Молекулярная биология метод электрофореза

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

источник

Электрофорез является движением дисперсных частиц относительно жидкости под действием пространственно-однородного электрического поля.

Электрофорез представляет собой метод, используемый в области молекулярной биологии для отделения частей молекулы ДНК. Это движение частиц в электрическом поле к одному из двух электрических полюсов. Он находит применение в биохимии и медицине для разделения высокомолекулярных соединений на фракции с различной молекулярной массой.

Впервые этот метод был использован в $1809$ году в Московском государственном университете.

Лекарственный электрофорез это комбинированное (одновременное) использование постоянного тока, в основном гальванического тока, а также небольшого количества препарата или комбинации препаратов.

Основное значение в терапевтическом механизме этого метода принадлежит току, который, также, повышает чувствительность тканей к действию лекарственных средств. Характеристики терапевтического действия лекарственных средств электрофореза включают:

Попробуй обратиться за помощью к преподавателям

возможность концентрации эффекта на поверхности определенной части тела, например суставе;
длительность действия процедуры сохраняется в течение нескольких дней;
исключено негативное влияние препаратов на органы пищеварения;
введение лекарственного средства в организм в виде ионов, то есть в активной форме.

Принимая во внимание, что ведущее значение в этом методе принадлежит току, основными показаниями для лекарственного электрофореза, а также гальванизации, являются местные и региональные патологические процессы.

Препараты выбираются по тем же основаниям. Системное действие этих методов, можно ожидать, главным образом во время функциональных нарушений вегетативно-сосудистых заболеваний.

Показания к физиотерапии весьма широки. Они определяются фармакотерапевтическими характеристиками вводимых препаратов. Терапевтичсекий электрофорез применяется при заболеваниях центральной и периферической нервной системы, опорно-двигательного аппарата, гинекологических заболеваний и т.д.

Задай вопрос специалистам и получи
ответ уже через 15 минут!

Гель-электрофорез (Электрофорез ДНК) это метод разделения и анализа макромолекул (ДНК, РНК и белков), а также их фрагментов, в зависимости от их размера и заряда. Он используется в клинической химии для разделения белков с помощью заряда или размера, а также в области биохимии и молекулярной биологии, чтобы отделить смешанную популяцию ДНК и РНК фрагментов по длине, чтобы оценить размер ДНК и РНК фрагментов или отдельных белков по заряду.

Проще говоря, электрофорез представляет собой процесс, который позволяет проводить сортировку молекул в зависимости от размера.

Термин » гель » в данном случае, относится к матрице, используемой, чтобы сдерживать, а затем отделять молекулы — мишени. В большинстве случаев, гель представляет собой сшитый полимер, состав и пористость выбирается в зависимости от удельного веса и состава мишени для анализа. При разделении белков или небольшие нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК) гель обычно состоит из различных концентраций акриламида и поперечно-сшивающего агента.

Электрофорез определяется электродвижущей силой (ЭДС), которая используется для перемещения молекулы через гелиевую матрицу.

Фонофорез является метод использованиея ультразвука для улучшения доставки применяемых препаратов. Фонофорез используют в целях повышения абсорбции местного применения анальгетиков и противовоспалительных средств, с помощью терапевтического применения ультразвука.

Была доказана неэффективность этого метода для некоторого вида лечения.

Так и не нашли ответ
на свой вопрос?

Просто напиши с чем тебе
нужна помощь

источник

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Национальный исследовательский университет

Новосибирский государственный университет

Факультет естественных наук

Задания к семинарским занятиям по молекулярной биологии

Учебно — методическое пособие

Предлагаемое учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-го курса биологического отделения факультета естественных наук и медицинского факультета. Оно содержит: краткое описание базовых молекулярно-биологических методов, примеры решения задач и задачи для самостоятельного решения, справочные таблицы.

В данном пособии используются материалы из следующих источников:

Уилсон Дж., Хант Т. Молекулярная биология клетки: Сборник задач: Пер. с англ. — М.: Мир, 1994

В. М. Глазер А. И. Ким, Н. Н. Орлова, И. Г. Удина, Ю. П. Алтухов. Задачи по современной генетике. Книжный дом «Университет». 2008

С. Примроуз, Р. Тваймен Геномика. Роль в медицине. Бином. Лаборатория знаний. 2008.

М. Сингер, П. Берг Гены и геномы (в 2-х томах) М. Мир. 1998

Мусил Я., Новикова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах — М.: Мир, 1984

Коничев А.С., Цветков И.Л., Попов А.П., и др.Практикум по молекулярной биологии. М.: КолосС, 2012

Wilson J, Hunt T. Molecular Biology of the Cell 5E — The Problems Book. NY. Garland Science — Taylor & Francis Group. 2008.

Составители: Доцент Колесникова Т.Д., ассистент Зайцева О.О.

Учебно-методическое пособие подготовлено в рамках реализации Программы развития НИУ-НГУ

Часть 1. Методы молекулярной биологии

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК

Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК, таких как выделение, рестрикция, ПЦР, молекулярное клонирование, наиболее часто используют электрофорез.

Электрофорез– метод разделения макромолекул (в том числе молекул и фрагментов ДНК) в геле по размеру и заряду в постоянном электрическом поле. Существует два вида электрофореза – горизонтальный и вертикальный.

Рис. 1. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле.

Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя, например бромида этидия.

Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода к аноду. На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов. Агарозный гель – пористая структура, и увеличение концентрации агарозы в геле приводит к уменьшению размеров его пор и, соответственно, к снижению скорости движения макромолекул сквозь гель. Увеличение напряженности электрического поля ускоряет движение молекул. Заряд молекулы увеличивается пропорционально ее длине, но при этом пропорционально длине увеличивается и ее масса. Поэтому ключевым фактором, определяющим скорость движения молекул в геле является способность молекул «протискиваться» через поры геля. Разделение молекул основано на том, что электрофоретическая подвижность молекулы ДНК снижается с увеличением ее длины. Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с одинаковой скоростью. Подвижность суперспирализованных и просто кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера.

При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в один из карманов геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с известными значениями молекулярных масс – как правило, это ДНК известной плазмиды или фага, порезанная определенной рестриктазой, но это могут быть и искусственно синтезированные фрагменты).

Рис. 2. Один из стандартных маркеров молекулярного веса (плазмида pR322, рестриктаза BsuR I).

Рис. 3 Электрофоретический гель, окрашенный бромидом этидия. На левой дорожке нанесен маркер молекулярного веса

Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например, бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза.

Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в двуцепочечные молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания электрофореза гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254-400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра, при этом становится видна ДНК.

Для вертикального гель-электрофореза используют полиакриламидный гель (ПААГ). Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью.

Рестрикционный анализ

Рестрикция – процесс расщепления чужеродной молекулы ДНК под действием специфических бактериальных ферментов – эндонуклеаз рестрикции или рестриктаз.

Эндонуклеазы рестрикции — это бактериальные ферменты, которые расщепляют молекулы ДНК внутри участков с определенной последовательностью. Фермент расщепляет обе цепи ДНК, причем одноцепочечные разрывы могут располагаться точно друг против друга (образуются «тупые» концы) или с некоторым смещением друг относительно друг друга (образуются «липкие концы»).

Рис. 4. «липкие концы», образующиеся в результате гидролиза ДНК рестриктазами BamH I и Pst I.

Эндонуклеазы рестрикции являются незаменимым инструментом молекулярного биолога, поскольку позволяют делить большие молекулы ДНК на заранее известные фрагменты

Репортерные гены.

Гены флюоресцентных белков. Продукт некоторых репортерных генов можно непосредственно наблюдать в клетках и по его наличию судить о присутствии в клетке рекомбинатного вектора. Такими репортерными генами могут быть гены флюоресцентных белков, излучающих свет при облучении ультрафиолетом.

Гены устойчивости к антибиотикам.Во многих плазмидах, обнаруженных в природе, закодированы гены, позволяющие бактериям противостоять воздействию различных антибиотиков. Это свойство можно использовать для селекции трансформированных клонов.

С помощью генов устойчивости к антибиотикам можно отобрать не только клоны, несущие вектор, но именно те колонии, которые содержат вектор со встройкой. Это очень полезный метод, так как эффективность лигирования вектора со встройкой не всегда стопроцентная, и часть клеток может получить плазмиду, которая зашилась сама на себя и не несет встройки. Для этого в векторе должно содежаться два гена устойчивости к разным антибиотикам, например к ампициллину и хлорамфениколу. Обычно такие гены обозначают Amp re и Chlo re . В одном из этих генов должен находиться сайт рестрикции, по которому происходит встройка целевого фрагмента. Сначала бактерии необходимо высеять на среде, содержащей ампициллин. Выжить на ней смогут только те колонии, которые содержат вектор с геном Amp re . Затем, при помощи бархатной печатки отпечаток колоний переносят на среду с хлорамфениколом. Поскольку в плазмидах, несущих целевую встройку, ген Chlo re нарушен, на этой среде они расти не смогут. Таким образом можно определить, какие колонии несут вектор со встройкой.

