Напишите на какие фракции разделяют белки сыворотки крови при электрофорезе

I группа- азотсодержащие небелковые компоненты. В состав небелкового азота крови входит азот промежуточных и конечных продуктов обмена простых и сложных белков.

Раньше небелковый азот называли остаточный азот (остается после осаждения белков):

1.азот мочевины (50 %);2.азот аминокислот (25 %); 3.низкомолекулярные пептиды; 4.креатин; 5.креатинин; 6.билирубин; 7.индикан; 8.некоторые другие азотсодержащие вещества.

При некоторых заболеваниях почек, а также при патологии, сопровождающейся массивным разрушением белков (например, тяжелые ожоги), может повышаться небелковый азот крови, т. е. наблюдается азотемия. Однако наиболее часто нарушается не общее содержание небелкового азота в крови, а соотношение между отдельными компонентами небелкового азота. Поэтому сейчас в плазме определяют азот отдельных компонентов.

В понятие «остаточный азот» включают и низкомолекулярные пептиды. Среди низкомолекулярных пептидов есть много пептидов, обладающих высокой биологической активностью (например, гормоны пептидной природы).

II группа -безазотистые органические вещества. К безазотистым (не содержат азот) органическим веществам плазмы крови относятся: 1)углеводы, липиды и продукты их метаболизма (глюкоза, ПВК, лактат, кетоновые тела, жирные кислоты, холестерин и его эфиры и др.); 2)минеральные вещества крови.

С возрастом прослеживается четкая возрастная динамика биохимических показателей крови: с возрастом происходит повышение в сыворотке крови общего белка, общего кальция, неорганического фосфора. У плода эмбриоспецифические белки, т.е. белки, характерные только для плода и в норме не синтезирующиеся в организме матери, сохраняют большое диагностическое значение. К таким белкам в первую очередь следует отнести альфафетопротеин (АФП), ацетилхолинэстеразу, белки микроворсинок кишечника плода и стероидные гормоны.

Дыхательная функция крови: механизм переноса кислорода и углекислого газа. Гемоглобин, структурная характеристика. Формы и производные гемоглобина. Механизм образования оксигемоглобина. Роль кооперативных взаимодействий. 2,3-дифосфоглицерат в регуляции сродства гемоглобина к кислороду. Эффект К. Бора и его роль в кислород-транспортной функции гемоглобина.

Сущность дыхательной функции крови состоит в доставке кислорода от легких к тканям и углекислого газа от тканейк легким. Кровь осуществляет дыхательную функцию прежде всего благодаря наличию в ней гемоглобина. Физиологическая функция гемоглобина как переносчика кислорода основана на способности обратимо связывать кислород. Поэтому в легочных капиллярах происходит насыщение крови кислородом, а в тканевых капиллярах, где парциальное давлениекислорода резко снижено, осуществляется отдача кислорода тканям. В крови здорового человека содержание гемоглобина составляет 120—165 г/л (120—150 г/л для женщин и 130—160 г/л для мужчин).

Итак, функцию переносчика кислорода в организме выполняет гемоглобин. Напомним, что молекула гемоглобинапостроена из 4 субъединиц (полипептидных цепей), каждая из которых связана с гемом (см. главу 2). Следовательно, молекула гемоглобина имеет 4 гема, к которым может присоединяться кислород, при этомгемоглобин переходит в оксигемо-глобин.

