экспертизой, является диагностика пола исследуемого объекта. Для исследования признака половой принадлежности, как и любого генетически детерминированного признака, не характерны какие-либо технологические особенности. Поэтому половая принадлежность исследуемого объекта диагностируется обычными методами ДНК-анализа.
Возможности судебного ДНК-анализа. Методы ДНК-анализа позволяют исследовать микроколичества биологического материала. Теоретически минимальной величиной объекта, пригодного для исследования методами ДНК-анализа, может быть лишь одна клетка, однако практически объект должен состоять как минимум из десятков или сотен неразрушенных клеток. Такая величина соответствует настолько незначительным размерам, что нередко пригодные для исследования объекты остаются не обнаруженными на месте происшествия. Например, 1 мкл цельной крови (1/30 величины минимальной по размерам капли) содержит около 50 нг ядерной ДНК, что в 50 раз превышает количество ДНК, необходимое для проведения генетического исследования [3] .
Судебный ДНК-анализ позволяет исследовать следы, загрязненные микрофлорой, а также содержащие ДНК двух и более лиц, например исследуются следы спермы, смешанные с выделениями потерпевшей.
Методы предварительного исследования объектов биологического происхождения. Выявление следов крови. Следы крови имеют различные оттенки: от ярко-красного цвета жидкой крови до бурого, коричневого, красно-оранжевого цветов, иногда с сероватым оттенком. В случае ее загнивания появляются включения черного, зеленого, серого и белого цветов.
Для выявления следов крови на месте происшествия используют многие реакции в качестве предварительных проб. Например:
- 1) 3%-ный раствор перекиси водорода (Н22) наносят на самый край исследуемого пятна. При наличии крови наблюдают появление «бугорка» пены белого цвета как результат действия фермента каталазы, содержащейся в форменных элементах крови;
- 2) диагностическую полоску гемо-ФАН (фирма Lachema, Чехия) с реагентом (предварительно увлажненную водой) накладывают на край пятна предполагаемой крови. Окрашивание полоски в синий цвет считается положительным результатом реакции;
- 3) в ультрафиолетовых (УФ) лучах пятно крови приобретает коричневый цвет и не флуоресцирует. Если же на частичку крови (например, на нить с пятном крови) нанести каплю концентрированной серной кислоты, то в УФ-лучах пятно приобретет ярко-красное свечение. Гемоглобин крови под воздействием серной кислоты переходит в гематопорфирин, который дает флуоресценцию красного цвета.
Выявление следов спермы. Следы спермы имеют белый цвет с желтоватым оттенком. На ощупь участок ткани, пропитанный веществом спермы, более плотный (жесткий), чем сама ткань. При осмотре с целью обнаружения следов спермы следует особое внимание уделять предметам обстановки, на которых, по данным потерпевших или свидетелей, был совершен акт изнасилования.
Предварительная проба на сперму основывается на выявлении в пятнах кислой фосфатазы. Для этого используют индикаторные полоски, например «Фосфотест». Индикаторный слой, пропитанный реагентом, смачивают водой и прижимают с краю исследуемого пятна. При наличии спермы через 20—30 с наблюдается яркая фиолетовая окраска подложки. В УФ-лучах сперма флуоресцирует ярко-голубым светом за счет содержащегося в ней флавина. Следы спермы, смешанные с кровью, не флуоресцируют.
Выявление следов слюны. Следы слюны имеют сероватый или желтоватый оттенок. Однако окурки сигарет, папирос и фрагменты бумаги, которыми закрывают дверные «глазки», следует всегда изымать и направлять на дальнейшее исследование, даже если нет видимых следов слюны.
Выявление потожировых следов. О наличии потожировых наслоений свидетельствуют блестящие участки ткани — так называемые участки засаленности, а также обнаруженные дактилоскопическими методами следы рук или иных частей тела.
Из дактилоскопических методов обнаружения следов рук или иных частей тела не разрушают вещества потожировых наслоений только методы специального освещения и оптического увеличения, осаждения копоти и метод опыления цветными порошками и их смесями. Другие методы оказывают на вещество потожировых наслоений то или иное разрушающее воздействие, исключающее возможность дальнейшего биологического исследования данных следов.