Также часто пользуются удобной репортерной системой X-gal/LacZ (в частности, она реализована в популярной плазмиде pBluescript). В таких векторах присутствует ген LacZ, кодирующий фермент β-галактозидазу. Этот фермент взаимодействует с бесцветным полисахаридом X-gal с образованием продукта, окрашенного в ярко-синий цвет. Cайт для внедрения встройки располагают в гене LacZ. Следовательно, те колонии, которые при выращивании на среде, содержащей X-gal, окажутся неокрашеными, несут встройку, поскольку встройка сбивает рамку считывания гена β-галактозидазы. Однако, следует помнить, что длина встройки в парах нуклеотидов не должна быть кратна трем.

Также наличие целевой встройки можно оценить при помощи ПЦР. Для этого необходимо иметь праймеры, располагающиеся по краям встройки. Плазмидную ДНК для анализа можно получить все лишь прикоснувшись носиком пипетки к колонии. Размер ПЦР-продуктов на электрофорезе говорит о длине встройки.

Рис. 7. Стандартный плазмидный вектор

Рис. 8. Типичный вектор, сконструированный на основе фага М13. Цифрами отмечены разные гены фага (гены 2 и 5 ответственны за репликацию, остальные детерминируют образование капсида и сборку). Светлый овал — область начала репликации; некодирующий участок выделен цветом. В некодирующую область фагового генома встроена часть lас-оперона E. coli. Затем в ген lacZ встроен сегмент длиной 42 п.н., содержащий несколько сайтов для эндонуклеаз рестрикции (полилинкер, или мультиклонирующий сайт).

Прежде чем клонировать специфическую генную последовательность, ее необходимо выделить из природных источников. ДНК может быть выделена из различного материала: свежего, замороженного, сушенного, фиксированного и т.д. В каждом случае подбирается соответствующий метод. Методы выделения ДНК могут значительно отличатся деталями, однако любой из них включает три стадии: 1. Гомогенизация 2. Обработка детергентом (лизис клеточных мембран) 3. Очистка ДНК.

Таким образом происходит выделение тотальной ДНК, то есть, интересующие исследователя индивидуальные последовательности ДНК (например, индивидуальные гены) «разбавлены» миллионами не относящихся к ним фрагментов ДНК.

Одним из подходов к решению этой проблемы является первоначально тотальное клонирование всех выделенных фрагментов генома – создание библиотеки ДНК. Затем проводится скринингбиблиотеки (то есть, поиск в ней колоний, соответствующих интереующим участкам генома).

Такой скрининг можно осуществлять путем гибридизации с использованием меченого ДНК-зонда. Этот метод выявления нужного клона в библиотеке основан на способности зонда узнавать определенную комплементарную последовательность. Подходящие зонды или праймеры могут быть выбраны на основании данных о структуре частичных клонов данного гена, родственных генов из других организмов, консенсусных последовательностей, характерных для определенного семейства генов, или аминокислотных последовательностей белков.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод амплификации (умножения числа копий) фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно быстро и избирательно получить миллионы копий определенных (целевых) нуклеотидных последовательностей.

В ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактарии Thermus aquaticus (Taq-полимераза), которая в присутствии четырех видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дСТФ, дТТФ) и коротких 20-30членных затравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностей ДНК. В качестве матрицы для ПЦР можно использовать тотальную ДНК, полученную из исследуемого материала.

В ходе ПЦР проводят термическую денатурацию двуцепочечной молекулы ДНК про 93-95 °С, после чего пробы охлаждают примерно до 60 °С, хотя оптимальная температура отжига (т. е. возникновения комплементарных взаимодействий между праймером и матрицей) различных праймеров отличается), что дает возможность праймерам связаться с одноцепочечной (в результате денатурации) ДНК. Праймеры подстраиваются по комплементарному принципу к гомологичным участкам «материнской» ДНК и служат для двух целей: запускают работу Taq-полимеразы и одновременно ограничивают участок синтеза ДНК. ПЦР имеет циклический характер. В первом и частично во втором цикле образуются копии (ампликоны), не соответствующие границам амплифицируемого гена. Начиная с третьего цикла длина большинства ампликонов становится стандартной, т.е. соответствует числу пар нуклеотидов ДНК-матрицы между 3’ концами праймеров. Ампликоны накапливаются в геометрической прогрессии, так как синтезированные ампликоны в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Повторяя циклы амплификации 30-40 раз, можно за 1,5-3 ч получить миллионы копий гена (2n, где n – число циклов амплификации).

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

· Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.

· Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

· Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

· Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин

Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Рис. 9. Принцип полимеразной цепной реакции. Двухцепочечную ДНК-матрицу денатурируют (разделяют на отдельные цепи), и проводят отжиг с двумя праймерами. Праймеры присоединяются к противоположным цепям навстречу друг другу, определяя границы целевого амплифицируемого фрагмента. В процессе достройки праймеров происходит копирование участка ДНК, расположенного между двумя праймерами, и в результате количество матрицы удваивается. Цикл реакций денатурации матрицы, отжига и удлинения праймеров повторяется 25—30 раз. При избытке праймеров и других компонентов реакции после 25 циклов теоретически может получиться более 8 млн копий фрагмента.

ПЦР — очень быстрый, чувствительный и производительный метод. Его можно использовать для получения больших количеств специфических фрагментов ДНК, исходя из очень малых количеств исходного материала, причем не обязательно хорошо сохранившегося. Однако копирование с помощью ПЦР в целом менее точное, чем клонирование в клетках, потому что ДНК-полимеразы, используемые в этой процедуре, имеют склонность к ошибкам. Стандартный метод ПЦР пригоден для амплификации фрагментов длиной только до 5 тыс. п. н., в то время как специальные векторы для клонирования позволяют умножать фрагменты ДНК длиной несколько сотен тыс. п. н.

Рис. 10. Метод Саузерн-блоттинга. Сложную смесь молекул ДНК (кДНК, расщепленная геномная ДНК), содержащую интересующую последовательность, подвергают электрофоретическому разделению и переносят на мембрану капиллярным блоттингом. Для этого на поверхность геля помещают мембрану, затем сверху плотно прижимают несколько слоев фильтровальной бумаги, так что буфер, проходя через мембрану, одновременно переносит на нее ДНК. Обычно используют щелочной буфер, так что ДНК денатурирует на отдельные цепи. Иммобилизованную ДНК гибридизуют с меченым зондом, узнающим целевую последова-тельность. В результате детекции на мембране обнаруживают единственную полосу или набор полос, соответствующих только интересующим фрагментам ДНК.

Гибридизация in situ позволяет определить, в каком сегменте хромосомы расположен соответствующий маркер. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) позволяет одновременно картировать несколько различно окрашенных маркеров ДНК, а гибридизация в период интерфазы — определить порядок маркеров в отдельных участках хромосомы. С помощью этого метода удается надежно выявить хромосомные аномалии

Препараты фиксированных хромосом гибридизуют (инкубируют при повышенной температуре с последующим охлаждением) с исследуемыми последовательностями нуклеотидов, меченными радиоактивной, флуоресцентной или иной меткой. После отмывания несвязавшейся метки оставшиеся меченые молекулы нуклеиновых кислот оказываются ассоциированными с участками хромосом, содержащими последовательности, комплементарные исследуемым меченым последовательностям нуклеотидов. Полученные гибриды анализируют с помощью микроскопа либо непосредственно, либо после авторадиографии. Для этой группы методов характерна более высокая разрешающая способность, чем для гибридизации соматических клеток , поскольку они позволяют локализовать изучаемые последовательности нуклеотидов на хромосомах.

Рис. 12

Обратная транскрипция

Обратная транскрипция – процесс ферментативного синтеза ДНК на матрице РНК, который катализируется ферментом обратной транскриптазой (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза).

Обратная транскриптаза ретровирусов обладает тремя активностями: РНК-зависимая ДНК-полимеразная, ДНК-зависимая ДНК-полимеразная (обеспечивает синтез второй цепи ДНК), активность РНКазыН (гидролизует РНК в составе ДНК/РНК дуплексов).

Реакцию обратной транскрипции применяют при создании кДНК библиотек – препаратов кДНК, полученных после обработки обратной транскриптазой тотальной РНК, выделенной из определенного организма, органа или ткани, с олиго(дТ) праймерами (комплементарны поли(А) хвосту мРНК). В результате получаются одноцепочечные ДНК-копии всех матричных РНК, по качественному составу и количеству которых можно судить об уровне экспрессии каких-либо генов. Кроме того, размер и первичная структура кДНК при сравнении с соответствующей последовательностью в геномной ДНК, позволяет выявить в ней некодирующие последовательности (интроны).

