Основной метод протеомики двухмерный электрофорез

1995 г. (Ян Хемпли-Смит) ввел термин протеом, подразумевая инвентаризацию всех белков клетки.

Протеомика — наука, основным предметом изучения которой являются белки, их функции и взаимодействия в живых организмах, в том числе в человеческом. Основная задача протеомики — количественный анализ экспрессии белков в клетках в зависимости от их типа, состояния или влияния внешних условий. Протеомика осуществляет сравнительный анализ больших групп белков: от всех белков, вовлеченных в тот или иной биологический процесс до полного протеома.

98,5% заболеваний человека связаны с нарушением протеома, остальные 1,5% -генетические заболевания.

2001 год – открыт проект HUPO по исследованию протеома человека.

1. Создание каталога белков человека: полный список всех белков, включая ко- и посттрансляционно модифицированные продукты, варианты множественного сплайсинга и характеристики семейств белковых изоформ, кодируемых одним геном. Это позволит соотнести рассчитанную последовательность генома человека с открытыми рамками считывания, стартовыми кодонами, границами экзонов/интронов с экспериментальными данными.

2. Сделать доступным клон кДНК, который позволит производить рекомбинантные белки с каждой открытой рамки считывания.

3. Производить «репортерные» лиганды для каждого продукта открытой рамки считывания. Такое производство может включать традиционные антитела, фаговое представление антител или отдельных фрагментов, аптомеры, аффитела и другие лиганды.

4. Детальный анализ белок/белковых взаимодействий.

5. Детальный анализ взаимодействий белков с нуклеиновыми кислотами.

6. Установление более тесных связей с геномным структурным сообществом.

7. Детальный анализ всех уровней тканеспецифичной экспрессии белков.

8. Детальный анализ всех уровней внутриклеточной экспрессии белка.

9. Статус каждого из восьми пунктов в отношении многочисленных заболеваний.

10. Диагностика молчащих опухолей (рак яичников, легких, рак костной ткани), различные формы гепатита (В,С,Е), заболевания внутритробного развития (патологии), туберкулез.

11. Создание селективных лекарственных средств.

До сих пор протеомика считается наукой, в основе которой лежат три методических подхода:

1. двухмерный электрофорез, используемый для разделения белков и их первичной идентификации;

2. масс-спектрометрии для идентификации белков и их секвенирования (именно этот подход сделал протеомику самостоятельной наукой).

3. биоинформатика при обработке результатов масс-спектрометрического анализа играет решающую роль.

Среди методических проблем протеомики проблема двухмерного электрофореза является особенно актуальной. Проблема 2D-электрофореза применительно к анализу мембранных белков, так как до сих пор протеомики мембранных белков не существует.

Важным методом протеомных исследований является масс-спектрометрия. В Мюнхене различные фирмы продемонстрировали свои успехи в этой области, продемонстрированы огромные возможности метода масс-спектрометрического анализа, позволяющие работать на атомо-молярном уровне в полностью автоматизированном режиме*Более того, были даны некоторые примеры прямого использования метода масс-спектрометрического анализа для анализа сложных белковых смесей без предварительного их разделения. Развитие всех направлений в этой области сводится к попытке найти какую-то замену двухмерному электрофорезу и перевести масс-спектрометрический анализ в область работы с фемто — и атомо-молярными уровнями концентраций исследуемых объектов.

Отдельно были также обсуждены возможности использования различных методов биоинформатики в протеомике и по сути дела декларирована необходимость создания программ, специфичных для этой области знаний. Поставлен вопрос о как можно более быстрой аннотации протеом и (также как и в случае генома), переводе линейных белковых структур в трехмерное пространство. Основной вопрос, который обсуждался в большинстве методических сообщений сводился к одному: какой же метод придет на смену электрофорезу? При ответе на этот вопрос можно выделить три принципиально различающихся подхода:

1. Развитие масс-спектрометрического анализа и биоинформатики до такой степени, чтобы он сам по себе позволял анализировать сложные биологические смеси, в состав которых могут входить мембранные белки;

2. Использование одномерного электрофореза вместо двухмерного с последующим анализом не отдельных белковых пятен, а всей области разделенных ДДС-электрофорезом белков. Современный масс-спектрометрический анализ позволяет это делать, а преимущество одномерного электрофореза перед двухмерным, где второе направление (а именно изоэлектрофокусировка) до сих пор остается в значительной мере искусством, а не наукой, очевидно.

3. Использование многомерной хроматографии на первом этапе вместо электрофореза для разделения белковых смесей. Этот подход также имеет все

очевидные преимущества, так как он является количественным и позволяет работать с электроспрейными детекторами в режиме «on line» или использоватьнаиболее популярный метод MALDI-TOF-анализа через стадию роботизированных коллекторов.

Заключение: протеомная наука развивается очень и очень быстро. Доминирующее положение в ней в настоящее время занимают не государственные структуры, а частные фирмы. Объясняется этотем, что протеомная наука очень дорогая. Ясно,что ни академическая, ни университетская науки такой финансовой поддержки не имеют и в ближайшее время вряд ли будут иметь. Лимитирующим является также и наличие специалистов высокого класса в области масс-спектрометрического анализа.

Не вызывает также сомнения, что протеомика пришла в нашу жизнь всерьез и надолго и задачи ее гораздо сложнее, чем задачи геномики. Разница заключается в том, что в случае анализа генома мы довольствуемся данными об информационном материале клеток, который в значительной мере идентичен в пределах одного вида и различных состояний В случае протеомного анализа мы имеем дело с десятками миллионов белков, концентрация которых весьма специфична для различных состояний клеток и организма и резко меняется при различных патологических состояниях. Поэтому задача идентификации и составления протеомного индекса человека, выявления белковых маркеров различных патологических состояний на несколько порядков сложнее тех задач, которые решала и решает современная геномика.

источник

В клинической биохимии анализ индивидуальных белков человека используется для установления вида патологического процесса (дистрофии, опухолевый рост, воспаление) и определения пораженного органа (инфаркт миокарда);

— установления природы патологии, например, при диагностике энзимопатий, инфекционных (гепатит) и других заболеваний;

— оценки течения различных физиологических процессов (беременность, развитие иммунной системы) и обнаружения осложнений в их течении (патология беременности).

