Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге

Лабораторная работа №8

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ

Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 B.

Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),

Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза

через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 — 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, — уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.

Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 — 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 — 8,9) при градиенте потенциала 3 — 5 В/см (120 — 350 B для полос длиной 40 — 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 — 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге — прогорание бумаги

1. Буферный раствор. Можно использовать:

а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;

б) веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;

в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.

2. Растворы для окраски электрофореграмм:

а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) —0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) — 100 мл + метиловый спирт — 900 мл;

б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;

в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO₄·7H₂O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.

3. Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:

а) уксусная кислота — 2 %-й раствор;

б) уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.

4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:

а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;

б) для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.

Получение сыворотки крови. 2 — 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 — 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.

Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18×45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 —5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы —2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 —8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.

Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 — 0,02 мл (1 — 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 — 24 ч при напряжении 200 — 300 B

Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 — 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 — 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 — 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.

Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α₁-, α₂-, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 —5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.

Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций

Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.

Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат — соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

источник

Фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге.

Принцип метода. Электрофорез – это движение заряженных частиц в поле постоянного электрического тока. Скорость перемещения молекул белков в электрическом поле зависит от величин заряда, молекулярной массы, pH, ионной силы раствора.

Белки сыворотки крови помещают на полоску бумаги, смоченную буферным раствором, через которую пропускают постоянный электрический ток. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжаются отрицательно и под воздействием электрического поля перемещаются к аноду.

Сыворотка крови человека содержит различные белки. С помощью электрофореза на бумаге выделяются 5 фракций — альбумины, α₁-, α₂-, β-, γ-глобулины.

Клинико-диагностическое значение.Многие патологические состояния сопровождаются количественными изменениями соотношения белковых фракций крови – диспротеинемиями. Уменьшение содержания фракции альбуминов характерно для заболеваний печени за счет снижения белок-синтезирующей функции гепатоцитов. Гипоальбуминемия также сопровождает заболевания почек вследствие потери белка с мочой. Увеличение содержания фракций α₁— и α₂-глобулинов наблюдается при стрессе, наличии воспалительных процессов за счет белков «острой фазы», при коллагенозах и метастазировании злокачественных новообразований. Фракция β-глобулинов растет при гиперлипопротеинемиях. Фракция γ-глобулинов повышается при иммунных реакциях, вызванных вирусными и бактериальными инфекциями. Снижение γ-глобулиновой фракции может иметь место при первичном и вторичном иммунодефиците.

Порядок выполнения работы

1. Устройство прибора для электрофореза. Прибор состоит из выпрямителя, подающего постоянный ток необходимого напряжения, и камеры для электрофореза. Сама камера состоит из 2-х ванн; в одной из них имеется неподвижная перегородка, куда помещается платиновый электрод (+ анод), а в другой находится электрод из нержавеющей стали (- катод). Между ваннами, заполненными соответствующим буфером, имеется соединительный мост, на который помещают полоски специальной фильтровальной бумаги.

2. Проведение электрофореза. Заполнить обе ванны камеры раствором вероналового буфера с pH 8,6. Буферного раствора в ваннах должно быть столько, чтобы он покрывал неподвижную перегородку, но был ниже подвижных перегородок.

Вставить в ванны электроды. Вырезать из фильтровальной бумаги полосы необходимого размера в зависимости от величины камеры (обычно шириной 4-6 см) и простым карандашом отметить место, на которое впоследствии будет наноситься сыворотка (старт). Смочить эти полоски в вероналовом буфере. Вставить в ванны-камеры соединительный мост. Поместить полоски бумаги на сухие пластинки щипцами, погрузив концы полосок в ванны с буфером, и на заранее отмеченные участки бумаги нанести сыворотку по 0,025-0,005 мл на расстоянии 5-6 см от края моста. Нанесение сыворотки производится со стороны катода.

Рисунок 1. Схема камеры для электрофореза белков на бумаге:

1-стабилизатор; 2-камера для электрофореза; 3-буферный раствор; 4-поддерживающий соединительный мост-электрод; 5-фильтровальная бумага для электрофореза.

После нанесения на бумажные полоски сыворотки камера герметично закрывается крышкой. На крышке камеры расположен прижим блокировки, служащий для включения камеры. Присоединенный выпрямитель подает к камере постоянный ток от 2 до 4 мА при постоянном напряжении 110-160В. Электрофорез проводят при градиенте потенциала от 3 до 8 В на 1 см полосы при комнатной температуре. Хорошее разделение происходит за 18-20 часов.

3. Выключение прибора и выявление белковых фракций. Выключают прибор. Снимают камеры и извлекают бумажные полоски из прибора. Затем каждую полоску помещают в сушильный шкаф на 20 минут при температуре 105 0 С. При этом происходит фиксация белковых фракций на бумаге. Окраску белков проводят раствором бромфенолового-синего в течение 30 минут, затем промывают электрофореграммы 2% раствором уксусной кислоты. Полученные электрофореграммы сушат на воздухе. Белковые фракции окрашиваются в сине-зеленый цвет.

4. Количественное определение белковых фракций. Окрашенные белковые пятна вырезают, краситель элюируют 0,01 н раствором щелочи. Интенсивность окраски каждой фракции определяют колориметрически на ФЭКе.

Количественное определение белковых фракций на электрофореграмме можно установить двумя способами: путем элюирования краски и фотоколориметрирования и денситометрическим методом.

Содержание белковых фракций сыворотки крови, полученное с помощью электрофореза на бумаге, в среднем составляет у взрослого человека:

Денситометрический метод. В специальном аппарате (денситометре) через электрофореграмму пропускают пучок света, поглощение которого зависит от оптической плотности окрашенных белковых пятен. Свет, прошедший через электрофореграмму, улавливается фотоэлементом и превращается в электрический ток, колебания которого фиксируют на бумажном листе в виде кривой, каждый пик кривой соответствует определенной белковой фракции.

Рисунок 2. Электрофореграмма сыворотки человека.

источник

Состав и количество фракций белков в биологических жидкостях зависит от применяемого метода фракционирования:

• нейтральными солями (высаливание) — способность белков плазмы выпадать в осадок при воздействии на них растворов солей различных концентраций,
• этиловым спиртом при низкой температуре;

2. Электрофоретическое фракционирование — различают несколько типов электрофореза в зависимости от поддерживающей среды. В качестве поддерживающих сред используют бумагу, ацетатцеллюлозную пленку, агаровый, полиакриламидный, крахмальный гели. При проведении электрофореза необходимо учитывать факторы, влияющие на подвижность разделяемых веществ:

• заряд (обычно зависит от pH), размеры и форма молекул веществ;
• электрическое поле : скорость миграции ионов прямо пропорциональна силе тока, обусловленной переносом ионов буфера и образца, напряжению и обратно пропорциональна сопротивлению (зависит от типа и размеров носителя и ионной силы буфера);
• тип буфера : состав, концентрация, pH, ионная сила. Ионная сила равна сумме n составляющих: с_nz_n 2 / 2, где с_n — молярная концентрация n-ого иона, z — заряд этого иона;
• носитель : учитывается его гидрофильность, адсорбция веществ на молекулах носителя, электроосмос, диффузия.

3. Иммунологические методы — основаны на иммунных свойствах белковых фракций: иммуноэлектрофорез, электроиммунодиффузия, радиальная иммунодиффузия, радиоиммунный анализ;

4. Седиментационный анализ — основан на различной зависимости скорости оседания белков от массы и величины их молекулы;

5. Ионообменная, адсорбционная, распределительная, аффинная хроматография , гель-фильтрация .

Наиболее распространенным методом фракционирования является электрофорез , основанный на разной скорости движения белков в электрическом поле, в зависимости от величины заряда и молекулярной массы. Количество выделяемых фракций определяется условиями проведения электрофореза и качеством поддерживающей среды. Так, например, при электрофорезе на бумаге и пленках ацетата целлюлозы выделяют 5 фракций (альбумины, α₁–, α₂–, β– и γ–глобулины), в то время как в полиакриламидном геле — до 20 и более фракций. При использовании более совершенных методов (радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и других) в составе глобулиновых фракций выявляются многочисленные индивидуальные белки.