Рис. 13. Схема обратной транскрипции с использованием олигоТ праймера

Полученную суммарную кДНК можно использовать в ПЦР со специфичными праймерами для получения целевого продукта, для получения библиотеки, клонирования-секвенирования и получения базы данных экспрессирующихся последовательностей – EST (expressed sequence tags), а также для исследования уровня экспрессии тех или иных генов. кДНК используется для техники микроэрреев или биочипов. Сравнение экспрессии генов в разных тканях (здоровых и раковых; на разных стадиях развития; и т.д.) позволяет выявлять различия в экспрессии тех или иных генов, проследить изменения профиля экспрессии генов на разных стадиях развития, выявить возможные мишени для дальнейшей разработки лекарств.

Рис. 15. Электрофорез белков в полиакриамидном геле. Разделение по молекулярному весу.

Изоэлектрическое фокусирование или изоэлектрофорез прменяется для разделения белков по их электрическому заряду.

Аминокислоты содержат по меньшей мере две ионизируемые группы: карбоксильную группу с pK лежащим между 1,7 и 3, и α-аминогруппу с pK около 10. В растворе с pH между 4 и 9 аминокислоты существуют в виде цвиттер-иона, в котором и и амино- и карбоксильная группы ионизированы. Кроме этих двух групп в состав некоторых аминокислот входят и другие группы, способные к ионизации, как, например, еще одна NH₂-, или еще одна COOH-, имидазол, ОН-, SH-группы и др.

Например, при физиологическом значении pH ионизованы обе NH2- группы и COOH-группа лизина, что приводит к появлению небольшого положительного заряда молекулы. При том же pH аспарагиновая кислота имеет небольшой отрицательный заряд , вызванный диссоциацией двух карбоксильных групп.

Как и аминокислоты, белковые молекулы в водных растворах заряжены, и величина заряда зависит от pH.

Кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда называется изоэлектрической точкой (pI). Растворимость амфотерных молекул, как правило, является минимальной при pH равной или близкой к изоэлектрической точке pI. Часто они в своей изоэлектрической точке выпадают в осадок. Этим свойством и пользуются при изоэлектрическом фокусировании.

Изоэлектрофокусирование проводят в буфере, который содержит зоны с разным pH. Белок, который находится в рН-зоне ниже собственной изоэлектрической точки, будет положительно заряжен и будет перемещаться к катоду. Белок, находящийся выше своей изоэлектрической точки, будет заряжен отрицательно и будет двигаться к аноду. В результате перемещения заряд молекулы будет приближаться к нулю, а перемещение — замедляться. В конце концов белок войдет в зону рН равного его изоэлектрической точке и станет нейтральным, и больше двигаться в электрическом поле не будет. Таким образом, белки образуют четкие полосы, и каждый белок будет располагаться в градиенте значений рН в соответствии с изоэлетрической точкой.

Изоэлектрическое фокусирование позволяет, в том числе, детектировать такие посттрансляционные изменения в структуре белка, которые изменяют заряд молекулы, такие как, например, фосфорилирование и гликозилирование.

Возможно проведениедвумерного электрофореза,при котором белки сначала разделяют по изоэлектрическим точкам, а затем в перпендикулярном направлении по молекулярной массе с помощью электрофореза в акриламидном геле (Рис. 16).

Рис. 16. Изоэлектрическое фокусирование белков

Рис. 17. Двумерный электрофорез белков. Сначала проводится изоэлектрофокусирование, затем разделение по молекулярной массе в другом направлении.

Иммунодетекция белков

Для детекции определенного белка в образце можно пользоваться методом, по своей логике аналогичным блоттингу нуклеиновых кислот — т. н. Вестерн-блоттингом. В основе этого метода лежит специфическое комплиментарное взаимодействие антиген-антитело.

Антитела (иммуноглобулины) — это особый класс гликопротеинов, присутствующих на поверхности В-клеток в виде мембраносвязанных рецепторов и всыворотке крови и тканевой жидкости в виде растворимых молекул. Они являются важнейшим фактором специфического гуморального иммунитета. Антитела используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов — например, бактерий и вирусов.

Рис. 18. Структура иммуноглобулина G. Иммуноглобулин состоит из четырех полипептидных цепей: двух идентичных легких и двух идентичных тяжелых. Структура стабилизируется с помощью дисульфидных связей, образующихся между двумя тяжелыми цепями и тяжелыми и легкими. В самих тяжелых и легких цепях также образуются дисульфидные связи.

Антитела синтезируются плазматическими клетками, которыми становятся В-лимфоциты в ответ на присутствие антигенов. Для каждого антигена формируются соответствующие ему специализировавшиеся плазматические клетки, вырабатывающие специфичные для этого антигена антитела. Антитела распознают антигены, связываясь с определённым эпитопом — характерным фрагментом поверхности или линейной аминокислотной цепи антигена.

На первом этапе проведения Вестерн-блота белки разделяют электрофорезом в ПААГ.

Затем переносят белки на нитроцеллюлозную мембрану, которая неспецифично связывает белки. Связывание белков основано как гидрофобных взаимодействиях, так и на электростатических взаимодействиях между мембраной и белком. Мембрана накладывается поверх геля, поверх мембраны кладут стопку фильтровальной бумаги. Всю стопку помещают в буфер для переноса, который продвигается верх по бумаге под действием капиллярных сил, уносит с собой белки. Другой метод переноса белков называется электроблоттингоми использует электрический ток, который переносит белки из геля на мембрану. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. В результате этого «промакивания» (от. англ. blotting) белки удерживаются на тонком поверхностном слое мембраны для детекции.

Затем нитроцеллюлозную мембрану обрабатывают раствором бычьего сывороточного альбумина или сухого молока. Белок из разбавленного раствора прикрепляется к мембране во всех местах, где не прикрепился целевой белок. Эта процедура исключает неспецифичное связывание антитела мембраной.

Затем приливают раствор специфического антитела к целевому белку, после чего следует отмывка от несвязавшегося антитела. Специфические антитела получают иммунизацией животных очищенным целевым белком.

Детекция возможна в одну или две стадии.

Детекцию проводят в одну стадию, если антитело на целевой белок помечено каким-либо образом. Это может быть радиоактивная метка, или флюоресцентная метка, пришитая к антителу ковалентно. Существуют антитела, связанные с репортёрным ферментом, например, с щелочной фосфотазой или пероксидазой хрена. В этом случае блот выдерживается на подложке с соответствующим субстратом. Субстрат выбрают так, чтобы в результате взаимодействия с ферментом он изменял свой цвет.

Как правило, однако, детекцию проводят в две стадии. В этом случае первичное антитело, специфически узнающее целевой белок, не детектируется. Меченым являетсявторичное антитело. Вторичное антитело представляет из себя антитело, распознающее видоспецифичные консервативные участки первичного антитела. Если, например, первичное антитело получали путем иммунизации мыши очищенным целевым белком, то вторичное антитело получают иммунизируя другое животное, например, козу, консервативным участком мышиного антитела. Такое антитело будет называться «anti-mouse” и будет специфически распознавать большинство любых мышиных антител. Двухступенчатая детекция позволяет иметь универсальные вторичные антитела для детекции любых первичных, полученных в данном животном, что удешевляет анализ. Кроме того, несколько вторичных антител могут связываться с одним первичным и усиливать сигнал.

Рис. 19. Общая схема Вестерн-блот анализа

Рис. 20. Общая схема метода секвенирования ДНК по методу Сэнгера. Исследуемая матрица амплифицируется отдельно в присутствии каждого из дидезоксинуклеотидтрифосфатов. В каждой пробирке образуется уникальный набор продуктов. Далее эти продукты разделяются электрофорезом с разрешением до одного нуклеотида. По длине фрагментов, образовавшихся в каждой пробирке, восстанавливают последовательность матрицы.

Одна из самых широко применяемых технологий, основанная на принципе гибридизации нуклеиновых кислот — использование ДНК-микрочипов.

ДНК-микрочип (микроэррей) представляет из себя набор микроскопических фрагментов ДНК (зондов), иммобилизованных, как правило, ковалентно на твердой подложке. Это могут быть короткие участки ДНК как генов, так и любых других последовательностей ДНК, способные специфично гибридизоваться с исследуемой кДНК (мишенью). Степень гибридизации зонда с мишенью обычно оценивают по уровню флюоро- или хемилюминисценции метки, присоединенной к мишени.

Сушествует два основных типа микрочипов: точечные микрочипы, получаемые нанесением фрагментов ДНК на покрытое гелем предметное стекло микроскопа, и олигонуклеотидные микрочипы высокой плотности, которые производят путем прямого синтеза олигонуклеотидов на стеклянной подложке.

Поскольку на одном микрочипе обычно помещаются десятки тысяч зондов, можно одновременно оценивать экспрессию очень большого числа генов, что упрощает анализ.ДНК-микрочипы применяются для одновременного измерения уровня экспрессии большого числа генов, генотипирования, количественных оценок, детектирования ОНП, альтернативного сплайсинга и т.д.

