Методы электрофореза в биотехнологии

Методы тонкой очистки веществ: виды хроматографии, двумерный электрофорез , ВЖХ, ультрацентрифугирование

Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами.

Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта).

По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул.

Можно разделять молекулы методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные молекулы проходят через колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями.

В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их:

заряду (ионообменная хроматография),

гидрофобности (гидрофобная хроматография),

размеру (хроматография гель-фильтрацией)

или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография).

При ионообменной хроматографии нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы: диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) — заряжена положительно; карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза — заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и рН элюирующего раствора.

Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи; в таких колонках задерживаются белки с обнаженными гидрофобными участками.

Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками; при использовании таких колонок происходит разделение белков по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза).

Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров.

Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок.

Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело-антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого рН. Однократная хроматография на такой колонке позволяет зачастую достигнуть очень высокой степени очистки препарата.

Разрешение обычной колоночной хроматографии ограничено негомогенностью матриксов (например, целлюлозы), что вызывает неравномерное протекание растворителя через колонку. Разработанные недавно хроматографические смолы (в основу которых обычно положен кремний) имеют форму мельчайших сфер от 3 до 10 мкм в диаметре, которые упакованы в специальный чехол и образуют гомогенную колонку. Такие колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ) обеспечивают высокий уровень разрешения. Поскольку частицы носителя в колонках для ВЖХ упакованы очень плотно, в отсутствие высокого давления скорость потока через них незначительна. По этой причине такие колонки обычно помещают в стальные цилиндры, соединенные со сложной системой насосов и шлангов, которые обеспечивают необходимое для высокой скорости протока давление.

В традиционной колоночной хроматографии скорость протекания через колонку может быть довольно низкой (примерно один объем колонки в час), таким образом, у разделяемых растворов достаточно времени для уравновешивания с внутренним содержимым крупных частиц матрикса. В условиях ВЖХ происходит быстрое уравновешивание растворов с внутренним содержимым крошечных сфер, так что растворы, обладающие различным сродством к матриксу, эффективно разделяются даже при высокой скорости потока. Таким образом, ранее для достижения плохого разделения с помощью колоночной хроматографии требовались часы, а в настоящее время благодаря ВЖХ качественное фракционирование занимает минуты. Вот почему именно этот метод чрезвычайно популярен сейчас для разделения и белков, и малых молекул.

Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их высокоскоростному центрифугированию. Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. Центрифугирование является, как правило, первым этапом фракционирования, с его помощью разделяются только значительно отличающиеся по размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций, необходимо гомогенат наслоить тонким слоем поверх солевого раствора.

При ультрацентрифугировании различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют отдельные полосы, которые можно выделить. Во избежание перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать инертный и хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно увеличивается сверху вниз, формируя градиент плотности. При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно выделить.

Скорость седиментации каждого из компонентов определяется его размерами и формой и обычно выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S. Скорость вращения до 80000 об/мин, так что на разделяемые частицы действуют силы, превосходящие силу тяготения более чем в 500000 раз. Под действием столь больших сил даже сравнительно небольшие макромолекулы, такие, как тРНК или простейшие ферменты, разделяются и распределяются в строгом соответствии со своими размерами. Измерение коэффициента седиментации макромолекулярных комплексов обычно используют для определения их общей массы и количества входящих в их состав субъединиц.

Ультрацентрифуга разделяет клеточные компоненты не только по массе, но и по плавучей плотности. В этом случае образец седиментирует в крутом градиенте, образованном высококонцентрированным раствором сахарозы или хлористого цезия. Компоненты клеток опускаются по градиенту до тех пор, пока не достигнут участка, плотность раствора в котором равна собственной плотности компонентов. Дальнейшей седиментации компонентов не происходит и они «застревают» на этом уровне. Таким образом в центрифужной пробирке возникает набор различных полос.

Метод центрифугирования в градиенте хлористого цезия был разработан в 1957 году для доказательства полуконсервативности репликации ДНК.

Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот.

Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется их суммарным зарядом, а также формой и размерами. В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза — электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе-полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе,содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент — додецил-сульфат натрия или ДСН (SDS).Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Каждая молекула белка связывает значительное количество молекул детергента, приобретая суммарный отрицательный заряд. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода.

Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку,во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие молекулы тормозятся значительно сильнее, чем малые, поэтому оказываются ближе к стартовой линии. Смесь молекул делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой.

Выявить эти полосы можно путем окрашивания соответствующим красителем. Например, белки индентифицируются красителем кумасси синим. Известно, что близко расположенные полосы в геле могут перекрываться. Этот эффект препятствует выявлению большого количества белков (не больше 50) с помощью одномерных методов их разделения.

Метод двумерного гель-электрофореза, в котором объединены две различные процедуры разделения, позволяет идентифицировать более 1000 белков. Результаты при этом получают в виде «двумерной» белковой карты.

При работе данным методом на первом этапе белки разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент-меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента-мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипептидных цепей; при этом изменения заряда цепей не происходит.

Диссоциированные полипептидные цепи разделяют затем методом изоэлектрического фокусирования, основанном на изменении заряда белковой молекулы при изменении рН окружающей среды. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлектрической точкой — значением рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, и, следовательно, белок не способен перемещаться под действием электрического поля. При изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в геле, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней.

Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза. На втором этапе гель, содержащий разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Неразделенными в результате остаются только те бели, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе; такое сочетание встречается очень редко.

источник

Что мы знаем о влиянии микроорганизмов? Ранее неизвестные науке мельчайшие существа, которые обладают биологической .

Особенности селекции микроорганизмов. В ряды микроорганизмов входят все прокариоты, и часть эукариот – грибы и водоросл.

Санитарное обследование, выбор точек отбора проб Основными объектами, территории которых подлежат контролю органов .

Вода является естественной средой обитания многих микробов. Основная масса микробов поступает из почвы. Количество мик.

Возбудитель бешенства относится к семейству Рабдови-русы. Семейство это включает вирусы бешенства, везикулярного стома.

Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот.

источник

Электрофорез оц- и дц-нуклеиновых кислот в неденатурирующих и денатурирующих условиях. Зависимость подвижности нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий электрофореза. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего образования

«НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МОРДОВСКИЙ

Факультет биотехнологии и биологии

Кафедра биотехнологии, биоинженерии и биохимии

«Электрофорез белков и нуклеиновых кислот»

202 группы направления подготовки 020501.65 Славкина О.А.

Проверил: канд., биол., наук, преподаватель кафедры биотехнологии, биоинженерии и биохимии И.В. Сюсин

Введение

1. Электрофорез нуклеиновых кислот
1.1 Электрофорез НК в неденатурирующих условиях. Зависимость подвижности оц — и дц — нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий э/ф (% и тип геля). Подвижность кольцевых молекул дц-ДНК, влияние на нееEtBr
1.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность
1.2.1 Щелочные гели
1.2.2 Денатурирующие гели с формамидом
1.2.3 Денатурирующие гели с формальдегидом.
1.2.4 Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем
1.3 Разделение цепей дц-ДНК электрофорезом: принцип и особенности электрофореза
1.4 Двумерный электрофорез нуклеиновых кислот
2. Электрофорез белков
2.1 Электрофорез в неденатурирующих условиях Параметр разделения
2.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. — Денатурация белка. Параметр разделения. — ПринципDISC-электрофореза (система буферов Орнштейна и Дэвиса, электрофорезSDS-денатурированных белков по Лэммли). Использование градиента концентрации геля, равноесный электрофорез
2.3 Изоэлектрофокусирование. — Принцип метода, параметр разделения. — Амфолины
2.4 Двумерный электрофорез белков
Заключение
Список использованных источников

Под действием электрического поля заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление носит название электрофореза. Скорость движения частицы (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность см 2 •с -1 •В -1 , а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ в аналитических или препаративных целях. Определение подвижности используется также для характеристики вещества.

Существуют три основных типа электрофоретических систем — электрофорез с подвижной границей (метод подвижной границы), зональный электрофорез и стационарный (или вытесняющий) электрофорез. В системах первого типа электрическое поле прикладывается к исходно резкой границе между раствором макромолекул и буфером. Скорость миграции заряженных частиц определяется путем наблюдения за перемещением этой границы. Если раствор содержит гетерогенную смесь ионизированных макромолекул, то можно увидеть множество движущихся границ. В такой системе индивидуальные компоненты нельзя разделить на отдельные зоны, так как наслоенный сверху буферный раствор имеет более низкую плотность по сравнению с находящимся под ним раствором макромолекул. Если бы и удалось достигнуть разделения зон, то все равно произошло бы их перемешивание, так как плотность раствора внутри этих зон была бы выше, чем между ними.

