Химия и химическая технология/ 6.Органическая химия
К.т.н. Ю.Ф. Якуба, к. с-х. н. М.В. Захарова, М.В. Филимонов,
Государственное научное учреждение Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства Россельхозакадемии, Россия
Определение глюкозы, сахарозы, фруктозы методом капиллярного электрофореза
На долю углеводов приходится около 80 % сухого вещества растений и плодов. Углеводы синтезируются всеми зелеными растениями, изучение компонентного состава углеводов способствует раскрытию физиолого-биохимических механизмов адаптации растений к стрессам окружающей среды. Синтез углеводов и их содержание напрямую связано с урожайностью, потребительским качеством ягод, плодов и винограда.
Аналитическая информация о компонентном составе сахаров в плодах, винограде и продуктах их переработки, как правило, ограничивается суммарными показателя, нередко носящими расчетный характер.
Практикуемые методы определения сахаров условно можно разделить на две группы – физические и химические. Среди химических методов анализа широко известны фотоколориметрические методики количественного определения сахаров: реакция с пикриновой кислотой (по Крезелиус — Зейферт); с 3,5-динитросалициловой кислотой; антроновый метод определения сахаров (по Моррису-Роэ), тонкослойной хроматографии, газовой хроматографии или хроматомасс-спектрометрии, ферментативного анализа, жидкостной хроматографии и высокоэффективного капиллярного электрофореза. Весьма перспективными для количественного определения сахаров представляется разработка и модификация методик с использованием капиллярного электрофореза, уже востребованного в аналитической практике [1].
Косвенное УФ-детектирование в методике капиллярного электрофореза использовано для определения концентрации сахаров, а также примесей в сахаре и образцах вина [2]. Данный прием позволил отказаться от дериватизации и обеспечить предел обнаружения – 1-10 мг/дм 3 испытуемого объекта [3]. Для решения проблемы эффективного разделения сахаров предложено использовать ведущий электролит с высоким значением рН, получать производные углеводов с помощью реагентов [4], молекулы которых содержат хромофорные ионогенные группы. Изучена возможность лигандообменного капиллярного электрофореза для определения глюкозы, фруктозы, сахарозы в форме соответствующих комплексов [5] с катионами двухвалентной меди. Предложены оптимизированные условия разделения глюкозы, фруктозы, сахарозы в следующих условиях анализа: ведущий электролит – 175 мМ/дм 3 аммиака, 1 мМ/дм 3 двухвалентной меди; дозирование пробы – 10 с, 30 мБар, напряжение +25 кВ, длина волны детектирования – 245 нм, эффективная длина кварцевого капилляра 0,5 м, внутренний диаметр 75•10 -6 м. Предел обнаружения изучаемых веществ составил 5-21 мг/дм 3 .
В проведенных исследованиях для оптимизации разделения и количественного определения массовой концентрации глюкозы, сахарозы и фруктозы, основывающихся на имеющейся информации, применяли косвенное детектирование и несколько вариантов ведущего электролита.
В результате оптимизированы следующие условия выполнения анализа:
система капиллярного электрофореза серии «Капель», оборудованная ультрафиолетовым детектором, с длиной волны лампы 254 нм, источником питания отрицательного напряжения и следующими характеристиками:
кварцевый капилляр, эффективной длиной 0,5 м до детектора, внутренним диаметром 75•10 -6 м.
Для эффективного количественного анализа используют раствор ведущего электролита следующего состава: 4 г/дм 3 сорбата калия, 8 г/дм 3 10% водного раствора цетил-триметил-аммоний-основания (ЦТА-ОН), 36 г/дм 3 глицерина, 0,16 г/дм 3 гидроокиси калия. Срок хранения ведущего электролита не более суток. Ведущий электролит готовят в количестве, обеспечивающем потребности рабочего дня. Рекомендуемое напряжение –16 кВ, время анализа 20 минут.
Пробоподготовку жидкой пробы осуществляли следующим образом: сок или вино разбавляли в 2-50 раз (в зависимости от ожидаемого суммарного содержания сахаров), при необходимости фильтровали, центрифугировали 3-5 минут при 6000 об -1 , переносили в прибор и производили дозирование пробы пневматическим методом под давлением 30 мБар в течение 5 секунд.
Для определения сахаров, например, в виноградных листьях, отбрали пробу в количестве 1,00 г, растирали в ступке при добавлении 9 см 3 дистиллированной воды до гомогенного состояния. Затем массу настаивали в течение 1 часа, фильтровали, центрифугировали и подвергали анализу.
Ориентировочное время миграции в предлагаемых условиях анализа: глюкозы – 15,2 мин, сахарозы – 16,2 мин, фруктозы – 14,5 мин. Диапазон измеряемых значений массовых концентраций сахаров составил 0,1-5,0 г/дм 3 .
Калибровочные растворы концентраций 0,1, 0,5, 1, 2, 5 г/дм 3 готовили на дистиллированной воде из химически чистых препаратов глюкозы, фруктозы, сахарозы. Растворы устойчивы в течение двух суток при комнатной температуре.
Пример определения модельной смеси сахаров в оптимальных условиях анализа, показан на рис.
Рисунок – Электрофореграмма модельной смеси сахаров; 2 – фруктоза, 3 – глюкоза, 4 – сахароза
В разработанных условиях методики проведен анализ градуировочных смесей, фруктовых соков, полусухих и полусладких красных и белых виноградных вин, экстрактов вегетативных органов растений, табл.
Таблица – Определение глюкозы, сахарозы, фруктозы в исследуемых объектах, г/кг
источник
научная статья по теме ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ МЕТОДОМ ЛИГАНДООБМЕННОГО КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Химия
Авторы работы:
Научный журнал:
Текст научной статьи на тему «ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ МЕТОДОМ ЛИГАНДООБМЕННОГО КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА»
ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2010, том 65, № 2, с. 205-211
ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ МЕТОДОМ ЛИГАНДООБМЕННОГО КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
© 2010 г. А. В. Алексеева, Л. А. Карцова, Н. В. Казачищева
Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет 198504 Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский просп., 26 Поступила в редакцию 21.08.2008 г., после доработки 30.04.2009 г.
Изучены возможности режима лигандообменного капиллярного электрофореза (рабочий электролит: 1 мМ меди(11), 175 мМ МЫ3; 30 мбар, 10 с; +25 кВ; 245 нм; 20°С) для определения Сахаров (глюкозы, фруктозы и сахарозы) в реальных объектах (фруктовые соки, вина, лекарственные препараты). На примере глюкозы проведена сравнительная оценка пределов обнаружения для прямого (в форме комплексов сахар—медь(11); 245 нм) и косвенного (рабочий электролит: 5 мМ триптофана, 50 мМ №ОЫ; 30 мбар, 10 с; +10 кВ; 280 нм; 20°С) УФ-детектирования:
Определение сахаров в биологических объектах и пищевых продуктах является важной аналитической задачей для клинической медицины при ранней диагностике диабета [1], для характеристики качества соков, вин, нектаров и др. (обычно контролируют соотношение содержания глюкозы и фруктозы) [2, 3].