В области разработки лекарств основной проблемой, как правило, является увеличение или уменьшение активности белков, поэтому необходим некоторый метод, позволяющий регулировать специфическую активность. 2Д электрофорез является основным средством изучения воздействия лекарств на протеом, или на совокупность всех белков органа. Как правило новые лекарства тестируются с помощью 2Д электрофореза, на накопление их в критических органах, например, в печени.

Пример 1. Лекарство ловастатин, понижающее уровень холестерола в крови. Специфика его действия заключается в ингибировании HMG-кофермент А редуктазы. Однако, при анализе эффекта, которое оказывает это лекарство в комбинации с другими средствами, понижающими холестерол, было найдено, что количество белка HMG-Кофермент-A синтазы значительно повышается, в то время как количество других белков уменьшаются. Позднее обнаружили, что основное действие изучаемого лекарства заключается не в прямом ингибировании синтеза холестерола, а в повышении активности другого белка, липопротеинового рецептора, который удаляет из крови холестерин.

Пример 2. Превентивное лекарство против рака олтипраз повышает экспрессию ряда белков, включая афлатоксин В1 альдегидредуктазу, который разрушает один из натуральных канцерогенов. Предполагалось, что эффект имеет место в эндоплазматическом ретикулуме. При анализе 2Д геля, однако, выяснилось, что большинство изменений происходит в растворимой и митохондриальной фракциях клетки. Кроме этого, при сравнении экстрактов печени самок и самцов, экспрессия более трети белков отличалась в количестве. Следует заметить, что почти все эти различия регулируются на гормональном эпигенетическом уровне и не обусловлены наличием Х или У хромосомы.

Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия генов в тканях очень пластична, отвечает на воздействия большого числа факторов и почти всегда включает не один или два, а много генов. 2Д электрофорез идеально подходит для изучения подобных динамических изменений.

Как правило, результаты 2Д коррелируют с известными механизмами функционирования белков. Так, если лекарство усиливает пролиферацию в пероксисомах по данным электронной микроскопии, то и на 2Д электрофорезе будет наблюдаться увеличение количества белков, характерных для этого типа органелл. Подобные структурно-функциональные взаимодействия означают, что идентификация белков-мишеней для нового лекарственного средства может помочь открыть механизмы функционирования этих белков.

Еще одна важная функция 2Д методов в клинической протеомике это поиск новых белков-маркеров заболеваний, в частности, онко-маркеров. Отмеченные в таблице 1 потенциальные маркеры рака простаты представляют особый интерес по разным причинам. Например, тимозин бета-15 может определяться в моче и, по-видимому, имеет прямое отношение к молекулярным механизмам злокачественного перерождения клеток. Соответственно, ген тимозина бета-15 и его продукты могут стать не только диагностическими маркерами, но и в перспективе мишенями для различных воздействий с целью подавления опухолевого роста.

Комплексное изучение «протеома» проводится методами и технологиями, направленными на одновременное разделение, а также последующую идентификацию и анализ всех белков, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме).

1. Изоэлектрофокусированием (ИЭФ) называют разработанный в начале 60-х годов метод разделения белков под действием электрического поля в среде с градиентом pH, который создается специальными амфотерными веществами – «амфолитами», способными переносить ток (хорошая проводимость), а также создавать локально и поддерживать рН (хорошая буферная емкость). Появление наборов полиамино-поликарбоновых кислот (амфолинов) обеспечило высокую эффективность фракционирования белков с помощью ИЭФ, при этом разделение осуществлялось за счет различий в pI.

2. Среди множества электрофоретических методов разделения белков наибольшая эффективность оказалась у особой модификации метода Лэммли для вертикальных пластин с градиентом концентрации полиакриламидного геля, использующего ионный детергент – додецилсульфат Na (SDS). За счет гидрофобных взаимодействий, используемый детергент практически одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1.4 мг SDS на 1 мг белка. Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты делает несущественной роль заряда самого белка. Электрофоретическая подвижность комплекса белок-SDS в градиентном геле оказывается линейно связана с десятичным логарифмом его молекулярной массы (Mm). Таким образом, эта система обеспечивает разделение белков по различиям в Mm.

3. Идентификация миросеквенированием основана на определении (расшифровке) части аминокислотной последовательности белка. Разработанные методы микросеквенирования позволяют работать с очень малыми количествами пептидов — вплоть до нанограммовых. Это важно, так как определение даже короткого фрагмента аминокислотной последовательности часто оказывается решающим для идентификации целого белка. В настоящее время возможно как проведение прямого N-концевого секвенирования белка, перенесенного на инертную мемебрану, так и секвенирование отдельных пепетидов, полученных из изучаемого белка после его ферментативного расщепления высокоэффективной жидкостной хроматографией. Микросеквенирование позволяет выявлять одиночные аминокислотные замены в анализируеемых белках.

4. Масс-спектрометрия устанавливает какие атомы входят в состав молекулы, какова структура их расположения и изотопный состав, а также какова масса молекулы. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрия измеряет соотношение массы частицы к заряду. Для этого используются законы движения заряженных частиц материи в магнитном или электрическом поле. Различают несколько модификаций масс-спектрометрических методов:

· Мягкая матриксная ионизация (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization -MALDI) позволяет анализировать такие биополимеры, как полисахара, пептиды и макромолекулы, без риска повредить их структуру. Ионизация производится лазерным пучком, а матрикс используется для защиты молекул от разрушающего действия лазера. Матрикс состоит обычно из кристаллов кислот в смеси с органическим растворителем.

· Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) проводится на приборе, который объединяет несколько анализаторов, позволяющих последовательно изолировать один пептид, стабилизировать ионы, составляющие его и идентифицировать фрагменты. Используется в идентификации белковых пятен после 2Д электрофореза.

5. Капиллярный электрофорез — это метод анализа сложных смесей, использующий электрокинетические явления – электромиграцию ионов и других заряженных частиц и электроосмос – для разделения и определения компонентов. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты. Модификацией метода является капиллярный электрофорез в чипах. Идентификация белков с помощью масс-спектрометрии может проводиться непосредственно после разделения.

6. Недавно был аннонсирован метод капиллярного изоэлектрофокусирования. После изофокусирования в канале чипа, покрытого специальной пленкой, чип замораживался, пленка удалялась и содержимое канала подвергалось высушиванию при критической точке для предотвращения изменения позиции белковых пятен. После этого матрикс для MALDI добавлялся непосредственно к содержимому чипа. В результате одновременно удавалось считывать информацию о молекулярном весе и изоэлектрической точке данного пептида.

