С лечебной целью ферменты вводят различными путями. Для ЛОР-клиники особый интерес представляет введение ферментов физическими методами. Наиболее часто применяется лекарственный электрофорез в постоянном электрическом поле, а также ингаляции аэрозолей.
Метод электрофореза, в котором сочетается действие фермента и небольших дозировок постоянного тока, имеет ряд преимуществ по сравнению с применением ферментных препаратов парентерально. С помощью электрофореза фермент можно вводить непосредственно в ткань патологического участка с нарушенным кровообращением из-за некрозов, инфильтратов, тромбоза сосудов, а также создать более высокие концентрации фермента в пораженном участке при меньших суммарных его дозах. При их введении методом электрофореза обычно не возникает местных и общих аллергических реакций, которые часто наблюдаются при парентеральном введении ферментов, так как последние, являясь для организма чужеродными белками, обладают антигенными свойствами.
Ниже изложены главным образом биохимические обоснования для применения ферментов методом электрофореза. Имеющиеся в руководствах сведения по электрофорезу часто не учитывают физико-химических свойств ферментов — веществ белковой природы, которые очень чувствительны к влиянию рН среды, температуры, ионов тяжелых металлов и другим воздействиям. Поэтому при лечебном применении ферментов методом электрофореза следует учитывать их устойчивость в растворителе, подвижность и полярность, что важно для правильного выбора полюса, с которого будет вводиться фермент.
Для определения полярности необходимо помнить, что ферменты — амфотерные электролиты: в их молекулах имеются свободные карбоксильные группы (-СООН), обладающие кислыми свойствами, благодаря отщеплению ионовводорода, и аминогруппы (-NH2), способные присоединять ионы водорода, приобретая при этом положительный заряд и придавая молекуле фермента щелочные свойства. Степень ионизации этих групп зависит от рН среды: карбоксильные группы полностью диссоциируют в щелочной среде, а аминные — в кислой. Значение рН среды, при котором белковая молекула имеет одинаковое количество положительно и отрицательно заряженных групп, называется ИЭТ. В ИЭТ белки, будучи электронейтральными, неподвижны в электрическом поле постоянного тока. Белки, как и другие лекарственные вещества, могут быть введены методом электрофореза не в молекулярной форме, а в виде ионов. Поэтому электрофорез должен проводиться в растворах с рН, удаленных от ИЭТ вводимого фермента в более кислую или щелочную зону. При этом белок приобретает положительный либо отрицательный заряд. Так, при добавлении водородных ионов (подкисление) подавляется диссоциация карбоксильных групп, белок приобретает катионные свойства и движется к катоду. Подщелачивание среды ведет к диссоциации —NH+ групп, которые превращаются в недиссоциированную форму (—NH2), что приводит к преобладанию в белковой молекуле отрицательно заряженных групп. В этом случае белок находится в форме аниона и передвигается в электрическом поле к аноду. Таким образом, при варьировании рН среды один и тот же фермент можно вводить как с положительного, так и с отрицательного полюса.
ИЭТ белков-ферментов может находиться в кислой, нейтральной, щелочной и даже сильно щелочной среде. ИЭТ трипсина, альфа-химотрипсина, рибонуклеазы, лизоцима, трасилола (ингибитор протеолитических ферментов белковой природы) лежит в щелочной зоне, следовательно, в среде с рН ниже ИЭТ (в частности, рН 7) эти белки являются катионами и должны вводиться с положительного полюса. В более щелочной зоне, чем ИЭТ, они приобретают отрицательный заряд и полюсом их введения становится катод. Ферменты гиалуронидаза и дезоксирибонуклеаза, у которых ИЭТ находится в кислой среде, при рН 7 заряжаются отрицательно и должны вводиться с катода. При значениях рН среды ниже ИЭТ они будут иметь положительный заряд и поэтому их следует вводить с анода.
Трипсин и альфа-химотрипсин в нейтральной среде (рН 7) обладают свойствами катиона и передвигаются к катоду, причем быстрее мигрирует трипсин, ИЭТ которого по сравнению с альфа-химотрипсином (ИЭТ 8,3-9,1) сдвинута в более щелочную сторону (рН 10,1). При смешивании двух ферментов их электрофоретические свойства не изменяются.
Для ферментного электрофореза важно правильно выбрать растворитель, чтобы рН раствора был отдален от ИЭТ, при этом белковая молекула будет обладать более высокой электрофоретической подвижностью. Например, при введении трипсина с ИЭТ 10,1 в качестве растворителя можно использовать физиологический раствор или еще лучше буферный раствор с рН 4-5. С другой стороны, при выборе растворителя необходимо знать рН стабильности фермента, который часто не соответствует рН-оптимуму действия. Так, точка максимальной устойчивости для трипсина находится при рН 2,3 а для химотрипсина — при рН 3-3,5, а рН-оптимум действия для двух протеиназ лежит при рН 7-8.
При повышении рН среды происходит автолиз этих ферментов, которым особенно выражен при рН свыше 8, при этом белок денатурируется с потерей энзиматической активности.
В предварительных опытах, предшествующих электрофорезу, необходимо также проверить влияние гальванического тока на активность используемого энзима. Кроме того, нужно помнить, что ряд катионов и анионов влияют на биологическую активность ферментов. Например, активность дезоксирибонуклеазы тормозится хлористым натрием, а ионы магния или марганца активируют белковые соединения.
Таким образом, применению электрофореза ферментов должны предшествовать тщательные исследования, включающие установление полярности, выбор растворителя и концентрации фермента.
Важной и нерешенной проблемой электрофореза ферментов является выяснение возможности проникновения белковых молекул с молекулярной массой в тысячи раз большей, чем неорганических ионов, в пораженную ткань через кожу и слизистую оболочку. Лишь при воспалении (повышении сосудистой проницаемости) могут создаваться условия для проникновения ферментов с помощью гальванического тока. Трудную задачу представляет собой количественное определение в тканях вводимых с помощью постоянного тока ферментов, поскольку их концентрация при этом незначительна.
Необходимо учитывать также, что ферменты быстро связываются с белками тканей, которые резко снижают их энзиматическую активность.
Другая новая область энзимофизиотерапии — применение ингибиторов ферментов в отоларингологии. Ингибиторы протеолитических ферментов показаны при тех патологических процессах, в генезе которых лежит активация протеолиза и фибринолиза.
В ЛОР-клинике до настоящего времени практически используется только эпсилон-АКК в качестве препарата, тормозящего процессы фибринолиза, а также как антиаллергическое средство.
Большие перспективы открываются при применении природных ингибиторов, которые в отличие от синтетических обладают более широким спектром действия: они подавляют активность многих протеолитических ферментов, активирующихся при ряде воспалительных и аллергических процессов. В частности, при реакции антиген — антитело освобождаются протеолитические ферменты, которые катализируют образование кининов.
Так как ингибиторы имеют белковоподобную природу, перед введением необходимо выяснить их полярность и электрофоретическую подвижность в различных растворителях. Поскольку выпускаемые препараты содержат примеси других неактивных белковоподобных соединений, которые могут изменять электрофоретические свойства, клиническому применению предшествовали биохимические исследования ингибиторов протеиназ. При растворении ингибиторов в физиологическом растворе (рН 6) пантрипин электрофоретически гетерогенен, он состоит из нескольких фракций, движущихся в сторону как анода, так и катода. Контрикал разделяется при электрофорезе на две катодные фракции; трасилол передвигается к катоду в виде одной фракции. Возникает вопрос, где же находится активная фракция? Предлагается определять специфическую ингибиторную активность во всех фракциях по их способности тормозить активность протеиназ. Опыты показали, что основная часть ингибирующей активности (примерно 90%) содержится в быстрой катодной фракции, в анодной фракции активность ингибитора не обнаружена.
На основании этих опытов можно сделать вывод о том, что ингибитор следует растворять в физиологическом растворе и вводить с положительного полюса.
Ингибиторы можно применять для лечения ряда аллергических и воспалительных заболеваний ЛОР-органов путем назального электрофореза. Учитывая дефицит препаратов ингибиторов, а также необходимость использования больших дозировок при парентеральном введении, в терапии регионарных воспалительных и аллергических процессов более целесообразно и экономически выгодно вводить ингибиторы непосредственно в очаг поражения с помощью постоянного тока (гальванический ток не влияет на активность ингибиторов). Так могут быть созданы более высокие концентрации ингибиторов в пораженных тканях, особенно при повышенной проницаемости слизистых оболочек, наблюдающейся при воспалительных и аллергических реакциях.
Приведенные материалы показывают, что успех ферментной физиотерапии в существенной мере зависит от знания физико-химических свойств используемых энзимов, а также возможности проникновения экзогенных ферментов в очаг поражения, длительности их пребывания и выведения их организма. Здесь еще много неясных вопросов, которые могут быть разрешены клиницистами совместно с физиотерапевтами, биохимиками, фармакологами, физиологами. Необходимо внедрение новых методов количественного определения ферментов в тканях, включая применение флюорохромированных ферментов, флюорохромированных антител, а также радиоактивных индикаторов для прослеживания вхождения ферментов в клетки и определения их активности в пораженных тканях.
Среди физических методов терапии ферментами ЛОР-заболеваний наряду с электрофорезом важное значение имеет введение энзимов и их ингибиторов с помощью ингаляций их аэрозолей. Использование ферментов путем ингаляций аэрозолей основано на том, что они могут непосредственно взаимодействовать со специфическими субстратами очага повреждения и вызывать их расщепление.
Методы электрофореза и ингаляций аэрозолей ферментов нашли применение в терапии заболеваний ЛОР-органов — ларингитов, ринитов, воспалений полости рта и глотки, стенозирующих ларинготрахеитов, бронхитов у детей и т.д.
источник
Термином «электрофорез» описывается процесс разделения ферментов на основе дифференциальной их миграции в электрическом поле. При проведении лабораторных работ в области аналитической биохимии электрофорез представляет собой метод, обеспечивающий высшую степень разделения ферментов на принципах физико-химической сепарации. Поэтому указанный метод изучался прежде всего с точки зрения препаративной сепарации. Именно для такого предназначения создано несколько специальных приборов. Однако необходимо иметь в виду, что на электрофоретическую подвижность ферментов решающим образом влияет ряд факторов; они могут быть ответственными за разочаровывающие результаты. Во-первых, электрофоретическая подвижность макромолекул низка, вследствие чего соответствующая операция разделения характеризуется малой скоростью и диффузия будет приводить к размыванию концентрационных зон, а ферменты — смешиваться с медленно движущимися продуктами электролиза. Подвижность молекул варьирует в обратном отношении к вязкости среды. Если отвод тепла от различных участков поперечного сечения сепарационной камеры происходит с разной интенсивностью, то подвижность молекул по поперечному сечению будет варьировать. Это обусловлено вариациями температуры по поперечному сечению и зависимостью вязкости от температуры. Наличие твердой фазы, хотя она сама по себе и не важна как объект для выделения, контролирует конвекционные возмущения потоков в сепарационной камере и вызывает гравитационные разрушения уплотненных зон. Твердая фаза также уменьшает подвижность молекул. Эти и другие проблемы осложняют применение методов перепаративного электрофореза. Капитальные затраты, относящиеся особенно к оформлению процессов охлаждения сепарационной камеры, удалению из нее продуктов электролиза и обеспечению безопасности эксплуатации, довольно высоки. Электрофорез может играть определенную роль только в процессах крупномасштабного выделения некоторых ферментов, особенно при сепарации ферментационных мультисубъединиц, которые подвержены разрушению в присутствии твердой фазы и требуются при хроматографии.
Центрифугирование при очень высоких частотах вращения было рассмотрено ранее применительно к сепарации твердой и жидкой фаз.
Однако первоначально намечалось как метод высокоразделяющей сепарации частиц, находящихся в растворе. При использовании для целей дифференциальной миграции ротор ультрацентрифуги заполнялся жидкостью определенной плотности, и к оси ротора таким образом добавлялась некоторая кольцевая зона. Эта зона подвергалась воздействию центробежных сил, что заставляло частицы различной плотности мигрировать из нее наружу с различными скоростями. Метод приобрел большое значение при очистке вирусов, которые по своей величине, в общем, на один порядок крупнее молекул ферментов. Гравитационные поля, требующиеся для разделения молекул ферментов, слишком велики. Поэтому в настоящее время очевидно, что использование метода будет и впредь ограничиваться экстремально крупными ферментативными комплексами. Кроме того, даже при использовании наиболее подходящих по величине роторов эффективная вместимость, центрифуг незначительна. Как и в случае электрофореза, метод зонального ультрацентрифугирования имеет то преимущество, что он не связан с наличием в жидкости твердой фазы. Однако присутствующие в растворе химические вещества, создающие градиент плотности, могут повреждать структуру комплексов ферментов.
Общепринято к отделочным операциям относить такие, как стерилизация продукта, уменьшение его размеров в товарном виде, таблетирование и составление рецептур, а также обессиливание ферментов, их концентрирование, высушивание, хранение на складе и контроль чистоты. Хотя эти установленные конечные, или отделочные операции предшествуют непосредственному выпуску препаратов в продажу, они могут в ряде случаев иметь даже более важное значение, чем собственно операции очистки ферментов. Во всяком случае, для внеклеточных ферментов дело обстоит именно так. Для ряда практических применений внутриклеточных ферментов фракционирование требуется лишь для того, чтобы избавиться от некоторых контаминантов. Остальные требования определяются исключительно стремлением придать выпускаемому продукту надлежащую форму и внешний вид и необходимостью точной и воспроизводимой их специфичности. Большинство отделочных операций — это скорее обобщение результатов практических традиционных приемов работ внутри той пли иной компании, чем воплощенный в натуре итог исследований. Исследовательские учреждения обычно не интересует такое свойство продукта, как сохраняемость; их критерий чистоты часто отличается от критерия, каким руководствуется изготовитель.