Наиболее распространенным вариантом определения моно- и дисахаридов является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в нормально-фазовом режиме с рефрактометрическим детектором [2], несмотря на его известные недостатки: низкое разрешение, ограниченная чувствительность, несовместимость с режимом градиентного элюирования, существенная зависимость стабильности базовой линии от температуры. Альтернативным вариантом является использование детектора светорассеяния [2]. Увеличения чувствительности и селективности разделения сахаров можно также достичь проведением анализа методом анионо-обменной ВЭЖХ с импульсным амперомет-рическим детектором или включением в анализ стадии получения производных, молекулы которых содержат хромофорные или флуорофорные группы, с последующим анализом методом ОФ ВЭЖХ с УФ-или флуориметрическим детектированием [2].
В последнее время для определения углеводов все чаще применяют метод капиллярного электрофореза (КЭ) со спектрофотометрическим детектированием, основным преимуществом которого по сравнению с хроматографией являются высокая эффективность и небольшое время анализа [4].
Главными трудностями при хроматографиче-ском и электрофоретическом определении сахаров с УФ-детектированием является отсутствие в их молекулах хромофорных групп и, как следствие, низкая чувствительность детектирования. Часто для решения этой проблемы проводят предваритель-
ную дериватизацию аналитов. Возможно определение как приготовленных заранее комплексов [1, 4, 5], так и полученных в режиме on-line [6]. Но получение производных не всегда оправдано, так как, во-первых, реакционная способность разных углеводов к одному и тому же дериватизирующему реагенту различна, что делает невозможным контроль полноты протекания реакции, во-вторых, результатом реакции может быть сложная смесь стереоизоме-ров. И, наконец, дериватизация достаточно длительный, трудоемкий и часто дорогостоящий процесс.
Другой подход — использование косвенного УФ-детектирования [3, 7], наиболее распространенного способа определения сахаров методом КЭ, не требующего проведения стадии дериватизации. Это позволяет достичь требуемых пределов обнаружения (1—10 мг/л [7]). При выборе поглощающего компонента рабочего электролита необходимо учитывать, что чем ближе подвижности поглощающего иона и аналита, тем меньшие концентрации последнего можно зафиксировать [7].
Отсутствие в молекулах сахаров легко ионизирующихся функциональных групп (табл. 1) затрудняет их определение в зонном режиме (например, значение pKa глюкозы составляет 12.46 [8]). Для решения этой проблемы можно использовать высокие pH (
11—13) рабочего электролита (аналиты мигрируют согласно их константам диссоциации) [7, 9], получать производные углеводов с помощью реагентов, молекулы которых содержат хромофорные ионогенные функциональные группы, изменять электрофоретические характеристики аналитов за счет получения комплексов (например, с борат-ионом [1, 10], ионами металлов [11, 12] и т.д.), проводить электрофоретическое определение сахаров или их производных в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии [3, 13].
Таблица 1. Bеличины pKa некоторых углеводов
источник
ГОСТ Р 53971-2010 Продукция винодельческая. Определение массовой концентрации пестицидов группы триазолов методом капиллярного электрофореза в сочетании с твердофазной экстракцией
Текст ГОСТ Р 53971-2010 Продукция винодельческая. Определение массовой концентрации пестицидов группы триазолов методом капиллярного электрофореза в сочетании с твердофазной экстракцией
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ
Определение массовой концентрации пестицидов группы триазолов методом капиллярного электрофореза в сочетании с твердофазной экстракцией
Цели и принципы стандартизации е Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. Ns 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0—2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»
1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Северо-Кавказским зональным научно-исследовательским институтом садоводства и виноградарства Россельхоэакадемии (ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхоэакадемии)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 91 «Пивобезалкогольная и винодельческая продукция»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 ноября 2010 г. Ns 539-ст
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
Приложение А (справочное) Элекгрофореграммы стандартного раствора триаэопое и образца
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Определение массовой концентрации пестицидов группы триазолов методом капиллярного электрофореза в сочетании с твердофазной экстракцией
Wine production. Determination of mass concentration of tna20le pesticides by capillary electrophoresis method
in combination with solid-phase extraction
Настоящий стандарт распространяется на винодельческую продукцию и устанавливает метод капиллярного электрофореза в сочетании с твердофазной экстракцией для определения массовых концентраций пестицидов группы триазолов — пенконазола. флутриафола. триадименола и тебуконазола в диапазоне измерений от 0.01 до 10.00 мг/дм 3 .
8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р ИСО 5725-2—2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
ГОСТ Р 51144—2009 Продукция винодельческая. Правила приемки и методы отбора проб ГОСТ Р 51652—20О0Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда, вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019—79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 1770—74(1042—83. ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4233—77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 4328—77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 14919—83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Тилы, основные параметры и размеры
ГОСТ 28498—90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29227—91 (ИСО 635-1—81> Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание — При пользовании нестоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — не официальном сейте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и
по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, а котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3.1 Требования электробезопасности при работе с приборами — поГОСТ 12.1.019.
3.2 При выполнении анализов необходимо выполнять требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.1.007.
3.3 ((выполнению измерений методом капиллярного электрофореза допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера, прошедшего соответствующий курс обучения, или лица, имеющие удостоверения на правоработы методом газовой или высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Прибор (система) капиллярного электрофореза, оснащенный кварцевым капилляром длиной не менее 50см до детектора, с внутренним диаметром 75 мкм. спектрофотометрическим детектором, работающим в диапазоне длин волн от 180 до 380 нм. и блоком высокого напряжения положительной полярности. и компьютером с программным обеспечением для обработки электрофореграмм.
Весы лабораторные с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ± 0.0001 г.
Термометржидкостной стеклянный с диапазоном измерения от 0 *С до 100 *С и ценой деления 1 *С по ГОСТ 28498.
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1.2.5.10 см 3 по ГОСТ 29227.
Колбы мерные 2-25-1 и2-100-1 поГОСТ 1770.
Стаканы химические вместимостью 50 см 3 по ГОСТ 25336.
pH-метр с диапазоном измерений pH от 1 до 10. погрешность измерения — не более ±0.05 ед. pH.
Центрифуга лабораторная с частотой вращения ротора не менее 6000 об/мин.
Пробирки одноразовые (типа Эппендорфа) вместимостью 1.5 см 3 .
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Кислота соляная по ГОСТ 3118.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.
Натрий хлористый ГОСТ4233.
Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья по ГОСТ Р 51652.
Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.
Ротационный вакуумный испаритель.
Додецилсульфат натрия с содержанием основного вещества не менее 99,0 %.
Тетраборат натрия с содержанием основного вещества не менее 99,0 %.
Стандартный образец пенкоказола с содержанием основного вещества не менее 99.6 %.
Стандартный образец флутриафола ссодержанием основного вещества не менее 94.5 %.