Предположим, перед нами стоит задача сравнить экспрессию генов в печени у здорового человека и больного. Для этого обычно применяют двухцветные (или двухканальные) микрочипы.

Сначала необходимо выделить тотальную мРНК из печени здорового и больного. Затем по матрице этой РНК при помощи обратной транскриптазы получить кДНК, меченую флюорофорной меткой. Для это используют меченые аналоги нуклеозидтрифосфатов. Флюоресцентные краски, которые обычно применяют для мечения кДНК, имеют длину волны эмиссии флюоресценции в областях спектра, соответствующих красному или зеленому. Пометим кДНК, полученную от больного человека, например, красным флюорофором, а от здорового — зеленым.

Полученная смесь молекул кДНК отражает содержание транскриптов в исходной смеси мРНК: чем больше данной мРНК было в исходной смеси, тем больше ее кДНК-копий. На следующем этапе кДНК из двух образцов смешивают и гибридизуют с одним и тем же микрочипом. При этом индивидуальные олигонуклеотиды, закрепленные на подложке взаимодействуют со своими мишенями, находящимися в образце. После окончания процесса гибридизации чипы промываются для удаления остатков материала.

В каждой ячейке микрочипа содержится примерно 10 6 -10 7 копий фрагмента, что намного превышает число копий каждой специфической кДНК в исследуемом образце. В таких условиях происходит ненасыщающая гибридизация. Интенсивность сигнала в каждой ячейке пропорциональна содержанию данного типа кДНК. Микрочип сканируют на двух длинах волн эмиссии флюоресценции, соответствующих излучению каждого красителя. Затем с помощью компьютера результаты накладываются друг на друга и выводятся на экран в виде изображения микрочипа с окрашенными в разные цвета ячейками. Поскольку красным флюорофором мы метили кДНК больного человека, а зеленым — здорового, ячейки, которые окрашены только красным, соответсвуют РНК, присутствовавшей только у больного человека, те, которые окрашены только зеленым — только у здорового. В ячейках, где происходит наложение цветов (в нашем случае они будут желтого цвета), находятся зонды, соответствующие генам, которые экспрессируются и у здорового, и у больного человека. Темными остаются ячейки, с которыми не гибридизовалась никакая кДНК из исследуемых образцов.

Можно проводить подобный анализ и на одноканальном микрочипе. Тогда оба набора кДНК метятся одним и тем же флюорофором, но гибридизуются с двумя копиями микрочипа отдельно. Плюс одноканального подхода в том, что каждый чип взаимодействует только с одним образцом. Это значит, что один плохо подготовленный образец не сможет повлиять на качество данных, полученных по другим образцам. Другой плюс одноканальной системы состоит в том, что данные, полученные с ее помощью в разных экспериментах, проще сравнивать между собой.

Рис. ДНК-микрочип. Сравнительный анализ уровней генной экспрессии. Сначала при помощи обратной транскрипции получают меченную флюорофорами кДНК. кДНК гибридизуют с микрочипом и отмывают от несвязавшихся молекул. Затем снимают флюоресценцию на соответсвующих длинах волн и обрабатывают полученные данные на компьютере. Объединенное изображение демонстрирует четыре типа сигналов: W — гены, экспрессирющиеся одинаково в двух образцах мРНК, X — гены, экспрессирующиеся сильнее в образце 1, Y — гены, экспрессирующиеся сильнее в образце 2, Z – гены, неэкспрессирующиеся ни в одном из образцов.

Часть 2. Задачи

1. Перед вами два примера мембранных липидов. Один характерен для бактерий и эукариот, другой – для архебактерий. Установите соответствие.

2.Что получится при электрофорезе смеси фрагментов ДНК: (T)₁₅₀, (G≡C)₁₅₀ и (T=A)₁₅₀?

3.Будет ли этот фрагмент ДНК разрезаться рестриктазами EcoRI (5’-GAATCC), AluI (5’-AGCT), PstI (5’-CTGCAG)? Если да, то сколько фрагментов получится?

5.Линейный фрагмент ДНК обработали рестриктазами HinсII, NdelI и их смесью. Продукты реакции разделили в агарозном геле и окрасили бромистым этидием. Результаты электрофореза представлены на рис. 22. Цифры справа указывают на приблизительные размеры фрагментов в п.н. Постройте рестрикционную карту фрагмента.

6.На Рис. 23 представлены электрофореграммы исследования полиморфизма экзона 9 гена VDR-3 (ядерный рецептор витамина D) рестриктазой TaqI в контрольной выборке (дорожки 1-21) и у больных остеопорозом (22-42). Цифрами справа обозначены длины фрагментов ДНК в п.н. Составьте возможные варианты рестрикционной карты аллелей T (с одним сайтом рестрикции) и t (с двумя сайтами рестрикции), если исходная длина амплифицированного фрагмента экзона 9 составляет 745 п.н. и в нем есть два сайта для рестриктазы TaqI, один из которых полиморфный, а другой – нет. Определите частоту аллелей T и t в контрольной выборке и у больных.

7.В кодирующей части гена CRR5 рецептора хемокинов встречается делеция 32 п. н. (CRR5de!32). Известно, что рецептор хемокинов CRR5 используется также вирусом иммунодефицита человека ВИЧ-1для проникновения в клетки человека. Данная делеция приводит к дефекту рецептора, препятствует его взаимо-действию с вирусом и тем самым определяет устойчивость к ин-фекции ВИЧ-1у гомозигот по присутствию делеции (CRR5del32/ CRR5del32). На электрофореграмме представлены результаты IIЦР-амплификации участка гена CRR5, затронутого этой делецией, у группы с высоким риском заражения ВИЧ-1. Определите дорож-ки, на которых представлены образцы людей, устойчивых к инфек-ции. Цифрами справа обозначены длины фрагментов ДНК в п. н.

Последнее изменение этой страницы: 2017-02-10; Нарушение авторского права страницы

источник

Лабораторная работа 1.1. Анализ белков при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE)

В основе метода электрофореза лежит явление миграции заряженных частиц под действием электрического поля. Многие биологические микро- и макромолекулы, такие как пептиды, белки, нуклеиновые кислоты, обладают ионизируемыми группами и при определенном значении рН окружающей среды существуют в растворе в виде положительно заряженных частиц – катионов, либо в виде отрицательно заряженных частиц – анионов. Следовательно, под влиянием внешнего приложенного электрического поля эти заряженные частицы будут мигрировать либо к катоду, либо к аноду, в зависимости от своего результирующего заряда и молекулярной массы.

Метод электрофореза, предложенный еще в начале ХХ века, сейчас широко используют в биологии и медицине для разделения белков в исследовательских и клинических целях. С помощью электрофореза можно разделить на отдельные компоненты белковую смесь, что позволяет установить молекулярную массу белка или его субъединиц, подтвердить чистоту выделенного белка. Таким образом, электрофоретический метод в биохимии – это способ пространственного разделения молекул в плотном пористом геле, имеющих разный заряд и размеры. Результатом проведения электрофореза является электрофореграмма — изображение, полученное после разделения сложной смеси с помощью электрофореза и специфического проявления (окрашивания).

Электрофореграммы белков различных биологических жидкостей человека (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.) позволяют врачам и медицинским биохимикам получить значительную диагностическую информацию. Результаты электрофоретического разделения ферментов (зимограммы) позволяют изучать изменения активности и изоферментного спектра таких белков под действием внешних и внутренних факторов, как у человека, так и у других организмов (рис. 1).

Обычно белки находятся в растворе в виде заряженных частиц. Заряд на поверхности белков возникает в результате диссоциации группировок, находящихся в боковых радикалах аминокислот (карбоксильных, амино-, имидазольных и др. групп), а также при связывании ионов. Так как степень диссоциации группировок зависит от рН раствора, то величина и знак суммарного заряда белковой молекулы зависят от рН среды, а также от ионной силы (интенсивности электрического поля, создаваемого ионами в растворе).

Рисунок 1 — Результаты электрофореза 7 образцов белков в полиакриламидном геле (ПААГ). После разделения белков, гель погружался в раствор красителя – Coomasie R250, который связывается с молекулами белков. Изображение (электрофореграмма) было получено сканированием окрашенного геля.

Для каждого белка существует такое значение рН среды (обозначаемое как рI – изоэлектрическая точка), при котором положительные и отрицательные заряды ионизированных групп будут скомпенсированы. Вследствие этого факта, заряд всей белковой молекулы равен нулю. Таким образом, в буферном растворе со значением рН = рI изучаемого белка, невозможно движение белковой молекулы в приложенном электрическом поле.

Из-за разницы в аминокислотном составе, все белки имеют разные значения рI. При рН ≠ pI молекулы белка приобретают заряд и под действием электрического поля перемещаются к противоположно заряженным электродам – катоду(‑) или аноду(+). Например, кислые белки, богатые моноаминодикарбоновыми аминокислотами (аспарагиновая кислота (Asp); глютаминовая кислота (Glu), даже в буферном растворе со слабощелочным значением рН (8.0 – 8.5) приобретут значительный суммарный отрицательный заряд, вследствие диссоциации карбоксильных групп на СОО ‑ и H + и будут двигаться к аноду.