Многие ферментные препараты нуждаются в освобождении от неорганических солей, которые придают продуктам неприятный запах и нежелательны в клиническом отношении. Обессоливание ферментных препаратов может также играть важную роль как промежуточная стадия в технологическом процессе выделения химически чистых ферментов. В частности, эта стадия предшествует очистке ферментов с помощью ионообменной абсорбции. Термин «обессоливание» также широко применяется для описания процессов удаления любых низкомолекулярных соединений из ферментных препаратов с помощью операций, которые не учитывают различий между ионами и незаряженными низкомолекулярными соединениями.
Классический метод удаления из препаратов мелких ионов с использованием смешанной ионообменной насадки был применен к очистке некоторых наиболее устойчивых ферментов. Это применение основывается на наличии у гидрофобных углеводородно-основных ионообменников пор весьма малого размера. Такие ионообменники имеют очень низкую емкость по макромолекулам, но высокую емкость по ионам. Посредством применения смешанной насадки из катионных и анионных ионообменных смол становится возможным удалить из обрабатываемых препаратов как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. К сожалению, гидрофобная природа указанных ионообменников и формирование на их поверхностях мощных зарядов приводят к возможности денатурации обрабатываемых ферментов. Данный метод имеет значительную конкуренцию со стороны второго хроматографического метода — метода гельфильтрации, который был описан выше. Возможности этого метода для осуществления, в промышленных масштабах операций удаления из ферментных препаратов различных ионов или мелких молекул доказаны вполне надежно. При этом неизбежно разбавление препаратов. В процесс вовлекаются только две фракции, а поскольку гельфильтрация не предполагает использования специфических сорбционных участков насадки, она может проводиться при высокой загрузке колонки, что ограничивает степень разбавления. Серьезно осложняет разделение ферментных препаратов высокая вязкость соответствующих растворов; не меньшую проблему составляет засорение геля белковыми материалами. Однако применение Сефадекса, который представляет собой декстран G-25 с поперечными связями, снимает последнюю проблему, так как он выдерживает очистку с помощью раствора гидроокиси натрия.
При удалении из ферментных препаратов всех низкомолекулярных соединений важную роль играют два мембранных метода — диализ и ультрафильтрация. Обычно ультрафильтрация будет позволять удалять низкомолекулярные соединения по существу с той же скоростью, как и воду. Обеспечив подпитку воды в ультрафильтрационную камеру, можно добиться достаточно эффективного удаления из системы и других молекул, помимо молекул воды. «Диафильтрация» обычно осуществляется при разбавлении на первой стадии препарата до необходимого уровня с тем, чтобы снизить до минимума концентрационную поляризацию.
Теоретически ультрафильтрация превосходит по своим возможностям диализ, так как ее реализация не требует преодоления предельной концентрации соли на фильтрующей стороне мембраны. Однако концентрация соли при диализе может поддерживаться на низком уровне благодаря быстрому пропусканию воды через фильтрующую сторону мембраны. Для этой цели может оказаться полезным применение деионизированной воды, позволяющее предотвратить контаминацию мембраны металлическими солями при промывке ее противотоком.
Серьезные ограничения, которые могли бы налагаться на процессы ультрафильтрации концентрационной поляризацией, в случае очистки диализом не выявлены, хотя это явление не теряет своей значимости с точки зрения достижения эффективного перемешивания потока продукта.
Фирмы, выпускающие оболочки для колбасных изделий,» в качестве вторичных продуктов производят также трубки для диализа. При этом в процессе производства соответствующих мембран в них неизбежно остается определенное количество металлических ионов и соединений, содержащих серу. Металлические ионы могут вызывать денатурацию обрабатываемых ферментов. Поэтому мембраны перед их применением подвергаются обычно кипячению в несколько раз сменяемых порциях воды, куда может добавляться этилендиаминтетрауксусная кислота.
В результате исследований процесса ультрафильтрации разработано новое поколение микротрубчатых диализирующих мембран. Мембраны образуются из большого количества микротрубок, заделываемых вместе в так называемый модуль с общим входом и общим выходом. Соотношение площади поверхности модуля и его объема является очень высоким. Конструкция оказалась весьма эффективной, если не считать подверженности ее забиванию нерастворимыми твердыми веществами. Кроме того, изготовление модулей обходится довольно дешево. Есть основания надеяться, что высокая эффективность диализирующих мембран подобного рода и их модульная форма вновь пробудят интерес к практическому применению процессов диализа.
Подобно ультрафильтрации, диализ может привести к значительной утрате активности фермента, однако маловероятно, что эта утрата обязана наличию срезающих усилий. Скорее всего инактивация фермента при диализе происходит из-за наличия в мембранах каких-то контаминантов или межфазных границ, локально ограничивающих поток материала.
Концентрирование — одна из основных стадий технологического процесса выделения внеклеточных ферментов. Как отделочная операция концентрирование обычно осуществляется методами сушки. При выделении внутриклеточных ферментов часто оказывается необходимым сконцентрировать жидкость во время промежуточной стадии очистки, поскольку высокая разделяющая способность соответствующих методов может приводить к избыточному разведению продукта. При низких уровнях содержания белка последний имеет выраженную тенденцию к покрытию рабочей поверхности плотным слоем. Твердые фазы, применяемые в хроматографии, обладают особенно большой площадью поверхности.
При концентрировании ферментов может применяться оборудование, обеспечивающее испарение влаги из материала при пониженных температурах, как это уже сделано применительно к технологии производства фруктовых соков могут быть использованы методы полного осаждения или полной адсорбции. Для изоляции внутриклеточных ферментов разумное применение соответствующей стадии обработки в определенные моменты процесса многостадийной очистки может в ряде случаев позволить исключить необходимость проведения собственно стадии концентрирования, которая по своей сути должна рассматриваться как непроизводительная. Такое построение процесса особенно важно в промышленных условиях, где концентрирование обходится довольно дорого, протекает медленно и может часто приводить к денатурации больших количеств продукта.
Для сушки ферментов могут с успехом применяться промышленные методы, разработанные применительно к получению » пищевых и фармацевтических продуктов. Как и в случае других биологических материалов, наиболее устойчивые ферменты могут быть высушены в распылительных сушилках или тепловым способом под вакуумом; менее стойкие требуют сушки в за мороженном состоянии (сублимационная сушка).
Большинство внутриклеточных ферментов, поступающих в продажу от специализированных компаний в высушенном состоянии, производится методом сублимационной сушки. И, как правило, всегда велик соблазн, приняв, что все внутриклеточные ферменты являются в высшей степени лабильными, ориентироваться на их сушку толь ко сублимацией. Однако истинное положение дел требует не принимать подобного опрометчивого решения без предварительного испытания более дешевых и простых способов сушки.
Для получения сухих препаратов внеклеточных ферментов широко применяется распылительная сушка. Достигаемая при этом степень концентрации ферментов приводится ниже, при обсуждении результатов и подобных продуктов. Классические выпарные аппараты корпусного или трубчатого типов или типа падающей пленки для концентрирования ферментов находят ограниченное применение из-за трудностей контроля пенообразования и обрастания рабочих поверхностей осадком. Могут быть применены пластинчатые теплообменники. Выпарную установку лучше всего нагревать горячей водой под высоким давлением. Концентрирование жидкости осуществляется непосредственно из системы, находящейся в слое паров, по мере его расширения с большой скоростью. Подвергаемые обработке растворы ферментов должны иметь гомогенную консистенцию, быть хорошо отфильтрованными и свободными от воздуха и крупных инородных частиц. Для предотвращения кавитации следует применять насосы вытесняющего действия. Температура должна поддерживаться на уровне 40 °С или даже ниже. При типичном процессе растворы ферментов обычно концентрируются в две стадии: от 8 или 12 % содержания твердых веществ до 35%, а затем — до 65%.
В настоящее время основным применением ультрафильтрации является концентрирование, так как концентрационная поляризация существенно препятствует осуществлению многих процессов фракционирования с использованием этого метода, хотя в случае осветленных культуральных жидкостей он позволяет удалить из препарата большую долю низкомолекулярных составных частей. (Уровень сконцентрированного белка во внеклеточной культуральной жидкости будет обычно невысоким, вследствие чего поляризация будет носить ограниченный характер.) Представляется, что подобное применение ультрафильтрации будет быстро прогрессировать и расширяться по мере того, как будет возрастать надежность информации о свойствах системы, которая подлежит обработке.
Наиболее важными операциями концентрирования являются те, которые определяются как фракционирование. В частности, операции осаждения или преципитации и адсорбции служат одновременно и операциями концентрирования. Для выделения целевых продуктов из нативных внеклеточных ферментов пли из нативных внутриклеточных ферментных препаратов реальных процессов выделения соответствующих препаратов.
Бактериальная а-амилаза была получена в сухом состоянии на вакуумной сушильной установке. При этом из 5000 л фильтрата культуральной жидкости, подвергнутого фракционированию спиртом, за 8 ч работы было получено 73,5 кг продукта. При промышленном производстве аспарогеназы сублимационным методом было получено несколько килограммов готового продукта. Для сушки ферментных препаратов сублимацией весьма важно обеспечить максимально полное удаление влаги из обрабатываемого материала.
источник
Электрофорез — метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных микрочастиц в жидкой среде под действием внешнего электрического поля.
Существует три различных электрофоретических метода. Под собственно электрофорезом обычно понимают зональный электрофорез (ЗЭ), два других называют методами изоэлектрофокусирования (ИЭФ)и изотахофореза (ИТФ).Электрофорез применяют главным образом для разделения веществ, молекулы которых различаются по электрофоретической подвижности, т. е. отношению скорости электрофореза (скорости перемещения заряженных частиц вещества) к напряженности электрического поля, которое зависит от свойств заряженных частиц окружающей их среды. Путем изменения внешних условий (например, рН среды, температуры, силы тока, состава и концентрации буферного раствора или носителя) создают подходящие условия для разделения. Вследствие того что при разделении на молекулы действуют только электростатические силы, электрофорез считают «мягким» методом и поэтому часто применяют для работы с лабильными веществами.
Электрофорез можно проводить в растворе, но из-за неизбежного выделения теплоты и возникающей в связи с этим тепловой конвекции процесс, как правило, проводят на носителе. Вследствие некоторых сопутствующих явлений (адсорбция, несоизмеримость размеров высокомолекулярных соединений и пор носителя) введение носителя ограничивает область применения метода. Однако свойства носителя иногда используют для повышения эффективности разделения: например, при электрофорезе в градиенте полиакриламидного геля фракционирование осуществляется не столько за счет различной электрофоретической подвижности веществ, сколько за счет различия в их молекулярных массах.
Зональный электрофорез (ЗЭ) — это метод разделения заряженных частиц в электрическом поле, основанный на том, что частицы с разными соотношениями заряд/масса мигрируют с различными скоростями. В зависимости от знака заряда молекулы вещества мигрируют в электрическом поле по направлению к аноду или катоду.
Результаты этого процесса регистрируются на электрофореграфе (по аналогии с хроматографией).
Ранее использовали один и тот же буфер в слое носителя электродных камерах, т. е. разделение вели в непрерывной буферной системе. В настоящее время этот прием еще применяют при электрофорезе на бумаге и пластинках. Приэлектрофорезе в прерывистой буферной системе (различные буферы в слое носите электродных камерах) быстро мигрирующие вещества образую более узкие зоны. Электрофорез в прерывистой буферной системе используют главным образом в гель-электрофорезе. ЗЭ обычно проводят на бумаге, пластинках и в гелях в водных буферных растворах.
При электрофорезе в электродных камерах происходит электролиз раствора и вследствие этого изменяется состав буфера. Поэтому электроды располагают так, чтобы они не касались носителя, а контакт между ними осуществлялся при помощи полосок фильтровальной бумаги. Электродная камера разделена на два отсека, которые соединяются дополнительным мостиком из фильтровальной бумаги. Подбирая соответствующий объем электродных камер или перекачивая буфер насосом от анода к катоду, поддерживают постоянными концентрацию и значение рН буфера в двухкамерной системе. Рекомендуется также проводить деполяризации электродов после каждого электрофоретического разделения.
Материалы-носители подразделяются на две группы:
первая — бумага, целлюлоза, ацетилированная целлюлоза, агароза и материалы для ТСХ(например, силикагель);
вторая — крахмал и полиакриламид.
Эффективность разделения зависит не только от суммарного заряда молекул анализируемых веществ, но и от размеров молекул. Определяющим параметром является соотношение заряд — масса.
Носители первой группы относительно инертны и слабо влияют на эффективность разделения. Материалы второй группы обладают пористой структурой, что существенно влияет на качество разделения. Поскольку размеры пор соизмеримы с размером макромолекул, то можно разделять вещества с одинаковыми суммарными зарядами, но с разными молекулярными массами (например, при ионообменной хроматографии).