Стандартный образец тебуконазопа с содержанием основного вещества не менее 98.5 %.
Стандартный образец триадименола ссодержанием основного вещества не менее 98,0 %.
Патроны концентрирующие для твердофазной экстракции с массой сорбента 500 мг и неподвижной фазой С18.
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии с содержанием основного вещества не менее 99 %.
Спирт пропиловый для жидкостной хроматографии с содержанием основного вещества не менее
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, оборудования с техническими характеристиками и реактивов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.
Отбор проб — по ГОСТ Р 51144.
Метод капиллярного электрофореза для определения массовых концентраций пестицидов группы триазолое основан на разделении их под действием электрического поля в капилляре в условиях, способствующих подавлению влияния посторонних веществ. Твердофазная экстракция предназначена для очистки и концентрирования проб винодельческой продукции. Идентификацию и количественное определение анализируемых пестицидов проводят, регистрируя поглощение в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 200 нм.
Показатели прецизионности метода определены в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2 и представлены в таблице!
Предел повторяемости г, %,Р * 0.95
Предел воспроизводимости R. %. Р « 0.9S
Границы относительной погрешности ± 6 при вероятности Р » 0.95 %
Подготовку проб и измерения проводят в лабораторных условиях при температуре окружающего воздуха (23±5)*С, атмосферном давленииот87до 107 кЛа, относительной влажности воздуха не более 80%. частоте переменного тока
9.1 Приготовление буферных и вспомогательных растворов
9.1.1 Раствор гидроксида натрия массовой долей 4 %
8 50 — 60 см 3 дистиллированной воды растворяют 4 г гидроксида натрия. По окончании растворения разбавляют дистиллированной водой до объема 100 см 3 . Срок хранения в сосуде из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой — 2 мес.
9.1.2 Раствор соляной кислоты массовой долей 3,5 %
8 мерную колбу вместимостью 100 см 3 помещают 8.3 см 3 соляной кислоты плотностью 1,18 г/см 3 , затем добавляют дистиллированную воду до метки и перемешивают. Срок хранения не ограничен.
9.1.3 Раствор тетрабората натрия молярной концентрации 0,05 моль/дм 3
8 стакан вместимостью 50 см 3 отбирают навеску (!906 ±0,001) г тетрабората натрия. Добавляют 20 см 3 дистиллированной воды (хранившейся с момента приготовления не более 4 сут) и перемешивают стеклянной палочкой. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу
9.1.4 Раствор додецилсульфата натрия молярной концентрации 0,1 моль/дм 3
8 стакан вместимостью 50 см 3 отбирают (0.721 ± 0,001) г додецилсульфата натрия, добавляют 15 см 3 дистиллированной воды и перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу (с пришлифованной пробкой) вместимостью 25 см 3 , доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре — 1 мес.
9.1.5 Рабочий буферный раствор
Раствор тетрабората натрия по 9.1.3. раствор додецилсульфата натрия по 9.1.4. дистиллирован* ную воду и пропиловый спирт смешивают в объемных соотношениях 1:4:4:1. Не допускают хранение рабочего буферного раствора более 2 сут с момента приготовления в плотно закупоренной емкости с пришлифованной пробкой. Полученный рабочий буферный раствор помещают в пробирки Эллендорфа в количестве 0.8 см 3 и центрифугируют 4 мин при 6000 об/мин.
9.1.6 Раствор этилового спирта объемной долей 12 %
В мерную колбу вместимостью 100 см 3 помещают 12см э этилового спирта, доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре — 3 мес.
9.2 Подготовка прибора и порядок проведения анализа
9.2.1 Прибор подготавливают к работе в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают следующие рабочие параметры:
• длина волны спектрофотометрического детектора — 200 нм;
— дозирование пробы — пневматическое при 30 мБар в течение 20 с при напряжении 0 кВ:
— рекомендуется термостатирование капилляра при температуре 25 «С.
Перед измерениями подготавливают капилляр к работе, промывая его последовательно раствором соляной кислоты (см. 9.1.2) втечениеЗ мин. дистиллированной водой — 3 мин. раствором гидроокиси натрия (см. 9.1.1) —в течение 3 мин. дистиллированной водой — в течение 3 мин и рабочим буферным раствором (см. 9.1.5) — в течение 3 мин. Капилляр промывают каждый раз при включении прибора. Между анализами капилляр промывают рабочим буферным раствором в течение 2 мин. При сильном загрязнении капилляра, что проявляется в искажении электрофореграммы. необходимо повторение начальной промывки.
9.2.2 Определение массовой концентрации пестицидов группы триазолов в градуировочном растворе или исследуемой пробе проводится путем пневматического дозирования проб (30 мБар. 20 с) и регистрации полученных данных в течение 20 мин в виде элекгрофореграмм. Процедуры градуировки и анализа исследуемых проб следует проводить при одинаковых рабочих параметрах прибора.
Результаты первого измерения на каждой порции буфера отбрасывают. Содержимое одной пробирки с рабочим буферным раствором можно использовать для выполнения не более пяти измерений.
9.3 Приготовление градуировочных растворов
9.3.1 Основной градуировочный раствор смеси триазолов концентрации 1000 мг/дм 3
Отбирают навески пенконаэола, флутриафола, триадименола и тебуконазола массой (0,02510,001) г каждая и вносят в мерную колбу (с пришлифованной пробкой) вместимостью 25 см 3 , добавляют 10 см 3 этилового спирта, перемешивают содержимое и доводят объем раствора в колбе до метки этиловым спиртом. Срок хранения основного градуировочного раствора не более 3 мес в стеклянной таре с пришлифованной пробкой при температуре от 2 в С до 8 °С.
9.3.2 Рабочие градуировочные растворы (массовой концентрации 1.2. 5 и 10 мг/дм 3 ) готовят из основного градуировочного раствора поЭ.3.1. Для этого вносят в четыре мерные колбы (с пришлифованными пробками) вместимостью 100 см 3 пипетками 0.1; 0,2:0.5 и 1 .Осм 3 основного градуировочного раствора соответственно, затем доводят объемы растворов в колбах до метки дистиллированной водой, закрывают колбы пробками и тщательно перемешивают. Срок хранения растворов в стеклянной таре с пришлифованной пробкой — не более 2 сут при температуре от 2 в С до 8 ‘С.
9.3.3 Рабочие градуировочные растворы концентрации 1.2.5 и 10 мг/дм 3 отбирают мерной пипеткой в объеме 0,8см э в пробирку Эппендорфа и центрифугируют 4 мин при 6000 об/мин для удаления растворенного воздуха. Проводят измерение по 9.2. Градуировочную характеристику получают, обрабатывая экспериментальные данные при помощи программного обеспечения. Градуировка признается удовлетворительной, если коэффициент корреляции, рассчитанный программой, будет не менее0.99. Идентификацию пиков проводят по времени удерживания триазолов. полученному е градуировочной характеристике. 8 случае затруднения идентификации какого-либо триаэола рекомендуется использовать метод добавок. Для этого в анализируемую пробу вносят этот триазол с расчетом на уве-личениеконцвнтрациина(100±50)%, и измерение повторяется. Увеличение высоты соответствующего пика свидетельствует о правильной идентификации.
