Уже указывалось, что для предотвращения агрегации белков
в рабочий буфер геля нередко вводят мочевину в концентрации
от 2 до 8 М. Ее, разумеется, добавляют и в исходный белковый
препарат. В электродные буферы вносить мочевину не нужно,
так как, не будучи заряженной, она не мигрирует в геле, а сле-
довательно, и не нуждается в пополнении. На электропроводно-
сти буфера присутствие мочевины практически не сказывается.
Однако под влиянием нового окружения могут изменяться рК
отдельных групп и суммарный заряд белка. Это может заметно
повлиять на конфигурацию, а следовательно, и на подвижность
белков.
В концентрированных растворах мочевины происходит дена-
турация белков, часть дисульфидных мостиков рвется и полипеп-
тидная цепочка, утратив вторичную структуру, ведет себя как
хаотический клубок. Денатурация не является полной и может
быть обращена. Степень и обратимость денатурации зависят от
природы белка и концентрации мочевины, поэтому при выборе
этой концентрации иногда приходится искать компромисс меж-
ду опасностью агрегации белков и угрозой их необратимой де-
натурации. Об очистке мочевины было сказано выше; добавим
только, что образование цианата в растворах мочевины идет ус-
коренно при щелочных рН, поэтому щелочные буферы с добав-
кой мочевины следует использовать сразу после их приготовле-
ния.
Для составления геля пользуются обычно «маточными» рас-
творами повышенной концентрации. Удобно, например, приго-
товить 40%-ный водный раствор смеси мономеров (T = 40). Ha-
помним, что Т выражает процентное отношение массы обоих мо-
номеров к конечному объему их раствора, а С — отношение мас-
сы NN / -мeтилeнбиcaкpилaмидa к сумме масс двух мономеров.
Отсюда следует, что С не изменяется при разбавлении маточ-
ного раствора. Так, если предполагается иметь для рабочего
геля параметры Т = 10 и С = 2,6, то при составлении маточного
раствора можно взять T = 40 и С = 2,6. Практически это означа-
ет, что надо отвесить (40 ´ 2,6)/100 = 1,04 г метиленбисакрилами-
да и 40 — 1,04 = 38,96 г акриламида и растворить их в воде до ко-
нечного объема 100 мл. Маточный раствор буфера может иметь
двух- или пятикратную концентрацию. В последнем случае по-
лезно проверить, что рН буфера сохраняется при соответствую-
щем разбавлении. Смесь расчетных объемов маточных раство-
ров мономеров и буфера доводят до нужного объема водой.
Персульфат аммония лучше добавлять в минимальном объ-
еме, который можно не учитывать. Для этого готовят концент-
рированный, обычно 10%-ный, маточный раствор персульфата,
остатки которого вскоре приходится выбрасывать, так как он
не хранится. Объемом вносимого в смесь ТЕМЕД также всегда
можно пренебрегать. Выбор содержания персульфата аммония
и ТЕМЕД, порядок их внесения в раствор мономеров, необхо-
димость деаэрации и контроль за процессом полимеризации геля
были подробно рассмотрены в главе 1,
Для приготовления геля с высоким содержанием мочевины ее
добавляют во все маточные растворы. При растворении моно-
меров до Т = 40 концентрацию мочевины приходится ограничи-
вать значением 2 — 3 М. Зато маточный раствор буфера можно
приготовить на 10 М мочевине и такой же концентрации раствор
ее использовать для доведения до расчетного объема вместо
воды.
Особо гидрофобные белки, например тяжелые цепи миозина,
при концентрировании их в полосах агрегируют даже в присут-
ствии 8 М мочевины. Во избежание этого их можно обработать
фенолом, который играет роль мягкого детергента. Белок сна-
чала растворяют в буфере до безопасной концентрации, а потом
переводят в смесь, состоящую из 50% фенола, 25% уксусной
кислоты, мочевины до концентрации 2 М и воды. Электрофорез
проводят в ПААГ, полимеризованном в 35%-ной уксусной кис-
лоте с 5 М мочевины [d’Abbis et al., 1979].