Электрофорез на бумаге позволяет экстрагировать вещества из соответствующих зон или пятен и использовать для дальнейшей работы; обнаруживать вещества, используемые в бумажной хроматографии; проводить фракционирование в двух направлениях.
Для электрофореза на бумаге используют специальные сорта бумаги, характеризующиеся следующими свойствами: достаточной механической прочностью; удовлетворительным для удерживания достаточного количества электролита и образца.
Наряду с камерами погружного типа применяют камеры для электрофореза в тонком слое с охлаждаемыми пластинами, в которых лист бумаги помещают между двумя изолирующими пленками.
Электрофорез в тонком слое проводят на стеклянных пластинках, покрытых слоем носителя. По сравнению с полосками бумаги пластины более удобны в обращении. Электрофорез на бумаге и в тонком слое применяют для исследования фракций, полученных при колоночной хроматографии, ферментативных гидролизатов белков, метаболитов, а также для разделения аминов, аминокислот, пептидов и белков, нуклеотидов, фенолов, нафтолов, фенолкарбоновых кислот, красителей, неорганических соединений.
Гель- электрофорез. Вместо целлюлозы и силикагеля можно использовать мягкие гели. Ниже приведены основные рабочие стадии проведения электрофореза в слое геля: приготовление гелей и подготовка образца ® электрофоретическое разделение ® детектирование ® анализ результатов и оформление их в рабочем журнале. Из множества гелей на практике применяют только два — гели агарозы и полиакриламида. В зависимости от способа приготовления геля и типа буферной системы различают несколько вариантов метода:
· электрофорез в геле полиакриламида (ПААГ);
· диск-электрофорез (диск-ПААГ) в прерывистой буферной системе;
· электрофорез в геле полиакриламида в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ);
· электрофорез в градиенте пористого полиакриламидного геля.
Гель окрашивают красителем. Поскольку молекулы красителя заряжены, гель можно обесцвечивать электрофоретически при напряжении 50 В. В местах, не содержащих исследуемое вещество, гель обесцвечивается. Количественную оценку проводят спектрофотометрически при помощи сканирующего денситометра.
После усадки гелей в водном этаноле или ацетоне их высушивают между двумя листами целлофана в вакууме при слабом нагреве.
Гель-электрофорез применяют для разделения всех классов заряженных веществ, например белков, ферментных комплексов, вирусов, олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот; определения молекулярных масс биополимеров; анализа белков на микроуровне (антигенов при количественном иммуноэлектрофорезе).
При электрофорезе в свободном потоке электролит (буфер) перемещается в вертикальном направлении (перпендикулярно направлению электрического поля). Заряженные частицы под действием электрического поля мигрируют в горизонтальном направлении и одновременно увлекаются потоком буфера. В итоге разделенные вещества распределяются в потоке в соответствии с их электрофоретической подвижностью и элюируются из прибора в различных фракциях. Электрофорез в свободном потоке применяют для препаративного разделения заряженных частиц, в том числе коллоидных, субклеточных частиц и клеток.
Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ). С помощью изоэлектрического фокусирования по изоэлектрическим точкам (ИЭТ) разделяют амфотерные вещества, в частности белки. Сущность метода заключается в том, что молекулы белков мигрируют под действием электрического поля в среде с линейным и стабильным градиентом рН до достижения области рН, соответствующей их ИЭТ.
Изоэлектрическое фокусирование отличается от зонального электрофореза тем, что разделение осуществляется не в буфере с постоянным значением рН, а в среде с линейным градиентом рН. Значение рН минимально вблизи анода, максимально — вблизи катода. Главное условие эффективного разделения белков — наличие стабильного градиента рН среды. В связи с тем что белки обладают амфотерными свойствами, необходимо, чтобы амфолиты – носители — вещества, с помощью которых формируется градиент рН, обладали высокой буферной емкостью. Амфолиты — носители представляют собой многокомпонентную смесь изомеров и гомологов алифатических полиаминополикарбоновых кислот, сульфокислот и фосфоновых кислот, изоэлектрические точки которых располагаются в широкой области значений рН.
ИЭФ применяют для аналитического разделения пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов и препаративного разделения белков; накопления следовых количеств веществ из больших объемов пробы; определения электрофоретической подвижности.
Необходимым условием проведения ИЭФ является наличие высокого напряжения при низкой ионной силе раствора. Однако именно в этих условиях усиливается электроосмос. Отрицательное воздействие на эффективность разделения веществ оказывают так же примеси солей, занесенные вместе с реактивами (гели для ИЭФ следует готовить из особо чистых реактивов). Для проведения ИЭФ более всего подходит полиакриламидный гель с низкими электроосмотическими свойствами. Продолжительность эксперимента зависит от напряженность поля и характера изменения рН- градиента.
Препаративное изоэлектрическое фокусирование проводят в вертикальных колонках (в градиенте плотности сахарозы, глицерина, этиленгликоля) или в слое инертного материала. В качестве таких материалов используют гранулированные гели (рН градиент формируют с помощью амфолитов).
источник
1. Широкое применение в медицинской практике ферменты находят в качестве диагностических (энзимодиагностика)и терапевтических (энзимотерапия)средств. Ферменты также используются в качестве специфических реактивовдля определения ряда метаболитов. Например, фермент глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови; фермент уреазу используют для оценки содержания в биологических жидкостях мочевины; с помощью различных дегидрогеназ выявляют наличие соответствующих субстратов, например пирувата, лактата, этилового спирта и т.д.
2. Энзимодиагностиказаключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека.
Важная особенность ферментов, используемых в диагностике, состоит в том, что можно определить активность каждого из них в природном биоматериале без предварительного фракционирования: в крови, моче, спинномозговой жидкости, слюне, желудочном и кишечном соке и др.
К ферментам, используемым в энзимодиагностике, предъявляют следующие требования:
• органоспецифичность (тканеспецифичность) фермента;
• выход фермента в кровь при повреждении органа или ткани;
• низкая активность фермента в крови в норме.
При этом условно различают:
• Неспецифические ферменты, которые присутствуют во всех тканях в разных количествах;
• тканеспецифические ферменты, присутствующие только в данной конкретной ткани.
Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но с разной первичной структурой белка, называют изоферментами.Они отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента. Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты или их субъединицы. На различиях в физико-химических свойствах и основаны методы определения изоферментов. Изоферменты часто являются органоспецифичными,так как в каждой ткани содержится преимущественно один тип изоферментов. Следовательно, при повреждении органа в крови появляется соответствующая форма изофермента. Обнаружение определенных изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.
Например, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ)катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты) (рис. 2.31). Лактатдегидрогеназа — олигомерный белок с мол. массой 134 000, состоящий из четырех субъединиц двух типов — М (от англ. muscle — мышца) и Н (от англ. heart — сердце). Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования пяти изоформ лактатдегидрогеназы (рис. 2.32, А). Активная ЛДГ представляет собой одну из комбинаций:
ЛДГ1 и ЛДГ2 наиболее активны в сердечной мышце и почках, ЛДГ4 и ЛДГ5— в скелетных мышцах и печени. В остальных тканях имеются другие варианты этого фермента. Изоформы ЛДГ различаются по молекулярной массе, заряду, электрофоретической подвижности, что позволяет устанавливать тканевую принадлежность изоформ ЛДГ (рис. 2.32, Б). Для диагностики заболеваний сердца печени и мышц необходимо исследование изоформ ЛДГ в плазме крови методом электрофореза. На рис. 2.32, В представлены электрофореграммы плазмы крови здорового человека, больного инфарктом миокарда и больного гепатитом. Выявление в плазме крови тканеспецифических изоформ ЛДГ широко используется в качестве диагностического теста. При поражении печени в крови повышается активность ЛДГ5, а при инфаркте миокарда — ЛДГ1.
Другим примером может служить креатинкиназа. Креатинкиназа (КК)которая катализирует реакцию образования креатинфосфата (рис. 2.33). Молекула КК представляет собой димер, состоящий из субъединиц двух типов М (от англ. muscle — мышца) и В (от англ. brain — мозг). Эти субъединицы образуют три изофермента: ВВ, МВ, ММ. Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ — в скелетных мышцах и МВ — в сердечной мышце. Изоформы КК имеют разную электрофоретическую подвижность (рис. 2.34). Определение активности КК в плазме крови имеет значение при диагностике инфаркта миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.
Рис. 2.31. Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой (ЛДГ)
Рис. 2.32. Изоформы лактатдегидрогеназы:
А — строение различных изоформ ЛДГ; Б — распределения на электрофореграмме и относительные количества изоформ ЛДГ в различных органах; В — содержание изоформ ЛДГ в плазме крови в норме и при патологии (электрофореграммы — слева и фотометрическое сканирование — справа)
Рис. 2.33. Реакция, катализируемая ферментом креатинкиназа (КК)
Рис. 2.34. Структура и электрофоретическая подвижность различных изоформ креатинкиназы
При карциноме простаты, патологии костной ткани, метастатических карциномах определяют активность кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, холинэстеразы и некоторых других органоспецифических ферментов в сыворотке крови.
• Энзимодиагностикаиспользуется для установления диагноза при заболеваниях различных органов. Набор анализов зависит от возможностей конкретной биохимической лаборатории и постоянно совершенствуется. Наиболее распространены следующие энзимодиагностические тесты:
— при заболеваниях сердца (инфаркт миокарда) — лактадегидрогеназа, креатинкиназа, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза. Одним из первых белков при инфаркте миокарда в крови появляется белок — тропонин;
— при заболеваниях печени — аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, ацетилхолинэстераза, гамма-глутамилтранспептидаза. При заболеваниях поджелудочной железы — панкреатическая амилаза, липаза;
— при заболеваниях простаты — кислая фосфатаза.
3. Применение ферментов в качестве лекарственных препаратовактивно развивают в следующих направлениях:
• заместительная терапия — использование ферментов в случае их недостаточности;
• элементы комплексной терапии — применение ферментов в сочетании с другой терапией.
Сейчас ферментативные препараты применяются в хирургии, терапии, акушерстве и гинекологии, урологии, стоматологии, отоларингологии и многих других областях медицины.
Заместительную энзимотерапию проводят при отсутствии ферментов в организме (наследственном или приобретенном). Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при гастритах со сниженной секреторной функцией. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приемом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезимфорте и др.).
Известно, что трипсин и химотрипсин практически не атакуют живые клетки, а легко расщепляют белки мертвых клеток. На этом основано их применение для очистки гнойных и некротических ран, лечения сильных ожогов, отморожений, пролежней, гангренозных поражений на почве диабета и атеросклероза, гнойных заболеваний мочевого пузыря и др. Наряду с наружным применением оба фермента стали использовать, вводя их в плевру (в бронхи) аэрозольным способом при лечении эмфизем легких, гематом грудной полости.
Дезоксирибонуклеазу, гидролизующую ДНК вирусов и бактерий, используют в качестве противовирусных препаратов при лечении аденовирусных конъюнктивитов, герпетических кератитах, а также для ингаляций в виде аэрозолей при гнойном бронхите, бронхиальной астме, абсцессах легких.
Ферментные препараты стали широко применяться при тромбозах и тромбоэмболиях для разрушения тромба. С этой целью используют препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы.
Гиалуронидаза (лидаза) гидролизует компонент межклеточного матрикса — гиалуроновую кислоту, повышая проницаемость ткани и сосудистых стенок. Она широко применяется вместе с препаратами для местной анестезии, ускоряя действие и снижая расход анестезирующего вещества, а также используют подкожно и внутримышечно для рассасывания спаек и рубцов после ожогов и операций.
Ферменты используют и в онкологии, например, для замедления развития лейкозов. Известно, что в лейкозных клетках отсутствует фермент, катализирующий синтез аспарагина. Они получают эту аминокислоту из крови. Внутривенное введение фермента аспарагиназы, катализирующего гидролиз аспарагина (рис. 2.38), снижает его концентрацию в крови, тем самым ограничивает поступление аминокислоты в опухолевые клетки При этом в лейкозных клетках на фоне дефицита аспарагина замедляется синтез белков, приводящий к нарушению метаболизма этих клеток, а соответственно и их рост. Развитие нанотехнологий, разработка методов нанокапсулирования ферментов и их направленной доставки к органам-мишеням (включая опухоли) существенно повысят эффективность энзимотерапии различных заболеваний.
Рис. 2.38. Реакция гидролиза аспарагина аспарагиназой
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
источник
Метод электрофореза основан на явлении миграции — движении ионов в электрическом поле. Различия в величинах подвижностей отдельных ионов используют для их разделения. Большинство электрофоретических методов нельзя отнести к хроматографии, поскольку здесь не происходит распределения частиц между ПФ и НФ. Однако с точки зрения аппаратурного оформления и некоторых теоретических положено ний методы электрофореза сходны с плоскостной и капиллярной хроматографией.
Различают метод простого электрофореза и электрофореза на носителе.
Метод простого электрофореза реализован как процесс перемещения ионов вблизи границы контакта исследуемого и буферного растворов (рис. 4.14). Растворы заливают в U-образную трубку. Во избежание механического перемешивания находящийся сверху буферный раствор должен иметь плотность меньшую, чем исследуемый.
Рис. 4.14. Схемы установок для простого электрофореза (слева) и электрофореза на бумажном носителе (справа)
Если при наложении постоянного напряжения на электроды ионы, находящиеся в исследуемом растворе, концентрируются вблизи поверхности раздела растворов, образуя зоны, такой электрофорез называют фронтальным.