За основу классификации белков по фракциям принято разделение белков на бумаге. На протеинограмму оказывают влияние только те белки, концентрация которых достаточно высока.

В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространены методы электрофореза на бумаге и на ацетатцеллюлозных пленках. В качестве унифицированного утвержден метод электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках.

Фосфатные буферы разной молярной силы осаждают соответствующие фракции белка, при этом более концентрированные буферы осаждают более мелкодисперсные фракции белка. По степени мутности судят о концентрации фракций белка.

Коллоидные частицы белка перемещаются в электрическом поле постоянного тока: в щелочной среде к аноду, в кислой — к катоду. В щелочной среде наиболее быстро перемещаются альбумины, α₁-, α₂— и β-глобулины.

Более подробное описание метода электрофореза можно прочитать здесь.

Диагностическое значение измерения преальбуминв и альбумина рассмотрено здесь

На практике диагностически значимо только повышение уровня белковых фракций.

Повышение α₁— и α₂-глобулиновой фракции связано с острыми и подострыми воспалительными процессами и некоторыми злокачественными опухолями, травмами, т.к. сюда входит большинство белков острой фазы (С-реактивный белок, α₂-макроглобулин, α₁-гликопротеид, α₁-антитрипсин, церулоплазмин, гаптоглобин).

Большая часть белков β-глобулиновой фракции является β‑липопротеинами, поэтому повышение этой фракции чаще всего связано с гиперлипопротеинемиями. Кроме того, влияние на динамику этой фракции оказывают трансферрин, гемопексин, компоненты системы комплемента.

Фракция γ‑глобулинов увеличивается при патологических состояниях, связанных с хроническими воспалительными процессами, т.к. содержит иммуноглобулины G, A и M.

источник

Для разделения белков сыворотки крови на их составляющие используют метод электрофореза, основанный на различной подвижности белков сыворотки крови в электрическом поле.

Принцип разделения белков сыворотки крови на фракции состоит в том, что в электрическом поле белки сыворотки крови движутся по смоченной буферным раствором хроматографической бумаге (ацетатцеллюлозной пленке, крахмаловому, агаровом гелям) со скоростью, зависящей в основном от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц.

Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются обычно на пять основных фракций: альбумины, альфа-1-глобулины, альфа-2-глобулины, бета-глобулины, гамма-глобулины, содержание которых определяется с помощью фотометрии или денситометрии.

Электрофорез в агаровом, крахмальном и особенно полиакриламидном геле дает лучшие результаты: четкое разделение и большое количество белковых фракций сыворотки. Недостатки метода: сложность процедуры приготовления геля (дороговизна готовых гелевых пластин).

Преимущества электрофореза на ацетатцеллюлозной пленке:

1. Химическая однородность пленки и одинаковый размер пор

2. Требует малый объем пробы (0,2-2 мкл) для разделения

3. Быстрота разделения и окраски белков, легкость отмывания фона

В сыворотке крови здорового человека при электрофорезе можно обнаружить шесть белковых фракций: преальбумины, альбумины, альфа-1-глобулины, альфа-2-глобулины, бета-глобулины и гамма-глобулины.

Это исследование в диагностическом отношении более информативно чем определение только общего белка или альбумина. При многих заболеваниях изменяется процентное соотношение белковых фракций, хотя общее содержание белка в сыворотке крови остается в пределах нормы.

Анализ фореграммы белков позволяет установить, за счет какой фракции происходит увеличение или дефицит белка, а также судить о специфичности изменений, характерных для данной патологии. Исследование белковых фракций, позволяет судить о характерном для какого-либо заболевания избытке или дефиците белка только в самой общей форме.

Белковые фракции сыворотки крови в норме:

При анализе результатов исследования сыворотки крови на белковые фракции выявляются три типа нарушений:

1. Диспротеинемия (изменение соотношения белковых фракций)

2. Генетические дефекты синтеза белков

3. Парапротеинемия (аномальные белки в крови)

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Увлечёшься девушкой-вырастут хвосты, займёшься учебой-вырастут рога 9790 — | 7665 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

В плазме человеческой крови находится множество белковых компонентов. Они различны по своему составу, строению и подвижности в определенной среде, проводящей электрический ток. На этом и строится разделение общего белка, который локализуется в плазме, на различные белковые фракции. При проведении электрофореза сыворотки крови выясняют количественное отношение отдельных белковых составляющих и структур. Это необходимо для определения наличия у человека различных патологических явлений, например инфекций или онкологии. Именно электрофорез белков сыворотки крови имеет большое значение при проведении диагностики различных болезней.

Для расщепления белковых фракций применяют электрофорез сыворотки крови, принцип которого основан на разной подвижности белковых компонентов в созданном электрическом поле. Такой метод исследования является более точным и информативным, в отличие от стандартного общего анализа крови. Но при этом электрофорез показывает только количество определённой фракции белка, характер и степень патологического процесса в общей форме. Анализ проведенных исследований позволяет медицинским специалистам выяснить, какое именно соотношение белковых фракций наблюдается в организме человека, и определить специфику патологии, присущую конкретному заболеванию.

Большую часть основной биологической жидкости человека, или крови, составляют белки. В общем количестве их норма находится в пределах 60-80 г/л. Для получения точного анализа проводится электрофорез сыворотки крови на бумаге. Это исследование является самым распространенным способом анализа. Основной средой является особая фильтровальная бумага. Главная ее особенность – высокая гигроскопичность. Такая бумага может поглотить воды больше своего веса в 130-200 раз. В зависимости от применяемого оборудования электрофорез на бумаге длится 4-16 часов. Происходит подразделение белковых структур. Затем полосы бумаги обрабатывают специальными красками для получения анализа. Такая методика является самой распространенной в работе медицинских лабораторий. За счёт воздействия электрического тока белковые фракции, заряженные отрицательно, двигаются в сторону положительно заряженного электрода. Благодаря этому белковые составляющие крови подразделяются на 5 известных фракций:

Альбумины заряжены отрицательно, имеют маленькую, по сравнению с другими фракциями, молекулярную массу. За счет этого скорость их передвижения гораздо выше, чем у остальных фракций, и они дальше всех локализуются от участка старта. Первые три фракции глобулина передвигаются с более низкой скоростью из-за своей массы. Но самая маленькая скорость регистрируется у γ-глобулинов. Эти белки имеют большую массу и крупные, относительно других, размеры. Их заряд почти нейтрален, поэтому данная белковая фракция практически не сдвигается с линии старта.

В настоящее время электрофорез сыворотки крови часто проводимый анализ для постановки точного диагноза болезни. Этот анализ могут назначить как терапевты, так врачи узкого профиля. Показаниями по проведению исследований будут:

• различные воспаления;
• болезни хронической природы;
• патологические процессы в соединительной ткани;
• внутреннее кровотечение;
• злокачественные новообразования.

Для того чтобы полученные результаты поведенных исследований были верными, не менее чем за 8 часов до сдачи крови необходимо отказаться от приёма еды. Кроме того, необходимо согласовать прием лекарственных средств, если таковые имеются, с лечащим врачом.

Для того чтобы результаты не были по ошибке завышены, необходимо снизить до минимума возможность свертывания крови для определения показателя белковых фракций и общего белка. Электрофорез сыворотки крови проводится аккуратно, поскольку существует вероятность искажения полученных результатов из-за фибриногена. Он может прятать ненормальные белки или быть спутанным с ними.

В течение суток после сдачи пробы будет готов анализ на электрофорез белков сыворотки крови. Норма полученных показателей по категориям у взрослых людей:

1. Общий белок – 63-82 г/л.
2. Альбумины – 40-60 % от общего количества фракций.
3. α₁-глобулины – 2-5 %.
4. α₂-глобулины – 7-13 %.
5. β-глобулины – 8-15 %
6. γ-глобулины – 12-22 %.

Изменение количества любой белковой фракции в большую или меньшую сторону может свидетельствовать о развитии той или иной патологии. Для получения достоверной информации об этом необходим электрофорез белков сыворотки крови. Расшифровка результатов облегчит медицинским специалистам постановку диагноза и выбор лечения.

В самом начале при анализе полученных результатов определяют количество альбумина. Увеличение этой фракции может говорить об обезвоживании. Такое может произойти, если у больного отмечается затяжная рвота или нарушения в пищеварительной системе. Также увеличение альбумина происходит при ожогах большой площади кожного покрова.