В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. Существует несколько способов получения стабильных зон. В свободном растворе зоны можно стабилизировать с помощью вращения или непрерывного потока тонкого слоя жидкости. В качестве среды для зонального электрофореза могут успешно применяться градиенты плотности. Но наиболее широко используемый вариант зонального электрофореза основан на применении пористой стабилизирующей среды, такой, как фильтровальная бумага, блоки гранулированного материала или различные гели.

Электромиграция третьего типа (стационарный, или вытесняющий, электрофорез) характеризуется тем, что через некоторое время после начала разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся два метода: изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т.е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза.

В составе нуклеиновых кислот имеется некоторое количество основных групп, эти соединения нельзя подвергать электрофорезу в виде катионов, так как при низких значениях pH высокомолекулярные нуклеиновые кислоты нерастворимы в воде. В нейтральной и щелочной средах молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, поскольку их заряд определяется диссоциацией фосфатных групп. Оливера и др. обнаружили, что в этом диапазоне значений pH электрофоретическая подвижность РНК и денатурированной ДНК в свободном растворе не зависит от их молекулярной массы. Такая закономерность объясняется постоянством отношения заряда молекулы к ее массе и указывает на то, что нуклеиновые кислоты невозможно разделить с помощью электрофореза с подвижной границей.

Для электрофоретического разделения различных полинуклеотидов используют эффект молекулярного сита, присущий целому ряду гелей. Детальные исследования показали, что посредством электрофореза в гелях можно получить данные о некоторых характеристиках молекул нуклеиновых кислот. Так, например, методом электрофореза можно определить молекулярную массу того или иного полинуклеотида и установить, является ли он рибо- или дезоксирибонуклеотидом. Кроме того, можно выяснить, состоит ли данная молекула из одной или двух полинуклеотидных цепей, а в случае ДНК определить, какую форму имеет молекула — линейную или кольцевую. Несмотря на существование более точных физических и химических методов определения указанных свойств, электрофорез в некоторых отношениях имеет преимущество перед ними. Оно состоит в том, что электрофоретические методы относительно просты, требуют сравнительно недорогого оборудования и могут быть использованы в тех случаях, когда для анализа доступно лишь небольшое количество неочищенного материала. Некоторые физические параметры разделенных нуклеиновых кислот изучают, не прибегая к их элюции из гелей. Фрагменты геля, содержащие анализируемые зоны, вырезали, промывали соответствующим раствором, вставляли в кварцевые трубки и с помощью спектрофотометра определяли изменения оптической плотности, вызванные нагреванием.

Перечисленные выше факты позволяют понять, почему, начиная с момента своего появления, электрофорез нуклеиновых кислот находит все более широкое применение в биохимии, генетике, вирусологии, микробиологии и других областях биологии.

1.1 Электрофорез НК в неденатурирующих условиях. Зависимость подвижности оц — и дц — нуклеиновых кислот от длины, выбор адекватных условий э/ф (% и тип геля). Подвижность кольцевых молекул дц-ДНК, влияние на нее EtBr

Электрофорез в агарозном геле — стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности. Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем — бромистым этидием в низкой концентрации.

Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется пятью главными параметрами, рассмотренными ниже.

Размер молекул ДНК. Молекулы линейной двухцепочечной ДНК перемещаются в геле предположительно одним концом вперед со скоростями, обратно пропорциональными десятичному логарифму их молекулярных масс (Таблица 1)

Концентрация агарозы. Фрагменты ДНК данного размера перемещаются в геле, содержащем разные концентрации агарозы, с разными скоростями. Между логарифмом электрофоретической подвижности ДНК m и концентрацией геля t существует прямая зависимость. Таким образом, применяя гели разных концентраций, можно разделить большой набор фрагментов ДНК, различиающихся по размеру (Таблица 2).

Конформация ДНК. ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформации, например кольцевая неповрежденная (форма I), кольцевая с одноцепочечным разрывом (форма II) и линейная (форма III), движутся в агарозном геле с разными скоростями. Относительная подвижность трех указанных форм зависит главным образом от концентрации агарозы в геле, а также и от таких факторов, как сила тока, ионная сила буфера или плотность сверхспиральных витков в форме I. В одних условиях форма I перемещается быстрее, а в других — медленнее, чем форма III.

ДНК (одно — и двухцепочечные) и РНК при ЭФ движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные той же длины. Поскольку молекулярная масса НК пропорциональна их длине (в парах нуклеотидов или в тысячах пар нуклеотидов), можно построить стандартную кривую зависимости расстояния, на которое перемещается маркерный фрагмент, от десятичного логарифма длины этого фрагмента. С ее помощью можно определять размеры фрагментов нуклеиновых кислот в данном препарате по расстоянию, на которое они перемещаются при электрофорезе.

Одноцепочечные молекулы ДНК с мол. массой от 1,2 млн. до 40 млн. можно разделять в 0,6% -ном агарозном геле при условии, что разница в молекулярной массе между молекулами составляет не менее 5%.

Подвижность двухцепочечных молекул ДНК почти не зависит от их молекулярной массы. С помощью электрофореза в агарозном геле можно также разделять комплементарные цепи ДНК бактериофагов.

Описан простой метод отделения линейных ДНК от открытых кольцевых. Перед полимеризацией геля препарат ДНК смешивают с раствором агарозы. В процессе гелеобразования кольцевые молекулы захватываются гелем, тогда как линейные молекулы остаются свободными и могут быть затем выделены путем электрофореза.

Чтобы однозначно определить конформацию ДНК, необходимо провести ее электрофорез в присутствии возрастающих концентраций бромистого этидия. С увеличением концентрации красителя число его молекул, связанных с ДНК, растет. При этом отрицательные сверхспиральные витки в молекулах формы I постепенно исчезают, а скорость движения ДНК в геле уменьшается. При некоторой критической концентрации свободных молекул красителя, когда в ДНК больше не остается сверхспиральных витков, скорость движения формы I достигает минимальной величины. Последующее добавление новых порций бромистого этидия приводит к образованию положительных сверхспиральных витков, в результате чего подвижность формы I начинает быстро возрастать. Подвижность формы II и формы III в описанных условиях снижаются, хотя и по-разному, вследствие нейтрализации зарядов и увеличения жесткости молекул ДНК под влиянием бромистого этидия. Для большинства препаратов ДНК, находящейся в форме I, критическая концентрация бромистого этидия находится в области 0,1 — 0,5 мкг/мл.

Напряженность электрического поля. При низких напряженностях скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. Однако с увеличением напряженности электрического поля подвижность фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой дифференциально возрастает. Следовательно, с увеличением напряженности область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается. Максимальное разделение фрагментов происходит при напряженности, и не превышающей 5 В/см.

Состав оснований и температура. Электрофоретическое поведение ДНК в агарозных гелях слабо зависит от состава оснований ДНК (Thomas, Davis, 1975) или температуры геля. В агарозных гелях в области температур от 4 до 30 о С изменения относительной электрофоретической подвижности фрагментов ДНК разного размера не наблюдается. Обычно электрофорез в агарозных гелях ведут при комнатной температуре. Однако следует отметить, что гели, содержащие менее 0,5% агарозы, очень мягкие, поэтому с ними лучше работать при 4 о С — в этих условиях они становятся более плотными [2].

1.2 Электрофорез в денатурирующих условиях. Денатурирующие агенты для денатурации ДНК и РНК. Разрешающая способность

Воспроизводимое фракционирование однонитевых молекул ДНК и РНК, а также определение их молекулярной массы по скорости миграции в геле оказываются возможными только при сохранении условий денатурации в ходе самого электрофореза. Поэтому во всех случаях, когда нет необходимости сохранить нативную структуру, нуклеиновые кислоты предпочитают фракционировать электрофорезом в денатурирующих условиях, или, как говорят, в «денатурирующих» гелях. Это означает, что внутри геля создается среда, препятствующая комплементарному спариванию одинарных нитей нуклеиновых кислот или их участков.

В некоторых случаях эта среда способствует распрямлению нитей, что делает зависимость скоростей миграции от значений длины полинуклеотидов более строгой, обеспечивает возможность их тонкого фракционирования и оценки молекулярной массы (сопоставлением с маркерами). Рассмотрим различные варианты электрофореза в денатурирующих гелях и их использование [1].