Градуировку прибора обязательно проводят заново в следующих случаях:
• при замене хотя бы одного из компонентов буферного раствора;
• при изменении рабочего напряжения;
• при изменении рабочей длины волны детектора;
• при изменении времени ввода пробы и давления ввода;
• при отрицательных результатах контроля стабильности градуировочной характеристики.
Примеры электрофореграмм приведены в приложении А.
9.3.4 Приготовление раствора для контроля стабильности градуировочной характеристики
Раствор для контроля стабильности градуировочной характеристики готовят из основного градуировочного раствора по 9.3.1. В мерную колбу вместимостью 100 см 3 вносят 0,2 см 3 основного градуировочного раствора, затем доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают. Действительное значение массовой концентрации пестицидов группы триаэолов составляет 2 мг/дм 3 . Срок хранения раствора — 1 мес при температуре от 2 *С до 8 *С. Контрольный раствор используют для проверки работоспособности прибора и для контроля стабильности градуировочной характеристики. Градуировочная характеристика признается стабильной, если полученные массовые концентрации триазолое составляют от 1.80 до 2.20 мг/дм 3 . а времена удерживания всех компонентов отличаются от полученных при градуировке не более чем на 5 %.
10.1 Патронлредварительнокондиционируютацетонитрилом(5см 3 ), затем промывают 12 %-ным раствором этилового спирта (5 см 3 ). Данная операция подготавливает весь объем твердой фазы патро-наксорбции.
Исследуемые пробы вина объемом 20 см 3 доводят до pH 9.5 раствором гидроксида натрия (см. 9.1.1). добавляют 6 г хлорида натрия, перемешивают и пропускают через предварительно подготовленные концентрирующие патроны для твердофазной экстракции со скоростью не более одна-две капли в секунду. После этого патрон дважды промывают 12 %-ным раствором этилового спирта по 2 см 3 и высушивают под вакуумом в течение 20 мин.
Триазолы элюируют ацетонитрилом (5 см 3 ), эту фракцию выпаривают до сухого остатка на ротационном испарителе при температуре не более 40 *С. Сухой остаток растворяют в 1 см 3 12 %-ного водно-спиртового раствора. Отбирают мерной пипеткой в объеме 0.8 см 3 в пробирку Эллендорфа и центрифугируют 4 мин при 6000 об/мин. Измерение проводят по 9.2.
11.1 Используя электрофореграмму. полученную при помощи программного обеспечения к прибору. рассчитывают массовую концентрациютриаэолов по установленным градуировочным зависимостям (см. 9.3.3). Массовую концентрацию триаэолов в исследуемой пробе X. мг/дм 3 . вычисляют по формуле
где С — концентрация триазола. найденная по градуировочному графику, мг/дм 3 : к — коэффициент концентрирования пробы.
Вычисления проводят до второго десятичного знака.
11.2 За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений массовой концентрации триазола. полученных в условиях повторяемости. если выполняется условие приемлемости
где Ху, Х2 — результаты двух параллельных измерений массовой концентрации триазола в пробе. мг/дм 3 ;
готи — значение предела повторяемости (таблица 1). %;
Хср — среднее значение двух параллельных измерений массовой концентрации триазола в пробе. мг/дм 3 .
Если условие (2) не выполняется, то проводят повторные измерения и проверку приемлемости результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6.
11.3 Результат анализа представляют в виде
где Хср — среднеарифметическое значение двух определений массовой концентрации триазола в пробе. признанных приемлемыми. мг/дм э ;
А — границы абсолютной погрешности определения, мг/дм 3 . при доверительной вероятности Р=0.95.
11.4 Границы абсолютной погрешности А вычисляют по формуле
Числовое значение результата определения должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение границы абсолютной погрешности.
12.1 Контроль повторяемости (сходимости)
При контроле повторяемости (сходимости) абсолютное значение разности двух результатов параллельных определений, полученных в условиях повторяемости (на одной и той же пробе, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в пределах короткого промежутка времени), не должно превышать абсолютного предела повторяемости (сходимости) г, т.е. с вероятностью Р — 0,95 должно выполняться условие (2).
12.2 Контроль воспроизводимости
При контроле воспроизводимости абсолютное значение разности двух результатов анализа одной и той же пробы, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, разными операторами. с использованием различного оборудования), не должно превышать предела воспроизводимости R. Результаты измерений считают приемлемыми при условии
гдеХср — среднеарифметическоезначениедвухопределенийХ, иХ2. выполненных в условиях воспроизводимости. мг/дм 3 ;
/?01Н — значение предела воспроизводимости (таблица 1), %.
При проведении контроля погрешности метода вычисляют степень повторного нахождения стандарта. %, по формуле
где Спр — массовая концентрация триаэолов в пробе, мг/дм 3 ;
Сс| — массовая концентрация триазолое в стандартном растворе, равная 1 мг/дм 3 :
Спр 4 сг — массовая концентрация триаэолов в пробе и в стандартном растворе, смешанных в объемных соотношениях 1:1. мг/дм 3 .
Измерения проводят по разделу 10.
Степень повторного нахождения должна находиться в интервале
Электрофореграммы стандартного раствора триазолов и образца винопродукции
А.1 Электрофореграмма стандартного раствора тривзолоа приведена на рисунке А. 1.
Рисунок А.1 — Электрофореграмма стандартного раствора триазолов. мг/дм 3 А.2 Электрофореграмма образца винопродукции приведена на рисунке А.2.
Рисунок А.2 — Электрофореграмма образца винопродукции. мг/дм э
Примечание — Назлектрофореграммахаозмохно появление пиков неидентифицированных веществ, не мешающих проведению количественного анализа.
УДК 663.2.001.4:006.354 ОКС67.160.Ю Н79 ОКСТУ9Ю9
Ключевые слова: продукция винодельческая, пестициды, триазолы. буферный раствор, капиллярный электрофорез, электрофореграмма
Редактор Л.В. Иоретнихооа Технический редактор Н.С. Гришаповв Корректор Ы.С. Кабашоеа Компьютерная версты АН. Зопоюаравой
Сдано в набор 20.12.2011. Подписано а печать 16.01.2012. Формат 60 к 84Гарнитура Ариал. Уел. леч. п. 1.40. Уч.’иад. л. 0.93. Тираж 160 ж». Зек. 64.
источник
Капиллярный электрофорез
Цель работы
Изучение возможностей метода капиллярного электрофореза при определении неорганических анионов в водопроводной воде.
Основные сведения о методе капиллярного электрофореза
Метод капиллярного электрофореза основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (
2 нл) вводят в кварцевый капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером — электролитом. После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей, в первую очередь, от заряда и массы (точнее, величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой; качественной характеристикой вещества является время миграции, а количественной — высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества.