Гораздо опаснее, если в организме снижается количество альбуминов, это может говорить о следующих патологиях:

1. Поражения почек и печени.
2. Патологии желудочно-кишечного тракта.
3. Инфекционные процессы.
4. Нарушения в деятельности сердечно-сосудистой системы.
5. Кровотечения.
6. Злокачественные новообразования.
7. Сепсис.
8. Ревматизм.

Незначительное уменьшение количества альбуминов может быть также:

1. У будущих матерей.
2. При превышении дозы лекарственных препаратов.
3. При длительной лихорадке.
4. У заядлых курильщиков.

Уменьшение количества a1-глобулинов регистрируется при недостатке α₁-антитрипсина. Увеличение же отмечают при обострении воспалений в организме, нарушениях в работе печени, при тканевом распаде.

Регистрируют его при сахарном диабете, воспалительных процессах в поджелудочной железе, у новорожденных детей при желтухе, при гепатитах токсического происхождения. Свидетельствует оно и о неправильном, несбалансированном питании.

Происходит при наличии следующих заболеваний:

1. Воспаления, особенно с присутствием гнойного экссудата (воспаление легких и другие процессы с наличием гноя).
2. Поражения соединительной ткани (например, ревматизм).
3. Злокачественные новообразования.
4. Периоды восстановления после ожогов.
5. Поражение почек.

Кроме того, такое явление характерно для гемолиза крови в пробирке во время проведения исследования.

Проявляется при гиперлипопротеидемии (увеличении количества липидов в крови), патологиях печени и почек. Можно обнаружить при открытой язве желудка, а также гипотиреозе (нарушение работы щитовидной железы). Снижение фракции регистрируют при гипобеталипопротеинемии (повышение в крови компонента беталипопротеин).

Эта фракция включает в свой состав иммуноглобулины. Поэтому увеличение γ-глобулинов регистрируется при сбоях в иммунитете. Обычно это происходит при различных инфекциях, развитии воспалительного процесса, изменениях ткани и ожоговых поражениях. Рост γ-глобулинов отмечают у больных хронической формой гепатита. Практически такая же картина характерна для цирроза печени. При запущенных случаях данного заболевания количество белковой фракции γ-глобулинов значительно выше показателя альбуминов. При определенных болезнях могут возникать сбои в образовании γ-глобулинов, и происходит развитие измененных протеинов в крови – парапротеинов. Для выяснения характера такого развития производится дополнительное исследование – иммуноэлектрофорез. Такая картина характерна для миеломного заболевания и патологии Вальденстрема.

Увеличение количества γ-глобулинов также присуще следующим патологиям:

• красной волчанке;
• эндотелиоме;
• ревматоидной форме артрита;
• остеосаркоме;
• хронической форме лимфолейкоза;
• кандидомикозу.

Снижение показателя γ-глобулинов подразделяют на 3 вида:

1. Физиологический (характерен для детей в возрасте от трех до пяти месяцев).
2. Врожденный (развивается с момента рождения).
3. Идиопатический (когда причину развития установить не удается).

Вторичное снижение регистрируется при развитии заболеваний, которые вызывают истощение иммунной системы. В последнее время в медицинской практике все чаще проводится анализ на определение количества преальбуминов. Обычно такое исследование проводят больным, находящимся в реанимации.

Уменьшение количества преальбуминов очень важный и точный тест на определение недостаточности белковых структур в организме пациента. При проведении анализа на преальбумины выполняют коррекцию белкового метаболизма у таких пациентов.

Принцип проведения подобного анализа схож с технологией выполнения электрофореза сыворотки крови. Проводят его для более точной постановки диагноза или обнаружения других патологий. Кроме того такой анализ поможет выявить у больного наличие протеинурии.

Электрофорез сыворотки крови и мочи – важные методы в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря методике исследования и высокой точности они помогают определить вид патологии. Точный диагноз – верный путь к правильному лечению и полному выздоровлению.

источник

Белки – высокомолекулярные органические азотсодержащие полимеры, структурной единицей которых являются аминокислоты, и имеющие высокий уровень структурной организации, что в конечном итоге и определяет их важные биологические функции (в процессе свертывания крови, реакциях гуморального иммунитета, регуляции КЩР, устойчивости эритроцитов и лейкоцитов в кровотоке и ряд других). Современные физико – химические и иммунохимические методы исследования позволяют выявить в плазме крови более 100 белковых фракций.

В условиях клинических лабораторий для разделения белков сыворотки крови наибольшее распространение получил метод электрофореза.

Амидошварц 1% раствор (1г амидошварца растворить в 100мл 2% уксусной кислоты); агар (агароза) 1,2% (к 12гр агарозы добавить 1л раствора мединало – вероналового буфера pH 8,6 при нагревании на водяной бане); буфер веронал – мединаловый pH8,6 (8,76г мединала и 1,38г веронала поместить в колбу на 1л, добавить 750мл воды; растворить при нагревании на водяной бане, довести водой до метки, при необходимости pH довести до 8,6).

Штатив с пробирками, пипетки на 5 и 10 мл, предметные стекла, прибор для электрофореза, денситометр, СФ или ФЭК, термостат.

Сыворотка крови (или другая биологическая жидкость).

Принцип метода – различные по молекулярной массе, заряду и изоэлектрической точке в постоянном электрическом поле перемещаются с различной скоростью, что и положено в основу их разделения и последующего количественного определения.

Провести в электрофоретической камере с крышкой, внутренние кюветы которой заполнены агаром и буферным раствором с pH 8,6. внутренние кюветы камеры залить горячим раствором агара и оставить до застывания. В наружные ввести мединал – вероналовый буферный раствор. Подготовить пластины с носителем агаром – на рамку, предварительно помещенную на горизонтальном столике, поместить предметные стекла 3*4см, залить горячим агаром с толщиной слоя 3мм, выровнять горизонтальный уровень и оставить для застывания (пузырьки воздуха, попавшие в агар, должны быть удалены до застывания). Пользоваться гелем рекомендуется не ранее, чем через сутки после заливки. В геле с помощью специального шаблона (или обломком лезвия безопасной бритвы) сделать канавки размером 5*0,3мм, агар из них удалить кусочком плотной фильтровальной бумаги (канавки не должны доходить до стекла, в то же время они должны быть такого размера, чтобы в них поместилось нужное количество (1 – 3 мкл) анализируемой белковой смеси). Хорошие результаты дает также другой способ – внесение разделяемой смеси в кусочки плотной хроматографической бумаги соответствующего размера, вставляемой в гель.

Рамку с пластинами поместить в электрофоретическую камеру. Для создания контакта между гелем кювет и агаром пластин создать перемычку путем внесения расплавленного геля.

Подготовленную электрофоретическую камеру подключить к источнику питания и проводить электрофорез (режим работы – при градиенте потенциала порядка 15V/см при 25 – 35 мА в течение 30 минут).

После отключения прибора стекла с рамкой извлечь и зафиксировать в 12% растворе уксусной кислоты на этаноле в течение 12 часов, а затем 24 часа в дистиллированной воде с добавлением антисептика, с последующим отмыванием антисептика. Затем стекла завернуть в фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой и выдержать 24 часа в термостате при 37°С. По истечении времени стекла осторожно отмыть от бумаги и поместить на 2 часа в раствор амидошварца, затем пластины отмыть 10% уксусной кислотой при комнатной температуре в вертикальном положении. При этом выступают различной интенсивности окраски пятна, соответствующие определенным белковым фракциям.

Для количественного определения окрашенных фракций применяют как денситометрию, так и элюцию красителя. В последнем случае пятна вырезают и элюируют в 5мл 0,01N растворе NaOH. Интенсивность элюированной окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 595нм или на ФЭКе с зеленым светофильтром. Исходя из показателей экстинкции, строят кривую распределения фракции белков на электрофореграмме. Для каждой пробы ставят два параллельных исследования и вычисляют среднее значение. Процентное содержание фракций вычисляют по формуле С_фр=(Е_фр*100)/Е_{всех фр}

Для большей точности рекомендуется в пробирки для элюции вносить следующие количества элюирующего раствора: альбумина – 20мл, α₁-глобулинов-5мл, α₂-, β-, γ-глобулинов – 10мл, что делается для того, чтобы сделать более близкими величины экстинкций при фотометрировании. После фотометрирования полученные величины экстинкций умножают на соответствующий фактор – для альбумина – 4, α₁-глобулина – 1, α₂-, β-, γ- 2 и ставят эти величины в формулу для определения соотношения фракций.