Выявление волос. Если при осмотре места происшествия или предметов обнаруживаются наложения в виде волокон, то они обозначаются как «объекты волокнистой природы», изымаются и направляются на исследование с целью установления их принадлежности к волосам.
Технологическая схема исследования ДНК, содержащейся в ядрах клеток (ядерной ДНК), включает следующие этапы: выбор объекта исследования, содержащего ДНК; выделение ДНК из объектов исследования; полимеразная цепная реакция (ПЦР);
электрофоретическое разделение продуктов ПЦР (электрофорез); интерпретация полученных данных (установление аллелей, математическая обработка данных, выводы).
Рассмотрим эту последовательность действий подробнее.
Объекты исследования, содержащие ДНК. Наиболее частыми объектами исследования являются кровь, слюна и сперма. Пригодными для исследования являются также образцы мышечной ткани, костные останки и отдельные волосы. Более редкими объектами исследования становятся следы пота, перхоть и др.
Выделение ДНК из объектов. Используются следующие основные методы выделения ДНК из биологических объектов:
- 1) метод, основанный на использовании ионообменной смолы Chelex 100;
- 2) метод выделения и очистки с помощью органических соединений, таких как фенол и хлороформ (фенольный метод);
- 3) метод выделения и очистки с помощью веществ, абсорбирующих ДНК, таких как соединения кремния (Silica) или синтетические сорбенты.
При выборе метода выделения учитывают вид объекта, его состояние, давность образования и условия хранения. Рассмотрим последний из них, представляющийся наиболее эффективным и перспективным.
Метод выделения ДНК с использованием абсорбирующих веществ в последнее время получает все большее распространение в экспертной практике. Он может быть применен для выделения ДНК практически из любых объектов, содержащих ДНК. Данный метод не требует использования токсичных реактивов и может быть автоматизирован. В отличие от фенольного метода, при котором очистка экстракта происходит за счет удаления из него белковых примесей, в данном случае из экстракта удаляют (абсорбируют) саму ДНК.
Применение данного метода для выделения ДНК из биологических объектов способствует более вероятному получению ДНК, свободной от ингибиторов ПЦР. В результате получают ДНК высокой степени очистки, которая пригодна для длительного хранения. К недостаткам метода следует отнести необходимость применения специального оборудования. Также этот метод является наиболее дорогостоящим. В настоящее время данный метод выделения ДНК особенно эффективен, когда имеется необходимость получения ДНК высокой степени очистки, не содержащей ингибиторы ПЦР.
Это интересно. Извлечь ДНК из тканей живых организмов совсем не сложно, Ниже приведен метод, позволяющий это делать даже в бытовых условиях [4] . Возьмите немного ткани какого-либо растения или животного — горох, кусок мяса. Добавьте немного соли и воды и размелите в однородную массу в кухонном комбайне. Затем добавьте немного средства для мытья посуды. Оно растворит окружающие клетки мембраны, слишком маленькие, чтобы их размолол кухонный комбайн. После этого добавьте немного размягчителя для мяса. Он удалит некоторые белки, прикрепленные к молекулам ДНК. Теперь получилось жидковатое мыльное пюре, в котором плавает ДНК. Добавьте к нему немного технического изопропилового спирта и получится двухслойный коктейль: внизу мыльное пюре, вверху прозрачный спирт. Встряхните: ДНК легко переходит из пюре в спирт. Появившийся в спирте округлый белый сгусток и есть ДНК.
С использованием метода на основе проведения ПЦР осуществляется следующий этап ДНК-анализа. Полимеразная цепная реакция (ПЦР или PCR от Polymerase chain reaction) представляет собой процесс контролируемого синтеза ДНК, позволяющий амплифициро- вать (копировать — как оригинал документа на ксероксе) интересующие исследователей участки последовательности ДНК. Осуществляется процесс с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Процесс амплификации аналогичен процессу воспроизведения ДНК, который происходит в клетке перед ее делением, с тем лишь отличием, что копируется не вся хромосома, а лишь только ее короткий фрагмент. К концу реакции (ПЦР) количество копий интересующих исследователей фрагментов измеряется миллионами. Именно ПЦР определяет высокую чувствительность криминалистического анализа ДНК.
Специфическим компонентом реакции служат так называемые праймеры, определяющие, какой участок ДНК будет избирательно синтезироваться в ходе реакции. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез новых полинуклеотидных цепей с помощью ДНК- полимеразы осуществляется только между ними (праймерами), удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК.