Чаще применяют электрофорез на носителе — ионы перемещаются в неподвижном слое носителя (бумага, гель, силикагель), который пропитан раствором инертного электролита. Края слоя контактируют с буферными растворами, в которые погружены электроды. Исследуемый раствор в виде полоски наносят у одного из концов слоя носителя. В процессе электрофореза ионы исследуемого раствора образуют отдельные зоны. Такой метод носит название зонный электрофорез.
Картина распределения ионов по зонам — называется электрофоре- граммой.
С помощью подходящей буферной смеси и под действием электрического поля можно создать зоны с соответствующим значением pH (градиент pH) — такой вариант электрофореза называют изоэлектриче- ским фокусированием. Необходимое условие — наличие устойчивого неподвижного градиента pH. Метод применяют для разделения амфолитов (аминокислот, белков).
Изотахофорез — вариант электрофореза, основанный на движении различных частиц в электрическом поле с одинаковыми скоростями.
В рассмотренных выше электрофоретических методах частицы движутся в постоянном электрическом поле Е с различными скоростями ut:
где и. — подвижность /-го иона.
Современный вариант электрофореза называют капиллярным электрофорезом или высокоэффективным капиллярным электрофорезом. Использование капиллярной техники позволяет преодолеть недостатки, присущие классическим методам электрофореза, а именно: недостаточную эффективность и воспроизводимость разделения, трудности регистрации зон отдельных ионов.
На рис. 4.15 показана схема установки для капиллярного электрофореза, которая включает: резервуары с буферными растворами, капилляр с системой охлаждения, источник высокого напряжения, устройства ввода пробы, детектора и регистрирующего устройства.
Рис. 4.15. Схема установки для капиллярного электрофореза
Обычно пробу вводят со стороны катода под действием силы тяжести или электрокинетических сил. Во внутреннем пространстве капилляра разделяемые ионы движутся к противоположному электроду. Из-за системы охлаждения капилляр практически не нагревается, поэтому конвекционные потоки жидкости незначительны. Поэтому ширина полученных пиков соответствует теоретически возможному минимуму.
Детектор располагают возле одного из концов капилляра. Расстояние от детектора до противоположного конца капилляра называют эффективной длиной капилляра.
Капиллярные методы имеют одну особенность, связанную с элек- троосмотическим потоком. Причина его возникновения — образование двойного электрического слоя между раствором и внутренней поверхностью капилляра (рис. 4.16). При этом внутренняя поверхность электрода заряжается отрицательно и притягивает из раствора положительные ионы. Жидкость, находящаяся в капилляре, оказывается заключенной в положительно заряженную трубку. При наложении напряжения весь объем жидкости начинает двигаться к катоду, т. е. происходит образование электроосмотического потока.
Рис. 4.16. Схема электроосмотического потока, возникающего в результате образования двойного электрического слоя
Электроосмотический поток можно уменьшить, подавить или повернуть в противоположном направлении, используя химическую модификацию капилляра. При отсутствии электроосмотического потока наложение напряжения приводило бы к тому, что все положительные ионы двигались бы к катоду, а отрицательно заряженные — к аноду.
Так как к катоду вместе с электроосмотическим потоком перемещаются и незаряженные частицы, детектор, установленный вблизи катода, регистрирует сначала катионы, затем нейтральные частицы и некоторые анионы. В таких условиях незаряженные частицы движутся с одной и той же скоростью и поэтому не разделяются. Их разделение возможно при наличии в растворе поверхностно-активных веществ, которые образуют мицеллы. Такой метод разделения нейтральных частиц называется мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографией и основан на распределительном равновесии с участием (псев- до)фаз — мицеллярной (аналог ПФ в хроматографии) и фазой раствора (аналог НФ).
источник
Учебно-методическое пособие для вузов (Практикум) Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета 2008 Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 5 мая 2008 г., протокол № Рецензент доктор биологических наук, профессор О.С. Корнеева Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.
Рекомендуется для студентов биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета всех форм обучения.
Для специальности: 020201 – Биология
Основные принципы выделения и очистки ферментов Тема 1.
Работа 1. Измерение скорости ферментативной реакции Работа 2. Разрушение клеток и экстракция Работа 3. Фракционирование солями Работа 4. Обессоливание с помощью сефадекса G-25 Работа 5. Применение ДЭАЭ-целлюлозы для разделения белков Работа 6. Определение молекулярной массы нативного фермента с помощью гель-хроматографического метода Электрофорез белков Тема 2.
Работа 1. Нативный ступенчатый электрофорез Работа 2. Электрофорез белков с ДДС по Лэммли Работа 3. Универсальное окрашивание белков в ПААГ Работа 4. Специфическое проявление белков в ПААГ Исследование каталитических свойств ферментов Тема 3.
Работа 1. Определение константы Михаэлиса Работа 2. Определение зависимости скорости реакции от температуры Работа 3. Определение зависимости скорости реакции от рН Работа 4. Исследование влияния ингибиторов Приложение 1 Приложение 2 Приложение 3 Список литературы
Белки – это высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. В клетке Еscherichia coli содержится около 3000 различных белков, а в организме человека насчитывается более 100 000 разнообразных белков.
Исследования строения и функций белков предполагают наличие высокоочищенных препаратов. Получение же белка в гомогенном состоянии – достаточно сложная задача. Как правило, биологический материал, являющийся источником выделения, содержит большое число белков, их комплексов друг с другом и другими биополимерами. Близкие свойства компонентов этой смеси требуют при выделении индивидуальных белков использования разнообразных методов и различных их сочетаний. Трудности получения чистого белка связаны также с лабильностью белков и опасностью их денатурации, что сужает круг возможных методов выделения.
Работа 1. Измерение скорости ферментативной реакции 1. Общие правила работы с ферментами.
Ферменты – вещества, имеющие лабильную структуру и, как правило, легко подвергающиеся инактивации. Поэтому при работе с ферментами необходимо соблюдать ряд предосторожностей.
• При определении активности фермента на разных стадиях очистки необходимо соблюдать одни и те же условия. По возможности следует подбирать условия, при которых фермент достаточно стабилен. рН среды и температура должны поддерживаться в пределах зоны стабильности фермента. Обычно ферментативные реакции проводят при температуре, лежащей в пределах 25–40 °С. Температура 25 °С соответствует стандартной, которой обычно придерживаются в большинстве случаев при определении ферментативной активности.
• Обычно выделение и очистку ферментов проводят в холодной комнате при температуре 0–4 °С.
• Часто на различных стадиях выделения и очистки ферментов необходимо интенсивное перемешивание ферментного раствора. Однако многие ферменты подвергается денатурации на поверхности раздела. Поэтому следует избегать сильного вспенивания при перемешивании. Для избегания возникновения пены ферментный раствор следует переливать из одного сосуда в другой осторожно, по стенке.
• Часто даже при наиболее благоприятных условиях наблюдается медленная инактивация фермента со временем. В связи с этим рекомендуется проводить очистку фермента как можно быстрее.
• В состав ферментных растворов нередко вводят стабилизаторы. Стабилизации ферментов, как правило, способствует добавление глицерина, альбумина. Наличие в ферментных растворах восстановителей (тиолов, аскорбиновой кислоты) защищает ферменты от окисления. ЭДТА, глутатион, цистеин препятствуют инактивации ферментов под действием ионов тяжелых металлов, которые в следовых количествах могут содержаться в дистиллированной воде.
2. Измерение скорости ферментативной реакции.
Наиболее существенную часть в методике исследования ферментов составляет измерение скорости ферментативной реакции. По скорости реакции принято определять количество присутствующего фермента. Скорость реакции характеризуется ферментативной единицей (Е). За Е любого фермента принимается то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при 25 °С в оптимальных условиях действия фермента. Температура 25 °С является стандартной в физической химии. Удельная активность выражается в ферментативных единицах на мг белка. Для того чтобы точно измерить скорость реакции, нужно проводить определение ферментативной активности в самом начале реакции, т. е. тогда, когда еще имеется избыток субстрата, минимальное количество продуктов реакции, и фермент находится в активной форме.
3. Методы количественного определения ферментативной активности бывают флуоресцентные, манометрические, поляриметрические, электродные, вискозиметрические, спектрофотометрические (в настоящее время для определения активности ферментов применяются наиболее широко).
Эта группа методов основана на способности многих субстратов и продуктов ферментативных реакций поглощать свет в определенных участках спектра. Положение максимума поглощения определяется наличием в химическом соединении определенных групп, например, линейных или циклических систем с сопряженными двойными связями. Спектрофотометрические методы отличаются высокой чувствительностью, малыми затратами времени, реактивов и ферментного препарата).
Раствор крахмала (0,2%), 0,1%-й раствор йода в 0,2%-м растворе йодида калия, раствор слюны – рот ополаскивают 2–3 раза водой, отмеряют цилиндром 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в течение 3–5 мин в несколько приемов, собранную жидкость фильтруют через вату и фильтрат используют в качестве источника фермента.
Среда спектрофотометрирования: 50 мМ трис-HCl-буфер, рН 7.5, 1.5 мМ оксалоацетат (М.в. 132 г/л), 0.15 мМ НАДН Na2 (М.в. 709.4 г/л).
Среда спектрофотометрирования 2: 100мМ трис-HCl буфер, рН 9.0, 4 мМ малат (М.в. 134.1 г/л), 1 мМ НАД+ (М.в. 663.4 г/л).
Спектрофотометр, набор варипипеток, кюветы, буфер, экстракт фермента, среды спектрофотометрирования, дистиллированная вода и др.
1. Действие амилазы: амилаза (КФ 3.2.1.1.) является ферментом, который катализирует гидролиз -глюкозидной связи -1,4-крахмала и гликогена до промежуточных продуктов – декстринов. Крахмал обладает способностью образовывать с йодом соединение синего цвета, амилодекстрин – фиолетового, эритродекстрин – красно-бурого, ахродекстрин – желтого.
В две пробирки вносят по 5 мл крахмального клейстера, в одну из них добавляют 0,5 мл раствора слюны, содержащей амилазу, хорошо перемешивают и оставляют стоять. Через 15 мин в обе пробирки прибавляют по 5 капель раствора йода. В пробирке с амилазой слюны раствор через некоторое время становится бесцветным, в пробирке без амилазы раствор остается сине-фиолетовым.
2. Измерение активности малатдегидрогеназы. Малатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.37.) катализирует превращение малата в оксалоацетат и наоборот в присутствии НАД+ или НАДН в качестве кофермента. Для определения скорости восстановления оксалоацетата МДГ в кювету внести 3 мл среды спектрофотометрирования 1 и начать реакцию добавлением 0.01 мл раствора МДГ. Для исследования реакций окисления малата использовать среду спектрофотометрирования 2. Метод измерения активности основан на учете изменения оптической плотности (уменьшение или увеличение) при использовании НАДН или НАД+ при 340 нм.
Активность фермента рассчитать по формуле:
где Е – общая активность фермента, мкмоль/мин;
Е – скорость ферментативной реакции;
– коэффициент экстинкции (для МДГ равен 0.482);
t – время измерения скорости ферментативной реакции, мин;
Vобщ – общий объем вытяжки, мл;
Vвн – объем внесения пробы в кювету, мл.
В природе ферменты находятся в виде смесей и комплексов с разнообразными веществами, в том числе с белками. В большинстве случаев примеси других веществ мешают глубокому изучению исследуемого фермента, оказывая на ферментативную активность косвенное влияние путем воздействия на фермент, субстрат или продукты реакции.
Существуют различные методы экстракции (гомогенизаторы, химические, энзиматические, биологические). Животные ткани различаются по своей прочности: легко разрушаются эритроциты, а в кровеносных сосудах, напротив, содержится жесткий коллагеносодержащий материал. Успешным является замораживание ткани в жидком азоте и измельчение ее в замороженном состоянии. Ряд белков можно извлечь из тканей после обработки их ацетоном или другими органическими растворителями. Растительные клетки труднее разрушаются, так как содержат целлюлозную оболочку. Некоторые бактерии легко разрушаются под действием осмотического шока, а более устойчивые с толстой клеточной стенкой требуют механического воздействия, например, ультразвуком.
Таким образом, способы разрушения клеток можно разделить на следующие группы:
1. Мягкое воздействие, которое включает лизис клеток с помощью осмотического шока, разрушение под действием ферментов (лизоцима и др.), химическую солюбилизацию (например, экстракция дрожжей толуолом, при которой частично растворяется клеточная стенка), гомогенизацию вручную (клетки продавливают через зазор).
2. Воздействие средней силы, при котором используют лопастной гомогенизатор или растирание с абразивом (песком, стеклянными шариками).
3. Сильное воздействие с помощью пресса, ультразвука или шаровой мельницы. Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей исследуемого белка. Для растворимого белка используют буферные растворы.
Обычно объем раствора в 2–3 раза превышает объем ткани.
Трис-ЭДТА буфер (ТЕ): 50 мМ трис-НСl, рН 8,0 и 10мМ ЭДТА (М.в. 292,0); свежеприготовленный раствор лизоцима в ТЕ-буфере, 10 мг/мл.
1. Лизис клеток с применением ферментов. Разрушение клеточных стенок с применением детергентов и ферментов проводят с небольшими порциями биомассы. Как правило, время лизиса не превышает 15–30 мин.