При исследовании белков методом 2Д электрофореза, целью исследования является:

· обеспечить воспроизводимое разделение основных известных белков, характерных для данной ткани;

· показать присутствие известных минорных белков;

· выявить и идентифицировать маркерные белки, характеризующих известные изменения в данной ткани.

Для достижения цели решают следующие задачи:

1) Все белки, содержащиеся в изучаемом образце, подвергаются солюбилизации и становятся объектами анализа;

2) Проводится аналитическое фракционирование по двум независимым друг от друга физико-химическим свойствам полипептидных цепей, отражающих особенности их первичной структуры — комбинированное использование – двумерный гель-электрофорез (2D):

· Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), обеспечивает фракционирование по pI.

· Электрофорез в присутствии SDS (SDS-ЭФ) обеспечивает разделение по Mm.

3) Выявление белковых фракций после разделения с помощью высокочувствительных методов детекции белков (различные модификации масс-спектрометрии).

4) Стандартизированное описание белков на двумерных электрофореграммах в системе прямоугольных координат, в которых одна из координат являться функцией молекулярной массы, а другая – изоэлектрической точкой для каждого вида полипептидных цепей.

Рис.6. Схема протеомных исследований

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8374 — | 8007 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Метод двумерного гель-электрофореза, в котором объединены две различные процедуры разделения, позволяет идентифицировать более 1000 белков. Результаты при этом получают в виде «двумерной» белковой карты. При работе данным методом на первом этапе белки разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент — меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента — мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипептидных цепей; при этом изменения заряда цепей не происходит. Диссоциированные полипептидные цепи разделяют. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлектрической точкой. ри изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в узкой трубочке, заполненной полиакриламидным гелем, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней. Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза. На втором этапе трубочка геля, содержащего разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Так осуществляется разделение во втором направлении двумерного гель-электрофореза.

Техника двумерного электрофореза требует, однако, в ряде случаев усовершенствования. Например, ведется поиск особых приемов для улучшения идентификации гидрофобных (связанных с мембранными структурами) белков.

Актуальным является уменьшение трудоемкости анализа совокупности белков микробной клетки, поскольку в ней насчитывается несколько тысяч индивидуальных белков. Тем не менее уже достигнута идентификация в одном эксперименте около 2000 белков.

Количественная протеомика.

количественная протеомика, позволяющая количественно сопоставлять экспрессию отдельных белков.

20.Определение экологии. Вклад биотехнологии в решении общих экологических проблем. Замена традиционных производств. Сохранение природных ресурсов источников биологического сырья. Разработка новых высокоспецефичных методов анализа. Биосенсоры. Классификация феромонов. Сигнально-комуникативные молекулы фермоны: феромоны-ремизеры, феромоны- праймеры.

Определение экологии

Экология – наука об отношении организмов к окружающей среде

Биосенсоры — это аналитические устройства, использующие биологические материалы для «узнавания» определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. Большинство биосенсоров ориентированы на анализ биологических жидкостей. Действительно, например, в крови находятся тысячи различных соединений. Задача заключается в том, чтобы быстро и эффективно (количественно) определить концентрацию нужного соединения, например глюкозы. Для людей, страдающих диабетом, это жизненно важный клинический анализ. Биосенсоры обеспечивают такую возможность/

Классификация феромонов

1. по взаимодействию между видами животных

а) анеомоны- дает выгоду донору

б) кайромоны- дает выгоду реципиенту

2. по практическому использованию феромонов

Б) феромоны- микроорганизмы

Сигнально-комуникативные молекулы фермоны: феромоны-ремизеры, феромоны- праймеры.

По своему воздействию феромоны делятся на два основных типа: релизеры и праймеры.

Релизеры — тип феромонов, побуждающих особь к каким-либо немедленным действиям и используются для привлечения брачных партнёров, сигналов об опасности и побуждения других немедленных действий.

Праймеры используются для формирования некоторого определённого поведения и влияния на развитие особей: например, специальный феромон, выделяемый пчелой-маткой. Это вещество подавляет половое развитие других пчёл-самок, таким образом превращая их в рабочих пчёл.

Вклад биотехнологии в решении общих экологических проблем.

Биотехнологические процессы с использованием микроорганизмов и ферментов уже на современном техническом уровне широко применяются в пищевой промышленности. Промышленное выращивание микроорганизмов, растительных и животных клеток используют для получения многих ценных соединений — ферментов, гормонов, аминокислот, витаминов, антибиотиков, метанола, органических кислот (уксусной, лимонной, молочной) и т. д. С помощью микроорганизмов проводят биотрансформацию одних органических соединений в другие (например, сорбита во фруктозу). Широкое применение в различных производствах получили иммобилизованные ферменты. Для выделения биологически активных веществ из сложных смесей используют моноклональные антитела.

А.С. Спириным в 1985-1988 разработаны принципы бесклеточного синтеза белка, когда вместо клеток применяются специальные биореакторы, содержащие необходимый набор очищенных клеточных компонентов. Этот метод позволяет получать разные типы белков и может быть эффективным в производстве. Многие промышленных технологий заменяются технологиями, использующими ферменты и микроорганизмы. Такие биотехнологические методы переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов, очистки и использования сточных вод для получения биогаза и удобрений. В ряде стран с помощью микроорганизмов получают этиловый спирт, используют как горючее для автомобилей (в Бразилии, где топливный спирт широко применяется, его получают из сахарного тростника и других растений). На способности различных бактерий переводить металлы в растворимые соединения или накапливать их в себе основан извлечение многих металлов из бедных руд или сточных вод.

21. Иммуноглобулины (ИГ). Основные этапы получения нормальных иммуноглобулинов человека (γ-глобулинов).

Природа антител. В ответ на введение антигена иммунная система вырабатывает антитела – белки, способные специфически соединяться с антигеном и т. о. участвовать в иммунологическом ответе. Они относятся к γ-глобулинам, т. е. наименее подвижной фракции белков. Вырабатываются плазмоцитами. Кол-во γ-глобулинов примерно 30% от всех белков плазмы.