Метод электрофоретического разделения продуктов ПЦР (электрофорез). В настоящее время фракционирование и детекция флуоресцентно меченых продуктов ПЦР проводятся в автоматизированных системах (секвенаторах или генетических анализаторах). В этих системах автоматизированы этапы электрофореза, детекции флуоресцентно меченых фрагментов ДНК и учета результатов электрофореза (рис. 8.19 и 8.20).
Использование метода электрофореза позволяет фракционировать (разделить) фрагменты ДНК различной длины. Этот метод является важнейшим методом исследования ДНК и широко используется в криминалистическом ДНК-анализе.
Процесс электрофореза чем-то напоминает тонкослойную хроматографию. Процедура электрофоретического разделения происходит на пластине, покрытой гелем на основе полиакриламида, имеющего сетчатую структуру с величиной ячеек, соизмеримой с величиной молекулы ДНК. Исследуемые пробы (смеси фрагментов ДНК) вно-
Рис. 8.19. Камера для горизонтального электрофореза
Рис. 8.20. Система генетического анализа (секвенатор) CEQ 8000, Beckman Coulter. Прибор предназначен для определения первичной нуклеотидной последовательности ДНК, автоматического распознавания и идентификации аллелей
сят в среду для электрофореза и накладывают электрическое поле. Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Фрагменты ДНК имеют отрицательный заряд и начинают перемещаться к аноду — положительно заряженному электроду, испытывая сопротивление сетчатой среды геля. Чем короче фрагмент, тем меньшее сопротивление он испытывает и тем быстрее он движется в электрическом поле. В результате электрофореза в среде образуются участки, содержащие фрагменты ДНК. Те области, которые располагаются ближе к аноду, соответствуют меньшим по длине фрагментам, а те, которые дальше, — ббльшим.
Амплификационная система PowerPlex2.1 System (Promega Corp., США) позволяет одновременно анализировать девять хромосомных локусов: Penta Е, D18S51, D21SII, THOI, D3S1358, FGA, ТРОХ, D8S1179 и vWA (рис. 8.21). М — комбинированный аллельный стандарт (представлены все аллельные варианты анализируемых локусов).
Рис. 8.21. Электрофорез хромосомной ДНК шести неродственных индивидуумов
Суммарный амплификационный профиль ДНК для каждого индивидуума создается комбинацией девяти пар полос, что обусловливает высокую индивидуальную специфичность.
В автоматизированных приборах в результате фракционирования продуктов ПЦР STR-локусов ДНК [5] получают первичные графические данные электрофореграмм. Эти данные представляют собой график измерений детектором интенсивности свечения флуоресцентных меток.
Методы интерпретации результатов электрофореза. Интерпретация результатов электрофореза с помощью специальной программы GeneMapper ID заключается в расшифровке полученной электрофо- реграммы, установлении на ней аллелей исследуемых STR-локусов.
Для установления аллелей при электрофорезе продуктов ПЦР исследуемых проб используют также пробу специального аллельного маркера или лэддера (контрольный эталон). Эта проба содержит фрагменты ДНК, соответствующие по последовательности и размерам всем встречающимся аллелям исследуемых локусов. Аллельные лэддеры производятся изготовителями реактивов для амплификации [6] .
Сравнение установленных генетических признаков по STR-локусам и их интерпретация зависят от задач исследования. При исследовании объектов, содержащих ДНК одного лица, и сравнении их генетических признаков с генетическими признаками определенных лиц возможны два варианта: генетические признаки исследуемых объектов полностью совпадают; генетические признаки исследуемых объектов имеют различия. В первом случае это означает, что исследуемые объекты могут иметь общий источник происхождения (от одного и того же индивидуума или его клона — однояйцевого близнеца).
Вероятностно-статистическая оценка идентификационной значимости результатов исследования ДНК. Оценка вероятности данного события проводится на основе исследований частот встречаемости аллелей STR-локусов. Чем реже частота встречаемости в популяции людей установленного генотипа, тем ниже вероятность случайного совпадения генетических признаков неродственных лиц и тем выше идентификационное значение исследования.
При анализе генетических признаков исследуемых объектов достаточно обнаружить несовпадение в одном исследованном STR-локу- се для исключения происхождения исследуемых объектов от одного лица.