Для того чтобы получить более подробное представление о методе, необходимо рассмотреть ряд процессов, происходящих в капилляре, заполненном электролитом и помещенном в продольное электрическое поле.
Находящиеся на поверхности плавленного кварца силоксановые группы при контакте с водой или водными растворами гидролизуются с образованием удвоенного количества силанольных групп, которые затем гидратируются.
Скорость и степень гидролиза зависят от температуры и pH водных растворов и, в меньшей степени, от концентрации солевого фона раствора. В водном растворе силанольные группы способны к кислотной диссоциации. Константа первой ступени имеет величину Ка1 = 2,5×10 3 . Это означает, что при pH водного раствора больше 2,5 поверхность кварца приобретает некоторый отрицательный заряд, который возрастает при увеличении pH раствора. Наоборот, при pH
2 и меньше диссоциация сила- нольных групп практически полностью подавлена, и поверхность кварца становится нейтральной.
Диссоциация силанольных групп вызывает на границе раздела кварц—водный раствор электролита образование двойного электрического слоя (ДЭС), рис. 1. Первую его обкладку составляют неподвижные отрицательно заряженные силанольные группы. Вторую обкладку двойного слоя составляют положительно заряженные катионы, существующие в растворе. Диэлектриком, разделяющим обкладки этого конденсатора, являются молекулы воды, гидратирующие как силанольные группы, так и катионы.
Положительная часть ДЭС, в свою очередь, делится на две части: первую (или неподвижную), непосредственно примыкающую к поверхности кварца, и вторую (или диффузную), располагающуюся на некотором удалении от поверхности. В неподвижной части количество положительных зарядов меньше, чем отрицательных зарядов на поверхности кварца из-за увеличения размеров катионов вследствие гидратации. В результате в диффузной части ДЭС образуется некоторая избыточная концентрация катионов. Между этими двумя слоями проходит т. н. граница скольжения — при наложении вдоль капилляра электрического поля неподвижная часть остается на месте, в то время как диффузная часть начинает мигрировать к катоду, увлекая за собой в силу межмолекулярного сцепления всю массу жидкости в капилляре. Возникает электроосмотический поток (ЭОП), который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра. Скорость ЭОП в сильной степени зависит от pH раствора: в сильнокислых растворах ЭОП отсутствует, в слабокислых — его скорость незначительна, а при переходе в нейтральную и щелочную область pH скорость ЭОП возрастает до максимально возможной. С другой стороны, эта величина зависит от концентрации электролита в ведущем буфере: чем она больше, тем выше становится доля катионов в неподвижной части ДЭС, а толщина диффузной части уменьшается и, соответственно, уменьшается скорость электроосмотического потока.
Рис. 1. Строение двойного электрического слоя.
В приборах для капиллярного электрофореза капилляр, заполненный раствором электролита, своими концами опущен в два содержащих тот же электролит сосуда, в которые введены электроды. Электролит должен обладать буферными свойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изменению состава раствора в приэлектродных пространствах, а с другой — стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа. При подаче на электроды высокого напряжения в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через капилляр протекает постоянный электроосмотический поток, на который накладывается взаимно противоположная электромиграция катионов и анионов.
Если в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить эту зону к катоду (в область детектирования), и зона некоторое время сможет находиться в капилляре под воздействием электрического поля высокого напряжения. В течение этого времени заряженные компоненты пробы будут перемещаться в соответствии с их электрофоретическими подвижностями.
Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток (рис. 2). Скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионы появляются первыми и тем раньше, чем больше их электрофоретическая подвижность.
Нейтральные компоненты пробы способны перемещаться только под действием электроосмотического потока, тогда как анионные будут перемещаться к аноду со скоростями меньшими, чем скорость ЭОП. Медленно мигрирующие анионы появятся на выходе после ЭОП, а те, чья скорость электромиграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, будут выходить из капилляра в прианодное пространство.
Рис. 2. Электрофоретическая миграция ионов в присутствии электроосмотического потока.
Если время нахождения пробы в капилляре (которое можно регулировать изменением напряжения, величины pH и концентрации ведущего электролита) достаточно, чтобы проявились различия в подвижности ионов, то на выходе капилляра вблизи катода можно наблюдать зоны раствора, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы.
Ведущий электролит (его называют также рабочим буферным раствором) должен иметь такую концентрацию, при которой электрическое сопротивление раствора в капилляре будет достаточно велико. Это требование связано с тем, что при прохождении электрического тока в проводнике выделяется тепло. Если ток достаточно велик, то жидкость в капилляре может даже закипеть.
Основные варианты капиллярного электрофореза
Наиболее распространенными вариантами метода капиллярного электрофореза являются капиллярный зонный электрофорез и мицеллярная электрокинетическая хроматография.
Самым простым вариантом КЭ является капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ). Компоненты сложной смеси движутся в среде электролита с разными скоростями, образуя дискретные зоны. Отличительная особенность КЗЭ состоит в том, что он пригоден для разделения только ионогенных компонентов пробы, тогда как нейтральные соединения, не обладающие собственной электрофоретической подвижностью, движутся со скоростью ЭОП и выходят в зоне нейтральных компонентов, зоне маркера ЭОП.
В приборах капиллярного электрофореза, в которых используется кварцевый капилляр, полярность входного конца чаще всего положительная (анод), и ЭОП переносит зону пробы к катоду. Вблизи катодного выхода установлен детектор. При этих условиях катионные компоненты пробы, тоже мигрируя к катоду, обгоняют ЭОП и первыми достигают детектора в виде отдельных зон, которые на электрофореграмме регистрируются индивидуальными пиками. Через некоторое время детектора достигает и зона исходного раствора, в которой остались нейтральные компоненты пробы. В зависимости от того, поглощают они или нет, на электрофореграмме регистрируется прямой (в некоторых случаях обратный) пик, который часто называют системным. Иногда для идентификации системного пика в пробу добавляют специальные вещества — маркеры ЭОП, например, бензиловый спирт. Что касается анионных компонентов пробы, то их поведение зависит от соотношения скоростей ЭОП и электромиграции анионов. Если скорость миграции аниона превышает скорость ЭОП, то такой анион рано или поздно выйдет из капилляра в прианодное пространство (это нежелательно, т. к. некоторые анионы, например хлорид, попадая в рабочий буферный раствор, будут, разряжаясь на аноде, вызывать коррозию платинового электрода). Если же скорость электромиграции аниона меньше скорости ЭОП, то такой анион может быть зарегистрирован на той же электрофореграмме после выхода системного пика. В этом варианте КЗЭ с положительной полярностью могут определяться катионные компоненты проб и большинство органических анионов.