Антитела – ИГ, которые вырабатываются в ответ на введение антигена и способные специфически взаимодействовать с ним.

1. Первичная – взаимодействие активных центров антител с комплементарными детерминантами антигенов.

2. Вторичная – способность: а) связывать антиген с целью его нейтрализации и элиминации; б) участвовать в распознавании чужого антигена; в) обеспечивать кооперацию иммунокомпетентных клеток (макрофагов, лимфоцитов); г) участвовать в различных формах иммунного ответа.

Структура антител. Белки ИГ по хим. составу относятся к гликопротеидам и построены из 18 аминокислот. Мол. масса 150 — 900 кД. Молекулы имеют цилиндрическую форму. До 80% ИГ устойчивы к слабым кислотам и щелочам и нагреванию до 60 0 С. Выделить из сыворотки можно физ. (электрофорез, аффинная хроматография) и хим. ( изоэлектрическое осаждение спиртом, кислотами, высаливание). ИГ по структуре, антигенным и иммунологическим св-вам делят на 5 классов: ИГ-М, ИГ-G, ИГ-А, ИГ-Е, ИГ-D. Иг-М, G, А имеют подклассы. Все классы и подклассы различаются по аминокислотной последовательности.

Молекулы ИГ состоят из полипептидных цепей – двух одинаковых тяжелых цепей Н и двух одинаковых легких цепей L, которые соединяются между собой дисульфидными мостиками.

Каждому классу подлежат 5 типов тяжелых цепей – μ, γ, α, ε, δ, различающихся по антигенности.

Легкие цепи всех классов общие и бывают двух типов: k и λ.

L-цепи ИГ различных классов могут вступать в соединения как с гомологичными (L), так и с гетерологичными H-цепями. Однако в одной и той же молекуле могут быть идентичные k-цепи.

Как в Н-, так и в L-цепях есть вариабельная чаcть – V, в которой последовательность аминокислот не постоянна, и константная область С с постоянным набором аминокислот. В L- и Н-цепях различают NН₂— и СООН-концевые группы.

При обработке γ-глобулин меркаптоэтанолом разрушается дисульфидные связи и молекула ИГ, распадается на отдельные цепи полипептидов.

При воздействии протеолитическим ферментом () ИГ расщепляется на 3 фрагмента некристаллизующихся содержащих детерминантные группы к антигену (называют Fab-фрагментами I и II) и один крмсталлизующийся Fc-фрагмент.

Fab I и Fab II-фрагменты сходны по свойствам аминокислотному составу; Fab- и Fc- фрагменты являются компактными образованными, соединенными между собой гибкими частями H-цепи, поэтому ИГ имеет гибкую структуру.

Как H-, так и L-цепи имеют линейносвязанные компактные участки, называемые доменами. В H-цепи по 4 домена, а в легкой – по 2 домена.

Активные цепи (детерминанты), которые формируются в V-областях, составляют около 2% процента от всей поверхности ИГ.

В каждой молекуле есть 2 активных центра, которые относятся к гипервариабельным участкам тяжелых и легких цепей, т. е. каждая молекула ИГ может связывать по 2 молекулы антигена. Поэтому антитела являются двухвалентными.

ИГ А может быть мономерными, димерными, тримерными. Бывает сывороточный и секреторный.

Если ИГ А секреторный, то молекула соединена с секреторным компонентом, который выделяется эпитемальными клетками, что защищает ИГ А от разрушения ферментами.

ИГ Е обладает высокой способностью присоединяться к тучным клеткам и базофилам, в результате выделяется гистамин и гистаминоподобные вещества.

ИГ D склонен к агрегации, имеет дополнительные дисульфидные связи.

В ответ на введение любого антигена возможна выработка ИГ всех всех пяти классов. Обычно вначале вырабатывается ИГ М, затем ИГ G, затем остальные. Фракции ИГ: ИГ G – 70 – 80% ИГ A – 10 – 15% ИГ M – 5 – 10% ИГ E – 0,002% ИГ D – 0,2%

Синтез антител. Основные этапы получения нормальных ИГ человека.

1. Плазму крови получают методом плазмофореза: кровь донора собирается в стерильные емкости из полимерного материала, содержащий р-р антикоагулянта (5% р-р цитрата натрия). Кровь центрифугируют, плазма отделяется, клетки возвращаются донору.

2. Выделение γ-глобулиновой части белков крови фракционированием 8-26% этанолом при температуре ниже 0 0 С. В этих условиях денатурирующее действие этанола незначительно и выделяемая γ-глобулиновая фракция сохраняет растворимость.

3. Лиофилизация γ-глобулинов.

4. Приготовлении 10% р-ра γ-глобулина, стерилизация, фильтрация и ампулирование.

5. Контроль на стерильность, апирогенность, содержание белка и безвредность.

Кроме нормальных ИГ из крови лоноров-добровольцев получают специфические ИГ: противостолбнячный, противококлюшевый, противостафилококковый, противовирусные (против гриппа, оспы, бешенства, энцефалита и др.).

Нормофлоры (побиотики, микробиотики, эубиотики) – препараты на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов. Общие проблемы микроэкологии человека. Понятие симбиоза. Различные виды симбиоза. Резидентная микрофлора ЖКТ. Причины дисбактериоза. Нормофлоры в борьбе с дисбактериозом. Гнотобиология. Гнотобионты.

Нормальная микрофлора – совокупность микробиоценнозов различных частей тела, контактирующих с внейней средой. Совокупность микробиоценозов называется нормобиоценоз или эубиоз.

В организме человека проживает 10 14 -10 16 бактерий, которые составляют «экстракорпоральный» орган со своими функциями, критериями, показателями состояния. Биомасса м/о составляет около 2,5-3 кг от веса человека.

Нарушения равновесия между отдельными видами м/о может повлечь нарушения гомеостаза. Дисбиотические состояния приводят к изменению качественного и количественного состояния нормофлоры человека.

М/о можно разделить на 4 группы:

1. М/о, не способные к длительному пребыванию в организме человека, нахождение которых носит случайный характер.

2. Постоянные представители микрофлоры, приносящие пользу (бифидо-, лакто- и колибактерии).

3. Условно-патогенные представители нормофлоры, α при определенных условиях могут стать патогенными (стафилококк).

4. М/о – возбудители инфекционных заболеваний.