В исследованиях по установлению родства используются иные подходы. Задачей исследования является установление возможности происхождения конкретного лица (ребенка) от одного или двух предполагаемых родителей. Особенностью анализа результатов исследования родства по сравнению с идентификационным исследованием является то, что каждый родитель передает своему ребенку только один аллель каждого локуса ДНК. Это означает, что потенциальным родителем ребенка может быть любой человек, имеющий в своем генотипе хотя бы один одинаковый с генотипом ребенка аллель по каждому исследованному локусу. В противном случае родство исключается.
Принцип определения величин вероятностей событий, изучаемых в ДНК-анализе. Расчеты величин вероятности случайного совпадения генетических признаков или вероятностей гипотез, объясняющих экспертный случай, сводятся к установлению вероятности встречаемости в популяции лица (группы лиц), обладающего определенными генетическими признаками. Данная вероятность теоретически будет равна частоте встречаемости в популяции такого лица (группы лиц).
Методы расчета частот генотипов в популяции основываются на законе Харди — Вайнберга, названном по именам установивших его в 1908 г. ученых. Смысл этого закона сводится к тому, что частоты аллелей из поколения в поколение в популяции будут оставаться постоянными при соблюдении определенных условий: популяция должна быть достаточно велика, чтобы обеспечить возможность случайного сочетания признаков; должен отсутствовать отбор, благоприятствующий (или неблагоприятствующий) определенным признакам; не должно возникать мутаций; не должна происходить миграция между популяциями.
В естественных условиях данные ограничения часто не соблюдаются, однако это не оказывает принципиального влияния на выполнение закона Харди — Вайнберга. Это может быть связано с тем, что численность природных популяций достаточно большая, избирательность при скрещивании не оказывает влияния на большинство генетических признаков, мутации происходят достаточно редко, естественный отбор не оказывает заметного влияния на частоту большинства аллелей, популяции в достаточной степени изолированы друг от друга.
Таким образом, использование закона как математической модели позволяет в большинстве случаев с достаточной степенью приближения определять частоты встречаемости признаков (и соответственно генотипов) в популяции.
Расчет значения вероятности встречаемости в популяции лица, обладающего определенными генетическими признаками по нескольким локусам, которые не являются сцепленными (наследование по ним происходит независимо), проводится согласно теореме умножения вероятностей (произведение вероятностей встречаемости признаков, вычисленных по каждому из локусов):
где Рь Р2, . Р„ — значения вероятностей встречаемости признаков, вычисленных по локусам, обозначенным номерами 1,2, п.
Следует отметить, что возможности методов ДНК-анализа значительно шире рассмотренных выше иных биологических методов экспертного исследования. Возможно использование ДНК-анализа для установления вида и конкретного животного при расследовании дел о браконьерстве, хищении элитных животных. Идентификационные исследования волос и крови домашних животных могут быть источником ценной информации при расследовании дел по экономическим преступлениям, грабежам и другим видам преступлений [7] .
- 1. Какие показатели исследуют с помощью органолептических методов?
- 2. Перечислите достоинства и недостатки биологических методов анализа.
- 3. При каких условиях обеспечивается сохранность пахнущих следов и собранных с них пахнущих проб?
- 4. Назовите требования к образцам для сравнения в судебной экспертизе пахнущих следов человека. Какой материал для их получения представляется экспертам?
- 5. Какими методами получают пахнущие пробы с объектов-следоносите- лей? Какие из них наиболее эффективны?
- 6. Назовите методы обеспечения достоверности сигналов собак-детекто- ров в ольфакторном исследовании. Для чего используются контрольные (эталонные) пробы?
- 7. Для решения каких задач применяется метод ИХА веществ?
- 8. В чем состоит техника применения метода ИХА?
- 9. Какими достоинствами характеризуется метод ИХА?
- 10. Какие задачи решает судебный ДНК-анализ?
- 11. Охарактеризуйте содержащие ДНК объекты биологического происхождения.
- 12. Как можно выявить следы крови, спермы?
- 13. Расскажите о строении ДНК.
- 14. Что такое нуклеотиды, аллели, локусы?
- 15. Охарактеризуйте используемый в ДНК-анализе метод электрофореза.
- 16. Какие способы оценки идентификационной значимости генетических признаков используются судебными экспертами?
источник