Для электрофоретического разделения биологических макромолекул оптимально такое значение рН рабочего буферного раствора, которое обусловливает максимальное различие зарядов разных белков, составляющих исходную смесь, а не их максимальный заряд. Обычно электрофорез проводят в среде (буфере) со значением рН, на 3 — 4 единицы отличающимся от среднего значения рI для белков данного типа. Это позволяет добиться хорошей электрофоретической подвижности и, вместе с тем, сохранить ощутимые различия молекул по заряду. Предпочтительно использовать буфер известной и постоянной ионной силы на основе однозарядных ионов. От рабочего буфера также требуется существенная емкость, так как локальная концентрация белка в образующихся при разделении смеси зонах скопления молекул может оказаться значительной. Поэтому используют буферы с концентрацией не менее 0.1 — 0.2 М. При проведении электрофореза электрическое поле создают с помощью источника питания – стабилизированного выпрямителя, способного давать регулируемое напряжение до 100 – 1000 В, при силе тока в несколько десятков миллиампер (мА).

Электрофорез проводят в однородном электрическом поле, то есть в поле, напряженность E которого во всех точках одинакова. Электрический ток пропускают через проводник – буферный раствор, налитый в канал из изолирующего материала (например, стекла) или пропитывающий какую-либо поддерживающую среду – носитель (например, бумагу или гель). Сопротивление R буферного раствора задается двумя факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электрофоретической подвижностью. Электрофоретической подвижностью (u) данной молекулы называют скорость движения заряженной молекулы (выражаемой в см/ч) в электрическом поле с напряженностью 1 В/см. Именно различия в электрофоретической подвижности белков, содержащихся в анализируемой смеси, делают возможным разделить эти белки в пространстве (в разных зонах электрофореграммы).

Скорость V движения белков к тому или иному электроду снижается из-за их трения в окружающей среде. Сила трения прямо пропорциональна скорости движения белковых молекул. Коэффициент трения белковой молекулы, обозначенный как f, зависит как от размера, формы и степени гидратированности этой молекулы, так и от свойств самой среды. Электрофоретическая подвижность белка зависит:

от самой молекулы: ее размера (молекулярной массы), формы, электрического заряда, степени диссоциации и гидратации,
от концентрации молекул,
от свойств среды: ее вязкости, рН, температуры и ионной силы,
от характеристик используемого электрического поля (для крупных макромолекул применяется электрофорез в пульсирующем электрическом поле).

1.1.2. Классификация электрофоретических методов:

Основными типами электрофореза являются:

зональный электрофорез,
изотахофорез,
изоэлектрическое фокусирование,
иммуноэлектрофорез.

Зональный электрофорез проводится при постоянном (не изменяющемся) значении рН буферного раствора, заполняющего данный носитель (бумагу, гель, др.). Исследуемый образец наносится пятном или тонким слоем на носитель, по которому и перемещается в электрическом поле. Усложненным вариантом зонального электрофореза является диск-электрофорез (многофазный зональный электрофорез), при котором рН и другие характеристики, постоянные внутри одной “фазы”, при переходе к другой “фазе” скачкообразно изменяются.

При изоэлектрическом фокусировании в среде для электрофореза создается плавный градиент рН. Белок останавливается в зоне, где значение рН равно его изоэлектрической точке (pI). Для создания градиента рН обычно используют раствор полиамино-поликарбоновых кислот, которыми насыщают носитель. В отсутствии электрического поля эта смесь обычно имеет значение рН равное 6.5. При наложении электрического поля указанные кислоты обеспечивают линейный градиент рН от 3 до 10.

В случае изотахофореза заряженные ионы сначала разделяются в соответствии с величинами их заряда и подвижности, а затем перемещаются в электрическом поле с одинаковыми и постоянными скоростями.

Иммуноэлектрофорез сочетает в себе электрофоретическое разделение белков с иммунопреципитацией, основанной на реакции “антиген – антитело”. Этот тип электрофореза превосходит остальные по чувствительности и разрешающей способности.

По цели применения электрофореза различают:

аналитический электрофорез (для анализа состава смеси),
препаративный электрофорез (для получения препаратов — значительных количеств чистых веществ).

По степени денатурации разделяемых белков различают:

нативный электрофорез,
электрофорез в денатурирующих условиях.

В отличие от нативного электрофореза, электрофорез в денатурирующих условиях предполагает применение химических реагентов, разрушающих пространственную структуру разделяемых белков и экранирующих собственный заряд молекулы.

По направлению фракционирования различают:

одномерный (1D) электрофорез, при котором белки движутся в одном направлении (горизонтальный или вертикальный электрофорез);
двумерный (2D) электрофорез, при котором сначала проводят разделение в одном направлении, а затем – в направлении, перпендикулярном первому. Двумерный электрофорез позволяет резко увеличить разрешающую способность при разделении смесей, состоящих из большого количества разных белков. В зависимости от ориентации носителя (геля, бумаги, др.) электрофорез также может быть вертикальным или горизонтальным;
электрофорез в объеме (3D). Один из наиболее точных аналитических методов, применяемых для анализа белков и нуклеиновых кислот. Носитель находится внутри стеклянного сосуда (колонки). Примером такого способа служит капиллярный зональный электрофорез – метод разделения молекул по заряду и размеру в тонком капилляре, заполненном электролитом. Для проведения капиллярного электрофореза требуется относительно простое оборудование. Основные компоненты системы: флакон для нанесения образца, стартовый флакон, конечный флакон, капилляр, электроды, мощный источник питания, детектор и устройство обработки данных. Флакон для нанесения образца, стартовый и конечный флаконы заполнены электролитом, например, водным буферным раствором. Для нанесения образца конец капилляра опускают во флакон с образцом и затем перемещают в стартовый флакон. Миграция молекул анализируемых веществ осуществляется под действием электрического поля, которое прилагается между стартовым и конечным флаконами. Ионы передвигаются по капилляру в одном направлении под действием электроосмотического тока. Анализируемые вещества разделяются по электрофоретической мобильности и детектируются около конца капилляра. Эффективность разделения путем капиллярного электрофореза значительно выше, чем эффективность других методов разделения, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В отличие от ВЭЖХ, в случае капиллярного электрофореза не происходит массообмена между фазами. Профиль потока для систем электроосмотического потока является плоским, в противовес ламинарному профилю хроматографических колонок, в которых разделение происходит под давлением. В результате этого при электроосмотическом разделении не происходит расширения полос, как при хроматографии. Разделение капиллярным электрофорезом может иметь несколько сотен тысяч теоретических тарелок. Еще сильнее повысить разрешающую способность электрофореза помогает комбинирование различных типов, например, иммуноэлектрофорез в вариации капиллярного зонального электрофореза.

На сегодняшний день, в целях обеспечения высокого качества фармацевтических и биофармацевтических субстанций, принято использовать так называемые «системы для электрофореза». Это оборудование, позволяющее производить быстрый, точный и качественный анализ препаратов различными методами электрофоретического разделения. Программное обеспечение данных систем позволяет подобрать оптимальный метод и грамотно проанализировать полученные результаты.

Рисунок 2 — Система фармацевтического анализа «PA 800 plus» от «Beckman Coulter» позволяет проводить высокоточные качественные и количественные исследования биофармацевтических субстанций с высокой производительностью. Предел детекции: 10 ‑18 – 10 ‑21 моль. Обеспечивает лабораторию следующими методами контроля: электрофорез белков в денатурирующих условиях с додецилсульфатом натрия (SDS) высокого разрешения для разделения белковых примесей и определения чистоты лекарственной субстанции; автоматический анализ чистоты препаратов рекомбинантных моноклональных антител IgG (иммуноэлектрофорез высокого разрешения), капиллярное электрофоретическое изофокусирование для анализа гетерогенности белковой лекарственной субстанции; изучение профиля гликозилирования молекул для определения микрогетерогенности белковой лекарственной субстанции.

1.1.3. Носители, применяемые для проведения электрофореза

Рассматривая историю появления метода электрофореза, можно отметить, что впервые электрофорез был применен без какого-либо носителя: электрическая цепь между электродами замыкалась через буферный раствор, в котором и происходило разделение белков. Позднее при электрофорезе начали применять носители жидкой фазы – полимеры, служащие “каркасом” для буферного раствора. Применение носителей позволило заметно снизить конвекцию (перемешивание) и, следовательно, повысить качество разделения белков. Носитель может быть в форме порошка, пленки, геля и др. Последующие разработки были посвящены усовершенствованию свойств носителей.