Симбиоз (от греч. symbiosis «совместная жизнь») — это близкое сообщество живых организмов, принадлежащих к разных видам. Такое сообщество может принимать различные формы в зависимости от природы отношений между двумя видами и от того, полезны эти отношения или вредны. Отношения, полезные для обоих видов, называются мутуализмом. Если отношения полезны для одной стороны и безразличны для второй, они называются комменсализмом, а аменсализмом — отношения, вредные одному организму, но безразличные другому. Отношения, вредные для одной стороны и полезные для другой, называются паразитизмом.

Ведущее место по численности среди микрофлоры кишечника занимают молочнокислые бактерии. Они относятся к грамположительным истинным бактериям.

Нормальная микрофлора кишечника формирует колонизационную устойчивость организма. Один из главных механизмов защиты от колонизации условно патогенными и патогенными м/о — присутствие достаточного кол-ва полезной имикрофлоры. Представители нормофлоры в кишечнике конкурируют с патогенной микрофлорой за аргинин, аспарагиновую кислоту и серин, а также за область обитания.

В процессе жизнедеятельности м/о образуются органические кислоты, которые снижают рН среды толстой кишки до 5,3-5,8, лизоцим и другие антибиотикоподобные вещества. Снижается хроническое отравление организма продуктами гнилостного распада в кишечнике (фенол, индол, скатол).

Бактериальные протеазы гидролизуют белки и пептиды, которые затем распадаются до аминокислот и пептидных остатков. Метаболизируются азот- и углеродсодержащие соединения, мочевина за счет уреаз. Участие в деградации липидов и их синтезе. Нормофлора принимает участие в рециркуляции желчных кислот и влияет на холестериновый и билирубиновый обмен.

Бифидо- и лактобактерии, бактероиды, эубактерии способствуют всасыванию кальция, витамина Д, железа. Эшерихии, бифидо-, лакто- и эубактерии выполняют витаминообразующую функцию (синтез и всасывание витаминов К, группы В, биотина, никотиновой кислоты), способствуют синтезу незаменимых аминокислот. Метаболиты бифидо- и лактобактерий препятствуют микробному декарбоксилированию гистидина и повышению количества гистамина. Лактобактерии образуют молочную кислоту, продуцируют лизоцим, лизин, ацидофилин. Кишечная палочка способствует синтезу иммуноглобулинов, вырабатывает канцеролитические вещества.

Анаэробы продуцируют БАВы, медиаторы, которые влияют на функции ЖКТ, печени, сердесно-сосудистой системы, кроветворение и обменные процессы.

Нормофлора способна утилизировать не переваренные пищевые субстраты, образуя органические кислоты, аминокислоты, нормализующие обмен в организме.

Положительные функции нормофлоры:

1. колонизационная резистентность.

2. синтетическая (способность продуцировать витамины, гормоны, антибиотики).

3. поддержание высокого уровня содержания лизоцима, секреторных иммуномодулинов, интерферонов.

4. детоксикация экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов.

5. обменная (участие в обмене в-в).

6. пищеварительная (морфокинетическое влияние на слизистые оболочки, абсобцию абиотических компонентов, транзит нутриентов, газовый состав, мышечный тонус кишечника, перистальтику кишечника, эвакуацию кишечного содержимого).

Дисбактериоз — это нарушение состава и свойств микрофлоры. Чаще всего проявляется дисбактериоз кишечника. Наиболее частая причина дисбактериоза – лечение антибактериальным препаратами (антибитики, сульфаниламиды и т.д.). По большому счету, любые препараты и любые способы терапии, подавляющие иммунитет способствуют развитию дисбактериоза (кортикостероидные гормоны, лучевая терапия, использование средств подавляющих рост опухолей и т.п.). Еще одна причина дисбактериоза — нарушения питания. Это и однообразная пища, и различные злоупотребления (жирным, сладким), и тяга населения к экспериментам над собой (голодание, уринотерапия, кефирная диета, яблочные дни, банановые недели). гастриты, дуодениты, язвы, панкреатиты, колиты и т.п. обуславливают возникновение дисбактериоза. Вполне естественно, что любое оперативное вмешательство на органах системы пищеварения тоже приведет к возникновению дисбактериоза.Инфекционные болезни — особенно и, пожалуй, прежде всего, кишечные инфекции — тоже вызывают дисбактериоз.

Для профилактики и лечения дисбактериоза применяют препараты нормальной микрофлоры кишечника – эубиотики (пробиотики).Пробиотики – ЛП, которые в своем составе содержат живые клетки специально подобранных штаммов м/о растительно или животного происхождения. Они выживают в условиях кислотно окружения, непатогены, нетоксичны, стабильны в течение длительного срока хранения. Положительное влияние пробиотиков: 1) подавляют микробные патогенны за счет продукции антибактериальных веществ, а также конкуренции за лимитирующие пит.в-ва и сайты адгезии на кишечной стенке. 2) влияют на ферментативную активность кишечных м/о. 3) стимулируют иммунную систему макроорганизма. Препараты: бифидумбактерин, бификол, лактобактерин, бактесубтил, линекс, энтерол.

Пребиотики – пищевые добавки, селективно стимулирующие рост и размножение нормофлоры. Это низкомолекулярные углеводы (фруктозоолигосахариды, инулин, лактулоза), которые не должны подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами.

Симбиотики – комплексные препараты, содержащие пробиотики и пребиотики.

Существуют препараты, воздействующие на патогенную микрофлору продуктами метаболизма нормофлоры. К ним относится хилак-форте – стерильные концентрат продуктов обменв в-в нормофлоры(молочную кислоту, лактозу, аминокислоты, жирные кислоты). Эти в-ва способствуют восстановлению в кишечнике биологической среды и подавляют рост патогенных м/о.

Гнотобиология (греч. gnōtos указанный, известный + биология; син. гнотобиотика) — отрасль экспериментальной биологии и медицины, занимающаяся получением и выращиванием стерильных животных, а также животных, микрофлора которых состоит из точно известных одного или нескольких видов микроорганизмов, с целью изучения механизмов и форм взаимодействия микроба с макроорганизмом.