У человека имеются три основных типа нормального гемоглобина: эмбриональный U (uterus) , фетальный — F (faetus) и гемоглобин взрослого человека – А(adult). В первые три месяца жизни плода человека в крови содержатся эмбриональные гемоглобины типа. Затем формируется гемоглобин F. Его глобин представлен двумя цепями альфа и двумя гамма. Гемоглобин F обладает на 20—30 % большим сродством к О2, чем гемоглобин А, что способствует лучшему снабжению плода кислородом. При рождении ребенка до 50—80 % гемоглобина у него представлены гемоглобином F и 15—40 % — типом А, а к 3 годам уровень гемоглобина F снижается до 2 %. Количество HbF, превышающее 2% считается патологическим для взрослого человека и для детей старше 3 лет. Гемоглобин А представлен еще HbА2 , который представлен 2 альфа и 2 дельта цепями. На его долю приходится около 2% от общего Hb. Гемоглобин F обладает повышенным сродством к кислороду и позволяет сравнительно малому объёму крови плода выполнять кислородоснабжающие функции более эффективно. Однако гемоглобин F обладает меньшей стойкостью к разрушению и меньшей стабильностью в физиологически широком интервале pH и температур. В течение последнего триместра беременности и вскоре после рождения ребёнка гемоглобин F постепенно — в течение первых нескольких недель или месяцев жизни, параллельно увеличению объёма крови — замещается «взрослым» гемоглобином А (HbA), менее активным транспортёром кислорода, но более стойким к разрушению и более стабильным при различных значениях pH крови и температуры тела. Такое замещение происходит вследствие постепенного снижения продукции γ-цепей глобина и постепенного увеличения синтеза β-цепей созревающими эритроцитами. по уровню фетального гемоглобина можно судить о «степени созревания» недоношенного ребенка. Определение уровня фетального гемоглобина важно для проведения лечебных мероприятий при гемолитической анемии новорожденных, касающихся заменных переливаний крови.

Гемоглобин, присоединивший О2, носит наименование оксигемоглобина(ННbО2); гемоглобин, отдавший О2, называется восстановленным, или редуцированным (ННb). Кроме того, часть гемоглобина через аминную группу связывается с СО2, образуя карбгемоглобин (ННbСО2), благодаря чему переносится от 10 до 20% всего транспортируемого кровью СО2.

Путем непрерывного превращения оксигемоглобина в редуцированный гемоглобин и обратно, осуществляется перенос

кислорода из легких к тканям. Сродство гемоглобина к кислороду и диссоциация оксигемоглобина зависят от напряжения кислорода (Р02), углекислого газа (РС02) в крови, рН крови, ее температуры и концентрации 2,3-ДФГ в эритроцитах. Так, сродство повышают увеличение Р02 или снижение РС02 в крови, нарушение образования 2,3-ДФГ в эритроцитах. Напротив, повышение концентрации 2,3-ДФГ, снижение Р02 крови, сдвиг рН в кислую сторону, повышение РС02 и температуры крови — уменьшают сродство гемоглобина к кислороду, облегчая отдачу тканям. 2,3-ДФГ связывается с р-цепями гемоглобина, облегчая отсоединение 02 от молекулы гемоглобина. Увеличение концентрации 2,3-ДФГ наблюдается у людей, тренированных к длительной физической работе, адаптированных к длительному пребыванию в горах. Содержание гемоглобина в отдельном эритроците составляет 27,5—33,2 пикограмма. Этот показатель имеет диагностическое значение. Например, гиперхромия эритроцитов характерна для В12-дефицитной анемии, гипохромия — для железодефицитной анемии.

Эффект Бора – в тканях много Н+. Он поступает в эритроцит и уменьшает сродсво гемоглобина к кислороду. Чем кислее среда, тем быстрее гемоглобин отдает кислород.

источник

1. Перечислите методы фракционирования белков, позволяющие получить индивидуальный белок.
2. Кратко сформулируйте, на каких физико-химических свойствах основаны перечисленные методы.
1.Выпишите способы определения молекулярной массы белков.
Показать полностью…
2.Перечислите данные, подтверждающие высокую молекулярную массу белков.
3.Чем можете подтвердить способность белков образовывать коллоидные растворы?
5.Охарактеризуйте принцип метода диализа. Какое практическое значение имеет диализ?
1. Вспомните механизм возникновения электрического заряда. Что такое изоэлектрическая точка?
2.Охарактеризуйте явление электрофореза белков. Запомните виды электрофореза.
3.Укажите факторы, от которых зависит скорость перемещения белковых молекул в поле постоянного электрического тока.
4. Напишите, на какие фракции разделяют белки сыворотки крови при электрофорезе на бумаге. Выпишите протеинограмму – соотношение белковых фракций — здорового ребенка и взрослого человека.
5. Изучите возможности электрофоретического разделения белков на полиакриламидном геле, принцип диск-электрофореза и его значение для разделения белков сыворотки крови.
1. Выясните, чем определяется растворимость белков, и какие факторы стабилизируют белковую молекулу в растворе.
1.Выпишите классификацию методов хроматографического разделения белков по механизму разделения и технике проведения. Сформулируйте принцип метода адсорбционной, ионнообменной, афинной, и распределительной хроматографии. Кратко опишите процедуру гель-фильтрации и газожидкостной хроматографии.