Идеальный носитель должен:

резко снижать конвекцию;
быть простым в приготовлении;
иметь высокую теплопроводность (при низкой теплопроводности трудно охлаждать систему);
обладать низкой адсорбционной емкостью и химической инертностью в отношении веществ, подвергаемых электрофорезу;
быть электронейтральным (не иметь заряда на поверхности), чтобы не вызывать эндоэлектроосмос. Если разделяемые белки заряжены отрицательно, то при электрофорезе они должны двигаться к аноду (+), однако, эндоэлектроосмос будет “тянуть” их в другую сторону, к катоду (‑), мешая электрофоретическому разделению.

Гели легко принимают разные геометрические формы, поэтому в названии электрофоретического метода с их использованием указывают, какова конфигурация рабочего пространства.

Гель для электрофореза можно заполимеризовать:

в трубках,
в капиллярах,
в пластинах (“слэбах” – от англ. slab),

Основной недостаток электрофореза в трубках — это отсутствие теплооттока: температура в центре цилиндра геля оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности. Это приводит к изгибу белковых зон. На одну трубку наносится одна исследуемая проба. Повысить теплоотток можно, применяя очень тонкие трубки — капилляры. В тонких пластинах также достигается гораздо более эффективное отведение тепла, чем в трубках. Кроме того, конфигурация пластины позволяет в абсолютно идентичных условиях проводить разделение сразу нескольких проб. Пластины легко сканировать и удобно разрезать. По сравнению с цилиндрическими гелями, пластины позволяют значительно уменьшить концентрацию белка в наносимой пробе.

Таблица 1 — Преимущества и недостатки использования различных носителей при электрофорезе

Преимущества метода и/или носителя

Электрофорез с подвижной границей (в свободном растворе). Носителя нет.

Первый электрофоретический метод, позволивший разделять белки

Сложно избежать конвекции – перемешивания разделяемых зон; для исследования нужна проба в десятки мг белка; разрешающая способность мала (не более 8 компонентов в пробе).

На фильтровальной или хроматографической бумаге (50-е годы XX в.)

Сниженная конвекция, разделенные зоны можно зафиксировать и окрасить. Оборудование проще.

Непрозрачность. Загрязнения и неоднородность бумаги мешают разделению. “Хвосты” на электрофореграммах из-за высокой адсорбционной емкости. Фон окрашивается, что затрудняет распознавание белковых зон.

На пленках из ацетата целлюлозы (известен с 1957г.)

Быстрый, требует меньшего количества пробы для анализа. Низкая адсорбционная емкость помогает избежать появления “хвостов” на электрофореграмме. После окрашивания фон остается бесцветным. Пригодны для иммуноэлектрофореза.

Непрозрачность в водных растворах (можно добиться прозрачности, погрузив в минеральное масло). Дороже, чем при использовании бумаги. Мало пригоден для препаративного электрофореза.

В крахмальном геле (предложен О. Смитисом)

Первый носитель со свойствами молекулярного сита. Активно препятствует конвекции. Повышает разрешение.

Низкая прозрачность, хрупкость, размер пор можно менять лишь в небольших пределах. Приготовление качественного геля трудоемко.

В агаровых и агарозных гелях

Удовлетворительная прозрачность, высокая пластичность (проще резать, удобнее красить и определять ферментативную активность прямо в геле), простота изготовления.

Из-за отрицательного заряда на сульфатных и СООН-группах сетки агара возникает электроосмос, приводящий к неравномерному распределению электрического поля, а иногда – гидростатического давления. Возможно химическое взаимодействие веществ с агаром.

В полиакриламидном (ПААГ) геле (предложен Л. Орнстейном и Д. Дэвисом)

Химически инертен, можно кипятить. Можно задать необходимый размер пор и обеспечить свойства молекулярного сита. Высокая прозрачность. Легко готовить. Упругий, прочный.

На сегодняшний день — лучший носитель, но готовится из акриламида — ядовитого вещества.

1.1.4. Особенности электрофореза в полиакриламидном геле

Полиакриламидный гель (ПААГ) обладает многими качествами идеального носителя. Имея свойства молекулярного сита, он обеспечивает электрофоретическое разделение белковых смесей не только по заряду, но и по размеру и форме частиц. При электрофорезе в ПААГ крупные молекулы, размеры которых соизмеримы с диаметром пор геля, движутся медленнее, а мелкие молекулы свободно и быстро проходят через поры геля. ПААГ формируют путем сополимеризации акриламида, создающего линейную основу, и N,N′-метиленбисакриламида (BIS), служащего для поперечных «сшивок» линейных цепей.

В результате сополимеризации образуется трехмерная сетка геля. Каждый второй углеродный атом линейной цепи содержит кислотную амидную группу (рис. 3), что обеспечивает гидрофильность полимера. В то же время ПААГ не содержит ионизируемых групп. Для сополимеризации нужны инициаторы и катализаторы (окислительно-восстановительные системы – источники свободных радикалов). Чаще всего используют систему из двух компонентов:

персульфат аммония (ПСА, APS). Синоним — надсернокислый аммоний. Функция: инициатор полимеризации
N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД, TEMED). Функция: катализатор образования ПААГ

Рисунок 3 — Реакция полимеризации полиакриламидного геля

Меняя концентрацию акриламида от 2 до 50% можно задать определенную пористость геля. Например, диаметр пор в геле, содержащем 7.5% акриламида, равен 5 нм, а 30% акриламида — 2 нм. При выборе концентрации геля учитывают среднюю молекулярную массу (Mr) разделяемых веществ и форму их молекул. Отнеситесь к этому факту внимательно! Если плотность геля не будет соответствовать молекулярной массе исследуемого белка, то он, либо не войдет в гель, либо будет мигрировать с очень высокой скоростью и, как следствие, выйдет из геля раньше времени. Также в качестве параметров, влияющих на эффективность разделения, в особенности белков с приблизительно равной молекулярной массой, можно отметить время проведения электрофореза, длину разгоночной дистанции (чем больше гель, тем выше разрешение), температура процесса (при пониженной температуре белковые зоны меньше размываются за счет диффузии).

Таблица 2 — Выбор концентрации акриламида для оптимального разрешения смеси белков

Линейный диапазон распределения, кДа

В случае, когда требуется фракционировать белки исключительно по молекулярной массе, применяют ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях. Такая система была разработана в 1970 году Лэммли ( англ. Laemmli) для изучения процесса сборки капсида четного бактериофага Т4. Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН, SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходило восстановление дисульфидных связей, что предотвращало выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфат-иона, имеющего в растворе отрицательный заряд.

При использовании данного метода исходят из следующих допущений:

белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
собственный заряд полипептида несущественен по сравнению с суммарным отрицательным зарядом связанных с ним молекул SDS;
все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы.

При более реалистичном рассмотрении вопроса, эффективность разделения зависит не от молекулярной массы белка, а от его молекулярного радиуса, так называемого радиуса Стокса. Действительно, многие белки имеют аномальную подвижность при проведении электрофореза, что зависит от множества факторов, в результате которых меняется удельный заряд, размер и форма комплексов «белок- SDS ». Тем не менее, практика подтверждает верность данных допущений в подавляющем большинстве случаев.

Для проведения денатурирующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез (от англ. discontinous — разрывный) то есть используют гель, состоящий из двух частей:

Формирующий (концентрирующий) гель имеет pH 6.8 и концентрацию полиакриламида от 2 до 8 %. Крупнопористый гель. Размер его пор ограничивает диффузию, но не обеспечивает гелю свойства молекулярного сита по отношению к большинству разделяемых белков. Этот гель нужен для электрохимического концентрирования белков пробы. Таким образом, концентрирующий гель собирает смесь белков перед переходом в разделяющий гель в одну узкую полосу.
Разделяющий гель имеет рН 8.5 – 9 и концентрацию полиакриламида от 5 до 20 %. Это мелкопористый гель, в котором, собственно, и происходит электрофоретическое и молекулярно-ситовое разделение компонентов пробы.

Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин . При рН 6.8 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8.8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся. В переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью. Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода. В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.

1.1.5. Способы визуализации результатов (электрофореграмм)

Зоны разделившихся белков удобно анализировать, если их проявить, то естьсделать видимыми невооруженным глазом. Проявление осуществляют либо с целью обнаружения всех белков, либо только белков с определенной ферментативной активностью. В последнем случае получают зимограммы (энзимограммы). Иногда делят белки, заранее меченые хромофором (например, флуорескамином), и обнаруживают их по флуоресценции в УФ-области спектра с помощью специального оборудования. Используют также и радиоактивную метку (радиоактивным углеродом или йодом). Регистрацию полос в этом случае проводят методом авторадиографии с помощью рентгеновской пленки.