Для лизирования клетки E. сoli суспендируют в ТЕ-буфере из расчета 3 мл буфера на 1 г сырой биомассы и нагревают до 37 оС. Добавляют 1 мл раствора лизоцима на каждые 5 мл суспензии или эквивалентное количество сухого лизоцима и инкубируют 10–20 мин при 37 оС.
2. Лизис клеток с помощью детергентов. Это наиболее мягкий и быстрый способ разрушения клеток по сравнению с другими методами. Перед лизисом клетки промывают несколько раз забуференным солевым раствором (например, 10 мМ трис-HCl буфером, рН 7.5, с 150 мМ NaCl). После последнего центрифугирования биомассу суспендируют до плотности 107–108 кл/мл, или 3–4 мг сухих клеток на 1 мл в том же буфере, с добавлением 0,1–0,3 % Тритона Х-100. Содержимое перемешивают и инкубируют на льду от 10 до 90 мин. Для стабилизации белков в экстракт добавляют 0,2 объема 50 % глиицерола. Вместо тритона Х-100 могут быть использованы и другие неионные детергенты.
3. Гомогенизация. Этот способ можно использовать для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой, для животных и некоторых растительных клеток.
Порции биомассы, суспендированные в буферном растворе (3–5 объемов), переносят в ручной гомогенизатор и пропускают через него биомассу 10–20 раз.
При использовании механических гомогенизаторов с блендерами время обработки обычно не превышает 1–2 мин интервалами по 20 с с промежуточным охлаждением биомассы на льду.
4. Обработка клеток ультразвуком. Измельчение клеточных суспензий в ультразвуковом дезинтеграторе широко применяется, особенно для разрушения бактериальных клеток. Однако в данном случае необходимо подобрать режим ультразвуковой обработки, не вызывающий инактивации фермента. Разрушение клеток ультразвуком происходит в результате микроколебаний суспензии, помещенной в стеклянный стакан с излучателем ультразвуковых волн. Ультразвук создает высокую степень вибрации суспензии, вследствие чего происходит механический разрыв клеток. Следует контролировать уровень пенообразования и перемешивать при обработке, поскольку интенсивное пенообразование вызывает денатурацию белков в образующихся тонких пленках на разделе фаз жидкость/газ. Для разрушения бактерий чаще всего используют излучатель на 22 кГц. При выбранном значении облучают суспензию клеток (1 г сырой биомассы и 5 мл среды разрушения) последовательно 6–10 раз с интервалами в 30 с при промежуточном охлаждении излучателя и суспензии в воде со льдом. Полученные клетки затем осаждают на скоростной центрифуге (примерно 20 тыс. g в течение 10–15 мин при 4 оС).
Метод фракционирования солями очень широко используется при очистке ферментов. Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли в растворе. Постепенно повышая концентрацию, можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого фермента в одной из них. Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок.
Наиболее часто для фракционирования белковых смесей употребляют сульфат аммония. Он хорошо растворим в воде, что позволяет получать четкое разделение белковых фракций. Растворимость его мало зависит от температуры, и он, как правило, не оказывает вредного воздействия на ферменты.
Сульфат аммония добавляют к ферментному раствору отдельными порциями, при перемешивании. Тщательное перемешивание и дробное добавление предотвращает местное повышение концентрации соли выше требуемой, что могло бы привести к загрязнению выделяемой фракции.
На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура.
При проведении высаливания концентрацию сульфата аммония выражают не в абсолютных величинах, а в «процентах насыщения» или «долях от полного насыщения». При этом за 100 % (или за 1.0) принимают максимально возможную (насыщающую) концентрацию сульфата аммония при комнатной температуре. Для достижения 100 % насыщения при комнатной температуре на каждый литр раствора необходимо прибавить 760 г сульфата аммония. Исходя из этого соотношения, рассчитывают количество соли, которое необходимо прибавить к определенному объему раствора белка, чтобы достичь определенной степени насыщения. Труднее произвести соответствующие расчеты при дробном высаливании, когда необходимо прибавлять сульфат аммония к раствору, уже содержащему некоторое количество соли. В таких случаях используют для расчетов специальную таблицу (см. приложение 1), горизонтальные строки которой соответствуют определенной степени насыщения исходных растворов, а вертикальные столбцы – той степени насыщения, которую необходимо достичь на данной стадии высаливания.
Магнитная мешалка, центрифуга, супернатант.
Для очистки МДГ из бесклеточного экстракта объемом 5 мл высаливать фракцию насыщения 35–80 %.
I стадия: 35 % (NH4)2SO4 (см. приложение 1);
19.7 г (NH4)2SO4 – 100 мл исходного раствора (супернатант) Таким образом взвесить 0.985 г (NH4)2SO4 и прибавлять к раствору постепенно, небольшими порциями, при обязательном перемешивании.
В ходе высаливания следить за изменениями рН; в случае подкисления провести нейтрализацию разбавленным раствором NH4OH. Каждую последующую порцию прибавляют после полного растворения предыдущей.
Соблюдение этих приемов имеет важное значение, поскольку при местном повышении концентрации соли на данной стадии могут выпасть в осадок белки, высаливаемые при более высокой ионной силе. После растворения последней порции соли раствор перемешивать еще 15–30 мин, а затем центрифугировать при 4 тыс.–10 тыс. g в течение 20–30 мин. На следующей стадии использовать полученный супернатант.
II стадия: 80 % (NH4)2SO4 (см. приложение 1);
29.5 г – 100 мл исходного раствора;
Взвесить 1.1 г (NH4)2SO4 и повторить процедуру, как на стадии 1.
После центрифугирования осадок перерастворить в небольшом объеме 50 мМ трис-НCl буфера (рН 7.5) и измерить в нем спектрофотометрически активность МДГ. Далее освобождают фермент от избытка сульфата аммония путем обессоливания.
Работа 4. Обессоливание с помощью сефадекса G- Белки чаще всего разделяют методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. После того как разные белки достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями. В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их заряду (ионообменная хроматография), размеру (хроматография гель-фильтрацией), или способности связываться с различными химическими группами (аффинная хроматография).
Низкомолекулярные соединения удаляют с помощью гель-фильтрации через сефадекс G-25. Сефадекс – гель, состоящий из полисахаридных цепочек декстрана, сшитых поперечными связями. Цифра сефадекса характеризует пористость. Так, G-10, G-15, G-25 мелкопористые (с небольшим размером пор, т. е. с большим количеством поперечных связей); G-150, G-200 – крупнопористые (с малым количеством поперечных связей).
Приготовление обессоливающей колонки: около 3 г сухого сефадекса G-25 суспендировать в 50 мМ трис-НСl буфере, рН 7.5, где он должен предварительно набухать в течение 3 часов, либо прокипятить на водяной бане в течение 1 ч. Далее заполнить суспензией колонку, и промывать буфером до тех пор, пока кислотность вытекающей из колонки жидкости не станет постоянной (рН 7.5).
Для освобождения от низкомолекулярных примесей, ферментную вытяжку пропустить через колонку (1,510 см) с сефадексом G-25. Объем наносимого образца не должен превышать 4 мл. После нанесения пробы колонку заполнить буферным раствором и начать элюирование трис-HCl буфером, рН 7.5. При этом белковый раствор освобождается от низкомолекулярных примесей, пигментов, и происходит смена буфера, если для экстракции белков использовался иной буфер. Элюат собирать фракциями по 2 мл, измерить активность фермента, продолжить очистку наиболее активной фракции. По окончании фракционирования колонку промыть водой, трис-HCl буфером до постоянного значения рН и вновь использовать для очистки.
Работа 5. Применение ДЭАЭ-целлюлозы для разделения белков В основе ионообменной хроматографии лежат реакции ионного обмена между белками и различными ионообменниками. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы (см. приложение 3).
При взаимодействии белков с ионообменниками в ходе адсорбции образуются множественные электростатические связи между функциональными группами на поверхности адсорбционной матрицы и группами белковых молекул, несущими противоположный заряд. Прочность связывания каждого белка на матрице зависит от ряда факторов и, в первую очередь, от величины заряда белка, зависящей от рН и ионной силы раствора. При пропускании через колонку определенного элюирующего раствора происходит хроматографическое разделение белков в зависимости от степени их взаимодействия с ионообменником. Разрыв связей достигается путем изменения рН или ионной силы протекающего раствора.
Хроматографическая колонка с рабочим объемом 20–30 мл, причем соотношение длины и диаметра колонки может варьировать от 20 до 4, магнитная мешалка, коллектор фракций, центрифуга, химическая посуда, ДЭАЭ-целлюлоза, 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7.5.
Приготовление ионообменной колонки (иониты промышленного изготовления после набухания фракционируют по размеру частиц и подвергают «циклизации» – переводу их из одной формы в другую): около 6 г целлюлозы суспендировать в 50-кратном объеме дистиллированной воды, перемешать и оставить набухать на ночь. Слой жидкости над ионообменником декантировать, снова залить дистиллированной водой, перемешать и через 2–2.5 ч верхний слой жидкости декантировать вместе с неосевшими мелкими частицами. К оставшемуся осадку прилить 15-кратный объем 0.5 М HCl и через 15–30 мин (время обработки анионообменника кислотой не должно быть большим) отмыть водой до рН 5.0. На следующем этапе сорбент обработкой 15-кратным объемом 0.5 М NaOH в течение 30 мин переводят в ОН- форму. Затем осадок на 5 мин заливают свежей порцией щелочи, фильтруют через колонку Бюхнера и отмывают дистиллированной водой до рН 7.0. После этого ионит уравновешивают 15-кратным объемом 50 мМ трис-HCl буфером, рН 7.5 и оставляют его на ночь, после чего заполняют колонку, следя за значением рН. В процессе подобной обработки стабилизируется структура ионита и функциональные группы становятся более доступными. Одновременно ионит освобождается от примесей.
Раствор фермента после стадии очистки через сефадекс G-25 нанести на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (объем раствора белка может значительно варьировать, но его концентрация не должна превышать 5 мг/мл). Колонку промывают буфером для удаления не сорбируемых в данных условиях белков до тех пор, пока в элюате не останется белка. Затем начинают элюцию белка с колонки раствором KCl с линейным градиентом концентрации (0–0.5М) в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5. В смеситель вносят 150 мл буфера, а в питающий сосуд – 150 мл 0.5 М KCl в буфере. Скорость элюции 1–1.5 мл/мин, время разделения около 4 часов. Элюат собирают фракциями по 2 мл и измеряют в них активность фермента.
По окончании фракционирования анионообменник необходимо регенерировать. Для этого к использованному сорбенту добавляют 30-кратный объем 0.2–0.5 н. раствора NaOH, перемешивают до получения однородной суспензии и фильтруют на воронке Бюхнера. Обработку щелочью проводят дважды. После этого ионит отмыть водой до нейтральной реакции фильтрата. Регенерированный анионообменник уравновесить буферным раствором. Хранить в солевой форме, добавляя антисептики: 0.02%-й азид натрия, мертиолоат или хлороформ.
Работа 6. Определение молекулярной массы нативного фермента с применением гель-хроматографического метода Гель-хроматография – метод разделения веществ на основе их молекулярной массы. Принцип метода основан на том, что для большого числа глобулярных белков имеется линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы и объемом элюирования с колонки, заполненной гелем с определенной величиной пор. Поэтому для определения молекулярной массы глобулярного белка достаточно определить объем его элюции с предварительно откалиброванной колонки. Калибровку колонки проводят, пропуская через нее белки с известной молекулярной массой и определяя объем элюции для каждого из них.
Массу исследуемого белка также можно рассчитать по формулам:
lg Mr = 6,0404 – 0,8032(Ve/Vсв) для сефадекса G-150, lg Mr = 6,698 – 0,987(Ve/Vсв) для сефадекса G-200, где Vсв – свободный объем колонки, определяемый эмпирически с помощью голубого декстрана;
Ve – элюционный объем, равный объему элюата, собранного с момента внесения вещества на колонку до момента его элюции с колонки, включая фракцию с максимальным его содержанием.
Чем выше молекулярная масса белка, тем ниже его элюционный объем. Поэтому сначала будут выходить белки с большей молекулярной массой, затем с более низкой и т. д.
Натрий-фосфатный буфер, рН 6.5, сефадекс G-200, голубой декстран (Mr около 2 000 000 Да), белки с определенной молекулярной массой (Да):
яичный альбумин (45 000), бычий сывороточный альбумин (68 000), рибонуклеаза из поджелудочной железы (12 700), цитохром с (13 000).
Приготовление хроматографической колонки: сухой сефадекс G- суспендируют в 100–200-кратном объеме буфера и оставляют набухать в течение 72 ч при комнатной температуре, или же в течение 5 ч на кипящей водяной бане (см. прил. 2). В колонку (отношение длины к диаметру должно равняться 10 : 1, 20 : 1) вносят относительно густую суспензию полностью набухшего геля. Для предотвращения образования пузырьков воздуха в слое геля в колонке суспензию сефадекса перед заполнением колонки можно деаэрировать с помощью водоструйного насоса в колбе Бунзена или вносить его в колонку при температуре, значительно превышающей комнатную (50–60 оС). Для получения хороших результатов разделения и четких пиков колонка должна быть заполнена равномерно, а верхняя и нижняя поверхности сефадекса строго горизонтальны. Сефадексу в колонке дают отстояться, затем с целью уравновешивания и достижения постоянной высоты столба геля колонку промывают 3–5 объемами буферного растовра. Чтобы избежать необратимой деформации частиц геля, максимальное гидростатическое давление при работе с сефадексами не должно превышать допустимого предела – 50, 35, 15 и 10 см водного столба соответственно для сефадексов типа G-75, G-100, G-150, G-200.