Чтобы методом КЗЭ можно было определять анионные компоненты проб (в основном, неорганического происхождения) необходимо изменить полярность прикладываемого напряжения. Однако в этом случае изменится не только направление миграции анионов, но также направление ЭОП. Для преодоления этого противоречия необходимо модифицировать поверхность кварцевого капилляра так, чтобы знаки зарядов двойного электрического слоя поменялись на обратные. Это достигается введением в рабочий буферный раствор катионного поверхностно-активного вещества, например, бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ). Катион ЦТА + активно сорбируется на кварцевой поверхности, занимая при достаточной его концентрации все вакансии в ближайшем к поверхности слое. Поверхность как бы «ощетинивается» длинными цетильными (С16Н33—) цепочками. Ставшая гидрофобной поверхность при дальнейшей промывке рабочим буферным раствором сорбирует еще один слой поверхностно-активного катиона, ориентированного аммонийным концом наружу (сорбция «щетка в щетку»). В результате первый слой двойного электрического слоя становится положительным, а второй, в том числе и диффузная его часть, — отрицательным, и ЭОП снова движется от входного конца к детектору, несколько отставая от мигрирующих быстрее анионов.
Основным достоинством КЗЭ является высокая эффективность (сотни тысяч теоретических тарелок), при этом селективность, определяемая механизмом разделения внутри одной фазы, в КЗЭ недостаточна. Повышение селективности может быть достигнуто за счет изменения pH ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок: поверхностно-активных веществ, макроциклов, органических растворителей и т. д.
Мицеллярная электрокинетическая хроматография объединяет электрофорез и хроматографию. МЭКХ получила наиболее широкое распространение среди других вариантов капиллярного электрофореза, в первую очередь, за счет способности разделять как ионогенные, так и незаряженные компоненты пробы. Разделение нейтральных соединений стало возможным благодаря введению в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ (ПАВ) — мицеллообразователей. Чаще всего используют анионные ПАВ (например, додецилсульфат натрия — ДДСН, англ. SDS) в концентрациях, превышающих критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ), которая, например, для ДДСН в водном растворе составляет 8 мМ. В этом случае в растворе электролита находятся преимущественно мицеллы и небольшая доля мономерной формы ПАВ. Мономеры состоят из гидрофобного «хвоста» и гидрофильной (в случае анионного по- верхностно-активного вещества отрицательно заряженной) «головы». При формировании прямых мицелл мономерные фрагменты агрегируются неполярными концами внутрь, а внешняя сферическая поверхность мицеллы становится отрицательно заряженной. Каждая мицелла окружена собственным двойным электрическим слоем, внешнюю диффузную часть которого формируют катионы, присутствующие в растворе ведущего электролита. Число мономеров, образующих мицеллу, может колебаться от 60 до 100 молекул, однако общий заряд мицеллы существенно меньше из-за наличия в неподвижной части второго слоя ДЭС гидратированных катионов. Ни мицеллярная, ни мономерная форма АПАВ не взаимодействуют со стенкой кварцевого капилляра, но при подаче на капилляр высокого напряжения обе формы мигрируют к аноду, в то время как ЭОП направлен к катоду. Если в капилляр на анодной стороне ввести пробу, содержащую нейтральные и заряженные компоненты, то ЭОП будет переносить их к катоду, а навстречу будет двигаться поток отрицательно заряженных мицелл АПАВ. Нейтральные компоненты пробы могут распределяться между фазой раствора и мицеллярной фазой, причем константа этого распределения специфична для каждого сорта молекул пробы. В результате на выходе капилляра регистрируется электрофореграмма нейтральных компонентов, а также медленно мигрирующих анионов пробы.
Общее устройство систем КЭ
Минимальный состав системы, реализующей метод капиллярного электрофореза, должен включать следующие узлы: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и систему сбора, обработки и вывода информации (рис. 3).
Дополнительными устройствами в системах капиллярного электрофореза являются, например, автосемплер и блок жидкостного охлаждения капилляра, которые позволяют:
► автоматизировать подачу образцов,
► осуществить эффективный отвод тепла от капилляра.
Рис. 3. Устройство системы капиллярного электрофореза.
В системах капиллярного электрофореза используют, как правило, капилляры из высокочистого плавленого кварца, прозрачного в УФ-области спектра, с внешним полимерным, чаще полиимидным, защитным покрытием. В случае детектирования внутри капилляра (on-line) полиимидное покрытие в зоне детектирования снимают, оставляя для прохождения света зону чистого кварца. Внутренний диаметр капилляров может варьироваться от 20 до 100 мкм, но чаще всего используют 50 и 75 мкм. Внешний диаметр составляет 365 мкм, длина капилляров 20—100 см.
Доминирующее число разделений в КЭ ведут на непокрытых изнутри капиллярах, так называемых немодифицированных. Их подготовка к анализу начинается, как правило, с промывки раствором щелочи для обеспечения диссоциации силанольных групп кварца и возникновения ЭОП.
Анализ методом КЭ можно проводить только тогда, когда капилляр находится в кондиционном состоянии. С точки зрения анализа кондиционное состояние капилляра следует понимать так, что выполняемые последовательно анализы должны быть воспроизводимы как по временам миграции пиков, так и по площадям пиков. При подготовке к работе капилляр обычно промывают раствором кислоты, водой и раствором щелочи. Цель первой операции заключается в удалении с поверхности примесей, в частности, многовалентных катионов, и первичном гидролизе силокса- новых групп. Промывка водой способствует удалению кислоты и дальнейшему гидролизу поверхности. Наконец, щелочная промывка предназначена для удаления примесей, не реагирующих с кислотой, и максимальной диссоциации образовавшихся силанольных групп. Финишная промывка водой имеет целью удалить из капилляра щелочь.
Источники высокого напряжения
В первую очередь, источники напряжения должны обеспечивать регулируемую подачу напряжения в диапазоне от —25 до +25 кВ и при заданной величине напряжения поддерживать постоянство этого значения. Максимально допустимый ток в капилляре при этом не должен превышать 200 мкА.
Как правило, переключение полярности происходит в ручном режиме, что сопровождается сменой высоковольтных блоков.
Типичный объем вводимой пробы в капиллярном электрофорезе составляет 1—20 нл. Общепринято заполнять пробой не более 2 % объема капилляра с тем, чтобы изначально, до анализа, не создавать широкую зону компонентов и обеспечить достаточное время нахождения зоны пробы в капилляре для установления значимых различий в электрофоретических подвижностях.
Непосредственно перед вводом пробы капилляр промывают рабочим буферным раствором, удаляя остатки пробы от предыдущего ввода.
Различают три способа ввода пробы:
Первые два способа реализованы во всех коммерческих системах капиллярного электрофореза, гидростатический, напротив, не нашел широкого применения.
Ввод пробы давлением (гидродинамический, пневматический) обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для пробы и выходным концом капилляра, при этом давление либо повышается в сосуде для пробы, либо снижается на конце капилляра.