Для окрашивания белковых зон на ПААГ-электрофореграмме используют несколько универсальных методов. Для этого разделившиеся зоны белков фиксируют раствором уксусной кислоты (1 – 10%), смесью уксусной кислоты и этанола (реже – метанола), раствором ТХУ, насыщенным раствором сульфата аммония и окрашивают, используя раствор красителя. Фиксация предотвращает размывание зон из-за диффузии белковых молекул в геле. Используют такие красители, как амидочерный (амидошварц), кумасси ярко-синий (марок G250, R250), Zn/имидазол, нитрат серебра. Окраска полос происходит пропорционально количеству белка в зоне. Окраска и количество полос, соответствующих белкам, также зависят от чувствительности того или иного красителя. Так, нитрат серебра выявляет зоны с меньшим содержанием белка, чем кумасси.

Чрезвычайно высокой чувствительностью отличаются методы окраски белковых полос при помощи Zn/имидазола и солей серебра. Проявление с помощью Zn/имидазола состоит в последовательной обработке геля растворами 0.2 М имидазола и 0.3 М ZnCl₂ в очень чистой дистиллированной воде, полученной с применением ионообменной хроматографии и очистки на мембранных фильтрах (дистиллят milliQ). Сочетание этих реактивов позволяет выявить 30 – 100 нг белка на полосу. Окрашивание с использованием нитрата серебра приближается по чувствительности к авторадиографии.

В настоящее время самым удобным и широко используемым является краситель кумасси ярко-синий, или бриллиантовый синий («Coomassie brilliant blue», он же ксилоловый яркий цианин), выпускаемый в двух модификациях: R-250 и G-250. Обе модификации кумасси плохо растворимы в воде и разбавленных кислотах, причем G-250 растворяется хуже, чем R-250. Повышению растворимости способствует добавление в раствор кумасси метанола, изопропанола или других спиртов. Не растворившиеся примеси следует отфильтровать. По сравнению с другими красителями кумасси ярко-синий имеет следующие преимущества:

его чувствительность выше, чем у амидочерного, и в большинстве случаев вполне подходит исследователям, — зависимость интенсивности окраски от концентрации белка остается линейной в более широком диапазоне концентраций,
кумасси значительно дешевле и проще в использовании, чем нитрат серебра и не требует особо чистой дистиллированной воды, как Zn/имидазол
в отличие от гелей, окрашенных Zn/имидазолом, гели при использовании кумасси можно хранить (либо высушить, либо поместить в 5%-ную уксусную кислоту, где существенного снижения интенсивности окраски полос не произойдет в течение 8-11 недель).

К недостаткам метода относится более низкая чувствительность, а также длительность процедуры отмывки геля от избытка связавшегося красителя. Для этих целей существуют модифицированные протоколы, например, окрашивание полиакриламидных гелей «коллоидным раствором кумасси». Также кумасси G250 используется для спектрофотометрического определения концентрации белков по методу Бредфорд.

Таким образом, целью лабораторного занятия является знакомство с методикой анализа белков при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (возможные варианты сокращений, наиболее часто встречающихся в литературе: ДСН‑ПААГ, SDS‑ПААГ, SDS‑PAGE).

Для реализации поставленной цели необходимо:

приготовить полиакриламидный гель, применимый для разделения белков с соответствующей молекулярной массой;
приготовить образцы для электрофореза;
приготовить электродный буферный раствор;
провести электрофоретическое разделение исследуемых образцов;
окрасить гель при помощи раствора кумасси ярко-синего;
получить электрофореграмму и проанализировать полученные результаты.

Лабораторное занятие проводится при строгом соблюдении правил безопасности при работе в химической лаборатории и эксплуатации электроприборов.

1.2.1. Расходные материалы и оборудование:

Камера для вертикального электрофореза белков «MiniProtean Tetra» (Bio-Rad, США или аналог);
Источник тока «Эльф-8» (ДНК-технология, Россия или аналог);
Система гель-документирования с функцией детекции в видимой области светового излучения (UVP, США или аналог);
Электронные аналитические весы (Shimadzu, Япония или аналог) и набор шпателей для взвешивания;
Система для получения деионизированной воды milliQ (Millipore, США или аналог);
Термостат «Гном» (ДНК-технология, Россия или аналог);
Комплект оборудования для формирования геля (Bio-Rad, США или аналог);
Настольная центрифуга (Eppendorf, Германия или аналог);
рН-метр (Аквилон, Россия или аналог);
Холодильник (Стинол, Россия или аналог);
Шейкер (ELMI, Латвия или аналог);
Набор автоматических пипеток (Sartorius, Швейцария или аналог);
Магнитная мешалка с нагревом (He >;
Набором магнитов для мешалки (Heidolph Instruments, Германия или аналог);
Химические стаканы (Simax, Чехия или аналог);
Пластиковые пробирки на 1.5, 5 и 50 мл (Corning или аналог);
Мерные колбы на 50, 100 и 1000мл (Simax, Чехия или аналог);
Мерные цилиндры (50 и 100мл) и мерные стеклянные стаканы (Simax, Чехия или аналог);
Стеклянные бутыли для хранения растворов (Simax, Чехия или аналог);
Фильтровальная бумага, парафильм;
Носики для автоматических пипеток (Corning или аналог);
Носики для автоматической пипетки для нанесения образцов в гель (Corning или аналог), либо шприц многоразовый на 25 мкл (Hamilton, Швейцария или аналог)

акриламид, N,N’ –метиленбисакриламид, Трис, додецилсульфат натрия (SDS), персульфат аммония, N,N,N’,N’ – тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), глицин, глицерин, β-меркаптоэтанол, ЭДТА, бромфеноловый синий, кумасси R250 (Bio-Rad, США или аналог), набор маркеров молекулярных масс белков (15-150 кДа) (Thermo Scientific или аналог), уксусная кислота, соляная кислота (х.ч), этанол.

1.2.3. Прописи для приготовления требуемых растворов:

1% раствор бромфенолового синего

Способ приготовления: Навеску бромфенолового синего растворить в воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Хранить при комнатной температуре.

Лабораторная пропись для получения 10 мл раствора: 0.1г бромфенолового синего, деионизированная вода .

30%-ный раствор бис-акриламида

Состав:1% BIS, 29% акриламид, деионизированная вода .

Способ приготовления: Соответствующие навески веществ растворить в воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Добавить активированный уголь и оставить для перемешивания на ночь на магнитной мешалке. Профильтровать и хранить при 4 0 С.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 1г BIS, 29г акриламида, деионизированная вода .

10%-ный раствор персульфата аммония

Состав: персульфат аммония, деионизированная вода .

Способ приготовления: Навеску персульфата аммония растворить в деионизированной воде MilliQ, довести объем раствора до метки. Хранить при ‑20 0 С.

Лабораторная пропись для получения 5 мл раствора:0.5г персульфата аммония, деионизированная вода .

Состав: «ледяная» уксусная кислота, деионизированная вода .

Способ приготовления: Разбавить «ледяную» уксусную кислоту водой MilliQ в соотношении 1:9. Хранить при комнатной температуре.

Лабораторная пропись для получения 100мл раствора: 10мл «ледяной» уксусной кислоты, 90 мл деионизированной воды .

Буферный раствор TES для приготовления образцов

Состав: 2% SDS, 100 мМ трис-HCl, pH 8.0, 10 мМ ЭДТА, деионизированная вода .

Способ приготовления: Смешать компоненты раствора и довести объем раствора до метки водой MilliQ. Довести рН до 8.0 при помощи соляной кислоты. Отфильтровать и хранить при комнатной температуре.

Лабораторная пропись для получения 50 мл раствора: 10 мл 10%-ного раствора SDS, 5 мл 1М раствора трис, 1 мл 0.5 М раствора ЭДТА, соляная кислота, деионизированная вода.

Буферный раствор 1 М трис-HCl, рН 6.8

Состав: 1М Tрис, соляная кислота, деионизированная вода .

Способ приготовления: Растворить навеску трис в деионизированной воде MilliQ. Довести рН до значения 6.8 при помощи соляной кислоты. Довести объем раствора до метки, отфильтровать и хранить при температуре +4 0 С.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 12.13 г трис, соляная кислота, деионизированная вода.

Буферный раствор 1 М трис-HCl, рН 8.8

Состав: 1М Tрис, соляная кислота, деионизированная вода .

Способ приготовления: Растворить навеску трис в деионизированной воде MilliQ. Довести рН до значения 8.8 при помощи соляной кислоты. Довести объем раствора до метки, отфильтровать и хранить при температуре +4 0 С.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 12.13 г трис, соляная кислота, деионизированная вода.

Окрашивающий раствор для геля:

Состав: 5% CH₃COOH, 45% C₂H₅OH, 0.25% Coomassie R-250, деионизированная вода .

Способ приготовления: Смешать соответствующее количество уксусной кислоты и этилового спирта, довести объем раствора до метки водой MilliQ, добавить сухой краситель сoomassie R-250. Хранить при комнатной температуре. Окрашивающая способность сохраняется на 15 – 20 использований.

Лабораторная пропись для получения 100 мл раствора: 50мл 10%-ной CH₃COOH, 45мл 96%-ного C₂H₅OH, 0.25 г сoomassie R250.