В некоторых случаях бывает необходимо при электрофорезе
сохранить ферментативную активность белка — либо для по-
следующей его элюции и использования, либо для обнаружения
с помощью биологического теста, т. е. по превращению субстра-
та ферментативной реакции (см. ниже). Использование в этом
случае концентрированного раствора мочевины является неже-
лательным, и уменьшать опасность агрегации приходится за счет
снижения загрузки геля. Чувствительность биологических тестов
зачастую позволяет это сделать. Необходимо точно проверить
устойчивость фермента при выбранной величине рН рабочего
буфера. При этом следует иметь в виду, что истинная величина
рН в геле примерно на 0,5 ед. больше, чем у используемого ще-
лочного буфера, и на 0,5 меньше, чем у кислого [Shuster, 1971].
Иногда следует проверить сохранность ферментативной ак-
тивности белка в ходе электрофореза в связи с возможностью
разобщения фермента с другими белками или необходимыми
для его работы кофакторами. Такую проверку можно проводить
следующим образом: на разных стадиях электрофореза выре-
зать и гомогенизировать участки геля, содержащие соответству-
ющую белковую полосу, и прямо в гомогенате, в сопоставимых
условиях, проверять сохранение активности фермента, исполь-
зуя возможность диффузии субстрата реакции в гель, а ее про-
дукта — из геля.
Загрузка геля и подготовка препарата
Исходный белковый препарат растворяют в том же рабочем
буфере, но меньшей концентрации (в 5 — 10 раз). По рассмот-
ренным выше причинам это приводит к значительному сужению
исходной зоны белков при ее вступлении в гель. Если электро-
форез идет в присутствии мочевины, то ее концентрация в раз-
бавленном буфере должна быть такой же, как в рабочем буфе-
ре геля. Еще раз подчеркнем необходимость удаления солей из
препарата; в противном случае эффект концентрирования белка
при вступлении в гель будет смазан. Недавно был предложен
простой и остроумный способ диализа белкового раствора в кап-
ле на плавающем мембранном фильтре [Marusyk, Sergeant,
1980].
Иногда проводят предварительное полное восстановление
белка путем прединкубации его в течение ночи при комнатной
температуре в буфере с рН 8,5 — 9, содержащем 0,1 М (b-меркап-
тоэтанола и 9 М мочевины (щелочное значение рН буфера спо-
собствует восстановительному эффекту b-меркаптоэтанола).
В раствор препарата добавляют до 10% глицерина или саха-
розы, чтобы облегчить его подслаивание под электродный буфер
(см. выше). Наконец, в препарат вносят еще и краситель, на-
пример бромфеноловый синий до концентрации 0,01%. Мигра-
ция этой «лидирующей» зоны до конца геля определяет момент
окончания электрофореза. Заметим кстати, что при последую-
щей фиксации белков бромфеноловый синий обесцвечивается.
Если далее предполагается определение величины Rf, то поло-
жение окрашенной полоски сразу после извлечения геля из фор-
мы следует отметить (например, вколоть в гель тонкую прово-
лочку) .
Как уже подчеркивалось, препарат должен быть заведомо
свободен от пыли, нерастворенных белков и других частиц. Пос-
ле внесения препарата в трубку или карман пластины на 5 —
15 мин включают напряжение, пониженное примерно вдвое про-
тив расчетного. За это время лидирующий краситель должен
полностью войти в гель. Такая процедура улучшает условия
формирования исходной белковой полосы в геле. Затем перехо-
дят на расчетный режим электрофореза по напряжению и силе
тока.
Вопросы фиксации, окраски и других методов обработки бел-
ков после электрореза,как и способы определения радиоактив-
ности и элюции белков, рассмотрены отдельно ниже.
Дата добавления: 2015-10-21 ; просмотров: 729 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
источник
Содержимое (Table of Contents)
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Электрофорез ОФС.1.2.1.0023.15
в полиакриламидном геле Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также в зависимости от конфигурации молекул. Изменяя концентрацию полимера, можно получать гели с широким диапазоном размеров пор, позволяющих проводить разделение белков и пептидов с молекулярными массами от 2 до 300 тыс. кДа. Можно также изменять электрический заряд макромолекул (путем вариации рН буферного раствора) и их конформацию за счет введения в буферный раствор денатурирующих агентов или детергентов.
Протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима с целью исключения изменений вязкости, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов.
Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними, причем скорость миграции наиболее подвижных макромолекул пробы должна быть несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда фронт красителя достигает противоположной границы геля, электрофорез прекращают.
Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и выдерживают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты фиксируются в том самом месте, где закончилась их миграция. После фиксации или одновременно с ней проводят окрашивание зон путем выдерживания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.
Вместо окрашивания или наряду с ним могут использоваться радиоактивные метки и приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.
Гель полиакриламида имеет ряд преимуществ, определяющих его широкое использование. Он прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей, и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос.
Разделяющие свойства полиакриламидных гелей (ПААГ) определяются трехмерной сетью волокон и пор, которая сформирована за счет бифункциональных бисакриламидных связей между смежными полиакриламидными цепями. Полимеризация катализируется системой, производящей свободные радикалы, составленной из аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина.
С увеличением концентрации акриламида в геле эффективный размер пор уменьшается. Эффективный размер пор геля определяет его разделяющие свойства, то есть сопротивление геля к перемещению макромолекул. Существуют пределы концентраций акриламида, которые могут использоваться. При высоких концентрациях акриламида гели становятся более ломкими и трудны в обращении. С уменьшением размера пор геля уменьшается скорость перемещения белка через гель. Регулируя размер пор геля путем изменения концентрации акриламида, можно оптимизировать разрешающую способность метода для конкретного анализируемого образца. Таким образом, физическое состояние ПААГ характеризуется по составу акриламида и бисакриламида. Обычно используются гели, в которых общая концентрация мономера и сшивающего агента находится в диапазоне от 3 до 30 %, а количество сшивающего агента обычно составляет от одной десятой до одной двадцатой от количества мономера. При этом содержание сшивающего агента тем меньше, чем выше общая концентрация геля.
Электрофорез в полиакриламидных гелях с использованием натрия додецилсульфата (SDS) – наиболее распространенный способ электрофореза, используемый для оценки подлинности и чистоты белковых продуктов. Денатурированные под воздействием высокой температуры полипептиды, связываясь с анионным детергентом SDS, становятся отрицательно заряженными и приобретают конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы независимо от типа белка. Поскольку количество связанного SDS почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от последовательности аминокислот в полипептиде, SDS-полипептидные комплексы мигрируют через полиакриламидные гели с подвижностью, прямо пропорциональной молекулярной массе полипептида.
Молекулярная масса белка может быть оценена по его относительной подвижности на прокалиброванном геле, и обнаружение отдельной полосы в таком геле является критерием чистоты.
Однако, наличие у полипептида радикалов типа N- или O-связанных гликозидов оказывает существенное влияние на оценку молекулярной массы белка, поскольку SDS не связывается с углеводной частью молекулы так же, как с полипептидной. Таким образом, пропорциональность отношения «заряд к массе» не выдерживается и электрофоретическая подвижность белков, подвергшихся посттрансляционным модификациям, не является истинным отражением молекулярной массы полипептидной цепи.
Трехмерная структура белков часто поддерживается за счет дисульфидных связей. Цель анализа SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить эту структуру путем расщепления дисульфидных связей. Денатурация и дезагрегация белков заключается в обработке их 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (DTT), в результате которой происходит разрыв S-S связей, разворачивание полипептидной цепи и последующее связывание с SDS. В этих условиях молекулярная масса полипептидных субъединиц может быть рассчитана методом линейной регрессии при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.
Без обработки восстанавливающими агентами типа 2-меркаптоэтанола или DTT дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Невосстановленные белки не могут полностью насыщаться SDS и, следовательно, не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Это делает определение молекулярных масс этих молекул методом SDS-ПААГ менее стандартизованным, чем исследование полностью денатурированных полипептидов. Однако, выявление одной полосы в таком геле (т.е. отсутствие любых компонентов, отличных от основного компонента) является показателем чистоты белка.
Электрофорез белков в полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом (SDS-PAGE), как правило, проводится в неоднородной буферной системе, которая описывается ниже.