В норме содержание белковых фракций в процентном отношении следующее: α₁-глобулина – 2,5 – 5, α₂-глобулина – 7 – 13, β-глобулина 8 – 14, γ-глобулина – 12 – 22, альбумина – 50 – 61.

При различных патологических состояниях происходит изменение протеинограммы. Острый воспалительный процесс характеризуется уменьшением содержание альбуминов и возрастанием количества α-глобулинов; а в более поздние сроки – увеличением концентрации γ-глобулинов. Для хронического воспаления более типично выраженное повышение уровня α_2- и γ-глобулинов и умеренное снижение альбуминов в сыворотке крови. При злокачественных новообразованиях резко снижается содержание альбуминов с одновременным существенным увеличением всех глобулиновых фракций. Поражения печени (гепатиты, цирроз) сопровождаются снижением альбуминов, которые синтезируются в печеночной ткани, и относительным увеличением γ-глобулинов. Вследствие увеличения IgA, происходящего при некоторых формах цирроза печени, отмечается слияние β- и γ-фракций.

Методом электрофореза может быть выявлена недостаточность α₁-антитрипсина. Этот белок является основным компонентом полосы α₁-глобулинов и у пациентов с недостаточностью α₁-антитрипсина (гомозиготных) эта полоса может быть очень неотчетливой, но у гетерозиготных пациентов полоса может казаться нормальной.

При электрофорезе иммуноглобулины ведут себя в большей степени как γ-глобулины, хотя IgA и IgM могут двигаться с β- или α₂-глобулинами. Поскольку концентрация IgG в нормальной плазме существенно превышает содержание других иммуноглобулинов, полоса γ-глобулинов, получаемая при электрофорезе нормальной сыворотки, в значительной степени представлена IgG. Уменьшение или увеличение концентрации иммуноглобулинов в плазме могут иметь как физиологический, так и патологический характер.

источник

Этот анализ является исследованием, которое позволяет определить их количественные и качественные показатели по тому, как белки распределяются в электрическом поле. Исследование основано на том, что белковые молекулы несут заряды, положительные или отрицательные в зависимости от того, какой кислотностью будет обладать среда, в которой будет проводиться непосредственно электрофорез. Молекулы, которые окажутся положительно заряженными, будут адсорбироваться лучше, нежели чем те, которые несут отрицательный заряд.

Носителями, которые будут применяться для электрофореза, могут быть хроматографическая бумага, агаровый гель, полиакриловой гель, ацетатцеллюлозная бумага или акриловый гель. Значительно реже применяется капиллярный электрофорез.

Во время анализа белки разделяют на 5 или 6 фракций, в зависимости от применяемого метода. Это будут гамма-глобулины, которые делятся на бета-1 и бета-2, альбумины — альфа-1 и альфа-2, а также бета-глобулины.

Имеются установленные нормы белковых фракций, которые должны присутствовать в крови. Отклонение их от показателей является признаком нарушения в организме, что требует проведения обследования для выявления причины.

Значения показателей, в зависимости от того какие реактивы применяются в конкретной лаборатории, могут несколько изменяться. Поэтому в бланке результатов исследования в каждом медицинском учреждении обязательно указываются значения нормы, которые приняты в нем. На них будет ориентироваться врач при расшифровке анализа.

Электрофорез белков крови назначают не очень часто, так как сегодня современные лабораторные исследования позволяют провести анализ на определенный белок, что ускоряет процесс диагностики. Абсолютным показанием к электрофорезу является наличие монолокальной гаммапатии. Также иногда анализ может быть показан в таких случаях:

• чрезмерно высокая скорость оседания эритроцитов, когда она превышает 50 мм/ч;
• значительно повышенный уровень гамма-глобулинов;
• скрининговое обследование для контроля эффективности лечения миеломной болезни;
• чрезмерно высокий общий белок в крови;
• ряд аутоиммунных заболеваний, поражающих печень и почки;
• слабость, для которой нет выраженной причины;
• развитие патологических переломов костей и постоянные боли в костях;
• частые рецидивы инфекционных заболеваний;
• нарушения, обнаруженные в прочих анализах, указывающие на то, что у человека могут развиваться анемии, лейкемии, гиперкальциемия или гипоальбуминемия.

При общей диспансеризации и получении медицинских справок для трудоустройства данное исследование крови не осуществляется. Не требуется оно и в процессе подготовки человека к хирургическому вмешательству.

Для получения наиболее точных результатов рекомендуется соблюдение правил подготовки к анализу. Они включают в себя голодную диету в течение 15 часов до того как будет взята кровь, когда пациент может употреблять только чистую не газированную воду. За 90 минут до проведения исследования необходимо полностью исключить нагрузки как эмоциональные, так и физические, и курение в активной или пассивной форме. Чтобы не допустить искажение данных, забор материала не проводят сразу после того, как был осуществлен гемодиализ или проведена процедура, при которой использовались радиоконтрастные составы. Важно также, чтобы за несколько дней до исследования полностью было исключено лечение пенициллином, так как он вызывает расщепление амбулина, что исказит результат.

Исказить показатели, кроме неправильной подготовки к проведению анализа, могут 2 фактора: недавно проведенная процедура гемодиализа, из-за которой произошло разрушение эритроцитов в крови, и повышенный уровень билирубина в организме. В любом из этих случаев потребуется пересдача анализа через некоторое время, которое определит врач.

источник

Исследование белковых фракций в крови (протеинограмма) – биохимический анализ, направленный на определение процентного соотношения альбуминов и глобулинов в плазме. Анализ на белковые фракции может проводиться в сочетании с общим протеином крови, протромбиновым временем, трансаминазами. Протеинограмма находит применение в диагностике и динамическом наблюдении за ходом лечения системных заболеваний соединительной ткани, острых и хронических воспалительных процессов, болезней крови, состояний, связанных с иммунодефицитом. Для фракционирования белков используется сыворотка венозной крови. Анализ производится методом электрофореза. В ходе исследования выделяют 5 фракций: альбумин, альфа-1-глобулин, альфа-2-глобулин, бета-глобулин, гамма-глобулин. Определяют их количественное содержание (в г/л) и соотношение (в %%). Продолжительность исследования составляет от 1 до 3 рабочих дней.

Исследование белковых фракций в крови (протеинограмма) – биохимический анализ, направленный на определение процентного соотношения альбуминов и глобулинов в плазме. Анализ на белковые фракции может проводиться в сочетании с общим протеином крови, протромбиновым временем, трансаминазами. Протеинограмма находит применение в диагностике и динамическом наблюдении за ходом лечения системных заболеваний соединительной ткани, острых и хронических воспалительных процессов, болезней крови, состояний, связанных с иммунодефицитом. Для фракционирования белков используется сыворотка венозной крови. Анализ производится методом электрофореза. В ходе исследования выделяют 5 фракций: альбумин, альфа-1-глобулин, альфа-2-глобулин, бета-глобулин, гамма-глобулин. Определяют их количественное содержание (в г/л) и соотношение (в %%). Продолжительность исследования составляет от 1 до 3 рабочих дней.

Большая часть протеинов крови представлена альбуминами — их содержание в плазме варьирует от 55 до 65%. Оставшаяся часть белков приходится на фракцию глобулинов. Синтез альбуминов, альфа- и бета-глобулинов происходит в клетках печени. Значительная доля бета- и гамма-глобулинов вырабатывается в костном мозге и лимфатической ткани. Если процентное соотношение компонентов белка отклоняется от нормальных значений, развивается диспротеинемия. При этом уровень общего белка может оставаться неизменным.

Главная роль сывороточного альбумина — сохранение коллоидно-осмотического давления плазмы на постоянном уровне, распределение воды между кровеносными сосудами и интерстициальным пространством. Альбумины являются переносчиками желчных пигментов, билирубина, лекарственных веществ и некоторых гормонов.