Вместо буфера в ПААГ и гелях агарозы можно использовать разбавленные водные растворы щелочи (0,02-0,03 М NaOH). Полимеризация акриламида в щелочной среде идет вполне успешно, но требует примерно трехкратного увеличения концентрации персульфата аммония и соответственно ТЕМЕД. На застывании раствора агарозы присутствие щелочи не сказывается. В щелочной среде благодаря электростатическому отталкиванию остатков фосфорной кислоты однонитевые ДНК и РНК не свертываются в клубки, а мигрируют в виде расправленных нитей. Жесткость таких нитей тем больше, чем они короче, подобно тому как это имеет место и для двунитевых молекул. При этом и скорость миграции однонитевых молекул оказывается приблизительно такой же, как у двунитевых, нативных молекул той же длины.

В щелочную среду обязательно надо вносить достаточное количество ЭДТА (2-3 мМ) для того, чтобы связать все остаточные Mg 2+ . В противном случае ионы магния «сшивают» нити нуклеиновых кислот и они даже могут выпадать в осадок.

Если исходный раствор нуклеиновых кислот был сильно забуферен, его надо предварительно подтитровать щелочью. Бромфеноловый синий в щелочной среде постепенно обесцвечивается, поэтому его следует вносить в исходный препарат непосредственно перед началом электрофореза. Еще лучше в качестве лидирующего красителя в этом случае использовать бромфеноловый зеленый. Он устойчив к воздействию щелочи, а по электрофоретической подвижности сходен с бромфеноловым синим.

Как и для нативной ДНК, при выбранной пористости геля скорость миграции денатурированной ДНК в щелочной среде становится независимой от молекулярной массы, если она превышает определенное значение. Это происходит тем раньше, чем мельче поры геля и чем выше напряженность электрического поля.

Электрофорез в щелочной среде, помимо оценки молекулярной массы, позволяет обнаружить однонитевые разрывы в исходных двунитевых структурах ДНК. Но в сильнощелочных значениях pH остатки гуанина и тимина приобретают отрицательный заряд. Это надежно обеспечивает невозможность ренатурации ДНК, но может сказаться на соотношении электрофоретических подвижностей разных молекул ДНК или двух комплементарных нитей одной молекулы, особенно если размеры — этих молекул невелики и различия нуклеотидного состава не усредняются [1].

Формамид является весьма сильным денатурирующим агентом. Он полностью разрушает вторичную структуру полинуклеотидов. Электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в гелях с формамидом зависит только от молекулярной массы, что открывает возможность ее определения С помощью маркеров и для высокомолекулярной РНК.

Акриламид хорошо полимеризуется в формамиде, давая несколько более мягкие гели, так что 4% -ный ПААГ в формамиде имеет примерно такие же механические свойства, как 2,5% -ный водный ПААГ. Вместе с тем и подвижность РНК в гелях на основе формамида выше, ием в обычном ПААГ такой же концентрации

Денатурацию нуклеиновых кислот успешно обеспечивает и более низкая концентрация формамида. Например, показано, что 3% -ный денатурирующий гель (С = 11) для электрофореза РНК можно готовить на 65% -ном водном формамиде. Электропроводность обеспечивал 0,02 М Na-фосфатный буфер, pH 7 [4].

Формальдегид легко реагирует с аминогруппами нуклеиновых оснований, давая их метоксипроизводные (Рисунок 1):

Эта реакция успешно конкурирует с образованием водородных связей по этим же аминогруппам, в результате чего формальдегид является сильным денатурирующим агентом для нуклеиновых кислот. Разумеется, нити нуклеиновой кислоты после денатурации формальдегидом оказываются модифицированными, однако эта реакция обратима — выдерживанием в воде при 60° можно удалить формальдегид и восстановить нормальную структуру нитей нуклеиновой кислоты, что видно, например, по восстановлению их способности к гибридизации.

Большую опасность представляет возможность образования прочных метиленовых мостиков между основаниями. Однако при 3% -ной концентрации формальдегида в рабочем буфере и сравнительно небольшой загрузке геля (4-5 мкг на трубку) метиленовые мостики не образуются. В цитируемой работе ПААГ, полимеризованный в 0,02 М Na-фосфатном буфере (pH 7) с 3% формальдегида, использовали для определения молекулярных масс фрагментов ДНК. В таком геле имеет место линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы ДНК и расстоянием ее миграции при электрофорезе. Использованный в этой работе 3% -ный (1 М) раствор формальдегида вполне обеспечивает денатурацию нуклеиновых кислот, хотя в последнее время нередко используют и вдвое большую концентрацию.

Ввиду его высокой концентрации формальдегид должен быть очень чистым. Следует работать со свежеприготовленным раствором формальдегида, без следов помутнения. Нейтрализовать раствор до pH 7 можно NaOH. Для приготовления денатурирующего геля на основе агарозы формальдегид добавляют к расплавленному водному раствору агарозы при 60° вместе с буфером [4].

Для полноты картины отметим, что нуклеиновые кислоты перед электрофорезом можно денатурировать и обработкой глиоксалем. При этом нет необходимости вносить глиоксаль в гель и вообще создавать в нем денатурирующие условия, так как денатурация глиоксалем в обычных условиях необратима. Глиоксаль прочно присоединяется по двум атомам азота гуанина (Рисунок 2):

электрофорез белок нуклеиновая кислота

Денатурацию глиоксалем ведут в пластмассовых пробирках с крышками в 0,01 М растворе Na-фосфата (pH 7), содержащем 1 М глиоксаль в 50% -ном диметилсульфоксиде, при 50° в течение 1часа [4].

Так, в работе [Garel et al., 1977] двумерным электрофорезом разделяли до 40 индивидуальных тРНК из суммарного препарата. В первом направлении (пластина 20X40X0,15 см) фракционирование вели в 9,6% -ном ПААГ, полимеризованном в обычном 0,089 М Трис-боратном буфере (pH 8,2) с 7 М мочевиной. Разделение происходило по длине молекул, полностью утративших свою вторичную структуру. Гель второго направления полимеризовали в таком же буфере, но мочевину добавляли лишь до концентрации 4 М. По-видимому, вторичная структура тРНК при этом частично восстанавливалась — в различной степени для разных индивидуальных тРНК. Концентрацию ПААГ во втором направлении соответственно увеличивали до 20%.

Особенности применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Исследование методом ЯМР комплексов нуклеиновых кислот с протеинами и биологических мембран. Состав и структура полисахаридов.

курсовая работа [3,5 M], добавлен 26.08.2009

Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).

презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014

Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая — ДНК, рибонуклеиновая — РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.

реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014

Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.

презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014

История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.

контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012

Распад нуклеиновых кислот, гидролиз. Классификация нуклеаз по месту и специфичности действия. Экзодезоксирибонуклеазы, рестриктазы. гуанилрибонуклеазы. Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Образование 5-фосфорибозиламина, присоединение глицина.

презентация [8,7 M], добавлен 13.10.2013

История изучения нуклеиновых кислот как биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды, функции и значение в жизнедеятельности организма. Правила Чаргаффа. Первичная и вторичная структура ДНК. Особенности репликации у эукариот, ее разновидности.

презентация [533,6 K], добавлен 05.11.2014

Механизм действия и модификация антисмысловых олигонуклеотидов. Физико-химические аспекты взаимодействия олигонуклеотида и РНК-мишени. Буферные растворы, использовавшиеся в работе. Электрофорез нуклеиновых кислот. Проведение полимеразной цепной реакции.

курсовая работа [1,3 M], добавлен 18.01.2013

Электрофорез как один из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии. Электрофорез белков в полиакриламидном и агарозном геле. Оборудование для проведения капиллярного электрофореза.

реферат [25,5 K], добавлен 31.08.2014

Клетка как элементарная единица строения и жизнедеятельности организмов. Молекулярная масса белков, методы ее определения. Классификация белков по степени сложности. Виды нуклеиновых кислот, их биологическая роль. Витамины в питании человека и животных.

контрольная работа [1,1 M], добавлен 17.10.2015

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

источник

Все живое на нашей планете состоит из огромного количества биологических молекул — ДНК, РНК, липидов, углеводов, — объединенных в сложные системы. Для того чтобы понимать, как эти системы работают, нам надо уметь разбирать их на отдельные компоненты — так получается гораздо проще. Если вы хотите узнать, как можно подойти к анализу сложных композиций биомолекул — читайте эту статью!

Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Партнер этой статьи — «Галахим»

«Галахим» специализируется на продаже, установке и сервисном обслуживании аналитических и препаративных хроматографов. Самый широкий в России ассортимент хроматографических колонок для ГХ и ВЭЖХ, сорбентов, пластин для ТСХ, фильтров и фильтровальной бумаги, реактивов, биохимических реагентов, микробиологических сред и стандартных образцов.

Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?

И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!

Основой жизни на нашей планете являются клетки, а каждая клетка состоит из огромного количества самых разных химических веществ — сложных и не очень [1], [2]. В химии живого есть несколько уровней сложности системы (рис. 1):

самый нижний уровень, представленный низкомолекулярными соединениями (неорганическими и органическими ионами, аминокислотами, липидами, моносахаридами, нуклеотидами);
средний уровень — биополимеров (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот) и их комплексов, включая и живую клетку как совокупность различных биологических молекул;
высшим уровнем сложности биологической системы оказывается живой организм, составленный из множества самых различных клеток (ну или одна клетка в случае одноклеточных организмов).

Рисунок 1. «Лестница масштабов»: каждый последующий объект крупнее предыдущего в 10 и более раз.

Для того чтобы исследовать химические процессы, связанные с жизнедеятельностью клетки и организма, необходимо уметь выделять из невероятного многообразия компонентов живого вещества то, что планируется исследовать, и уже с этим материалом работать дальше [3]. Собственно, появление вечно молодой бабушки современной молекулярной биологии — биологической химии (на заре ее становления она называлась физиологической химией), — стало возможным только после разработки методов выделения отдельных компонентов живого, для их исследования сперва in vitro, а потом и in vivo.

Разделение сложных смесей молекул и выделение из биологического материала отдельных его компонентов было известно человеку задолго до появления биохимии:

разделение молока на молочную сыворотку, содержащую белок, и на сливки, содержащие преимущественно жиры-триглицериды;
сворачивание молока сычужным ферментом в сыроварении с отделением от сыворотки практически всего белка — казеина;
получение крахмала из зерна и клубней картофеля отмыванием его от других компонентов исходного сырья;
выделение душистых масел из цветков, коры и плодов растений путем перегонки или экстракции жирами и маслами;
получение жира для мыловарения вытапливанием.

Все эти практические способы были методами выделения отдельных фракций тех или иных биологических молекул из природного материала. Кратко история развития методов выделения и разделения молекул суммирована на рисунке 2.

Рисунок 2. История развития методик очистки и разделения молекул. 1833 г. — открытие амилазы (диастазы), грубая очистка из солода (А. Пайен и Ж. Персо). 1842 г. — первая книга по химии живого (Ю. Либих). 1842 г. — расщепление гемоглобина (Й. Берцелиус). 1862 г. — кристаллизация гемоглобина (Ф. Хоппе-Зейлер). 1869–1871 гг. — выделение липидов и нуклеиновых кислот (Ф. Мишер). 1877 г. — термин «биохимия» (Э. Бюхнер). 1907 г. — открытие возможности брожения сахаров в бесклеточных системах (Э. Бюхнер). 1926 г. — кристаллизация первого фермента (уреазы) (Дж. Самнер). 1926 г. — изобретение и применение ультрацентрифуги (Т. Сведберг). 1955 г. — применение электрофореза для разделения белков (О. Смитис). 1956 г. — открытие гель-хроматографии (Дж. Порат и П. Флодин) [5], [12]. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Пожалуй, первое «настоящее» и хорошо документированное выделение индивидуального биологического компонента — белка гемоглобина (рис. 3) — предпринял основоположник физиологической химии, профессор Тюбингенского университета (Германия) Феликс Хоппе-Зейлер (1825–1895 гг.). В 1862 году он совершил прорывное открытие, впервые выделив из крови человека в чистом кристаллическом виде окрашенный дыхательный белок гемоглобин [4]. До этого он назывался просто «Blutfarbstoff» — «окрашивающее кровь вещество». Иенс Берцелиус (1779–1848 гг., Швеция), автор термина «органическая химия», до этого смог расщепить грубый препарат гемоглобина на органическое вещество глобулин, и на содержащий железо пигмент, способный связывать кислород.

Рисунок 3а. Гемоглобин — от структуры к кристаллу. Четыре субъединицы объединяются в компактную кубическую структуру.

Рисунок 3б. . — и посмотрите, как кристаллы гемоглобина снаружи напоминают молекулы, их составляющие!

Рисунок 3в. Кристаллы гемоглобина под микроскопом.

Хоппе-Зейлер характеризовал полученный им белок с различных сторон — например, впервые применив ранее предложенный Бунзеном и Кирхгофом спектроскоп для описания спектров поглощения гемоглобина как в чистом виде, так и в комплексе с различными физиологически значимыми газами (кислород, углекислота, угарный газ). Далее Хоппе-Зейлер измерил способность гемоглобина к специфическому связыванию кислорода, и подтверждил современную гипотезу тканевого дыхания, согласно которой газообмен в органах осуществляется через кровь посредством гемоглобина, предложенную ранее Юлиусом Лотаром Мейером (1830–1895 гг., Германия).

Чистые препараты нуклеиновых кислот впервые выделил сотрудник Феликса Хоппе-Зейлера Фридрих Мишер (1844–1895 гг.), ранее работавший с известным немецким химиком Адольфом Штрекером (1822–1871 гг.), специалистом в области органической химии, впервые синтезировавшим аминокислоту аланин из уксусного альдегида, аммиака и циановодорода. В 1869 и 1871 годах Мишер первым указал на то, что белки и липиды являются основными химическими веществами, составляющими цитоплазму клетки, и предпринял первую попытку классификации белков — однако не преуспел в этом из-за недостаточно развитых на тот момент методов анализа. При исследовании гистологически однородной популяции лейкоцитов из гноя он впервые выделил из этих клеток вещество, названное им «нуклеин», выпадавшее в осадок при добавлении кислот и растворявшееся обратно при добавлении щелочей (рис. 4).

Рисунок 4. Микропрепарат гноя человека. Ядерный материал лейкоцитов (ДНК и белки) окрашен в розово-синий цвет красителем азур II, вокруг лейкоцитов лежат лишенные ядра эритроциты. Как можно видеть, ДНК в гное очень много. Справа — поведение «нуклеина», комплекса ДНК и белков, в растворах кислоты (выпадение в осадок) и щелочи (растворение).

Это вещество представляло собой первый грубый препарат ДНК в истории человечества — а вернее, комплекс ДНК с белками (дезоксирибонуклеопротеид). «Согласно имеющимся гистохимическим данным, я предполагаю, что это вещество содержится в ядре клетки», — пишет Мишер, и далее фокусируется на ядре клетки — органелле, о которой тогда было известно очень мало. Нуклеин Мишера радикально отличался от всех известных на тот момент белков тем, что после осаждения не растворялся в воде, уксусной кислоте, разбавленной соляной кислоте и в растворах солей. Мишер разработал протокол выделения клеточных ядер выдерживанием клеток на холоде в растворах соляной кислоты и протокол экстракции нуклеина из ядер щелочами с последующим осаждением. После получения чистого нуклеина Мишер сделал ряд основополагающих открытий о ДНК — например, определил отношение фосфора к другим компонентам, оказавшееся весьма близким к нынешним данным (22,5% против 22,9%), установил природу ДНК как многоосновной кислоты, предположил, что нуклеин является носителем наследственных свойств [5].

Со времени исторических работ первых биохимиков методы выделения и разделения различных молекул, важных для биологии, претерпели значительные изменения, но в целом их содержание осталось примерно тем же. При работе с биологическим объектом первым этапом всегда оказывается разрушение тканей и их предварительное фракционирование [3]. При этом стоит задача максимально предотвратить разрушение целевых молекул, и избавиться от максимального количества загрязняющих примесей.

Для разрушения тканей применяют различные методы — механическую гомогенизацию (например, проворачивание материала в мясорубке), гомогенизацию ультразвуком (при которой клетки разрушаются кавитацией в растворе), продавливание через небольшое отверстие под высоким давлением, замораживание-оттаивание и др. (рис. 5). В среду для разрушения тканей добавляют различные защитные реагенты — например, бета-меркаптоэтанол для предотвращения окисления белков, ингибиторы ферментов (преимущественно гидролаз, разрушающих биополимеры или меняющих их свойства), а саму работу проводят на холоде для максимального снижения скорости действия ферментов в гомогенате.