Электрофорез в геле с неоднородной буферной системой (диск—электрофорез)
Метод диск-электрофореза, благодаря своей высокой разрешающей способности, рекомендуется для характеристики смесей белков и для обнаружения примесей, которые могут иметь подвижность, близкую к подвижности главного компонента.
Метод подразумевает использование прерывистой системы, состоящей из двух отличных гелей: разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего) геля. Эти два геля имеют различную пористость (верхний – крупнопористый, нижний – мелкопористый). Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. Пористость, длина и тип буфера для нижнего геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза.
Отличительной особенностью данного вида электрофореза является обязательное использование в составе электродного буферного раствора подвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки; например, применение иона Cl — для щелочных буферных растворов или иона K + – для кислых. В этом буферном растворе подвижность иона, мигрирующего в том же направлении, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для этого удобно использовать цвиттерионы: например, простые аминокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки лежат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97).
Под действием электрического поля ионы глицина, входящие в состав электродного буферного раствора, следуют за белками в концентрирующий гель. Область перемещающихся границ быстро формируется под действием высоко подвижных хлорид-ионов во фронте и относительно медленных замыкающих ионов глицина. Хлорид-ион из-за его небольшого размера мигрирует быстрее, чем любой из белков, присутствующих в образце. Величина рH образца и концентрирующих слоев выбирается так, чтобы быть приблизительно на 3 единицы ниже, чем верхнее значение pKa глицина. Поэтому, на пересечении этих слоев только около 0,1% глициновых молекул имеют отрицательный заряд. Таким образом, быстродвижущиеся хлорид-ионы постепенно замещаются ионами глицина, которые при рН 6,8 в концентрирующем геле нейтрализуются и перестают участвовать в проведении тока. Сопротивление верхней части концентрирующего геля резко возрастает, а вместе с ним возрастает и напряженность поля. Локализованные зоны высоковольтового градиента между передним и задним ионными фронтами вызывают относительно высокую скорость миграции белков в концентрирующем геле, которая не ограничивается благодаря крупнопористой структуре этого геля.
На границе концентрирующего и разделяющего гелей белки достигают высокоплотных слоев геля и замедляются из-за уменьшающегося размера пор разделяющего геля. Более высокое значение pH, с которым фронт электродного буферного раствора встречается в разделяющем геле, также заставляет глицинат мигрировать быстрее, и напряженность поля падает, что также снижает скорость движения белков. Таким образом, происходит концентрирование пробы и все компоненты образца, независимо от первоначальной высоты столбика пробы в лунке, входят в нижний гель практически одновременно в виде узкой зоны с высокой концентрацией белка.
В мелкопористом разделяющем геле начинается процесс медленной миграции белков и их фракционирования в зависимости от молекулярных масс, а то обстоятельство, что процесс разделения начинается с узкой исходной зоны, обеспечивает высокую разрешающую способность системы вцелом.
Прибор для электрофореза состоит из:
1) источника постоянного тока с регулируемым напряжением и со стабилизатором напряжения;
2) камеры для электрофореза, служащей для размещения пластинки или трубки геля и поддержания постоянных условий проведения анализа. Камера обычно имеет прямоугольную форму, изготовлена из стекла или твердой пластмассы с двумя изолированными буферными резервуарами (анодным и катодным), содержащими раствор электролита. В каждый резервуар погружен электрод (например, платиновый), подключенный к соответствующему полюсу источника тока. Должен поддерживаться одинаковый уровень электролитов в резервуарах, чтобы предотвратить поток жидкости и гидростатическое давление на гель. Камера для электрофореза оснащена крышкой, которая предотвращает испарение растворителей и обеспечивает равномерно насыщенную влагой атмосферу во время всего процесса. Предпочтительно использование предохранителя для отключения электропитания, когда крышка камеры снята. Если мощность тока, приложенного к электрофоретической пластинке, превышает 10 Вт, то рекомендуется применять охлаждение камеры.