Гнотобионты [от греч. gnotos — известный, определенный и бионт (ы)], безмикробные животные и животные, выращенные в стерильных условиях в период постнатального развития. Обычно Гнотобионты получают путем кесарева сечения и содержат в специальных боксах, в которых отсутствуют микробы (подаются стерильный воздух, пища, вода). Гнотобионты не подвержены воздействию сапрофитной или патогенной микрофлоры воздуха, вследствие этого, в отличие от обычных животных, их реакции на воздействие факторов окружающей среды более выражены.

источник

Протеомные исследования в биологии и медицине

Термин «протеом», обозначает весь белковый комплемент, экспрессируемый геномом – “PROTEOME: entire PROTEin complement expressed by genOME”. Протеомика – это системное изучение «протеома», то есть всех белков, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме). Высокая значимость каждого из индивидуальных белков для обеспечения тех или иных функций и/или молекулярных структур в организме не только определяет их вовлеченность в различные физиологические и патологические процессы с потенциальными возможностями для использования белков в качестве эффективных диагностических маркеров, но и для применения некоторых белков как лекарственных средств. Для обнаружения и исследований новых белков широко применяются новые технологии, которые после завершения международного проекта «Геном человека» принято называть постгеномными. В частности, для системных исследований информационных РНК (транскриптов) используют термин «транскриптомика», а для системных исследований белков – «протеомика». Освоение и использование геномных и постгеномных технологий позволяет вывести молекулярно-биологические исследования, направленные на решение медицинских вопросов, на качественно более высокий уровень.

Традиционные подходы к изучению индивидуальных белков – биохимический и иммунохимический ориентируются на последовательное изучение отдельных белков. Для достижения цели белки изучают (выделяют), используя их индивидуальные свойства – функциональную активность или антигенность. В тоже время, системный подход ориентируется на параллельное изучение многих индивидуальных белков, совокупность которых составляет определенную систему, что характеризует исследуемый объект в целом. Рисунок 1 демонстрирует различие в разрешающей способности между одномерным электрофорезом (разделение смеси белков по разнице в их молекулярных массах) и комплексным методом – двумерным электрофорезом. Двумерный электрофорез в состоянии выявить в несколько раз больше индивидуальных белков, по сравнению с одномерным.

Рис. 1. Сравнение результатов одномерного (А) и двумерного (Б) форезов мембранных белков эритроцитов человека. Результат: одномерный форез выявил около 30, а двумерный – 189 белков.

В 20 веке методы аналитической химии прогрессировали от простых процедур, имеющих дело с единичными элементами, к более сложным методам, основанным на физическом разделении и детекции веществ. Таким образом, уже более 50 лет назад большое внимание уделялось методам разделения частиц – хроматографии, электрофорезу, масс-спектрометрии. Несколько позднее изобрели капиллярный электрофорез (гг.). Из всех этих методов только масс-спектрометрия обеспечивала разрешение, достаточное для разделения и идентификации сложных элементных смесей, однако до недавнего времени, и она не могла адекватно разделять макромолекулы. Задавшись целью увеличить разделительную способность, ученые пришли к выводу о необходимости совместить в двух измерениях два каких-либо метода, основанных на измерении разных параметров. Изначально предлагалось использовать два различных растворителя при разделении молекул в процессе хроматографии на бумаге, а также предпринимались попытки совместить электрофорез, в качестве первого направления с хроматографией, в качестве другого. Эта же концепция также имела место при разделении молекул по седиментационным коэффициентам и по различиям в плотности при ультрацентрифугировании. Если два метода разделения независимы друг от друга, то финальное разрешение должно определяться суммой разрешения обоих методов. В принципе, можно было бы добавить более двух измерений, однако такой подход может привести к значительному падению концентрации исследуемого вещества и к возникновению проблем в детекции сигнала.

По крайней мере шесть независимых попыток разработать двумерный электрофоретический метод было предпринято, прежде чем в 1975-76 гг. была опубликована первая доступная весия метода, объединяющая изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в растворах мочевины с электрофорезом в присутствии йонного детергента додецилсульфата Na (SDS). Разделение проводилось по первому направлению на основе заряда денатурированных белков (зависит от аминокислотной последовательности), а по второму направлению – в зависимости от молекулярной массы (см. раздел Методы).

В течение прошедших с тех пор 30 лет метод подвергался многим дополнениям, в частности, была предложена идентификация разделенных белков с помощью микросеквенирования и масс спектрометрии. Создаются компьютерные базы данных, содержащие сведения о клетках в культуре, белках плазмы крови, белках печени мыши и крысы, E. Coli, дрожжей и других модельных объектах. Практическое расширение области используемых pH связано с использованием коммерческих наборов иммобилинов, то есть иммобилизованных на специальных стрипах амфолинов. Использование таких наборов увеличивает воспроизводимость и увеличивает область действия метода. Иммобилиновая система позволяет использовать значительные нагрузки по белку: 1-10 мг на полоску (обычная нагрузка составляет около 100 мкг белка) и обеспечивает возможность изучения белков с рН > 8,5.

2Д электрофорез заложил основу для расшифровки молекулярного строения человеческих и животных тканей, клеток, бактерий и вирусов и для детектции изменений, происходящих при развитии, старении, заболеваниях а также в ответ на изменения окружающей среды. Протеомные методы используются для определения маркеров заболеваний и разработки новых лекарств. Также комбинация 2Д электрофореза с фракционированием клеточных органелл может дать информацию о внутриклеточной локализации специфических белков. Метод должен отличаться воспроизводимостью и возможностью количественной оценки результатов. В идеальном случае, должна быть возможность автоматизации всего набора процедур. До сих пор не существует полностью автоматизированного 2Д электрофореза, в связи с тем, что процедуры, входящие в него очень трудоемки.

Интересный аспект истории 2Д электрофореза показан на рис. 2, представляюшем число публикаций, найденных по запросу: 2Д электрофорез и протеомика. В последние 10 лет число статей, посвященных 2Д электрофорезу стабилизировалось и вышло на плато. С чем это связано — с тем, что 2Д электрофорез выходит из моды? Или это объясняется теми успехами секвенирования генома, которые наблюдаются в последние годы? Однако, даже если представить себе полностью расшифрованные геномы всех без исключения живых существ, протеомика будет иметь право на существование, так как связывает продукты деятельности генов с функциями организма. В последние несколько лет термин «протеомика» очень часто встречается среди цитируемых статей (рис. 2)

Рис. 2. Число публикаций, посвященных 2Д электрофорезу (2D or two D) и протеомике (proteom*) в базе данных MEDLINE c 1975 по 2005 гг.