Рисунок 5. Гомогенизация. Общая схема разрушения биологического материала для получения отдельных субклеточных фракций.

Для выделения макромолекул — белков и нуклеиновых кислот — наиболее часто используют механическую гомогенизацию. Ее можно осуществлять вручную или с помощью специальных устройств — гомогенизаторов.

Метод измельчения образца выбирают в зависимости от метода анализа и объекта исследования. При этом важно избежать перекрестной контаминации образцов, особенно если образец измельчается для последующего молекулярно-генетического анализа.

Например, для измельчения тканей насекомых, хрящей, опухолевого биоптата используют гомогенизаторы, работающие по принципу шаровой мельницы (например, FastPrep 24).

В гомогенизаторах этого типа к образцу добавляют специальные матриксы — шарики разного диаметра из твердых инертных материалов (металл, стекло, керамика, гранатовый или кварцевый песок). При интенсивной вибрации шарики ударяют по образцу, тем самым перемалывая его.

Измельчение происходит в стерильных пробирках объемом 2, 15 или 50 мл. Для предотвращения перегрева образца предусмотрено охлаждение образцов сухим льдом.

Преимущества FastPrep 24:

измельчение образцов в течение одной минуты;
одновременное измельчение до 24 образцов;
отсутствие риска перекрестной контаминации.

Для измельчения сухих образцов (например, семян) использует ножевые мельницы Tube Mill. Фактически это аналог кофемолки, но измельчение происходит в индивидуальной стерильной сменной камере, что позволяет избежать загрязнения образца. Данный вариант идеален при работе с сухими сыпучими продуктами (например, измельчении зерна или комбикорма для анализа на наличие ГМО).

Избежать перекрестной контаминации очень важно и при измельчении ультразвуком. Как правило, при использовании данного метода специальный стержень — зонд — погружают в образец, и здесь возникает высокая вероятность загрязнения образца. При длительном использовании наконечник погружного зонда разрушается, и на нем образуются микротрещины, где могут оставаться вещества, которые легко могут попасть в анализируемый образец.

Чтобы избежать кросс-контаминации, компания Qsonia разработала технологию опосредованного воздействия ультразвукового импульса на образцы.

Суть технологии проста: импульс от зонда, расположенного снизу, передается к образцу в пробирке опосредованно, через жидкость (воду), в которую помещена пробирка с образцом. Эта жидкость, помимо передачи импульса, осуществляет функцию термостатирования образцов, оберегая чувствительные макромалекулы от излишнего перегрева. Данное решение позволяет измельчать до 12 образцов одновременно в одинаковых условиях.

Конечно же это далеко не все варианты гомогенизаци. C другим оборудованием для измельчения образцов вы можете ознакомиться на сайте «Диаэм»:

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Следующим шагом разделения обычно оказывается центрифугирование (рис. 6). Дробное центрифугирование, при котором гомогенат подвергается действию всё бóльших центрифужных полей, позволяет не только отделить неразрушенные клетки, но и выделить отдельные интересующие исследователя компоненты клеток — например, ядра, митохондрии, рибосомы, мембраны. Центрифугирование существенно обогащает препарат целевыми молекулами, сильно упрощая последующие шаги по разделению сложнейшей смеси биокомпонентов, и может быть проведено для большого количества биоматериала — это очень важно для выделения минорных компонентов из смесей [6].

Рисунок 6. Центрифугирование. Вверху — устройство центрифуги. В зависимости от скорости вращения ротора и его размера центрифуга способна генерировать значительные ускорения. Роторы могут быть угловыми и бакет-роторами (с качающимися стаканами), они отличаются направлением действия центробежной силы. Внизу — схема дифференциального центрифугирования. В зависимости от силы приложенного поля мы можем получать различные фракции клетки — от самых крупных органелл (например, ядер), садящихся при небольших значениях относительного ускорения, до самых мелких (рибосом и пр.), осаждающихся большими ускорениями.

Рисунок 7. Ультрацентрифуга. Прибор, способный создавать в пробирках с биоматериалом огромные перегрузки — до 1 000 000 g. В таком центробежном поле можно осадить даже ионы, не говоря уже про крупные белки или органеллы клетки. Центрифужный ротор сделан из особо прочного материала (титана), камера охлаждается точным холодильником (для исключения конвекции образца), ротор вращается в глубоком вакууме (для предотвращения разогрева из-за трения о молекулы воздуха). Можно сказать, что образец летит на искусственном метеорите.

Центрифуги очень широко применяются как в промышленности (например, в молочной для отделения сливок от обрата или для разделения смесей твердых и жидких веществ), так и в лаборатории. Основные параметры центрифуги — максимальный объем вещества, помещающийся в ее ротор, и создаваемое ей центрифужное поле. Обычно это поле выражают как относительное центробежное ускорение — в единицах, кратных гравитационному показателю Земли g (ускорению свободного падения), и данная величина оказывается пропорциональна скорости вращения ротора центрифуги. Для разных целей применяют центрифуги с разными максимальными ускорениями — от сотен и тысяч g для разделения грубых смесей до сотен тысяч g для осаждения индивидуальных белков из раствора. Ультрацентрифуга (рис. 7), создающая высокие ускорения, была долгое время единственным способом определения молекулярной массы крупных белков — эта масса была пропорциональна скорости движения молекул белка в центрифужном поле.

Как вы можете догадаться, центрифугирование образцов на высокой скорости имеет ряд нюансов. В первую очередь — это обеспечение сохранности образцов, чувствительных к нагреву. Для предотвращения перегрева образцов из-за трения, ультрацентрифуги оснащают системами вакуумирования и охлаждения. Так что на выходе мы имеем весьма громоздкий напольный агрегат.

Но время и технологии не стоят на месте. Компания Thermo Fisher Scientific выпустила компактную настольную версию микроультрацентрифуги Sorvall MTX 150. Центрифуга дает 1 048 680 g, имеет встроенный компрессор для термостатирования образцов и при этом обладает весьма скромными габаритами и весом: габариты 582×590×408 мм; вес — 97 кг.

Другие виды центрифуг:

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

После центрифугирования препарат можно подвергнуть или экстракции отдельных интересующих исследователя химически близких групп компонентов (например, смесью эфира и метанола можно количественно извлечь из мембран липиды), или предпринять дальнейшие усилия по отделению примесей. Наиболее сложным вопросом при таком разделении оказывается разделение белковых смесей — необходимо выделить зачастую весьма немногочисленный компонент смеси, при этом он не должен потерять своей естественной биологической активности. Выделенный фермент должен работать не хуже, чем он это делает в клетке, выделенный фактор транскрипции должен хорошо и специфично связываться с ДНК, иными словами, выделенные белки должны оставаться нативными — такими же, как в живой клетке.

Рисунок 8. Высаливание белка. При определенном значении рН среды белки имеют различную растворимость в растворах неорганических солей — и, повышая содержание соли в растворе, мы можем переводить определенные белки из растворенного состояния в осадок, который потом отделять центрифугированием.

Для первичного разделения смесей белков можно применять различия растворимости белков в растворах солей. Феномен высаливания белка (рис. 8) известен давно — так, кристаллы яичного белка овальбумина добавлением насыщенного раствора сульфата аммония получил Франц Гофмейстер в 1890 году. То, что белки по-разному растворимы в растворах солей, активно используется и в промышленности — например, рассольные сыры делаются более плотными за счет засаливания в концентрированном рассоле. Если мы добавим к раствору белка насыщенный раствор хорошо растворимой соли — сульфата аммония, — достигнув, например, 10% насыщенной концентрации, то некоторые белки выпадут в осадок, то есть обратимо денатурируют. Если мы разведем этот осадок водой или не содержащей сульфата аммония буферной средой, осадок растворится, а белки из него вернутся от денатурированной к нативной конформации. Если мы будем повышать концентрацию сульфата аммония ступенчато, и всякий раз отделять осадок белка центрифугированием, мы сможем грубо фракционировать исходную смесь, а целевой белок обнаружить в определенной фракции по его свойствам, например, цвету или ферментативной активности. Именно возможность фракционирования белковых смесей высаливанием позволила разделить белки плазмы крови на фракции глобулинов (выпадающих в осадок при более низкой концентрации сульфата аммония) и альбуминов (остающихся в растворе белков меньшего, чем глобулины, размера), и именно высаливанием до сих пор пользуются для приготовления как отдельных фракций сывороточных белков для медицины, так и для выделения фракции иммуноглобулинов — антител [7].