Глобулины делятся на 4 основные фракции. Альфа-1-глобулин в значительной степени представлен альфа-1-антитрипсином, который выполняет функцию ингибирования протеаз – трипсина, химотрипсина и эластазы. В состав альфа-1-глобулина входят альфа-кислый гликопротеин, участвующий в образовании новых фибрилл в зоне воспаления, и белки, транспортирующие жиры и гормоны.

Альфа-2-глобулин включает в себя острофазовые белки: альфа-2-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин и транспортный белок аполипопротеин В. Альфа-2-макроглобулин — это белок-модулятор воспалительных и иммунных реакций, участвует в системе свертывания крови, является неспецифическим маркером фиброза печени. Гаптоглобин образует соединение со свободным гемоглобином при разрушении эритроцитов, тем самым препятствует его выведению из организма; доказана роль этого глобулина в активизации лимфоцитов в очаге воспаления. Церулоплазмин — это белок, характеризующийся высокой антиоксидантной способностью. Его ведущей ролью является окисление двухвалентного железа в безопасное трехвалентное. Церулоплазмин содержит 90% всей меди организма.

Бета-глобулин преимущественно состоит из белка-переносчика железа – трансферрина. В состав глобулина входят также бета-липопротеины, транспортирующие холестерин и фосфолипиды; иммуноглобулины и компоненты комплемента, участвующие в формировании гуморального и клеточного иммунитета. Гамма-глобулин состоит из совокупности иммуноглобулинов – IgG, IgM, IgA, IgE. Эти соединения являются антителами, отвечающими в большей части за гуморальный иммунитет. Их основная функция — защита организма от инфекционных агентов.

Исследование белковых фракций применяется в ревматологии для диагностики системных заболеваний соединительной ткани, определения степени активности заболеваний и эффективности проводимой терапии. Иммунологи и инфекционисты используют результаты анализа для оценки способности иммунной системы адекватно реагировать на экзогенные и эндогенные антигены, степени тяжести воспалительного процесса. В гастроэнтерологии фракционирование белков в крови проводят для диагностики и мониторинга заболеваний печени и кишечника, определения уровня печеночной недостаточности и степени выраженности синдрома нарушенного кишечного всасывания.

Анализ на белковые фракции назначают в ходе второго этапа комплексного обследования по результатам выявленных отклонений в клинических и биохимических показателях. Проведение анализа показано при патологических переломах костей, повышенном кальции в крови, анемии. Такие симптомы могут говорить о развитии остеопороза, связанного с накоплением парапротеина в костях при миеломе. Протеинограмму назначают при отеках и выраженной протеинурии для исключения нефротического синдрома вследствие патологии гепаторенальной системы, развития гипо- и диспротеинемии.

Исследование белковых фракций показано при необъяснимой слабости, продолжительной лихорадке, частых простудных заболеваниях. Эти симптомы появляются вследствие уменьшения уровня глобулиновой фракции в плазме и развития иммунодефицитного состояния. Анализ проводится с целью дифференциальной диагностики заболеваний печени и почек, врожденной недостаточности отдельных фракций протеина, эндокринных заболеваний.

После рентгенологического обследования с контрастированием, процедур гемодиализа и плазмафереза требуется недельная отсрочка в проведении исследования.

Подготовку к исследованию белковых фракций в крови необходимо начинать заблаговременно. За несколько недель до планируемого анализа отменяют прием препаратов, снижающих холестерин. Ориентировочно за трое суток до исследования не следует заниматься тяжелой физической работой и употреблять спиртные напитки. Перерыв между забором крови и последним приемом пищи должен составлять минимум 8-10 часов. За 1 час до непосредственной сдачи анализа нельзя курить. Взятие крови производится в первой половине дня.

Кровь из периферической вены забирают одноразовым шприцом или с использованием вакуумной системы – вакутайнера. Пробирку с кровью маркируют, информацию о пациенте вносят в обычный или электронный журнал. Промаркированные емкости передают курьеру в спецконтейнере для транспортировки в медлабораторию. Имеется множество способов фракционирования протеинов в крови: осаждение нейтральными солями, иммунологический, седиментационный анализ, хромография, гель-фильтрация и электрофоретический. В настоящий момент электрофорез белков на пластинах с агаровым гелем получил наибольшее распространение.

Принцип метода основан на разъединении макромолекул белка, отличающихся между собой молекулярной массой, конфигурацией и электрическим зарядом. Исследуемый материал вносят в лунку, находящуюся у края геля. В лунку добавляют заряженный краситель и начинают пускать электроток. Небольшие по массе и конфигурации молекулы двигаются стремительнее и дальше. Постепенно весь материал с красителем распределяется зонами по всей длине и достигает конца пластины. Каждой зоне соответствует своя фракция белка. По насыщенности окрашивания полос судят о концентрации белковых молекул.

Определение белковых фракций в крови является высокотехнологическим и трудоёмким анализом, требующим особой подготовки врача-лаборанта. Срок выполнения исследования — от 1 до 3 дней, зависит от оснащённости и загруженности лаборатории.

Нормальные значения белковых фракций могут несколько отличаться в разных лабораториях. Поэтому полученный результат необходимо сравнивать с показателями, указанными на бланке. Единицей измерения является % (процент). У взрослых референсные значения имеют следующие диапазоны: альбумин — 55-65, альфа-1-глобулин — 2,5-5, альфа-2-глобулин – 6-12, бета-глобулин – 8-15, гамма-глобулин – 11-21%. По итогам анализа определяют отношение альбуминов к глобулинам, так называемый альбумин-глобулиновый коэффициент. В норме у здорового человека коэффициент равен 1,5-2,3.

У детей уровень глобулинов несколько ниже, чем у взрослых. Во время III триместра беременности отмечается физиологическое снижение альбуминов и гамма-глобулинов, а фракции альфа-1, альфа-2 и бета–глобулинов, наоборот, возрастают. Снижение альбумина связано с усиленным его использованием для роста и развития плода. Уменьшение уровня гамма-глобулинов является компенсаторной реакцией, которая предотвращает развитие иммунной реакции будущей матери на чужеродные ткани плода.

Альбумин. Повышение альбуминов в крови возможно при состояниях, сопровождающихся потерей жидкости: рвотах, поносах, длительной лихорадке с обильным потоотделением. Причиной относительного повышения альбумина в крови в этих случаях является снижение массы циркулирующей крови. Концентрация альбумина увеличивается при обширных ожогах и тяжелых травмах, сопровождающихся шоком. Генез повышения протеина тот же.

Альфа-1-глобулин. Показатель повышается при остром воспалении (бронхопневмонии, холецистите), ревматических и инфекционных болезнях. Причиной является рост уровня альфа-1-антитрипсина и альфа-1 кислого гликопротеина, которые вырабатываются организмом для моделирования местного иммунного ответа. Концентрация альфа-1-глобулина увеличивается при циррозе печени, лимфогранулематозе, беременности с патологией плода.

Альфа-2-глобулин. Уровень фракции повышается при нефротическом синдроме. Это связано с развитием компенсаторного механизма, выражающегося в ускоренном синтезе белка в качестве ответа на его усиленное выделение почками. Увеличение концентрации альфа-2-глобулина отмечается при хронических заболеваниях печени, инфаркте миокарда, системных заболеваниях соединительной ткани, неопластических процессах. Причиной роста показателя является повышение выработки альфа-2-макроглобулина, гаптоглобина и церулоплазмина, которые участвуют в иммунных и воспалительных реакциях.

Бета-глобулин. Увеличение уровня бета-глобулина происходит при острых воспалительных заболеваниях, гломерулонефрите, ревматоидном артрите. Причиной является повышенное образование иммуноглобулинов и активация комплементарной системы, участвующих в клеточном и гуморальном иммунитете. Рост бета-глобулина при железодефицитной анемии связан с ускоренным синтезом трансферрина в ответ на снижение концентрации железа в организме. Уровень бета-глобулина возрастает при наследственных и приобретенных гиперлипопротеинемиях. Это обусловлено увеличенной нагрузкой на транспортные белки — бета-липопротеины, которые являются переносчиками холестерина и фосфолипидов.