Расшифровка генотипа организмов открывает перед учеными перспективу открытия базовых различий между хозяином и паразитом, между нормальной и необластической клетками. Знание этих различий приводит к пониманию причин генетических заболеваний, и, соответственно, к возможности лечения и предупреждения их.

Эпигенетическая система отражает взаимодействие организма с окружающей средой, а также взаимодействия между генами и продуктами их деятеьности. Эти взаимодействия могут быть прямыми (рис. 3) или осуществляться посредством сложной сети взаимодействий на белковом уровне (рис. 4) В последнем случае, наличие дефекта в гене может приводить или не приводить к заболеванию; кроме этого, степень и тяжесть заболевания может изменяться в зависимости от индивидуума. В эти сложные взаимодействия также включается воздействия окружающей среды на организм.

Рис. 3. Схематическое изображение системы, в которой между генотипом и фенотипом существуют только прямые взаимодействия

Рис. 4. Схематическое изображение системы в которой между генотипом и фенотипом существуют комплексные взаимодействия на белковом уровне. Х –гипотетическое лекарственное средство; стрелки справа означают регуляторное воздействие лекарственного средства на фенотип (стрелка вверх – усиление экспрессии, стрелка вниз – подавление экспрессии специфические белки).

Известно, что только 2% болезней человека вызваны действием одного гена. Оставшиеся 98% заболеваний являются поли — или эпигенными по своей природе. Из этого утверждения следует то, что ни один ген не может действовать в одиночку. Он действует только в связи с другими генами а также с окружением. Гены могут экспрессироваться по-разному в разных организмах, а также ингибировать друг друга (явление, называемое эпистаз). Таким образом, для большинства полигенных заболеваний невозможно предсказать фенотип, исходя только из данных расшифровки генома.

Клетка реагирует на изменения внешней среды изменением ее белкового состава. В ответ на внешнее воздействие синтез одних белков увеличивается, других – уменьшается. Таким образом, фенотип не линейно зависит от проявлений генотипа, так как системы эпигенеза контролируют и модифицируют экспрессию генов. Практически все элементы эпигенетической системы – белки.

Молекулярный фенотип живой клетки невероятно лабилен. Многие белки имеют своей основной функцией перенос информации. Не существует фиксированного синтеза того или другого белка, поэтому концентрация белков в клетке изменяется. При обработке клетки гормонами, токсинами или лекарствами, количественные изменения наблюдаются не в одном, а в целом ряде белков. Существует два типа регуляции: up — и down-. Клетки – реактивные системы, в которых информация передается не только от генов к белкам, но и противоположном направлении (рис. 5).

Рис.5. Схема взаимодействия генома с окружающей средой.

Элиминация единичного белка в организме (например, в Knock-out мыши) приводит к изменению всего молекулярного фенотипа целого организма. Более того, любое лекарство, которое воздействует на белок, например, на ионный канал, опосредованно влияет на белковый состав всего организма.

Степень гликозилирования определяет биофизические свойства и биологическую активность молекулы белка. Гликозилирование – это посттрансляционная модификация, поэтому оно является основой гетерогенности белковой популяции. Попытки охарактеризовать гетерогенную популяцию гликозилированных белков предпринимались с использованием капиллярного электрофореза в тандеме с масс-спектрометрией.

В клинической биохимии анализ индивидуальных белков человека используется для установления вида патологического процесса (дистрофии, опухолевый рост, воспаление) и определения пораженного органа (инфаркт миокарда);

— установления природы патологии, например, при диагностике энзимопатий, инфекционных (гепатит) и других заболеваний;

— оценки течения различных физиологических процессов (беременность, развитие иммунной системы) и обнаружения осложнений в их течении (патология беременности).

В области разработки лекарств основной проблемой, как правило, является увеличение или уменьшение активности белков, поэтому необходим некоторый метод, позволяющий регулировать специфическую активность. 2Д электрофорез является основным средством изучения воздействия лекарств на протеом, или на совокупность всех белков органа. Как правило новые лекарства тестируются с помощью 2Д электрофореза, на накопление их в критических органах, например, в печени.

Пример 1. Лекарство ловастатин, понижающее уровень холестерола в крови. Специфика его действия заключается в ингибировании HMG-кофермент А редуктазы. Однако, при анализе эффекта, которое оказывает это лекарство в комбинации с другими средствами, понижающими холестерол, было найдено, что количество белка HMG-Кофермент-A синтазы значительно повышается, в то время как количество других белков уменьшаются. Позднее обнаружили, что основное действие изучаемого лекарства заключается не в прямом ингибировании синтеза холестерола, а в повышении активности другого белка, липопротеинового рецептора, который удаляет из крови холестерин.

Пример 2. Превентивное лекарство против рака олтипраз повышает экспрессию ряда белков, включая афлатоксин В1 альдегидредуктазу, который разрушает один из натуральных канцерогенов. Предполагалось, что эффект имеет место в эндоплазматическом ретикулуме. При анализе 2Д геля, однако, выяснилось, что большинство изменений происходит в растворимой и митохондриальной фракциях клетки. Кроме этого, при сравнении экстрактов печени самок и самцов, экспрессия более трети белков отличалась в количестве. Следует заметить, что почти все эти различия регулируются на гормональном эпигенетическом уровне и не обусловлены наличием Х или У хромосомы.

Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия генов в тканях очень пластична, отвечает на воздействия большого числа факторов и почти всегда включает не один или два, а много генов. 2Д электрофорез идеально подходит для изучения подобных динамических изменений.

Как правило, результаты 2Д коррелируют с известными механизмами функционирования белков. Так, если лекарство усиливает пролиферацию в пероксисомах по данным электронной микроскопии, то и на 2Д электрофорезе будет наблюдаться увеличение количества белков, характерных для этого типа органелл. Подобные структурно-функциональные взаимодействия означают, что идентификация белков-мишеней для нового лекарственного средства может помочь открыть механизмы функционирования этих белков.