Электрокинетический ввод пробы. При этом способе ввод пробы осуществляется путем подачи высокого напряжения на электроды, когда на входе установлена пробирка с раствором пробы, а на выходе — с рабочим буфером. За счет возникающего при этом ЭОП компоненты пробы перемещаются в капилляр. Количество введенной пробы при этом способе зависит от величины приложенного напряжения, времени, в течение которого приложено напряжение, и подвижности компонентов пробы.
Гидростатический ввод пробы. В этом способе для ввода пробы используют разницу в высоте между буферным сосудом и сосудом для проб.
Детектирование в системах капиллярного электрофореза может осуществляться различными способами:
► непосредственно в капилляре в части, близкой к выходному концу, в режиме реального времени (on-capillary). В зоне детектирования с внешней стенки капилляра снимают защитное полиимидное покрытие. Этот способ характерен для большинства коммерческих систем капиллярного электрофореза;
► непосредственно на выходном конце капилляра (end-capillary)’,
► вне системы КЭ (off-capfflary, при этом, как правило, детектор представляет собой отдельный самостоятельный прибор (например, масс-спектрометр) и соединен с системой капиллярного электрофореза специальным интерфейсом).
Основными принципами детектирования в КЭ являются:
► фотометрическое в УФ-видимой области спектра (прямое и косвенное),
► флуориметрическое (прямое и косвенное),
► амперометрическое (прямое и косвенное),
Наиболее распространенным вариантом детектирования продолжает оставаться фотометрическое, основанное на поглощении веществом УФ или видимого света. Фотометрические детекторы в КЭ, подразделяют на:
► Детекторы с фиксированной длиной волны: источники света с линейчатым спектром (ртутная лампа (254 нм), кадмиевая лампа (229 нм) и цинковая лампа (214 нм). В приборах «Капель-104» фотометрический детектор работает на длине волны 254 нм (строго 253,7 нм), поэтому отклик детектора будет наблюдаться только в том случае, если определяемый компонент имеет заметное поглощение на указанной длине волны
► Детекторы с изменяемой длиной волны: источниками света служат дейтериевые и вольфрамовые лампы (рабочий диапазон длин волн 190—350 нм и 340—850 нм, соответственно). Необходимая спектральная селекция достигается применением монохроматоров или узкополосных светофильтров.
► Детекторы на диодной матрице (ДМД). В таких детекторах световой поток, прошедший через капилляр, разлагается в спектр с помощью высококачественного светосильного монохроматора, а матрица фотодиодов постоянно регистрирует сигналы в ультрафиолетовой и видимой частях спектра (УФ-В-детекторы), обеспечивая запись в режиме сканирования. Данные, полученные одновременно на различных длинах волн (до 5), обрабатываются с помощью компьютеров, выделяющих сигнал на оптимальной длине волны и вычитающих фон. Применение детекторов на диодной матрице обеспечивает получение аналитических данных с гораздо большей степенью достоверности.
Для соединений, анализируемых с помощью КЭ и не поглощающих в УФ-диапазоне, существует возможность регистрации методом косвенного УФ-детектирования. В этом случае в состав ведущего электролита вводят небольшое количество хромофора — вещества, поглощающего на требуемой длине волны. Так, в случае определения анионов поглощающий ион тоже должен быть анионом, например, хромат-ион, фталат-ион, а при определении катионов чаще всего используют катионы ароматических аминов или гетероциклов, в частности, ион протонированного бензимидазола. Так как ионная сила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне, где находится непоглощающий ион, уменьшается концентрация поглощающего иона. Обмен происходит строго эквивалентно, на электрофореграмме наблюдаются обратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациям определяемых ионов. Косвенное УФ-детектирование является универсальным вариантом детектирования, т. к. позволяет регистрировать все присутствующие в анализируемом растворе компоненты.
Капиллярный электрофорез относится к группе комбинированных методов анализа, в которых объединены два основных процесса: предварительное разделение компонентов сложной смеси и их определение/детектирование. Важными характеристиками разделения являются разрешение, эффективность и селективность. Для конечного определения наиболее актуален параметр чувствительности, в первую очередь зависящий от типа используемого детектора.
Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью.
Несмотря на высокую эффективность, достигаемую в капиллярном электрофорезе, селективность разделения, особенно в зонном варианте может быть недостаточна, в первую очередь, из-за осуществления процесса разделения внутри одной фазы. Задача повышения селективности разделения в том или ином варианте КЭ требует знания факторов, ее определяющих, и может быть решена за счет изменения pH ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок, например, ПАВ, макроциклов, органических. Следует иметь в виду, что все эти факторы будут сказываться также на скорости ЭОП, однако, сам по себе электроосмотический поток не ответственен за изменение селективности разделения и определяет лишь изменение времени миграции (на равную величину для всех компонентов пробы).
Выбор ведущего электролита является чрезвычайно важной задачей для успешного разделения в любом варианте КЭ. Величина pH ведущего электролита определяет как скорость течения жидкости в капилляре (величину ЭОП), так и форму нахождения компонента в растворе (заряд). Чувствительность ЭОП к изменению pH раствора заставляет использовать ведущие электролиты с высокой буферной емкостью, при этом диапазон pH, как правило, имеет значения рКа±1. Благодаря высокой стабильности кварцевого капилляра при электрофоретическом разделении можно использовать буферные системы с pH от 2 до 12.
Идеальный буфер для капиллярного электрофореза должен обладать следующими свойствами:
► достаточная буферная емкость в выбранном диапазоне pH,
► малое поглощение на длине волны детектирования,
► низкая подвижность ведущего иона.
Список так называемых «подходящих» буферов возглавляют боратный буфер и TRIS, так как они могут использоваться в широком диапазоне концентраций без существенного увеличения тока, что позволяет, в свою очередь, применять максимально высокие напряжения в ходе анализа.
Среди используемых в капиллярном электрофорезе добавок наиболее популярны поверхностно-активные вещества. Их введение в состав буферных растворов позволяет в разной степени влиять на селективность, причем определяющими факторами являются тип ПАВ и его концентрация. В КЭ могут быть использованы как ионогенные (катионные (КПАВ) и анионные (АПАВ), а также цвиттер-ионные), так и нейтральные поверхностно-активные вещества.
При концентрации ниже ККМ мономерные формы ионогенных ПАВ могут выступать как ион-парные добавки (различные АПАВ, КПАВ), а также влиять на растворимость гидрофобных компонентов смеси и модифицировать стенки капилляра (например, ЦТАБ). Возможные при этом механизмы взаимодействий поверхностноактивного вещества и пробы — ионные и/или гидрофобные. Добавки ПАВ в ведущий электролит влияют не только на поведение зоны пробы в капилляре, но и на стенки самого капилляра, модифицируя ЭОП (уменьшая, увеличивая или обращая).