Ход работы. За 2–3 часа перед работой колонку с сефадексом следует перенести в холодильник. Исследуемую белковую смесь растворяют в буферном растворе и вносят в колонку. В аналитической работе объем наносимого образца должен занимать не более 1–2 % объема колонки.
Перед использованием колонки определяют ее свободный объем (Vсв.).
Для этого через колонку пропускают 1 мл (1 мг/мл) раствора голубого декстрана (линейный водорастворимый полиглюкан с молекулярной массой около 2 млн, несущий ковалентно присоединенные хромофорные группы) в соответствующем буфере. Наиболее яркую фракцию определяют либо визуально, либо спектрофотометрически при 630 нм.
После определения свободного объема через колонку последовательно пропускают растворы соответствующих белков-маркеров (по 3–4 мг в объеме 0.5–1 мл). Белки удобно наносить последовательно в порядке уменьшения их молекулярной массы с интервалом, зависящим от размера колонки. Во время нанесения белков колонку перекрыть. Элюат, вытекающий из колонки со скоростью 15–20 мл/ч, собирают небольшими порциями (1–2 мл). Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически при 280 нм. Оптическую плотность растворов, содержащих рибонуклеазу, определяют при 230 нм, цитохром с – при 412 нм. Строят профиль элюции отдельных белковых фракций. Для этого вычерчивают график, на горизонтальной оси которого откладывают номера фракций или объем прошедшей через колонку жидкости, а на вертикальной оси – величины оптической плотности фракций. Затем строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы белков-маркеров и объемом элюирования с колонки. После построения калибровочного графика на колонку наносят исследуемый белок и, определив объем элюции, находят по графику его молекулярную массу.
Хранить сефадекс можно в набухшем состоянии (в холодильнике), добавив к нему 0.02%-й азид натрия. Для перевода сефадекса в первоначальное состояние его перемешивают несколько минут с 2-кратным объемом 50%-го этанола и фильтруют на воронке Бюхнера. Затем перемешивают 30 мин с 2-кратным объемом неразведенного этанола и опять фильтруют. Обработку неразведенным спиртом повторяют несколько раз. Осадок высушивают в термостате при 60–80 °С.
Электрофорез занимает центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.
Работа 1. Нативный ступенчатый электрофорез Диск-электрофорез широко применяется в настоящее время для проверки гомогенности ферментных препаратов. Этот метод достаточно быстрый, характеризуется высокой разрешающей способностью и воспроизводимостью, требует небольших количеств исследуемого материала. Используется он и для других целей, например, для идентификации изоферментов, определения молекулярной массы белков и их субъединиц и т. д.
Диск-электрофорез – метод, сочетающий в себе разделение макромолекул по их общему электрическому заряду, по величине молекулярной массы и по форме. Использование двухслойного носителя с различным размером пор и пары буферов, отличающихся между собой по составу и по значению рН, обеспечивает концентрирование веществ в узкой стартовой зоне. Это является существенным для четкого разделения компонентов смеси.
Процедура: ПААГ – синтетический продукт, выполняющий функции молекулярного сита, он химически стабилен и инертен. Прозрачен, лабилен, устойчив к изменениям рН и температуры и не растворим в большинстве растворителей. Получают его путем сополимеризации акриламида (CH2=CH-CO-NH2) и сшивающего агента метиленбисакриламида. Подбирая соответствующую концентрацию акриламида, получают гель с нужным размером пор. При работе с глобулярными белками рекомендуют пользоваться соотношением между средней величиной молекулярной массы разделяемых белков (Мr) и концентрацией (с) акриламида, которую нужно взять для полимеризации:
В качестве катализаторов при получении ПААГ используются персульфат аммония и тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД).
Физический принцип метода. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом – сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала.
Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препарат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом связываться с белками, а скорость его продвижения по гелю должна быть заведомо больше, чем у наиболее быстро мигрирующего белка. Вместе с тем краситель не должен слишком сильно отрываться от белков, чтобы его прохождению до конца пластины или трубки соответствовало использование большей части находящегося в них геля для фракционирования белков. В щелочных и нейтральных буферах, когда кислые белки заряжены отрицательно и мигрируют к аноду, а также для любых белков в комплексе с ДДС-Na (см. ниже) используют отрицательно заряженные красители. Наибольшее распространение получил бромфеноловый синий, имеющий достаточно сложную структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфенольных остатка.
Для характеристики электрофоретической подвижности белков в данных условиях электрофореза принято указывать отношение расстояния, пройденного белковой полосой от начала рабочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя в этом же геле. Это отношение, как и в хроматографии, обозначают Rf.
Прибор для проведения электрофореза, центрифуга.
Растворы для гелей: 1) 1 н. HCl – 48 мл, трис – 36.6 г, тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) – 0.23 мл в 100 мл водного раствора, рН 8.9; 2) 30 г акриламида, 0.8 г метиленбисакриламида в 100 мл водного раствора;
3) 1.4 мг/мл персульфата аммония; 4) 6.4 мл 1М H3PO4, 1.43 г трис, 0.02 мл ТЕМЕД в 25 мл раствора, рН 6.9; 5) 2.5 г акриламида, 0.63 г метиленбисакриламида в 25 мл водного раствора; 6) 40 мг/л рибофлавина. Все растворы, кроме (3), можно хранить в холодильнике несколько месяцев, раствор (3) – не более недели. Для приготовления смесей используются нагретые до комнатной температуры растворы.
Разделяющий гель (7.5 %): сливают вместе 1 часть раствора (1), 2 части раствора (2), 1 часть Н2О, 4 части раствора (3). Гель образуется в течение 30 мин. Концентрирующий гель: сливают вместе 1 часть раствора (4), 2 части раствора (5), 1 часть растовра (6), 4 части Н2О. Гель (2.5 %) формируется за 15–30 мин в зависимости от интенсивности синих лучей солнца, или люминесцентной лампы.
Электродный буфер: 1 г трис, 5 г глицина в 1 л водного раствора (рН 8.3).
0.001%-й раствор бромфенолового синего, 40%-я сахароза.
Белки из растительной ткани экстрагируют подходящим буфером. Его состав мало влияет на результаты разделения белков, определяемые составом буферов в ПААГ и электродных сосудах. Для более четкого разделения белков экстракт очищают от низкомолекулярных примесей пропусканием через колонку с сефадексом G-25. Эта процедура необходима, если исходный экстракт имеет высокую ионную силу. Затем белковый экстракт уплотняют глицерином или сахарозой, доводя их концентрацию в растворе до 10–20 %, и добавляют 1 каплю раствора бромфенолового синего на 1–2 мл экстракта. На 1 см2 поверхности геля наносят 0.1–2 мг белка в растворе.
В течение 15–40 мин проводят концентрирование белков при 100–200 В, 3–6 мА/см2. За это время белки проходят концентрирующий гель и собираются на старте разделяющего геля. Разделение белков ведут при 300 В, 10–5 мА/см2 в течение 1.5–2 ч, пока полоса лидирующего красителя не приблизится к нижней границе геля. Гели окрашивают на активность и на гомогенность соответствующими методами.
Работа 2. Электрофорез белков с ДДС по Лэммли Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсульфата натрия (ДДС) в присутствии -меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в ПААГ белковые зоны распределяются таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы.
ДДС – ионное соединение с поверхностно-активными свойствами, часть молекул отрицательно заряжена. ДДС адсорбируется на гидрофобных участках цепи, что приводит к денатурации белка. Т. к. предварительная обработка белка и последующий электрофорез проводят в ДДС, то в данном случае фактически определяют молекулярную массу отдельных полипептидных цепей.
Прибор для электрофореза, водяная баня.
Электродный буфер: 1.2 г трис, 5.7 г глицина, 0.1 % ДДС в 1 л водного раствора, рН 8.3. Буфер для проб: 0.756 г трис, 1 г ДДС, 10 мл глицина, 5 мл -меркаптоэтанола, 1 мг бромфенолового синего, концентрированная HCl до рН 6.8 в 100 мл раствора.
Растворы для гелей: 1) 30 г акриламида, 0.8 г N,Nметиленбисакриламида в 100 мл водного раствора, 2) 280 мг персульфата аммония в 100 мл водного раствора, 3) 18.6 г трис, 0.4 г ДДС, концентрированная HCl до рН 8.8 (примерно 2.7 мл) в 100 мл водного раствора, 4) 6.04 г трис, 0.4 г ДДС, концентрированная HCl до рН 6.8 (примерно 4.6 мл) в 100 мл раствора воды. Все растворы, кроме раствора (2), можно хранить несколько месяцев в холодильнике, раствор (2) готовить еженедельно.
Разделяющий гель (15 % акриламида, 0.375 М трис-буфера, 0.1 % ДДС):
2 части раствора (1), 1 часть раствора (2), 1 часть раствора (3), 0.0012 части ТЕМЕД. Полимеризуется за 30–40 мин при комнатной температуре (сливают нагретые до комнатной температуры растворы). Концентрирующий гель (5 % акриламида, 0.125М трис-буфера, 0.1 % ДДС): 2 части раствора (1), 3 части раствора (2), 3 части раствора (4), 4 части воды, 0.0072 части N,N,N’,N-тетраметилэтилен диамина (ТЕМЕД). Полимеризуется за 30–40 мин при комнатной температуре.
Пробу смешивают с буфером для проб в соотношении 1 : 1 и нагревают на водяной бане при 80 оС в течение 5 мин. На 1 см2 поверхности геля наносят 0.1–2 мг белка в растворе. До тех пор пока белки не войдут в гель, электрофорез ведут при 50 В. Напряжение 100 В поддерживают, пока белки не достигнут разделяющего геля. Разделение ведут при 200 В в течение 2 ч и заканчивают, когда полоса лидирующего красителя приблизится к концу геля.
Для построения калибровочной кривой и определения молекулярной массы субъединиц используются стандартные маркерные белки (кДа): целлюлаза – 94,6; бычий сывороточный альбумин – 66,2; яичный альбумин – 45;
карбоангидраза – 31; лизоцим – 14,4; цитохром с – 12,5. После проведения электрофореза гели окрасить по методике с нитратом серебра. Гели хранить в 7%-й уксусной кислоте. Для расчета молекулярной массы субъединиц фермента с помощью ДДС-ПААГ электрофореза необходимо построить калибровочную кривую по белкам с известной молекулярной массой.
Работа 3. Универсальное окрашивание белков в ПААГ Как только прекращается действие электрического поля, разделившиеся белковые зоны склонны «расплываться» в силу тепловой диффузии.
Поэтому сразу после окончания разделения белки необходимо фиксировать в тех местах геля, куда они успели дойти. Проще всего это сделать осаждением из раствора прямо в геле. Для фиксации осаждением пригодны крепкие растворы уксусной кислоты или трихлоруксусной кислоты.
Часто фиксацию белков совмещают с их окрашиванием. Наиболее часто для прокрашивания белка после электрофореза в ПААГ используется амидо-черный 10В и кумасси бриллиантовый синий R-250. Второй из них более чувствительный, равномернее связывается с различными белками, слабо сорбируется ПААГ и поэтому легко от него отмывается. Однако после прокрашивания с помощью кумасси близко расположенных друг от друга белковых полос между ними может остаться окрашенный фон.
Препараты амидо-черного не отличаются постоянством своих характеристик, и результаты окрашивания при использовании различных партий этого красителя могут быть не похожи друг на друга.
На порядок величины лучшую чувствительность дает окрашивание белков ионами серебра. После осаждения белков трихлоруксусной кислотой и ацетоном, тщательной промывки ацетоном и водой гель переносят на 8 минут в 0.1%-й раствор AgNO3. Затем после отмывки водой в такой же объем карбоната натрия и 0.02%-й формальдегид. Окрашенные полосы белка появляются через несколько минут. Механизм окрашивания неясен, но, по-видимому, он в чем-то сходен с восстановлением серебра в фотографическом процессе.
Реакционная смесь 1: 25%-я ХУ, 30%-й этиловый спирт, 200 мг кумасси на 100 мл воды.
Реакционная смесь 2: 1 г амидо-черного 10В растворить в 100 мл 7%-й уксусной кислоты.
Реакционная смесь 3: 58.5 мл 50%-й ацетон, 1.5 мл 50%-й ТХУ, 0.1 мл формальдегида.
Реакционная смесь 4: 0.1 мл 10% Na2S2O3 в 60 мл Н2О. Раствор тиосульфата следует готовить непосредственно перед проявлением.
Реакционная смесь 5: 0.12 г AgNO3, 0.6 мл формальдегида довести до 60 мл Н2О.
Реакционная смесь 6: в 60 мл Н2О внести 1.2 г Na2CO3, 0.06 мл 10%-го раствора Na2S2O3, 0.06 мл формальдегида.
1. Проявление белков с помощью кумасси бриллиантового синего R-250. После проведения электрофореза извлечь гелевую пластинку и поместить в реакционную смесь 1 на 3–24 часа. Краситель, не связанный с белком, отмывают 7%-й уксусной кислотой. Для этого раствор красителя заменяют отмывающим раствором на 1–2 часа, повторяя эту процедуру несколько раз. Хранят отмытый гель в том же растворе, который использовался для его отмывания.