Еще одна важная функция 2Д методов в клинической протеомике это поиск новых белков-маркеров заболеваний, в частности, онко-маркеров. Отмеченные в таблице 1 потенциальные маркеры рака простаты представляют особый интерес по разным причинам. Например, тимозин бета-15 может определяться в моче и, по-видимому, имеет прямое отношение к молекулярным механизмам злокачественного перерождения клеток. Соответственно, ген тимозина бета-15 и его продукты могут стать не только диагностическими маркерами, но и в перспективе мишенями для различных воздействий с целью подавления опухолевого роста.

Значимость для диагностики рака простаты (РП)

Секреторный белок, андроген-индуцируемый, обнаружен в РП, гиперэксперессия в 89% случаев РП. Обнаруживается при других опухолях

2. Простат-специфический мембранный антиген

Маркер с прогностической значимостью. Высокий уровень коррелирует со злокачественностью и метастазированием, но определяется и при аденоме

По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью

«Мочевой» маркер, что перспективно при организации скрининга

Обнаруживается при других злокачественных опухолях.

По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью.

5. Рацемаза (alpha-methylacyl CoA racemase, AMACR)

По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью.

6. Антиген простатных стволовых клеток (Prostate stem cell antigen, PSCA)

Маркер клеточных поверхностей, показана гиперэкспрессия гена при РП до 80%; высок уровень экспрессии при метастазах РП

7. Высокомолекулярный цитокератин 34betaE12 (High-molecular-weight keratin 34betaE12)

По иммуногистохимии – маркер с прогностической значимостью.

Комплексное изучение «протеома» проводится методами и технологиями, направленными на одновременное разделение, а также последующую идентификацию и анализ всех белков, синтезирующихся в клетке или другом объекте (органе, организме).

1. Изоэлектрофокусированием (ИЭФ) называют разработанный в начале 60-х годов метод разделения белков под действием электрического поля в среде с градиентом pH, который создается специальными амфотерными веществами – «амфолитами», способными переносить ток (хорошая проводимость), а также создавать локально и поддерживать рН (хорошая буферная емкость). Появление наборов полиамино-поликарбоновых кислот (амфолинов) обеспечило высокую эффективность фракционирования белков с помощью ИЭФ, при этом разделение осуществлялось за счет различий в pI.

2. Среди множества электрофоретических методов разделения белков наибольшая эффективность оказалась у особой модификации метода Лэммли для вертикальных пластин с градиентом концентрации полиакриламидного геля, использующего ионный детергент – додецилсульфат Na (SDS). За счет гидрофобных взаимодействий, используемый детергент практически одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1.4 мг SDS на 1 мг белка. Огромный избыток полностью диссоциированных остатков сульфокислоты делает несущественной роль заряда самого белка. Электрофоретическая подвижность комплекса белок-SDS в градиентном геле оказывается линейно связана с десятичным логарифмом его молекулярной массы (Mm). Таким образом, эта система обеспечивает разделение белков по различиям в Mm.

3. Идентификация миросеквенированием основана на определении (расшифровке) части аминокислотной последовательности белка. Разработанные методы микросеквенирования позволяют работать с очень малыми количествами пептидов — вплоть до нанограммовых. Это важно, так как определение даже короткого фрагмента аминокислотной последовательности часто оказывается решающим для идентификации целого белка. В настоящее время возможно как проведение прямого N-концевого секвенирования белка, перенесенного на инертную мемебрану, так и секвенирование отдельных пепетидов, полученных из изучаемого белка после его ферментативного расщепления высокоэффективной жидкостной хроматографией. Микросеквенирование позволяет выявлять одиночные аминокислотные замены в анализируеемых белках.

4. Масс-спектрометрия устанавливает какие атомы входят в состав молекулы, какова структура их расположения и изотопный состав, а также какова масса молекулы. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрия измеряет соотношение массы частицы к заряду. Для этого используются законы движения заряженных частиц материи в магнитном или электрическом поле. Различают несколько модификаций масс-спектрометрических методов:

· Мягкая матриксная ионизация (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization — MALDI) позволяет анализировать такие биополимеры, как полисахара, пептиды и макромолекулы, без риска повредить их структуру. Ионизация производится лазерным пучком, а матрикс используется для защиты молекул от разрушающего действия лазера. Матрикс состоит обычно из кристаллов кислот в смеси с органическим растворителем.

· Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) проводится на приборе, который объединяет несколько анализаторов, позволяющих последовательно изолировать один пептид, стабилизировать ионы, составляющие его и идентифицировать фрагменты. Используется в идентификации белковых пятен после 2Д электрофореза.

5. Капиллярный электрофорез — это метод анализа сложных смесей, использующий электрокинетические явления – электромиграцию ионов и других заряженных частиц и электроосмос – для разделения и определения компонентов. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты. Модификацией метода является капиллярный электрофорез в чипах. Идентификация белков с помощью масс-спектрометрии может проводиться непосредственно после разделения.

6. Недавно был аннонсирован метод капиллярного изоэлектрофокусирования. После изофокусирования в канале чипа, покрытого специальной пленкой, чип замораживался, пленка удалялась и содержимое канала подвергалось высушиванию при критической точке для предотвращения изменения позиции белковых пятен. После этого матрикс для MALDI добавлялся непосредственно к содержимому чипа. В результате одновременно удавалось считывать информацию о молекулярном весе и изоэлектрической точке данного пептида.

При исследовании белков методом 2Д электрофореза, целью исследования является:

· обеспечить воспроизводимое разделение основных известных белков, характерных для данной ткани;

· показать присутствие известных минорных белков;

· выявить и идентифицировать маркерные белки, характеризующих известные изменения в данной ткани.

Для достижения цели решают следующие задачи:

1) Все белки, содержащиеся в изучаемом образце, подвергаются солюбилизации и становятся объектами анализа;

2) Проводится аналитическое фракционирование по двум независимым друг от друга физико-химическим свойствам полипептидных цепей, отражающих особенности их первичной структуры — комбинированное использование – двумерный гель-электрофорез (2D):

· Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), обеспечивает фракционирование по pI.

· Электрофорез в присутствии SDS (SDS-ЭФ) обеспечивает разделение по Mm.

3) Выявление белковых фракций после разделения с помощью высокочувствительных методов детекции белков (различные модификации масс-спектрометрии).

4) Стандартизированное описание белков на двумерных электрофореграммах в системе прямоугольных координат, в которых одна из координат являться функцией молекулярной массы, а другая – изоэлектрической точкой для каждого вида полипептидных цепей.

Идентификация по базам данных