Рисунок 9. Изоэлектрическая точка. Заряд белковой молекулы зависит от рН среды вокруг него — когда количество отрицательных и положительных зарядов у белковой молекулы равно, ее общий заряд равен нулю. Белковые молекулы в растворе перестают отталкиваться друг от друга, начинают слипаться и могут образовать осадок. Растворимость белка в изоэлектрической точке минимальна.

Белки и их смеси — особенно сложные для работы объектами, так как физико-химические свойства разных белков сильно отличаются друг от друга благодаря различному аминокислотному составу. Белки состоят из аминокислот, в боковой цепи которых могут встречаться полярные группы — например, кислотные или основные остатки. В зависимости от водородного показателя (рН) среды, в которой находится белок, то есть от кислотности среды, белок может иметь различный заряд, то есть белковая молекула может быть отрицательно заряжена в щелочной среде, иметь нулевой заряд в нейтральной среде и перезаряжаться (становиться положительно заряженной). Точка рН, соответствующая нулевому заряду белка, называется его изоэлектрической точкой (рис. 9), и белки в ней обычно имеют минимальную растворимость. Навязывая белку определенную кислотность среды, мы можем получить выпадение белка в осадок — и именно это заставляет скисшее молоко, в котором лактобактерии сбродили молочный сахар до молочной кислоты, разделяться на сыворотку и белковые сгустки. Изоэлектрическая точка основного белка молока, казеина, лежит как раз в области кислых значений рН.

Рисунок 10. Диализная очистка. Раствор высокомолекулярного вещества (белка, синие точки) и соли (красные точки) помещен в мешочек из целлофана (целлюлозной мембраны, поры которой пропускают ионы соли и задерживают крупные молекулы белка). Если такой мешочек поместить в раствор, не содержащий соли, то соль начнет выходить из мешочка через поры, а белок останется внутри. Примерно так устроены и наши почки — соль и низкомолекулярные продукты обмена уходят в мочу, а белки остаются в плазме крови.

При выделении отдельных макромолекул — ДНК, белков, полисахаридов — часто встает задача отделения от них низкомолекулярных примесей. Так, например, после высаливания белка необходимо удалить из осадка избыток сульфата аммония, одновременно переведя белок в нативное растворимое состояние. Если мы поместим наш осадок в мешочек из полупроницаемой мембраны (например, целлофана — химически обработанной целлюлозы, поры которой пропускают ионы соли и другие низкомолекулярные вещества, но слишком узки для больших молекул белка или ДНК), а сам мешочек опустим в дистиллированную воду или буферный раствор с небольшим содержанием соли, осадок начнет растворяться, а соль выходить в раствор снаружи мешочка. Так будет происходить до момента, пока концентрации соли по разные стороны мембраны не сравняются. Если мы будем менять раствор снаружи, мы сможем полностью удалить все низкомолекулярные примеси из препарата — они выйдут через поры мешочка, а биополимеры останутся внутри. Такой прием называется диализом (рис. 10) — и именно по этому принципу у нас работают почки, удаляющие из организма лишние соли, продукты азотистого обмена и другие низкомолекулярные вещества, но сохраняющие в организме все высокомолекулярные белки.

«Диаэм» предлагает широкий выбор продукции для диализа производства Thermo Fisher Scientific — диализные мешки, кассеты, флаконы, спин-колонки и др. Они предназначены как для диализа в классическом понимании, так и для концентрирования или обессоливания белковых растворов. Важная характеристика диализной мембраны — отсечка молекулярной массы (размера молекул, способных проходить через поры мембраны). Обычно она варьирует от 2 до 20 кДа. Объем образца может варьировать от 10 мкл до 500 мл — в зависимости от типа диализной емкости.

Емкость для диализа используют при работе с небольшим количеством образца, в диапазоне от 10 мкл до 2 мл. Кассеты для диализа необходимы, когда количество образца составляет от 0,5 мл до 30 мл. При больших объемах (от 150 до 250 мл) используют колбы для диализа. Планшеты для диализа предназначены для обработки от 1 до 96 образцов объемом от 10 до 100 мкл. Также в разделе представлены традиционные мешки для диализа в виде трубочек объемом от 2 мл до 9,6 мл.

Одно из популярных устройств для диализа — диализные кассеты Slide-A-Lyzer производства Thermo Fisher Scientific. В отличие от традиционных диализных мешков кассеты Slide-A-Lyzer не требуют зажимов и гарантируют отсутствие потери диализуемого образца из-за протечек. Кроме того, кассеты снабжены поплавком, удерживающим их в вертикальном плавучем положении при погружении в раствор.

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Смесь белков иногда можно весьма эффективно разделить и способами, при которых примесные белки денатурируют (рис. 11) — превращаются в нерастворимый осадок, а целевой белок остается в растворе. Например, если мы синтезируем в клетках кишечной палочки термостабильный белок, ген которого взят из живущих в горячих источниках архей (например, фермент ДНК-полимеразу из Thermus aquaticus, температурный оптимум которого находится около 72 °С), мы можем отделить практически 99% всех белков кишечной палочки от нужного нам белка, просто прогрев гомогенат клеток при 80 градусах. Не обладающие термостабильностью белки кишечной палочки денатурируют, а нужный нам рекомбинантный белок останется в растворе.

Рисунок 11. Различные способы денатурации белков. Тепловая денатурация белков при приготовлении пищи — так еда становится вкуснее, а денатурированный белок доступнее для пищеварительных ферментов. Механическая денатурация — взбивание белков — сродни тепловой, только происходит из-за механического «запутывания» белковых молекул. Высаливание — обратимая денатурация, рассмотренная ранее.

Рисунок 12. Гель-хроматография. Смесь белка (синие точки) и соли (красные точки) нанесена на колонку с носителем, поры которого не пропускают белок внутрь. При промывании колонки буферным раствором соль «застревает» в носителе, свободно диффундируя в его гранулы, а белок выходит, не задерживаясь. Так можно быстро и просто разделить как смеси белков и соли, так и смеси белков разного размера (подбирая диаметр пор носителя).

Важным способом разделения смесей биомолекул по размеру является гель-хроматография [8], или проникающая хроматография (рис. 12).

В 1959 году шведские ученые Порат и Флодин впервые предложили новый метод разделения сложных смесей белков по молекулярной массе, и это стало возможно благодаря полученному им новому материалу под торговой маркой Sephadex. Длинные линейные молекулярные цепочки полисахарида декстрана сшивали между собой так, что удавалось получить молекулярные сита — материал с контролируемым в широком диапазоне размером пор. Этот материал был доступен в виде гранул разного размера — от микрон до сотен микрон. Белки и другие биомолекулы не адсорбировались этим материалом и не теряли своей нативной активности. Материал замачивали в буферном растворе — гранулы набухали, поры заполнялись раствором и начинали напоминать маленькие поролоновые шарики.

Дальше ими наполняли длинную трубку с воронкой сверху и краном снизу, закрывали кран, и наносили сверху смесь биологических макромолекул. Крупные молекулы белка были слишком велики для того, чтобы проникнуть в поры молекулярных сит, ну а низкомолекулярные вещества (соли, витамины, коферменты, нуклеотиды) свободно диффундировали вглубь шариков сита через поры. Через воронку начинали пропускать буферный раствор, а из крана вытекал раствор, который до того был внутри шариков сита и между ними. Крупные молекулы, не вошедшие в шарики, двигались с раствором между шариками, в исключенном объеме, равном примерно объему жидкости между шариками, а низкомолекулярные вещества задерживались материалом колонки и выходили сильно позже — с объемом, примерно равным объему колонки, то есть с полным объемом. Так удалось отделить крупные молекулы от мелких (чем-то похоже на диализ, правда?), а при подборе размера пор у молекулярного сита удалось достичь и хорошего разделения смесей биомолекул на размерные классы — длинные участки ДНК от коротких, крупные белки от мелких. Этот метод до сих пор активно применяется и при определении молекулярной массы белков и ДНК — для этого колонку с носителем сперва калибруют по смеси белков или ДНК известного размера.