Работа № 1. Разделение и количественное определение белковых
фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге.
Принцип метода. Электрофорез – это движение заряженных частиц в поле постоянного электрического тока. Скорость перемещения молекул белков в электрическом поле зависит от величин заряда, молекулярной массы, pH, ионной силы раствора.
Показать полностью…
Белки сыворотки крови помещают на полоску бумаги, смоченную буферным раствором, через которую пропускают постоянный электрический ток. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжаются отрицательно и под воздействием электрического поля перемещаются к аноду.
Сыворотка крови человека содержит различные белки. С помощью электрофореза на бумаге выделяются 5 фракций — альбумины, α1-, α2-, β-, γ-глобулины.
Клинико-диагностическое значение. Многие патологические состояния сопровождаются количественными изменениями соотношения белковых фракций крови – диспротеинемиями. Уменьшение содержания фракции альбуминов характерно для заболеваний печени за счет снижения белок-синтезирующей функции гепатоцитов. Гипоальбуминемия также сопровождает заболевания почек вследствие потери белка с мочой. Увеличение содержания фракций α1- и α2-глобулинов наблюдается при стрессе, наличии воспалительных процессов за счет белков «острой фазы», при коллагенозах и метастазировании злокачественных новообразований. Фракция β-глобулинов растет при гиперлипопротеинемиях. Фракция γ-глобулинов повышается при иммунных реакциях, вызванных вирусными и бактериальными инфекциями. Снижение γ-глобулиновой фракции может иметь место при первичном и вторичном иммунодефиците.
Порядок выполнения работы
1. Устройство прибора для электрофореза. Прибор состоит из выпрямителя, подающего постоянный ток необходимого напряжения, и камеры для электрофореза. Сама камера состоит из 2-х ванн; в одной из них имеется неподвижная перегородка, куда помещается платиновый электрод (+ анод), а в другой находится электрод из нержавеющей стали (- катод). Между ваннами, заполненными соответствующим буфером, имеется соединительный мост, на который помещают полоски специальной фильтровальной бумаги.
2. Проведение электрофореза. Заполнить обе ванны камеры раствором вероналового буфера с pH 8,6. Буферного раствора в ваннах должно быть столько, чтобы он покрывал неподвижную перегородку, но был ниже подвижных перегородок.
Вставить в ванны электроды. Вырезать из фильтровальной бумаги полосы необходимого размера в зависимости от величины камеры (обычно шириной 4-6 см) и простым карандашом отметить место, на которое впоследствии будет наноситься сыворотка (старт). Смочить эти полоски в вероналовом буфере. Вставить в ванны-камеры соединительный мост. Поместить полоски бумаги на сухие пластинки щипцами, погрузив концы полосок в ванны с буфером, и на заранее отмеченные участки бумаги нанести сыворотку по 0,025-0,005 мл на расстоянии 5-6 см от края моста. Нанесение сыворотки производится со стороны катода.