Гамма-глобулин. Повышение фракции гамма-глобулина отмечается при хронических инфекциях, глистных инвазиях, дерматомиозите, склеродермии. Причиной является формирование В-клеточного иммунитета, сопровождающегося ростом выработки иммуноглобулинов класса G и Е. Уровень показателя возрастает при макроглубулинемии Вальденстрема, миеломе. Это обусловлено синтезом огромной массы патологических белков.

Альбумин. Снижение концентрации альбумина в крови сопровождает диабетическую нефропатию, нефротический синдром. Это связано с повышенным выделением белка с мочой через поврежденные почечные канальцы. Причинами гипоальбуминемии при гепатитах и циррозах печени является угнетение синтеза альбуминов гепатоцитами. Снижение уровня альбумина отмечается при энтероколитах и панкреатитах. При этих состояниях всасывание белков, поступающих с пищей, замедляется. Неопластические процессы, гипертиреоз, продолжительная терапия кортикостероидами снижают концентрацию альбумина вследствие быстрого разрушения белковых соединений.

Альфа-1-глобулин. Снижение уровня альфа-1-глобулина отмечается у больных с тяжелой хронической обструктивной болезнью легких, бронхиальной астмой, эмфиземой. Причиной является врожденная недостаточность альфа-1-антитрипсина. Уровень фракции уменьшается при острых вирусных гепатитах по причине массивного поражения печени и нарушения ее белковосинтетической функции.

Альфа-2-глобулин. Снижение уровня альфа-2-глобулина наблюдается при заболеваниях, сопровождающихся внутрисосудистым гемолизом или повышенным высвобождением гемоглобина. К ним относятся аутоиммунные гемолитические анемии, малярия, посттрансфузионные гемолизы. Это связано с тем, что уровень гаптоглобина быстро истощается за счет связывания с высокотоксичным свободным гемоглобином. Концентрация альфа-2-глобулина уменьшается при панкреатитах, ожогах, лечении альтеплазой и стрептокиназой. Причиной является быстрое удаление альфа-2-макроглобулина с протеолитическими ферментами.

Бета-глобулин. Падение концентрации бета-глобулина в крови происходит при циррозе печени за счет угнетения синтеза этого белка печеночными клетками. Снижение показателя отмечается при состояниях, связанных с перегрузкой железом, например при частых переливаниях крови или гемахроматозе. Причиной является усиленное расходование белка трансферрина, участвующего в транспортировке железа в костный мозг и печень. Снижение уровня бета-глобулина в крови обнаруживается при злокачественных опухолях, обширных ожогах и травмах, что обусловлено быстрым распадом белка в организме.

Гамма-глобулин. Сниженный уровень гамма-глобулина отмечается при наследственных и приобретенных иммунодефицитных состояниях, таких как болезнь Брутона, лимфосаркома, лимфогранулематоз. При этих состояниях гамма-глобулины не вырабатываются совсем, или в организме резко уменьшается их синтез.

Результаты анализа крови на белковые фракции очень сложны для интерпретации. Они не могут быть использованы для самодиагностики и лечения. Точный диагноз может поставить только врач в совокупности с данными жалоб и анамнеза пациента, другими анализами и инструментальными методами обследования. После установления причины и вида диспротеинемии специалист определяется с тактикой лечения и рекомендациями, которые необходимо неукоснительно соблюдать.

источник

Основные требования к технологическим системам и процедуре осуществления зонального электрофореза (на хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозной пленке, гелях) белков плазмы (сыворотки) крови

Принцип фракционирования ( электрофореза) основан на том, что в электростатическом поле белки сыворотки крови движутся по смоченной буферным раствором хроматографической бумаге (ацетатцеллюлозной пленке, крахмаловому, агаровому гелям) со скоростью, зависящей в основном от величины электрического заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются обычно на 5 основных фракций: альбумины, α₁-глобулины, α₂-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины, содержание которых определяется с помощью фотометрии или денситометрии. При обработке красителями белки связываются с ними пропорционально своей концентрации. Определив интенсивность окрашивания, можно вычислить концентрацию белковых фракций.

Основные требования к приборам, реагентной базе и процессу осуществления электрофореза

Система для электрофореза. Блок питания должен давать стабилизированный ток силой 50—100 мА при напряжении 180— 600 В.

Электрофоретическая камера . Для предохранения полосы носителя от высыхания в камере должна поддерживаться определенная влажность воздуха. При нагревании бумаги уси­ ленно испаряется буферный раствор в середине полосы и с краев ленты, что обусловливает его движение (реофорез) и вследствие этого изменение формы пятен фракций белков в процессе их электрофоретического разделения; поэтому отдельные конструк­ ции электрофоретических камер располагают системой охлажде­ ния полосок носителя.

В разных отделах камеры буферный раствор должен иметь одинаковый уровень, чтобы избежать его перелива через ленту в результате сифонного действия. Концы полосок носителя не сле­дует погружать в буферный раствор, в котором находятся элек­троды. Электрическую связь между лентами и электродами уста­навливают посредством фитильков из бумажных полосок (ваты, марли), смоченных буферным раствором; этим устраняется пере­дача изменений рН буфера в то пространство, в которое погруже­ ны ленты.

Поскольку полоса ацетатцеллюлозной пленки (бумаги) может быть расположена как горизонтально, так и под углом к горизон­тали (вертикально), соответственно различают горизонтальный и вертикальный электрофорез. Первый из них позволяет получить более точные результаты. Важно, чтобы полоска носителя (хроматографической бумаги, ацетатцеллюлозной пленки) была хо­рошо натянута. Желательно, чтобы она располагалась как бы в «подвешенном» состоянии, поддерживаемая вертикально распо­ложенной перегородкой, системой натянутых капроновых нитей, а связывающий обе ванны мостик имел шипы для укладывания на них полосок. Это предотвращает образование тонкого капил­лярного слоя буферного раствора между полоской ацетатцеллю­лозной пленки, хроматографической бумаги и пластиной; капил­лярный слой буферного раствора в значительной мере ухудшает качество электрофоретического разделения.

Большое значение имеют свойства носителя , исполь­ зуемого для электрофореза. Ацетатцеллюлозная пленка, как и хроматографическая бумага, должна быть однородной и плотной. Поскольку в отдельных лабораториях все еще используют хроматографическую бумагу, в отношении ее как носителя необходимо отметить следующее.

Избранный сорт бумаги: «хроматографическая быстрая» или «хроматографическая медленная» — нельзя менять, так как от этого в определенной мере зависят получаемые результаты. Если хроматографическая бумага подлежит денситометрии, то реко­ мендуется быстро впитывающий сорт, в остальных случаях пред­ почтительнее пользоваться бумагой для медленного впитывания (марки «М»). Бумага марки «М» имеет гладкую лицевую и рубча­ тую обратную стороны. При внимательном рассмотрении обрат­ной стороны можно заметить грубые и крупные штрихи, идущие параллельно более длинной стороне листа. Эти штрихи отражают ход волокон целлюлозы. Применяемые для электрофореза бу­мажные полоски, размером 3,5 х 40 см (или другого формата, со­ответствующего габаритам электрофоретической камеры), наре зают таким образом, чтобы волокна целлюлозы шли вдоль поло­сок. Благодаря этому каждая полоска бумаги представляет собой систему продольно идущих капилляров, что способствует прод­вижению белков (и других веществ) и препятствует их растека­нию к краям полоски. Кроме того, полученная лента, в отличие от аналогичной с поперечным ходом волокон целлюлозы, мень­ше деформируется при увлажнении и высыхании. На одном из концов каждой полоски простым карандашом отмечают номер анализа и дату взятия крови для исследования.

Направление хода волокон целлюлозы в бумаге можно опре­ делить и по растеканию на ней капли воды, принимающей форму эллипса, длинник которого и соответствует распространению во­локон целлюлозы.

Подготовка к электрофорезу и процедура его проведения. Пе ред электрофорезом камеру устанавливают строго горизонталь­но. Кюветы заполняют буферным раствором таким образом, что­ бы уровень жидкости в них был одинаков. Оба отделения каждой кюветы соединяют друг с другом полоской фильтровальной бу­маги. Полоски ацетатцеллюлозной пленки (хроматографической бумаги) равномерно натягивают между кюветными отделениями. Необходимо, чтобы концы увлажненных буфером полос (мем­бран) были погружены в буферный раствор внутренних отделе­ний (если таковые имеются) электродных кювет. Затем на зара­ нее отмеченные у катода участки полосы носителя наносят сыво­ ротку (иногда на расстоянии 2 см от середины полоски в сторону катода).