Рисунок 13. Ионобменная хроматография. Белки с различным зарядом наносят на колонку, содержащую заряженный определенным образом сорбент. Белки с противоположным заряду сорбента зарядом задерживаются в колонке, с одноименным зарядом — выходят из нее. Задержавшиеся белки можно снять с сорбента определенной концентрацией низкомолекулярной соли, растворенной в буферном растворе. Маленькие ионы соли, находящиеся в большом молярном избытке по сравнению с крупными белковыми молекулами белка, «сталкивают» их с сорбента в раствор, занимая их место.

Если взять похожий носитель с крупными порами, но сделать его поверхность заряженной положительно или отрицательно (например, химически присоединив к носителю различные заряженные группы — аминогруппу, сульфогруппу и пр.), можно использовать его для другого вида разделения — ионообменной хроматографии [9] (рис. 13). Например, ДНК, представляющая собой поликислоту, заряженную в нейтральных или щелочных условиях отрицательно, будет взаимодействовать с положительно заряженным носителем — анионообменником, связываясь с группами на его поверхности. При добавлении в систему избытка соли ее анионы будут конкурировать с ДНК за группы на носителе, и вытеснять ДНК из комплекса с носителем, причем соли потребуется тем больше, чем длиннее молекулы ДНК, связанные с носителем. Та же картина будет наблюдаться и с белками, заряженными отрицательно. Для связывания положительно заряженных белков необходим носитель с отрицательными группами на поверхности — катионообменник. Этот метод позволяет отсеять из сложной смеси молекулы, не имеющие в данных условиях заряда, или заряженные так же, как носитель — связывание окажется невозможным, и эти молекулы просто выйдут из колонки с носителем.

Партнером этой публикации является «Галахим» — компания, специализирующаяся на продаже, установке и сервисном обслуживании аналитических и препаративных хроматографов.

Говоря о хроматографии, невозможно не упомянуть высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) — наиболее эффективный метод разделения сложных смесей веществ, часто используемый в аналитической химии и химической технологии. Принцип жидкостной хроматографии основан на различии компонентов в их равновесном распределении между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элюент). Слово «высокоэффективная» подразумевает, что разделение ведется при высоком давлении (до 400 бар) и с использованием мелкозернистых сорбентов (обычно 3–5 мкм, но бывает и менее 2 мкм). Как правило, время анализа занимает от 3–5 до 30 минут, в зависимости от условий и анализируемой смеси.

Аналитическая ВЭЖХ применяется для качественного и количественного определения веществ. Но если задача шире, например, нужно выделить и очистить целевой продукт, а также иметь возможность масштабировать этот процесс вплоть до килограммов, на помощь может прийти препаративная хроматография. Ее активно применяют в молекулярной биологии и химии, в промышленном фармацевтическом производстве и для многих других задач, перечисленных в таблице.

Таблица. Области применения препаративной хроматографии

Масса вещества	Область применения
Микрограммы	Ферменты для молекулярной биологии
Миллиграммы	Биологические и биохимические тесты Характеристика структуры веществ (ЯМР, МС) Анализ побочных продуктов реакций Метаболиты биологических объектов Природные соединения для исследования
Граммы	Аналитические стандарты — наработка веществ Соединения для токсикологического скрининга Особо чистые вещества для исследований Выделение побочных продуктов реакций
Килограммы	Промышленное производство Фармацевтическая промышленность

Рисунок 14. Базовый принцип препаративной хроматографии на примере метода, предложенного Кларком Стилом. Колонка, заполненная песком и силикагелем, оснащенная также краником для дозирования элюата.

Препаративную хроматографию как метод впервые разработал в 1978 г. профессор Колумбийского университета У. Кларк Стил. Он же ввел в обиход термин флэш-хроматография (рис. 14) [10]. Эта методика позволяла ускорить процесс разделения даже относительно сложных смесей, но имела существенные недостатки, главные из которых:

самостоятельная упаковка колонок, приводящая к низкой воспроизводимости результатов;
необходимость переупаковки колонки для каждого нового процесса;
сложность ввода в колонку труднорастворимых образцов;
невозможность контроля разделения веществ, не поглощающих в видимой области спектра.

Большинство из перечисленных проблем к концу семидесятых годов успешно решалось классической ВЭЖХ. Но очистка вещества при помощи ВЭЖХ — всегда компромисс между получением желаемой чистоты вещества, объемом загрузки и производительностью хроматографической системы. Другие недостатки препаративной ВЭЖХ: высокая стоимость колонок и сорбентов, необходимость самостоятельной упаковки колонок большого объема, что может существенно влиять на воспроизводимость результатов.

Таким образом, к концу XX века образовался разрыв между недорогим, но не самым эффективным методом флэш-хроматографии, и эффективным, но весьма дорогостоящим методом препаративной ВЭЖХ. Французская компания Interchim SA (производитель материалов для хроматографии и твердофазной экстракции) успешно решает эту проблему, выпуская хроматографы серии puriFlash (рис. 15), выгодно отличающиеся от аналогичного оборудования других производителей. Идеология этих приборов основана на современной концепции Ultra-Performance Flash Purification (UPFP), то есть «Ультрапроизводительной флэш-очистки».

Рисунок 15. Устройство препаративного хроматографа puriFlash — блок управления, коллектор фракций, насос, камера смешения, детектор и другие элементы прибора отмечены на схеме. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Основное отличие UPFP от традиционной флэш-хроматографии заключается в использовании сорбентов со сферическими частицами малого размера, что максимально сближает такие материалы с сорбентами ВЭЖХ-качества. Применение в качестве хроматографических колонок пластиковых картриджей, уже заполненных сорбентом, позволяет существенно увеличить скорость потока элюента и снизить давление в системе. Это обеспечивает столь востребованную воспроизводимость процесса при смене картриджа. Кроме того, увеличение максимального давления в приборах PuriFlash до 250 бар позволяет работать и с металлическими препаративными ВЭЖХ-колонками.

Группа компаний «Галахим» осуществляет поставку, пуско-наладку и сервисное обслуживание препаративных хроматографов Interchim puriFlash и аналитического оборудования ЖХ/МС, ЖХ/МС/МС, ГХ/МС, ВЭЖХ-систем, спектрофотометров, спектрофлюориметров. В «Галахиме» большой выбор расходных материалов и реактивов от лучших производителей, а наши менеджеры всегда проконсультируют вас по продукции и подберут оптимальный вариант по критерию «цена-качество». Доставка по всей России!

Полезные ссылки на брошюры на русском языке: хроматографы Hitachi для ВЭЖХ и УВЭЖХ, флэш-хроматографы Interchim, специальные цены на расходные материалы для хроматографии для читателей «Биомолекулы»!

Материал предоставлен партнёром — компанией «Галахим»

Рисунок 16. Гель-электрофорез. Чем молекулы ДНК объемистее, тем сложнее им бегать — все как у людей!

Разделение смесей биомолекул в электрическом поле называется электрофорезом (рис. 16, 17, 18). Молекулы будут двигаться в сторону соответствующего полюса в поле постоянного тока, и скорость их движения будет зависеть как от степени их заряда, так и от их размера. Если мы поместим смесь биомолекул в буферный раствор и приложим постоянное напряжение, молекулы сперва начнут делиться, а потом немедленно перемешаются благодаря конвекции — водный раствор будет выполнять функции резистора, полностью рассеивая всю приложенную энергию электрического тока в виде тепла. Для предотвращения конвекции и в качестве молекулярного сита обычно используют гели агарозы (полисахарида, линейного компонента агара) или полиакриламида (полимеризованного амида простейшей непредельной карбоновой кислоты — акриловой).

Рисунок 17. Гель-электрофорез. На этом рисунке виден гель — молекулярное сито, «полоса препятствий» для заряженных молекул. Все молекулы ДНК будут двигаться по направлению к аноду, но скорость их движения будет различаться — чем молекула крупнее, тем труднее ей будет преодолевать препятствия.

Подбирая концентрацию этих веществ, можно получать гели с заданной величиной пор, оптимизируя их для разделения тех или иных смесей. В геле биомолекулы движутся со скоростью, пропорциональной их длине — чем мельче, тем быстрее, — и заряду. Такой вариант электрофореза хорошо подходит для разделения химически однородных смесей, содержащих молекулы одного типа, но разной длины — например, смеси фрагментов нуклеиновых кислот. ДНК будет двигаться в поле постоянного тока от отрицательного полюса к положительному, и ее движение можно видеть в ультрафиолетовом свете — после добавления в гель особого красителя бромистого этидия, комплекс которого с ДНК флуоресцирует ярко-оранжевым светом. Отдельные компоненты смеси разделяются на полоски, содержащие популяцию молекул одной длины. Гель напоминает по текстуре мармелад или студень — и нужную полоску можно вырезать из геля, а молекулы из нее исследовать другими способами.