Рисунок 1. Схема камеры для электрофореза белков на бумаге:
1-стабилизатор; 2-камера для электрофореза; 3-буферный раствор; 4-поддерживающий соединительный мост-электрод; 5-фильтровальная бумага для электрофореза.
После нанесения на бумажные полоски сыворотки камера герметично закрывается крышкой. На крышке камеры расположен прижим блокировки, служащий для включения камеры. Присоединенный выпрямитель подает к камере постоянный ток от 2 до 4 мА при постоянном напряжении 110-160В. Электрофорез проводят при градиенте потенциала от 3 до 8 В на 1 см полосы при комнатной температуре. Хорошее разделение происходит за 18-20 часов.
3. Выключение прибора и выявление белковых фракций. Выключают прибор. Снимают камеры и извлекают бумажные полоски из прибора. Затем каждую полоску помещают в сушильный шкаф на 20 минут при температуре 1050С. При этом происходит фиксация белковых фракций на бумаге. Окраску белков проводят раствором бромфенолового-синего в течение 30 минут, затем промывают электрофореграммы 2% раствором уксусной кислоты. Полученные электрофореграммы сушат на воздухе. Белковые фракции окрашиваются в сине-зеленый цвет.
4. Количественное определение белковых фракций. Окрашенные белковые пятна вырезают, краситель элюируют 0,01 н раствором щелочи. Интенсивность окраски каждой фракции определяют колориметрически на ФЭКе.
Количественное определение белковых фракций на электрофореграмме можно установить двумя способами: путем элюирования краски и фотоколориметрирования и денситометрическим методом.
Содержание белковых фракций сыворотки крови, полученное с помощью электрофореза на бумаге, в среднем составляет у взрослого человека:
альбумины 55,4-65,9 %
α1-глобулины 3,4-4,7 %
α2-глобулины 5,5-9,5 %
β-гдобулины 8,9-12,6 %
γ-глобулины 13-22,2 %
Денситометрический метод. В специальном аппарате (денситометре) через электрофореграмму пропускают пучок света, поглощение которого зависит от оптической плотности окрашенных белковых пятен. Свет, прошедший через электрофореграмму, улавливается фотоэлементом и превращается в электрический ток, колебания которого фиксируют на бумажном листе в виде кривой, каждый пик кривой соответствует определенной белковой фракции.

Рисунок 2. Электрофореграмма сыворотки человека.

Работа № 2. Очистка белков от низкомолекулярных примесей методом диализа.
Принцип метода основан на неспособности молекул белка (коллоидных частиц) проникать через полупроницаемую мембрану (пергамент, целлофан, колодий и др.), в то время как низкомолекулярные примеси легко проходят через поры этих мембран. Метод диализа широко используется для разделения и очистки белков и других биополимеров от примесей солей и низкомолекулярных органических соединений. Основанный на этом же принципе метод гемодиализа (вивидиффузия), применяется для лечения больных с почечной недостаточностью (аппарат «искусственная почка»).
Ход работы. В подготовленный колодиевый или целлофановый мешочек поместить 1 мл сыворотки крови (раствора яичного белка) и 3-4 мл 6% раствора хлористого натрия, аккуратно поместить их в стакан с дистиллированной водой. Через 30-60 минут с небольшими порциями диализируемого раствора белка (содержимое мешочка) и диализата (наружная жидкость) провести пробы на хлориды и белок, чтоб удостовериться в том, что соль диффундировала, а белок остался в мешочке.
Для обнаружения белка провести биуретовую реакцию.
Принцип метода. Реакция основана на способности пептидной группы белков и полипептидов образовывать с ионами меди в щелочной среде комплексные соединения фиолетового цвета. Реакция позволяет обнаружить наличие пептидной связи в исследуемом веществе и, следовательно, является универсальной реакцией для обнаружения веществ белковой природы. Свое название реакция получила от производного мочевины биурета, который дает в данных условиях то же окрашивание, что и белок.
Техника проведения работы. В пробирку добавить 5 капель раствора белка, 10 капель раствора едкого натра и 1 каплю раствора сульфата меди. Отметить появление красно-фиолетового окрашивания.
Для обнаружения хлоридов к 0,5-1 мл раствора добавить 1-2 капли 1% раствора азотной кислоты и 1-2 капли 1% раствора азотнокислого серебра и отметить выпадение творожистого осадка.