Наилучшие результаты дает метод пропитывания хроматогра­фической бумаги буферным раствором. Однако на практике в це­лях экономии времени ленты обычно смачивают в буфере и слег­ ка высушивают, отжимая между листами фильтровальной бумаги.

Нанесение на полоску носителя биологического матери­ала осуществляется с помощью аппликатора (специального или импровизированного) либо микропипетки (автоматической, обычной). При первом способе на узкий край шлифованного стекла (покровного, предметного) или полоски отмытой рентге­новской пленки наносят 0,1-миллилитровой микропипеткой 10 мкл (0,01 мл) свежеполученной (негемолизированной) сыворот­ ки.

Этот импровизированный аппликатор приставляют нижним ребром к увлажненной бумаге и после впитывания сыворотки сразу же отнимают (нужно следить за тем, чтобы между боковыми гранями аппликатора и краями полос оставался промежуток ши­ риной 5—6 мм). Наносить сыворотку на бумагу можно и непос­ редственно из пипетки — таким образом, чтобы след сыворотки составил поперечную (по отношению к длиннику бумаги) полоску.

В том и другом случаях нужно соблюдать следующие правила: если используют микропипетку на 0,1 мл, в нее насасывают сы­воротку до метки 0,085. Пипетку зажимают между пальцами в вертикальном положении, причем верхнее ее отверстие не следу­ ет закрывать пальцем. Небольшое количество сыворотки, нахо­ дящееся в пипетке, не вытекает из нее, так как жидкость удержи­ вается капиллярными силами. Слегка касаясь бумаги (материала ацетатцеллюлозной пленки) нижним краем пипетки, ее переме­щают по полосе в поперечном направлении (не доводя пипетку на 2 мм до каждого края), пока мениск сыворотки не опустится до метки 0,095. Удобно пользоваться и автоматической микропи­ петкой.

Допустимо окрашивание сыворотки перед ее нанесением на полосу хроматографической бумаги. Для этого к 0,5 мл сыворот­ки добавляют несколько крупинок (проще всего на кончике стек­ лянной иглы) порошка бромфенолового синего. По перемеще­нию пятна красителя, связывающегося, прежде всего с альбуми­ном, можно визуально следить за миграцией пятен.

Затем крышку камеры плотно закрывают и включают прибор.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови осуществляют при комнатной температуре и градиенте потенциала от 3 до 8 В на 1 см длины полоски носите­ля. Сила тока, зависящая от величины подаваемого напряжения, разновидности, особенностей состава и рН буферного раствора, толщины полоски носителя (хроматографической бумаги или ацетатцеллюлозной пленки), температуры, при которой происхо­дит разделение, не должна превышать 0,1—0,3 мА на 1 см попе­речного сечения хроматографической бумаги или ацетатцеллю­лозной пленки . Оптимальное время электрофореза подбирают опытным путем. Обычно оно составляет 20—40 мин при электрофорезе на ацетатцеллюлозной пленке и 7—12 ч при электрофорезе на хроматографической бу­маге. По окончании электрофореза отключают источник посто­янного тока, из камеры извлекают бумажные полоски и прикрепляют их на деревянные рамки или развешивают на стеклянных палочках, затем бумажные полоски помещают в горячий сушиль­ ный шкаф так, чтобы они не касались ни друг друга, ни металли­ческих стенок и деталей шкафа (это предохраняет электрофореграммы от смазывания фракций).

Бумажные ленты высушивают в шкафу при 95—105 0 С в тече­ ние 10—15 мин, но не более 20—30 мин. Поскольку связывание индикатора (красителя) белками при последующей обработке за­ висит от условий фиксации (температуры, времени прогрева­ния), необходимо строго соблюдать их постоянство.

Полоски ацетатцеллюлозной пленки (мембраны) не высушивают и далее обрабатывают влажными.

Для окраски электрофореграмм сухие бумажные ленты или увлажненные буферным раствором ацетатцеллюлозные пленки кладут в развернутом виде на дно плоских эмалиро­ванных кювет и осторожно, медленно приливают красящий рас­твор. В процессе обработки реагентами электрофореграммы нельзя накладывать друг на друга и сворачивать.

1. Буферные растворы. На электрофоретическое фракционирование белков большое влияние оказывает рН бу­ ферных растворов, состав и концентрация составляющих их реа­гентов, так как от кислотности (щелочности) среды, ионной силы буферной смеси и некоторых других факторов во многом зависят знак и величина электрического заряда молекул белков.

В качестве электролита чаще всего применяют веронал-мединаловый, веронал-ацетатный, мединаловый, трис-буфер. Реже используют боратный и фосфатный буфер.

Наиболее хорошо зарекомендовали себя следующие буфер­ные растворы:

ü Вероналовый (веронал-мединаловый) буфер с рН 8,6.

ü Веронал-ацетатный буфер с рН 8,6.

ü Мединаловый буфер с рН 7,6.

ü Трис-буфер с рН 8,9 (о чень хорошо разделяются белки сыворотки крови (с выделе нием до 9 фракций) при использовании трис-буфера с рН 8,9).

2. Окрашивающие реагенты. Основным их компонентом явля­ ются индикаторы (бромфеноловый синий, кислотный сине-чер­ ный, амидо черный 10 В и некоторые другие), представляющие собой красители, характерно связывающиеся с белком.

Сухие бумажные ленты выдерживают в этих красителях в те­ чение 30 мин. Входящие в состав красящих растворов сулема, сульфат цинка и уксусная кислота выступают в роли фиксаторов, способствующих улучшению связывания красителя с белком.

3. Отмывающие растворы. Для удаления не связавшегося с б елком красителя электрофореграммы обрабатывают в несколь­ких (обычно 3—5) сменах отмывающего раствора — до тех пор, пока фон лент не сделается светлым (белым), а промывная жид­ кость не перестанет окрашиваться в желтый цвет. Состав отмыва­ ющего раствора во многом зависит от природы применявшегося для окрашивания белков индикатора. Так, при окраске бромфе­ ноловым синим используют раствор уксусной кислоты, получае­мый добавлением к 20 мл ледяной уксусной кислоты 980 мл дис­ тиллированной (или водопроводной) воды; в случае применения амидо черного 10 В или кислотного сине-черного не связавшиеся с белком красители отмывают смесью следующего состава: уксус­ ной кислоты (ледяной) — 100 мл, фенола (расплавленного) — 40 мл, воды водопроводной — 860 мл.

Подготовка электрофореграмм к учету результатов способами денситометрии и фотометрии. Бумажные ленты, отмытые от избытка красителя, высушивают на воздухе при комнатной температуре, притом в затемненном месте, если в качестве красителя использовался бромфеноловый синий. Сухие и окрашенные электрофореграммы хранятся в темноте.

Дальнейшая количественная обработка электрофореграмм состоит либо в элюции (извлечении) красителя из участков бумаги с располагающимися на них окрашенными белковыми фракциями с последующим фотометрическим измерением оптической плотности растворов, либо непосредственной записи электрофореграмм с помощью денситометра – прибора, позволяющего регистрировать (сканировать) картину разделения фракций анализируемых веществ в отраженном или проходящем монохроматическом световом потоке.

При денситометрии в проходящем свете предварительно обесцвечивают фон ацетатцеллюлозных пленок и бумажных лент (последние для этого пропитывают просветляющей жидкостью либо обесцвечивают материал носителя другим способом). Полосу располагают в перемещающем ее устройстве таким образом, чтобы против щели освещения находился неокрашенный участок. Записанная прибором кривая позволяют судить о числе фракций и о содержании в них белка. С помощью интегрального устройства осуществляется количественная обработка картины разделения фракций белков, осуществляемая в автоматическом режиме.