Органические растворители (метанол, ацетонитрил, изопропанол и др.), которые вводят в буферный раствор в концентрации от нескольких долей процента до 30 % (об.) могут, с одной стороны, повышать растворимость анализируемых соединений, делая капиллярный электрофорез пригодным для анализа веществ с ограниченной растворимостью в водных средах. С другой стороны, органические добавки могут уменьшать гидрофобные взаимодействия между анализируемым компонентом и мицеллой в МЭКХ, а также влиять на подвижность ЭОП и собственную электрофоретическую подвижность аналита. Макроциклические реагенты как компоненты ведущих электролитов широко распространены в КЭ.
Обработка результатов в капиллярном электрофорезе. Качественный и количественный анализ
Целью любого анализа является получение ответов на вопросы: какие компоненты присутствуют в анализируемом образце и какова величина их концентраций? Первый из вопросов есть задача качественного анализа, второй — количественного. Для решения обеих задач в КЭ перед анализом пробы обязательно проводят процедуру градуировки системы путем измерения одной или нескольких смесей с известным качественным и количественным составом. Результатом градуировки являются формирование таблицы компонентов (содержит времена миграции и имена определяемых компонентов) и построение градуировочной зависимости (показывает зависимость сигнала детектора от концентрации/содержания вещества).
В капиллярном электрофорезе используют те же принципы интегрирования пиков, методы градуировки, способы формирования отчетов, как в газовой хроматографии и ВЭЖХ. По аналогии с ВЭЖХ большинство детекторов в капиллярном электрофорезе являются концентрационными, для которых высота или площадь пика прямо пропорциональны концентрации вещества, образующего пик.
Качественный анализ. Характеристики миграции/удерживания
Качественный анализ обычно состоит в сравнении времен миграции (в случае капиллярного зонного электрофореза) или времен удерживания (в случае мицеллярной электрокинетической хроматографии), полученных для стандарта и пробы, измеренных в одинаковых условиях. Если эти времена совпадают с заданной точностью (обычно окно идентификации не превышает 5 %), то считают, что искомое вещество в пробе найдено и переходят к количественному анализу. Тем не менее, такой способ идентификации вещества не всегда надежен, особенно в случае анализа проб со сложной матрицей.
Несмотря на высокую разделительную способность капиллярного электрофореза, качественный анализ близкорасположенных пиков может вызывать некоторые трудности. В этом случае можно рекомендовать использование метода добавок. В пробу, для которой затруднена идентификация анализируемого вещества, вносят это вещество и проводят повторный анализ. Если на электрофореграмме появляется новый пик, это означает, что анализируемый компонент ранее в пробе отсутствовал. Если же один из бывших пиков увеличился по высоте (площади), то можно утверждать, что это и есть анализируемый компонент. Величину добавки обычно выбирают так, чтобы высота (площадь) интересующего нас пика увеличилась не более чем в 2—3 раза.
Зачастую приходится сталкиваться с ситуацией, когда время миграции компонента не стабильно от анализа к анализу, что связано, в том числе, с нестабильностью электроосмотического потока. Причин этому несколько, от недостаточно кондиционного состояния капилляра, использования модификации внутренней поверхности капилляра или введения добавок в состав буферного электролита до температурных эффектов и влияния матричных и сопутствующих компонентов. Использование в таких ситуациях маркера ЭОП (например, ацетона) как в растворе стандарта, так и в пробе, позволит вычислить исправленные времена миграции, представляющие собой разность времен миграции анализируемого вещества и метки ЭОП.
Еще одним из вариантов повышения достоверности идентификации анализируемого компонента является введение в стандартный раствор и раствор пробы маркера — внутреннего стандарта. Это должно быть вещество, заведомо отсутствующее в анализируемых пробах, но имеющее схожие с определяемым веществом физико-химические свойства. Для стандарта и пробы вычисляют относительные времена миграции (можно арифметически поделить время миграции компонента на время миграции ЭОП и, наоборот, но для пробы и для стандарта это должно быть сделано одинаково) и находят в пробе близкие по численному значению результаты.
Наиболее полную и достоверную идентификацию вещества на сегодняшний день можно получить при использовании диодно-матричного детектора, который по результату одного анализа может предоставить информацию:
по сопоставлению времени миграции вещества и его спектра в пробе и стандартном растворе (при этом дополнительно будет дана оценка чистоты пика пробы, например, по наложению спектров, снятых в трех точках пика: на обоих склонах и в максимуме);
по отношению откликов пика (например, площади) на двух разных длинах волн, полученных для стандарта и пробы. Для одного и того же вещества на двух разных длинах волн при неизменном времени миграции отношение площадей в стандартном растворе и растворе пробы должно быть постоянным. Длины волн выбирают так, чтобы компонент имел при этом разное поглощение, т. е. высота или площадь пика при двух разных длинах волн были бы различными.
Количественная обработка результатов анализа
В основе количественного анализа лежит прямо пропорциональная зависимость высоты (площади) пика от концентрации вещества при использовании концентрационных детекторов, какими являются, например, фотометрические и флуориметрические детекторы.
Суть количественного определения сводится к следующему: сначала выбирают метод градуировки (внешнего стандарта (абсолютной градуировки), внутреннего стандарта, метод добавок и т. д.); определяют какую величину отклика детектора — высоту пика или площадь пика — будут использовать; затем анализируют стандартные растворы с известными концентрациями веществ и для каждого компонента строят градуировочную зависимость отклика детектора от концентрации вещества; после чего анализируют пробу неизвестного состава и по градуировочному графику находят концентрацию определяемых веществ.
Основным методом градуировки является метод внешнего стандарта (абсолютной градуировки), для которого необходимо иметь ГСО или химически чистые стандарты всех определяемых компонентов. Градуировка может быть одноточечной и многоточечной. Одноточечная означает, что для градуировки компонента используется только один градуировочный раствор, зависимость носит строго линейный характер и, как правило, выходит из начала координат. Это частный случай многоточечной градуировки, для построения которой анализируют несколько специально подобранных по концентрациям градуировочных растворов, после чего с помощью метода наименьших квадратов рассчитывают коэффициенты прямой, наилучшим образом описывающей экспериментальные данные. Правильное и тщательное проведение градуировки является необходимым условием точности получаемых количественных результатов анализа.
Основными областями применения метода КЭ являются:
· Анализ объектов окружающей среды: природные, питьевые, сточные воды и почвы (анионы, катионы, гербициды).
· Контроль качества пищевой продукции и продовольственного сырья: (неорганические катионы и анионы, консерванты, органические кислоты, подсластители, синтетические красители, антиоксиданты, аминокислоты, витамины, углеводы, белки).
· Анализ показателей качества кормов, комбикормов и сырья для их производства: (аминокислоты, белки, витамины).
· Фармация: технологический контроль и анализ готовых лекарственных форм, разделение оптических изомеров.
· Клиническая биохимия: определение неорганических катионов и анионов, аминокислот, белков в биологических жидкостях, определение фармакокинетики лекарственных препаратов.
· Криминалистическая экспертиза: обнаружение остаточных количеств взрывчатых веществ, анализ наркотических средств.
· Химическая промышленность: технологический контроль, определение состава сырья и полупродуктов.
источник