2. Проявление протеинов с помощью амидо-черного 10В.
Поместить гелевую пластинку в реакционную смесь 2 на несколько суток, после чего промыть окрашенный гель несколько раз водой. В свежеприготовленном красителе белковые полосы окрашиваются в темносиний цвет, в постоявшем – почти в черный.
3. Окрашивание белков нитратом серебра.
1. Фиксация: поместить гелевую пластину в реакционную смесь 3 на 2. Отмыть гель водой в течение 5–10 минут.
3. Предобработка геля 50%-м ацетоном в течение 5–10 мин.
4. Залить гелевую пластинку реакционной смесью 4 на 1 минуту, после чего отмыть гель несколько раз водой.
5. Окраска серебром: поместить гель на 8 мин в реакционную смесь 5, после чего отмыть его несколько раз водой.
6. Проявление: опустить гель в реакционную смесь 6 до появления белковых полос.
7. Для хранения залить гелевую пластинку 7%-й уксусной кислотой.
Работа 4. Специфическое проявление белков в ПААГ Ферментативную активность белковых компонентов исследуемой смеси после электрофоретического разделения можно выявить либо после элюции их из геля, либо непосредственно в геле.
В первом случае гель разрезают на отдельные диски, гомогенизируют в соответствующем буфере, центрифугируют или фильтруют и в надосадочной жидкости измеряют ферментативную активность. Во втором случае белковые полосы специфически прокрашивают непосредственно в геле.
Реакционная смесь 1: 50 мМ трис-HCl-буфер, рН 8.3, 20 мМ малат, 3мМ НАД+, нитросиний тетразолий (предварительно растворенный в 0.5 мл этиленгликоля) и феназинметасульфат в расчете 4 мг на 10 мл раствора.
Реакционная смесь 2 (указаны конечные концентрации): 2-амино-2метил-1,3-пропандиольный буфер – 25 мМ, рН 8.5, цитохром с – 2 %, мочевина – 2 М, хлористый кальций – 1.2 мМ.
Реакционная смесь 3: 25 мМ 2-амино-2-метил-1,3-пропандиольный буфер, рН 8.5, содержащий 1.2 мМ хлористый кальций.
1. Специфическое проявление дегидрогеназ. Дегидрогеназы после их электрофоретического разделения в ПААГ обычно прокрашивают с помощью нитросинего тетразолия. Этот метод успешно используется для выявления многих и неокислительных ферментов, каталитическая активность которых может быть определена с использованием дегидрогеназ в качестве вспомогательных ферментов. Сущность метода заключается в следующем.
Под действием дегидрогеназы в присутствии соответствующего субстрата происходит восстановление НАД+ (или НАДФ+). При участии феназинметасульфата (который выполняет роль вспомогательного переносчика) водород затем переносится на нитросиний тетразолий. Этот краситель в окисленном состоянии имеет желтую окраску и хорошо растворим в воде.
Его восстановленная форма (диформазан) практически нерастворима в воде и окрашена в фиолетовый цвет. Восстановленная форма красителя сорбируется на той белковой фракции в геле, под действием которой произошло восстановление НАД+ (НАДФ+). Таким образом, появление окрашенной полосы будет свидетельствовать о наличии в геле исследуемого фермента; вместе с тем идентифицируется его местоположение.
Для прокрашивания белковых полос на малатдегидрогеназную активность гель после окончания электрофореза сразу вынимают из пластинки, споласкивают в воде или буферном растворе и помещают в реакционную смесь 1. Гель инкубируют в темноте при 37 оС в течение 15–120 мин. После прокрашивания гель промывают дистиллированной водой и хранят в 7%-й уксусной кислоте. Окраска стабильна в течение недели.
2. Выявление протеаз. Если после диск-электрофореза препарата протеазы гель выдержать в растворе денатурированного цитохрома с, то за счет протеолитического действия на общем коричневом фоне геля проявится светлая полоса, которая соответствует положению протеазы в геле.
Сразу после окончания электрофореза гель споласкивают дистиллированной водой или буферным раствором, помещают в реакционную смесь 2 и инкубируют при 37 оС в течение 1 ч. Затем гель переносят в реакционную смесь 3, и выдерживают еще час при той же температуре, после чего помещают в 12.5%-й раствор ТХУ.
Кинетика ферментативной реакции (т. е. зависимость скорости реакции от ее условий) определяется в первую очередь свойствами катализатора, вследствие чего она значительно сложнее, чем кинетика некаталитических реакций.
Ферментативная активность зависит, в основном, от следующих факторов: концентрация фермента и субстрата, рН, присутствие ингибиторов и активаторов.
Работа 1. Определение константы Михаэлиса Если фермент подчиняется кинетике Михаэлиса – Ментен, можно определить кинетические параметры реакции: константу Михаэлиса (Км) и максимальную скорость.
В случае односубстратной реакции задача сводится к получению серии данных, характеризующих зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата, и к соответствующей графической обработке этих данных. В более часто встречающихся случаях двух- или трехсубстратной реакции эксперимент ставят таким образом, чтобы, меняя концентрацию одного из субстратов, обеспечить присутствие другого в насыщающей концентрации.
Условия проведения ферментативной реакции. Прежде чем приступить к постановке кинетических экспериментов, необходимо выполнить ряд условий.
1. Подобрать концентрацию фермента, при которой скорость реакции была бы пропорциональна количеству добавляемого белкакатализатора.
2. Подобрать условия инкубации, при которых обеспечивалось бы постоянство всех параметров кроме того, который исследуется, т. е. в ходе эксперимента не должна изменяться температура.
3. Начинать реакцию следует внесением фермента или одного из субстратов, добавляемых в минимальном объеме при быстром перемешивании реакционной смеси.
4. Обеспечить условия измерения начальной скорости реакции, поскольку скорость ферментативной реакции со временем снижается. Это можно объяснить снижением степени насыщения фермента субстратом, который расходуется в процессе ферментативной реакции; увеличением скорости обратной реакции (если реакция обратима); возможным ингибированием фермента образующимися продуктами реакции; изменением условий, например, снижением рН в ходе реакции; инактивацией фермента и др.
Спектрофотометр, кюветы, пипетки, гомогенный ферментный препарат МДГ.
Среда спектрофотометрирования: 50 мМ трис-HCl буфер, рН 9.0, 1 мМ НАД+. Отдельно готовится 50 мМ малат (М.в. 134.1 г/л).
Для определения константы Михаэлиса МДГ по малату в 2 мл среды спектрофотометриярования внести 0.01 мл раствора МДГ и начать реакцию добавлением различных концентраций малата – от 0.25 мМ до 2.5 мМ (при внесении 0.01 мл 50 мМ малата в кювету концентрация субстрата в среде спектрофотометрирования будет соответствовать 0.25 мМ). Измерить скорость ферментативной реакции при 10 различных значениях концентрации малата (0.25 мМ, 0.5 мМ, 0.75 мМ, 1.0 мМ, 1.25 мМ, 1.5 мМ, 1.75 мМ, 2.0 мМ, 2.25 мМ, 2.5 мМ). Далее построить график в двойных обратных координата (по Лайнуиверу – Берку), и определить с его помощью Км МДГ по малату.
Работа 2. Определение зависимости скорости реакции от Скорость ферментативной реакции повышается в 1,5–2,2 раза с повышением температуры на 10 оС. Поэтому такого понятия, как «температурный оптимум активности», не существует. Вместе с тем в условиях экcперимента существует определенное значение температуры, при котором активность фермента максимальна; дальнейшее увеличение температуры приводит к снижению скорости реакции. Следует иметь в виду, что это происходит в результате денатурации части фермента. Оптимальная температура действия фермента зависит от соотношения между влиянием температуры на скорость ферментативной реакции, с одной стороны, и на скорость денатурации фермента – с другой.
Водяная баня, термостат, пробирки, спектрофотометр, раствор слюны, йод, 1%-й раствор крахмала.
1. Исследование влияния температуры на активность амилазы слюны.
В 4 пробирки наливают по 5 мл 1%-го раствора крахмала. Первую пробирку помещают в кипящую водяную баню, вторую – в термостат при 40 оС, третью оставляют при комнатной температуре, четвертую помещают на лед. Через 10 минут во все пробирки, оставляя их в тех же условиях, прибавляют по 1 мл раствора слюны и перемешивают. Гидролиз крахмала наблюдают в реакции с йодом. Для этого на стеклянную пластинку наносят несколько капель раствора йода и смешивают их с каплями смеси, которую отбирают из каждой пробирки через 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 мин. По изменению окрашивания раствора крахмала с йодом судят о степени гидролиза в каждой пробирке. В пробирке, которая содержалась на водяной бане при 100 оС, смесь окрашивается в синий цвет, поскольку фермент инактивирован, и гидролиз крахмала здесь не происходит. В других пробирках окраска зависит от степени гидролиза крахмала: в пробирке, находившейся в термостате, раствор приобретает желтый цвет, в третьей и четвертой – красный или фиолетово-красный. Сделать вывод о влиянии температуры на скорость протекания биохимической реакции.
Работа 3. Определение зависимости скорости реакции от рН Разные ферменты максимально активны при разных значениях рН;
при рН выше и ниже оптимальной их активность снижается. Оптимум рН обычно находится в пределах, близких к нейтральной среде. Для некоторых энзимов – в кислой или щелочной области. Эффект рН складывается из влияния на стабильность фермента и на величину ионизации функциональных групп его белковой части, субстратов и кофакторов.
Для экспериментального определения оптимума рН измеряют скорость ферментативной реакции, используя буферные растворы с различными значениями водородного показателя. На кривую зависимости активности фермента от рН существенное влияние могут оказывать такие факторы, как состав буфера и величина ионной силы.
0.1 М фосфатный буфер с значениями рН 5.8, 6.2, 6.6, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0, раствор слюны, 0.1%-й раствор йода в 0.2%-м растворе йодида калия, 1%-й раствор крахмала.
Определение влияния рН на активность амилазы слюны по изменению интенсивности окрашивания раствора крахмала с йодом. Для этого в семь пробирок налить по 2 мл фосфатного буферного раствора с различными значениями рН (5.8, 6.2, 6.6, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0). Затем прилить по 5 мл 1%-го раствора крахмала и по 1 мл слюны. Содержимое пробирок перемешать и поместить в термостат на 10 мин при 38 оС. После инкубации в термостате во все пробирки прибавляют по 5 капель йода, перемешивают, наблюдают окраску и отмечают активность. Для амилазы слюны оптимум рН 6.8, а в кислой и щелочной среде активность фермента снижается.
Работа 4. Исследование влияния ингибиторов Ингибиторы, специфически взаимодействующие с ферментами, делятся на две группы – необратимые и обратимые. Действие необратимых ингибиторов можно наблюдать, блокируя функционально важные группы ферментов (например, модифицируя SH-группы йодацетатом). Большинство ингибиторов ферментов действуют обратимо, т. е. не вносят в молекулу фермента каких-либо изменений после своей диссоциации. Обратимое ингибирование может быть конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное. Конкурентное ингибирование наблюдается, когда ингибитор и субстрат имеют сходные структуры и конкурируют за связывание с активным центром фермента. Неконкурентное ингибирование наблюдается, когда ингибитор и фермент не сходны по структуре и ингибитор присоединяется к регуляторному центру фермента. При бесконкурентном ингибировании ингибитор присоединяется к комплексу фермент–субстрат.
Принцип действия ингибитора, тип его ингибирования определяют путем сравнения кинетики реакции в присутствии ингибитора и без него. Для определения констант ингибирования используются различные координаты – Лайнуивера – Берка, Иди – Хоффсти, Уэбба и пр. Для определения типа ингибирования и величины Кi широко используется метод Диксона. Если построить зависимость 1/Vo от [I] при различных [S], то абсцисса общей точки пересечения этих прямых линий дает константу ингибирования, т. е. этот метод требует измерения изменения скорости реакции при нескольких заданных постоянных концентрациях субстрата при изменении концентрации ингибитора.
1) 1%-й раствор NaCl, CuSO4, раствор слюны, йод.
2) 1%-й раствор малоновой кислоты, 1%-й раствор метиленового синего, ткань поперечно-полосатой мышцы.
3) спектрофотометр, среда спектрофотометрирования МДГ (50 мМ трис-НCl буфер, рН 7.5, 0.15 мМ НАДН, две различные концентрации оксалоацетата: 0.05 мМ и 0.15 мМ), 100 мМ MnCl2 (М.в. 198 г/л), гомогенный ферментный препарат.
1. Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы слюны • В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, во вторую – 8 капель воды и 2 капли 1%-го раствора хлорида натрия, в третью – 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди (II).
• В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной (1 : 10) слюны, содержимое пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин.
• В это время готовят три пробирки с водой (по 1 мл в каждой), подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 2–3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В первой пробирке появляется фиолетовая или краснобурая окраска, во второй пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в третьей пробирке, где ионы меди тормозят действие амилазы, окраска остается синей. Если описанной картины не наблюдается, то опыт повторяют через 10 мин. Результаты вносят в таблицу.
• Записывают в тетрадь полученные результаты. Делают выводы о характере влияния хлорида натрия и сульфата меди на активность амилазы.