Работа № 3. Очистка от низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации на сефадексе (молселекте).
Основным свойством декстранового геля, как хроматографического материала, является способность разделять вещества согласно размерам молекул. Крупные молекулы при хроматографии не проникают в частицы геля и элюируются в свободном объеме, т.е. в свободном пространстве между частицами геля. Применяя сефадексы (молселекты) разных типов с разными размерами частиц и изменяя условия хроматографии; гель-фильтрацию на сефадексах (молселектах) можно использовать для разделения смесей в зависимости от молекулярной массы, для определения чистоты веществ, а также в целях обессоливания и концентрирования растворов высокомолекулярных соединений и др.
Расчеты показывают, что на сефадексе Г-25 (молселекте Г-25) молекулы массой 5600 уже будут элюировать в свободном объеме, а соли и органические вещества с молекулярной массой в пределах 1000 проникают в частицы декстранового геля, обладая коэффициентом распределения 0,7-1,0. Это позволяет сравнительно легко отделить с помощью сефадекса Г-25 (молселекта Г-25) соли и низкомолекулярные органические примеси из растворов белков и других молекул.

Рисунок 3. Схема устройства для гель-фильтрации.
1-колонка; 2-пробирка со стеклянной трубкой; 3-капельница, содержащая элюирующий раствор; 4-зажим; 5-кружок фильтровальной бумаги; 6-поверхность суспензии геля; 7-изотонический раствор NaCl; 8-смесь фракционируемых веществ.
⌂-вода; •-Hb; +-изотонический раствор NaCl; о-молселект.

Ход работы. Предварительно производят подготовку сефадекса (молселекта) и наполняют колонку. Для этого около 50 г сефадекса Г-25 (молселекта Г-25), достаточного для заполнения 7-8 колонок, необходимо суспендировать в стакане 0,1% растворе хлористого натрия (около 400 мл) и оставить для набухания на двое суток. Затем раствор соли из стакана слить, залить дистиллированной водой, суспензию сефадекса (молселекта) взболтать, дать осесть основной массе геля, а воду с неосевшими частицами слить. Отделение мелких частиц сефадекса повторить 4-5 раз.
Колонку размеров 2×10 см закрепить в штативе в строго вертикальном положении, на дно колонки поместить диск из плексигласа с отверстием и сверху на него опустить кружок фильтровальной бумаги. Колонку на 2/3 объема заполнить водой и в остальную часть постепенно вливать суспензию сефадекса высотой 2-3 см, начать медленно профильтровывать воду, продолжая добавление сефадекса. После образования слоя геля 5-6 см наполнение колонки прекратить, колонку закрыть и над слоем сефадекса поместить кружок фильтровальной бумаги. При наполнении колонки следить, чтобы в колонке не оставалось пузырьков воздуха, и над гелем был слой жидкости.
Для проведения работы открыть подготовленную колонку, дать профильтроваться воде над слоем геля и наслоить пипеткой 1-1,5 мл 2% раствора гемоглобина или другого окрашенного белка с равным объе-мом 3% раствора хлористого натрия. Как только раствор профильтруется (войдет в гель), ополоснуть стенки колонки небольшим количеством дистиллированной воды и начать элюирование дистиллированной водой со скоростью тока примерно 0,5 мл в минуту. Элюаты объемом 2,5-3 мл собирать в отдельные пробирки. Через 12-15 минут элюирование прекратить, в исходном растворе белка и в отдельных фракциях элюата проверить наличие белка по окраске содержимого пробирок и наличие хлоридов реакцией с азотнокислым серебром (см. выполнение предыдущей работы).

источник

Лабораторная работа №8

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ

Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 B.

Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),

Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза

через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 — 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, — уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.

Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 — 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 — 8,9) при градиенте потенциала 3 — 5 В/см (120 — 350 B для полос длиной 40 — 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 — 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге — прогорание бумаги

1. Буферный раствор. Можно использовать:

а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;

б) веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;

в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.

2. Растворы для окраски электрофореграмм:

а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) —0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) — 100 мл + метиловый спирт — 900 мл;

б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;

в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO₄·7H₂O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.

3. Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:

а) уксусная кислота — 2 %-й раствор;

б) уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.

4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:

а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;

б) для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.

Получение сыворотки крови. 2 — 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 — 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.

Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18×45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 —5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы —2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 —8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.

Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 — 0,02 мл (1 — 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 — 24 ч при напряжении 200 — 300 B

Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 — 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 — 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 — 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.

Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α₁-, α₂-, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 —5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.

Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций

Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.

Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат — соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

источник