Для смесей белков такой вариант электрофореза — нативный — подходит далеко не всегда: при том, что белки состоят из аминокислот, их заряд может существенно отличаться при различных значениях рН среды, да и форма/размер белков могут варьировать в широких пределах. Представим, что мы поместили в поле постоянного тока смесь белков с положительным, нейтральным и отрицательным зарядами. Каждый из заряженных белков пойдет к своему противоположному по заряду полюсу, а нейтральные незаряженные белки останутся на месте. Более того, крупные белки могут вообще оказаться крупнее пор геля и не войти в них, несмотря на свой заряд. Для того чтобы все белки стали заряжены одноименно, и превратились в частицы примерно одинаковой формы, мы можем обработать белок анионным детергентом — поверхностно-активным веществом додецилсульфатом натрия. Именно он является основой практически всех стиральных порошков и моющих средств для бытовых нужд. Белки под его воздействием разворачиваются и становятся похожи на ниточки, плотно облепленные молекулами додецилсульфата натрия, и заряд у этих ниточек оказывается отрицательным за счет сульфогруппы детергента.

Такие белки не будут обладать нативной биологической активностью — денатурируют, но будут разделяться в геле по размерам — скорость движения таких частиц пропорциональна их длине, и все белки пробы будут двигаться в электрическом поле строго в одном направлении, от катода к аноду. Такой вариант — денатурирующий электрофорез — активно применяется для анализа белковых смесей любой сложности (рис. 18). И в нативном, и в денатурирующем электрофорезе есть задача увидеть бесцветные белки, разделенные на геле. Обычно для этого используют органические красители — например, кумасси бриллиантовый синий, плотно связывающийся с белками и окрашивающий их в синий цвет, но отмывающийся от не содержащего белки геля. Синие белковые полосы на бесцветном фоне отлично читаются, и по стандартам молекулярной массы на том же геле можно определить примерную молекулярную массу неизвестного белка.

Рисунок 18. Схема проведения белкового гель-электрофореза. Белки денатурируют бета-меркаптоэтанолом, при этом они утрачивают все виды структуры выше первичной, превращаясь в отдельные ниточки — полипептидные цепи. Эти цепи оказываются плотно покрыты детергентом — додецилсульфатом натрия, молекулы которого маскируют собственный заряд белка. Таким образом, все белки пробы будут в электрическом поле двигаться к аноду.

Электрофорез широко применяют в качестве препаративного метода для выделения макромолекул заданного диапазона. При этом лаборант после идентификации нужной полосы на геле вырезает скальпелем нужный фрагмент и выделяет из него белки или нуклеиновые кислоты.

Метод не очень удобен тем, что весьма трудоемок и результат зависит от того насколько «тверда» рука лаборанта.

Компания Sage Science выпустила систему препаративного электрофореза белков и нуклеиновых кислот BluePippin. Принцип метода тот же, что и в классическом электрофорезе: движение макромолекул в геле, который заполняет тонкий Y-образный капилляр, от одного электрода к другому. Но в нужный момент направление тока меняется, и заданная фракция собирается в отдельной лунке.

Таким образом, лаборанту остается только внести образец в лунку, задать диапазон интересующих масс и дождаться, когда система соберет нужную фракцию в отдельную лунку.

Данная концепция стала довольно популярна в лабораториях генетического анализа (для подготовки библиотек ДНК/РНК с заданным диапазоном длин фрагментов), а также в лабораториях, где используют метод времяпролетной масс-спектрометрии при анализе белковых молекул.

Видео. Система BluePippin: принцип метода.

В последнее время все большим спросом пользуются готовые полиакриламидные гели для электрофореза белков. Преимущества готовых гелей:

экономия времени;
возможность выбора геля, оптимально отвечающего исследовательской задаче;
воспроизводимость результатов;
сведение к минимуму ошибок, связанных с человеческим фактором при заливке геля.

Выбор гелей велик. Ниже приведена схема, которая позволит выбрать подходящий гель для различных экспериментальных задач:

анализа низко- и высокомолекулярных белков;
нативного и денатурирующего электрофорезов;
изоэлектрофокусирования, двумерного электрофореза;
анализа протеиназ (узкоспециализированные гели).

Помимо готовых гелей и реагентов для их приготовления, «Диаэм» предлагает источники тока, камеры для вертикального и горизонтального электрофорезов, а также вспомогательные реагенты (буферные растворы и маркеры молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот, красители белковых гелей).

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Используя примерно одну и ту же схему эксперимента — колонку, наполненную носителем, через которую можно пропускать раствор разделяемой смеси и другие растворы, — можно получить еще несколько вариантов хроматографического разделения сложных смесей. Например, если на поверхность носителя нанесены специфичные к белку антитела, белок будет связываться с ними и оставаться на поверхности носителя, откуда потом его можно снять. Такой метод называется иммунохроматографией, и это один из вариантов аффинной хроматографии — хроматографии по сродству (рис. 19). Любое вещество, связанное с носителем, и способное взаимодействовать с целевым белком — лиганд, — в принципе можно использовать для выделения целевого белка из смесей [11]. Гликопротеины (белки, содержащие углеводную часть) могут быть выделены на носителях, покрытых лектинами — белками, узнающими углеводы. Ферменты можно выделять по связыванию с иммобилизованными на носителе субстратами этих ферментов.

Рисунок 19. Аффинная хроматография. Колонка наполнена сорбентом, покрытым веществом, которое способно узнавать интересующую нас молекулу, или самими интересующими нас молекулами — смотря что мы хотим выудить из пробы. После пропускания через колонку смеси веществ в ней задержится только то, что способно специфически связаться с сорбентом. Потом это вещество можно снять с колонки или высокой концентрацией соли, или другим значением рН среды, или денатурантом — условиями, нарушающими специфическое сродство связанной молекулы и сорбента.

Практически любое исследование в биомедицинской области включает в себя то или иное разделение сложных смесей биологических молекул. Разберем диагностику инфекционного заболевания, вызванного патогенными микробами, по шагам (рис. 20).

Взятие пробы у пациента. Биологический материал из области воспаления тщательно измельчают, смешивают с инактивирующим бактерии реагентом, а затем растворяют содержащиеся в нем клетки (патогена и пациента) так, чтобы ДНК из клеток перешла в раствор.
Выделение ДНК. Для выделения ДНК к лизированному препарату биоматериала добавляют носитель, специфично связывающий ДНК. Носитель несколько раз отмывают от прочих компонентов пробы, не связавшихся с ним, и снимают ДНК с его поверхности.
Амплификация ДНК. Фрагменты ДНК патогенного микроба специфически амплифицируют с помощью ПЦР, получая фрагмент ДНК определенной длины. В реакции параллельно участвует положительный контроль — ДНК патогена — и отрицательный контроль, не содержащий ДНК (он нужен для контроля чистоты реагентов).
Электрофорез ДНК. Полученные продукты ПЦР разделяют гель-электрофорезом и анализируют результат. Наличие в продуктах ПЦР фрагмента ДНК, соответствующего ожидаемой длине и совпадающего по длине с фрагментом, полученным амплификацией с ДНК патогена (положительным контролем), подтверждает наличие ДНК патогена в исследуемой пробе.

Рисунок 20. Схема определения методом ПЦР наличия ДНК патогенного микроорганизма в пробе биоматериала пациента. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

В этом простейшем исследовании применяются два приема разделения смесей биомолекул — сперва для выделения ДНК, а потом для анализа продуктов ПЦР. Любой биомедицинский анализ включает в себя разделение смесей на этапе подготовки пробы, а далее на этапе получения данных. Возможны комбинации самых разных подходов к разделению смесей биомолекул, и каждый новый вариант таких систем немедленно включается в практику исследований.

Несмотря на почтенный возраст большинства методов разделения сложных смесей биологических молекул, эти методы нисколько не утрачивают своей актуальности. Развитие новых методов исследования, способных работать в микромасштабе, разработка новых приборов для анализа сделает разделения быстрее и удобнее, и позволит прийти к созданию новых диагностических и терапевтических приборов и подходов. Совершенству не может быть предела.

На основе статей спецпроекта мы решили сделать календарь «12 методов биологии» на 2019 год. Эта статья представляет январь.

источник