Окрашивающий раствор для образцов (Лэммли буфер)

Состав: 62.5 мМ трис- HCl , pH 6.8, 5% β -меркаптоэтанол, 10% глицерин, 2% SDS (10%), до 0.2% бромфенолового синего, деионизированная вода.

Способ приготовления: Смешать все компоненты раствора в указанном количестве.

Лабораторная пропись для получения 8.5 мл раствора: 0.5 мл 1М трис– HCl , pH 6.8, 0.4 мл β -меркаптоэтанола, 0.8 мл (1 г) глицерина, 1.6 мл 10%-ного раствора SDS , 0.2 мл 1%-ного раствора бромфенолового синего, 4.8 мл деионизированной воды .

Tрис-глициновый стоковый раствор 10Х:

Состав: 250 мМ трис, 1.92 М глицин, деионизированная вода .

Способ приготовления: Растворить навески трис и глицина в деионизированной воде MilliQ , довести объем до 1 л водой. Значение рН результирующего раствора должен быть в районе 8.3. Ни в коем случае нельзя подводить рН буфера до требуемого значения! Следует переделать его! Профильтровать через фильтр с диаметром пор 0.65 мкм.

Лабораторная пропись для получения 1л раствора: 30.25г трис, 144г глицина, деионизированная вода.

Tрис-глициновый электродный буферный раствор 1Х

Состав: 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0.1% SDS, деионизированная вода .

Для приготовления электрофорезного буфера развести в десять раз трис-глициновый стоковый раствор в мерной колбе и добавить SDS до конечной концентрации 0.1%. Довести деионизированной водой до требуемого объема.

Лабораторная пропись для получения 1л раствора: 100 мл трис-глицинового стокового раствора 10Х, 10 мл 10%-ного SDS , деионизированная вода .

Состав: 62.5 мМ трис-НС l , рН 8.8, 46.5% бис-акриламид (30%, 29:1), 0.1% SDS , 0.5% персульфата аммония, 0.09% TEMED , деионизированная вода .

Способ приготовления: Смешать все компоненты геля в указанном количестве

Лабораторная пропись для получения 1 геля: 0.74 мл деионизированной воды, 1.50 мл 1М трис-НС l , рН 8.8, 2.00 мл раствора бис-акриламида (30%, 29:1), 40 мкл 10%-ного раствора SDS , 20 мкл 10%-ного раствора персульфата аммония, 4 мкл TEMED .

Формирующий (концентрирующий) гель:

Состав: 62.5 мМ трис-НС l , рН 6.8, 26.85% бис-акриламид (30%), 0.1 % SDS , 0.94% персульфата аммония, 0.2% TEMED , деионизированная вода .

Способ приготовления: Смешать все компоненты геля в указанном количестве

Лабораторная пропись для получения 1 геля: 0.8 мл деионизированной воды, 0.25 мл 1М Трис-НС l , рН 6.8, 0.4 мл раствора бис-акриламида (30%, 29:1), 20 мкл 10%-ного раствора SDS , 14 мкл 10%-ного раствора APS , 3 мкл TEMED

Для выполнения данной лабораторной работы рекомендуется использовать гребенки с 10 ячейками и спейсеры толщиной 0.75 мм. Ширина каждой ячейки – 6.5 мм. Максимальный объем образца – 30 мкл.

В качестве подготовки к лабораторной работе стеклянные пластины промывают мягким детергентом, ополаскивают достаточным объемом деионизированной воды и спирта, затем высушивают в вертикальном положении.
Рамку для заливки геля ставят в вертикальное положение зажимами вперед в открытом положении, затем собирают форму для геля – одно стекло – с приклеенным спейсером, второе – укороченное.
Форму берут таким образом, чтобы метки («up») на стекле со спейсером находились вверху и укороченное стекло ‑ спереди, и устанавливают в рамку для заливки геля. Следует убедиться, что нижние края обоих стекол находятся на одном уровне, после чего необходимо зафиксировать форму зажимами.
Собранную рамку устанавливают в стенд для заливки геля стеклянной формой вперед: упираясь нижним краем стекол в резиновую прокладку, подводят верхний край стекол под выступ на клипсе.
Затем вставляют гребенки между стекол: надписями вперед, пока выступ на гребенке не упрется в укороченное стекло. От дна ячеек отмеряют 1 см и отмечают это положение фломастером. Удаляют гребенку.
До этого уровня будет заливать разделяющий гель. После заливки разделяющего геля поверх него наслаивают 96% этиловый спирт. Как только разделяющий гель заполимеризовался (это занимает примерно полчаса), спирт тщательно удаляют при помощи фильтровальной бумаги.
Заливают формирующий гель и устанавливают гребенку. Дают гелю полимеризоваться (это занимает примерно полчаса), и достают рамку из стенда для заливки геля.
Повернув защелки вперед, извлекают кассету с гелем, вставляют в щели на дне электродной ячейки (укороченное стекло смотрит внутрь) и прижимают к зеленой прокладке. Следует убедиться, что укороченное стекло попадает в углубления на зеленой прокладке.
Вставляют кассеты с гелем и электродную ячейку в фиксирующую рамку. Надавливая сверху на электродную ячейку, защелкивают оба зажима на фиксирующей рамке, и опускают фиксирующую рамку в мини-резервуар.
Внутреннюю камеру заполняют трис-глициновым электродным буферным раствором так, чтобы его уровень располагался между верхними краями укороченного стекла и стекла со спейсером (для этого необходимо примерно 125 мл буфера) и добавляют примерно 200 мл трис-глицинового буфера в мини-резервуар.
Готовят образцы для электрофореза.
Приготовление образцов из телец включения, клеточной биомассы, нерастворимой фракции:
Центрифугируют 100 мкл образца при 7000 g в течении 10 минут, тщательно удаляют полностью супернатант, затем добавляют к пробе 100 мкл горячего буфера TES и прогревают образец в течение 5 минут при 99 0 С. После чего добавляют к пробе 100 мкл буфера Лэммли и снова прогревают образцы 5 минут при 99 0 С.

Приготовление растворимых белковых образцов:
Отбирают 100 мкл образца и добавляют к нему 100 мкл буфера Лэммли. Прогревают образцы в течение 5 минут при 99 0 С.
Маркер молекулярных весов поставляется уже в готовом состоянии. Его необходимо только прогреть в течение 5 минут при 99 0 С.
Наносят образцы в ячейки геля при помощи мини-шприца Гамильтона или дозатора с тонким носиком.
Электрофорез проводят при постоянном напряжении 200 В. Время электрофореза — примерно один час.
По окончании электрофореза отсоединяют ячейку Mini-Protean III от источника напряжения. Снимают крышку и осторожно достают фиксирующую рамку с электродной ячейкой и кассетами для геля, после чего сливают электрофорезный буферный раствор, открывают защелки фиксирующей рамки и достают электродную ячейку с кассетами для гелей.
Специальным шпателем разъединяют стеклянную форму для геля. Гель погружают в фиксирующий раствор (10%-ная уксусная кислота) и, осторожно покачивая, отсоединяют его от стекла.
Фиксируют гель в течение 30 мин при постоянном покачивании, после чего заливают его окрашивающим раствором. Для ускорения процесса окрашивания можно подогреть окрашивающий раствор вместе с гелем в микроволновой печи.
Когда интенсивность полос на геле перестает меняться, окрашивающий раствор необходимо слить, а гель промыть раствором 10%-ой уксусной кислоты. Раствор для отмывки также можно подогреть вместе с гелем в микроволновой печи. Это существенно ускоряет процесс отмывки.
Результаты электрофореза визуально анализируют по электрофореграмме, путем сравнения со стандартными образцами и маркером молекулярных весов.

1.3. Вопросы для подготовки к вебинару

Какое свойство белковых молекул позволяет им образовывать отдельные зоны на электрофореграмме? От каких условий это свойство зависит и может изменяться?
Что такое суммарный заряд белковой молекулы? Почему он изменяется при изменении рН окружающей среды? Что такое pI?
Как будет изменяться суммарный заряд белковых молекул при проведении электрофореза в нативных и денатурирующих ( SDS ) условиях?
Почему не следует выбирать электродные буферные растворы со значением рН, значительно (более чем на 4 ед.) отличающимся от рI разделяемых белков?
Напишите структурную формулу полиакриламидного геля. Почему ПААГ считается лучшим носителем жидкой фазы?
Объясните использование следующих компонентов для приготовления геля: персульфат аммония, акриламид, N,N′-метиленбисакриламид , додецилсульфат натрия, трис?
Объясните использование следующих компонентов для приготовления буфера Лэммли: трис, β-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия, глицерин, метиленовый синий?
Как можно повысить разрешающую способность электрофореза для более эффективного разделения препарата, состоящего из белков со следующими значениями молекулярной массы: 10 кДа, 18 кДа, 30 кДа, 32 кДа, 36 кДа, 48 кДа, 79 кДа, 112 кДа, 220 кДа?

источник