Количественную обработку денситограмм можно выполнить и ручным способом. Для этого кривую делят на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству красителя, соединившегося с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют, например, по массе вырезанных участков бумаги, определенной на торсионных весах. Общую массу всех участков принимают за 100% (1,0) или же за содержание общего белка в плазме (в г/л) и вычисляют, какой процент по отношению к нему составляет масса каждого участка (фракции).

Для просветления электрофореграмм (перед «сканированием» в проходящем свете на денситометре) применяют: вазелиновое масло и раствор альфа-бромнафталина в вазелиновом масле – для обесцвечивания фона бумажных лент, а также смеси: ледяная уксусная кислота – ацетон (1:1); пропиловый (изопропиловый) спирт – ледяная кислота – глицерин (85:12:3) – используют для просветления материала ацетатных полос.

Метод элюирования состоит в том, что сначала электрофореграммы разрезают по числу фракций, ориентируясь на самый светлый участок между ними. Каждую фракцию помещают в отдельную пробирку и заливают, например, 3 мл элюирующего раствора. К альбуминовой фракции добавляют двойной (или тройной) его объем, на основании чего величину оптической плотности для альбуминовой фракции умножают на 2 (или на 3). Контролем служит участок фореграмм, не содержащий белка. Пробирки осторожно встряхивают и оставляют в затемненном месте на 30 минут (лучше на 40 минут – 1 час). Плотность испытываемых растворов определяют на фотоэлектроколориметре любого типа с зеленым (красным) светофильтром. В качестве контрольного используют элюирующий раствор, по которому устанавливают «электрический нуль» прибора.

При использовании способа элюирования находят величину абсорбции каждой фракции и общую сумму значений оптической плотности, которую принимают за 100% (либо 1,0) или величину содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови, представленную в размерности г/л. В первом случае результаты выражают в относительных, во втором – в абсолютных единицах.

Состав элюирующих растворов, применяемых для извлечения красителя из окрашенных фракций электрофореграмм (эстрагирующие реагенты), во многом зависит от природы используемого индикатора. Так, для извлечения бромфенолового синего применяют 0,01Н раствор едкого натра. Для извлечения кислотного сине-черного красителя используют 0,1Н раствор едкого натра.

Приняв сумму показателей оптической плотности отдельных элюатов за 100% (1,0), по простому тройному правилу рассчитывают относительное содержание альбумина и фракций глобулинов.

Пример . Абсорбция фракции альбумина – 0,52, α₁-глобулины – 0,02, α₂-глобулины -0,05, β-глобулины-0,10, γ-глобулины-0,15. В сумме оптическая плотность отдельных растворов равна 0,84; это значение принимается за 100% (или 1,0).

Тогда содержание альбумина, выраженное в относительных единицах, составит: (0,52 • 1,0)/0,84 = 0,62. Подобным же образом рассчи­тывают относительное содержание всех остальных белковых фракций, выражая его в долях от единицы или процентах. Следу­ ет стремиться к представлению результатов не в относительных, а в абсолютных единицах. Для этого сумму показателей абсорбции всех фракций достаточно отнести к концентрации об­ щего белка сыворотки крови. Тогда, пользуясь аналогичным рас­ четом, легко найти действительную концентрацию альбумина и всех глобулинов.

Пример . Общее количество белка в сыворотке крови — 82 г/л. Сумма абсорбции всех фракций — 0,84. На долю абсорбции фракции альбумина приходится 0,52 ед. Если показатель А, рав­ ный 0,84 ед, соответствует 82 г/л, то 0,52 (А) — х. Отсюда: концен­ трация альбумина в сыворотке крови равна (82 • 0,52)/0,84 = 50,7 (г/л).

Зная содержание общего белка сыворотки (плазмы) крови, легко перевести относительные единицы в абсолютные: 100% со­ответствует 82 г/л, 62,0% — х. Тогда х = (62,0 • 82)/100 = 50,8 (г/л).

Для лучшего запоминания отмечаемых в норме показателей процентного (долевого от единицы) содержания альфа-1 -, альфа- 2-, бета- и гамма-глобулинов сыворотки крови можно ориенти­роваться на следующие средние величины и варианты отклоне­ний: 1 (0,04 + 0,01), 8± 1 (0,08 ±0,01), 10 ± 2 (0,10 ± 0,02), 16 + 4 (0,16 + 0,04) — соответственно. Относительное содержание аль­ бумина составляет, по данным А.А.Покровского (1969), 56—66% (0,56—0,66), многих других авторов: 50—61% (0,50—0,61). У прак­ тически здоровых взрослых людей концентрация альбумина, аль­ фа-1-, альфа-2-, бета- и гамма-глобулинов, выраженная в абсо­лютных единицах, составляет соответственно: 42,0—51,0, 2,0— 5,0, 4,0-7,0, 5,0-9,0, 8,0-17,0 г/л.

Краткая характеристика других носителей.

В последние годы электрофорез на бумаге практически полностью вытеснен предложенным Коном (1958) электрофорезом на ацетатцеллюлозе. Ацетатцеллюлозная пленка в отличие от бумаги лишена эндоосмоса, способности к поглощению отдельных белковых фракций поверхностью волоконец. В результате получается четкое фрак­ ционирование со светлыми промежутками между «пятнами» бел­ ков, а время электрофореза сокращается обычно до 30 мин.

Для разделения фракций белков и липопротеинов широко ис­пользуется метод электрофореза на агаре (агарозе), предложен­ный Гордоном и др. в 1949 г.

Способ электрофореза в крахмальном геле (Смитис, 1955) позволяет получить до 20 фракций вместо пяти, обычно выделя­емых методом электрофоретического фракционирования на бу­маге.

Введенный Грабаром и Вильямсом в 1953 г. иммуноэлектро форез представляет собой комбинацию электрофоретического и иммунологического фракционирования белков. После передви­ жения белковых фракций в геле агара в узкий желобок помешают перпендикулярно к фракционным линиям сыворотку лошади, иммунизированной белковыми компонентами сыворотки чело­века (антисыворотка). Антисыворотке дают возможность диф­ фундировать в геле агара. В месте контакта содержащихся в них антител с электрофоретически разделенными белковыми фрак­циями образуются преципитационные дуги, характерные для со­ ответствующих фракций. При помощи этого метода обнаружива­ ется не менее 25 различных белков.

Структура агарового и крахмального геля такова, что размеры пор в этих носителях, как и в материале бумаги, ацетатцеллюлозной пленки, значительно превосходят размеры макромолекул: белков, липопротеинов и др. Лишь в полиакриламидном геле, формируемом из золя с концентрацией около 7,5%, размеры пор примерно соответствуют размерам молекул белков. Благодаря этому создается молекулярно-фильтрующий эффект, в значительной мере улучшающий качество электрофоретического разделения, с помощью которого выделяется обычно около 30 фрак­ций белков. К тому же перед началом электрофоретического Фракционирования белков все они стартуют с весьма узкой линии, будучи как бы сконцентрированы на ней. Формирование многослойного полиакриламидного геля, отдельные зоны в кото ром отличаются размерами пор, дает возможность эффективно разделять липопротеины разных классов (по Е.Я. Маграчевой, 1979). К тому же полиакриламидный гель отличается большой прозрачностью, термостабильностью. Широкое применение в клинической практике метода электрофореза в полиакриламид­ном геле сдерживается трудностью идентификации и количественного учета отдельных выявляемых фракций.

Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы.

Принцип метода: белки сыворотки крови разделяют методом электрофореза с использованием в качестве носителя пленки из ацетата целлюлозы.

Реактивы: 1) барбитал-натриевый буферный раствор (рН 8,6) (иногда применяются другие буферные смеси); 2) бромфеноловый синий (при приготовлении раствора добавляют сульфат цинка и уксусную кислоту для фиксации белков); 3) отмывающий раствор – уксусная кислота, 50 г/л; 4) просветляющий раствор: вазелиновое масло, смесь ледяной уксусной кислоты с ацетоном (1:1).

Ход определения : смачивают пленки буферным раствором (помещают в буферный раствор на 5 минут). Удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Закрепляют пленку в камере матовой стороной кверху (пленки должны располагаться параллельно друг к другу и строго параллельно стенкам прибора, не должны свисать). Закрывают камеру крышкой и пропускают ток напряжением 150В в течение 5 минут, после чего выключают ток.

источник