2. Выявление ингибирующего действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы (в присутствии соединений, структурно сходных с янтарной кислотой (малоновая, щавелевая, глутаровая, фенилпропионовая), но неспособных дегидрироваться, может происходить блокирование активного центра сукцинатдегидрогеназы и тем самым тормозить протекание нормальной реакции). В 3 пробирки внести по 3–4 г тщательно измельченной ткани поперечно-полосатой мышцы. В первую прибавить 0,4 мл дистиллированной воды, во вторую – 0,2 мл 1%-го раствора малоновой кислоты и 0,2 мл воды, а в третью – 0,4 мл 1%-го раствора малоновой кислоты. Во все пробирки долить по 1 мл 1%-го раствора янтарной кислоты, и по 2–3 капли 1%-го раствора метиленового синего. Содержимое пробирок перемешать, добавить по 3–4 капли вазелинового масла и выдерживать в термостате при 38 оС. Через 5–10 мин в первой пробирке произойдет почти полное исчезновение голубой окраски, некоторое уменьшение интенсивности окраски во второй пробирке и полное сохранение ее в третьей.
3. Определение типа ингибирования и значения Ki МДГ ионами цинка (по Диксону). Для этого следует измерить скорость ферментативной реакции при добавлении в среду спетрофотометрирования ионов Mn2+ в концентрациях 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 мМ (при внесении 0.01 мл 100 мМ MnCl2 в 2 мл кювету концентрация субстрата в среде спектрофотометрирования будет соответствовать 0.5 мМ). Измерение следует провести с различными концентрациями оксалоацетата – 0.05 мМ и 0.15 мМ. Концентрация НАДН и объем внесения фермента остаются неизменными. Далее построить график зависимость 1/Vo от [Mn2+] при различных концентрациях оксалоацетата, и определить с его помощью тип ингибирования и Ki.
Степень на- Количество (г) твердого (NH4)2SO4 различной степени насыщения на каждые 100 мл исходного раствора G-25 (грубый) (средний) (тонкий) G-25 (сверхтонкий) G-50 (грубый) G-50 (сред- (тонкий) G-50 (сверхтонкий) G-75 (сверхтонкий) Ионообменные адсорбенты, обычно используемые Анионообменники:
аминоэтил-(АЭ-) – О – CH2 – CH2 –NH2 4–9 Целлюлоза триэтиламиноэтил – O – CH2 – CH2 – Катионообменники:
1. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. – М. : Наука, 1985. – 536 с.
2. Практикум по биохимии / под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. – М. : Изд-во МГУ, 1989. – 509 с.
3. Практикум по биохимии растений / С.М. Щипарев [и др.]. – СПб. :
Изд-во СПб. ун-та, 1996. – 200 с.
4. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. – М. : Высш. шк., 1980. – 272 с.
5. Клиническая биохимия / В.Н. Бочков [и др.]. – М. : Изд-во МГУ, 2004. – 506 с.
6. Чиркин А.А. Практикум по биохимии / А.А. Чиркин. – Минск : Новое знание, 2002. – 512 с.
7. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии / Л.М. Пустовалова. – Ростов н/Д. : Феникс, 1999. – 540 с.
Епринцев Александр Трофимович
Учебно-методическое пособие для вузов Подписано в печать 25.08.08. Формат 6084/16. Усл. печ. л. 2,09.
Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета.
394000, г. Воронеж, пл. им. Ленина, 10. Тел. 208-298, 598-026 (факс) http://www.ppc.vsu.ru; e-mail: pp_center@ppc.vsu.ru Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета.
394000, г. Воронеж, ул. Пушкинская, 3. Тел. 204-133.
«КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.И.УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТ Тимофеева О.А. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ НОВЫХ ФОРМ РАСТЕНИЙ Учебное пособие КАЗАНЬ 2006 Печатается по решению редакционно-издательского совета биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета имени В.И.Ульянова-Ленина Рецензент: кандидат биологических наук Н.И. Румянцева Данное учебное пособие является частью лекционного курса Агрофитобиотехнология. В нем изложены. »
«1 ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н. И. ЛОБАЧЕВСКОГО Биологический факультет Факультет физической культуры и спорта Кафедра физиологии и биохимии человека и животных Кафедра организации физкультурной спортивной деятельности Ошевенский Л.В., Крылова Е.В., Уланова Е.А. ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА ПО ФУНКЦИОНАЛЬНЫМ ПОКАЗАТЕЛЯМ ОРГАНИЗМА Методические указания. »
«Выписка из протокола заседания НМС № 5 от 25.02.2014 Присутствовало – 19 чел. Отсутствовало – 4 чел. Повестка дня: Анализ качества проведения учебных занятий 1. Делексишвили Е.В. 2. Психолого-педагогические аспекты работы со студентами нового набора Кравченко Л.И. 3. Показатели здоровья студентов нового набора: проблемы и перспективы Дочкина Н.Л. 4. Рассмотрение положений Барсукова Ю.И. 5. Утверждение учебно-методической документации Антонова О.В. Решение Утвердить: Методические рекомендации. »
«Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ кардиологии Сибирского отделения РАМН Департамент здравоохранения Администрации Томской области УТВЕРЖДАЮ УТВЕРЖДАЮ Начальник Департамента здравоохранения Директор Учреждения РАМН Администрации Томской области НИИ кардиологии СО РАМН профессор Кобякова О.С. академик РАМН Карпов Р.С. _2011 г. _2011 г. ПОДГОТОВКА ПАЦИЕНТОВ К ЭНДОКАРДИАЛЬНОЙ РАДИОЧАСТОТНОЙ АБЛАЦИИ ФИБРИЛЛЯЦИИ ПРЕДСЕРДИЙ, ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОЕ НАБЛЮДЕНИЕ Методическое пособие Томск УДК. »
«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра физиологии человека и животных РАЗВИТИЕ ВЫСШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ: ПТИЦЫ Методические указания по курсу Биология индивидуального развития для студентов биологического факультета специальности 1-31 01 01 Биология МИНСК 2007 УДК 611.06 ББК 28.706 Р 17 Авторы-составители: Г. Т. Маслова, А. В. Сидоров Рекомендовано Ученым советом биологического факультета 7 декабря 2007 г., протокол № 5 Рецензент кандидат биологических наук, доцент C. »
«Утверждено Министерством здравоохранения РА Роджер В. Оганесян Марианна Л. Шахсуварян ГЛАЗНЫЕ БОЛЕЗНИ Учебное пособие Ереван 2005 С ОД Е РЖ А Н И Е Предисловие Слова признательности ГЛАВА 1 АНАТОМИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ГЛАЗА ГЛАЗ КАК ОПТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ГЛАВА 2 ОБСЛЕДОВАНИЕ ГЛАЗА 2.1 МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СБОР ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКОГО И СОМАТИЧЕСКОГО АНАМНЕЗА СБОР АНАМНЕЗА ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ГЛАЗ СОМАТИЧЕСКИЙ АНАМНЕЗ СЕМЕЙНЫЙ АНАМНЕЗ ПОШАГОВОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ ГЛАЗ ПРОВЕРКА ОСТРОТЫ ЗРЕНИЯ ПРОВЕРКА ОСТРОТЫ ЗРЕНИЯ. »
«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГБОУ ВПО РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ПИРОГОВА МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ И БИОЭНЕРГЕТИКА Методическое пособие для самостоятельной работы студентов лечебного и педиатрического факультетов МОСКВА – 2012 БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ. Методическое пособие для самостоятельной работы студентов лечебного, педиатрического, стоматологического и фармацевтического. »
«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра Безопасность жизнедеятельности УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БЕЗОПАСНОСТИ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ Основной образовательной программы по направлению подготовки (специальности) 280101.65 Безопасность жизнедеятельности в техносфере Благовещенск 2012 г. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ 1. »
«Международный университет природы, Общества и человека Дубна Кафедра Биофизики Т.Б. Фельдман, М.А.Островский Фотобиология и фотохимия первичных процессов зрения Учебно-методическое пособие Дубна, 2009 г. 1 Часть I Теоретический обзор Введение Глаз нельзя понять, не зная Солнца. Вот почему глаз солнечен, по словам поэта: так заканчивает свою замечательную книгу Глаз и Солнце академик С.И.Вавилов. Напечатанная впервые в 1927 году, она выдержала более десяти изданий и до сих пор остается лучшим. »
«1 2 Н. И. Федюкович АНАТОМИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА Допущено Министерством образования Российской Федерации в качестве учебного пособия для студентов медицинских училищ, обучающихся по специальности 0406 Сестринское дело Издание второе Ростов-на-Дону Феникс 2003 ББК 28.8я723 Ф32 3 Федюкович Н. И. Ф 32 Анатомия и физиология человека: Учебное пособие. Изд. 2-е. — Ростов н/Д: изд-во: Феникс, 2003. — 416 с. В учебном пособии освещены вопросы нормальной, анатомии и физиологии человека с учетом. »
«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Уральский государственный университет им. А.М. Горького ИОНЦ Экология и природопользование Биологический факультет Кафедра экологии Кафедра физиологии и биохимии растений МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗУЧЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ РАСТЕНИЕ И СТРЕСС Екатеринбург 2008 2 УТВЕРЖДАЮ Руководитель ИОНЦ Экология и природопользование Радченко Т.А. (подпись) (дата) Методические указания по изучению. »
«Федеральное агентство морского и речного транспорта Морской государственный университет имени адмирала Г. И. Невельского Кафедра психофизиологии и психологии труда в особых условиях ПСИХОЛОГИЯ И ПЕДАГОГИКА Методические указания к выполнению контрольных работ для студентов очно – заочной, заочной формы обучения Составила О. В. Мельникова Владивосток 2007 3 Контрольная работа один из важнейших элементов учебного процесса, выполнение которой способствует всестороннему изучению одной из проблем. »
«Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Иркутский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации Органы пищеварения: анатомо-физиологические особенности, методы исследования и семиотика основных поражений Учебно-методическое пособие для студентов Иркутск ИГМУ 2012 УДК [616-053.2:612.3(075.8)] ББК 57.319я73 O 64 Рекомендовано ФМС педиатрического факультета ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России в качестве. »
«Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Казанский государственный университет Биолого-почвенный факультет Кафедра физиологии человека и животных УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС По дисциплине Нейрофармакология Цикл дисциплины – ФТД.8 – Факультативные дисциплина код ОКСО: 020205 для специальности 012000 физиология специализация 012001 – физиология человека и животных Ведущий преподаватель по дисциплине: д.б.н., профессор. »
«Лошакова Л. Ю. Лахмотко Г. И. Киселёв Г. Ф. Организация работы по стоматологическому гигиеническому обучению и воспитанию беременных Кемерово 2013 ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России ГАУЗ КО Областная клиническая стоматологическая поликлиника УТВЕРЖДАЮ УТВЕРЖДАЮ Ректор ГБОУ ВПО КемГМА начальник ДОЗН КО Минздрава России В. М. Ивойлов _ В. К. Цой __ 2013 г. __ 2013 г. Лошакова Л. Ю., Лахмотко Г. И., Киселёв Г. Ф. ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ПО СТОМАТОЛОГИЧЕСКОМУ ГИГИЕНИЧЕСКОМУ ОБУЧЕНИЮ И ВОСПИТАНИЮ. »
«СМОЛЕНСКИЙ ГУМАНИТАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Маринич В.В. ВАЛЕОЛОГИЯ Учебно-методическое пособие для студентов заочной формы обучения, обучающихся по специальности 230500 Социально-культурный сервис и туризм Смоленск – 2007 1. ПРОГР АММА (СОДЕРЖАНИЕ) УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ ТЕМА №1. Введение в предмет валеологии. Концепция валеологии. Валеология – учение о здоровье и здоровом образе жизни. Валеологический анализ факторов здоровья. Здоровье как социальная ценность. Валеологический анализ здоровья и здорового. »
«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ Заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации О.В.ШАРАПОВА 10 ноября 2000 г. ОРГАНИЗАЦИЯ ЛЕЧЕБНОГО ПИТАНИЯ В ДЕТСКИХ БОЛЬНИЦАХ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Материал разработан специалистами Научного Центра здоровья детей РАМН (докт. мед. наук, проф. Ладодо К.С., докт. мед. наук Боровик Т.Э., канд. мед. наук Рославцева Е.А., канд. мед. наук Семенова Н.Н., канд. мед. наук Дружинина Л.В., канд. мед. наук Рыбакова Е.П., канд. мед. »
«Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Иркутский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации Сердечно-сосудистая система: анатомо-физиологические особенности, методы исследования и семиотика основных поражений Учебно-методическое пособие Иркутск ИГМУ 2012 1 УДК [616-053.2:611.1(075.8)] ББК 57.319я73 С 32 Рекомендовано ФМС педиатрического факультета ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России в качестве. »
«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Методические рекомендации и контрольные работы по дисциплине Микробиология для студентов 3 курса заочного отделения фармацевтического факультета Учебно-методическое пособие для вузов Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета 2010 2 Утверждено научно-методическим советом фармацевтического факультета _ 2010. »
«КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ ПОСОБИЕ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ЛЕЧЕБНОГО, МЕДИКО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО, ПЕДИАТРИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТОВ КУРСК – 2003 УДК 57:54(072) Печатается по решению ББК 28,072я7 редакционно-издательского совета КГМУ Задания на самоподготовку по биологической химии для студентов лечебного, медико-профилактического, педиатрического факультетов / Под ред. проф. А.И. Конопли и проф. Л.Г. Прокопенко. — Курск. »
© 2013 www.diss.seluk.ru — «Бесплатная электронная библиотека — Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»
Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.
источник