3) устройства для заливки геля, представляющего собой стеклянную трубку, стеклянную пластину или пару прямоугольных пластин (ячейку), служащих для формирования поддерживающей среды, в которой непосредственно проводится процесс электрофоретического разделения. Пластины могут быть расположены в камере вертикально или горизонтально (вариант горизонтального электрофореза обычно применяется для агарозных гелей) и должны быть погружены или иметь контакт посредством фитилей с катодным и анодным изолированными буферными резервуарами, содержащими раствор электролита. Преимуществом пластин для проведения процесса является возможность сравнения образцов в одной общей ячейке геля, что более информативно по сравнению с набором гелей из ряда трубок. Преимущество горизонтальных пластин по сравнению с вертикальными заключается в отсутствии проблемы герметизации швов, а недостаток – в большой поверхности контакта с воздухом и, соответственно, риске испарения жидкости.
Сборку прибора и его очистку после использования проводят в соответствии с инструкцией производителя.
Перед заливкой геля основание и боковые стороны ячейки закрывают подходящими прокладками, толщина которых определяет толщину рабочего геля (при этом после полимеризации геля прокладку в основании убирают). Ячейку заполняют раствором мономера с поперечно-сшивающим агентом и катализатором. Растворы должны быть дегазированы перед полимеризацией и гели должны использоваться свежеприготовленными. Заливку растворов проводят таким образом, чтобы исключить попадание внутрь ячейки пузырьков воздуха.
Гребенку, имеющую зубцы соответствующего размера (в зависимости от объемов наносимого образца), устанавливают в верхнюю часть ячейки на разделяющий гель и оставляют там до окончания полимеризации геля. Формирование геля обычно занимает не менее 30 мин и может считаться законченным, когда между гелем и водным слоем появляется четкая граница. После удаления гребенки из геля, прошедшего полимеризацию, остается ряд лунок.
Заполняют нижний и верхний резервуары камеры предписанным электродным буферным раствором. Готовят испытуемый и стандартный растворы, содержащие краситель и сахарозу или другой плотный и вязкий растворитель. Наносят образцы шприцем или микропипеткой в основания лунок, сразу включают электрический ток и начинают электрофорез, соблюдая предписанные условия (температуру и величину напряжения).
После окончания процесса (когда краситель достигает нижней границы пластины) ток выключают, пластину удаляют из камеры, зоны фиксируют, окрашивают и при необходимости пластину высушивают.
Подготовка полиакриламидного геля для вертикального электрофореза с SDS в неоднородной буферной системе
Сначала готовят и заливают в подготовленную ячейку нижний разделяющий гель, а затем сверху наслаивают концентрирующий гель.
В конической колбе готовят рассчитанное в зависимости от объема ячейки количество раствора для разделяющего геля, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в Таблице 1. Смешивают компоненты в указанном порядке. В тех случаях, где требуется, перед добавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (TEMED) раствор фильтруют, и, если необходимо, дегазируют раствор через мембрану из ацетата целлюлозы (с диаметром пор
0,45 мкм) под вакуумом при перемешивании. Добавляют соответствующие количества раствора аммония персульфата и TEMED как указано в табл. 1, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки. Оставляют достаточное место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя суженную стеклянную пипетку, тщательно наслаивают на гель сверху воду или изобутанол. Оставляют гель в вертикальном положении при комнатной температуре до завершения полимеризации.
После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.
В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл.2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 5 мл | 10 мл | 15 мл | 20 мл | 25 мл | 30 мл | 40 мл | 50 мл | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 4% акриламида | ||||||||
| Вода очищенная | 2,6 | 5,3 | 7,9 | 10,6 | 13,2 | 15,9 | 21,2 | 26,6 |
| Раствор акриламида 1) | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 | 6,0 | 8,0 | 10,0 |
| 1,5М Трис | ||||||||
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
(рН 8,8) 2)
| Компоненты раствора | Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема | |||||||
| 1 мл | 2 мл | 3 мл | 4 мл | 5 мл | 6 мл | 8 мл | 10 мл | |
| Вода очищенная | 0,68 | 1,4 | 2,1 | 2,7 | 3,4 | 4,1 | 5,5 | 6,8 |
| Раствор акриламида 1) | 0,17 | 0,33 | 0,5 | 0,67 | 0,83 | 1,0 | 1,3 | 1,7 |
| 1,0М Трис | ||||||||
(рН 6,8) 6)
1) Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1)
2) 1,5М Трис (рН 8,8): 1,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 8,8
3) 100 г/л SDS: раствор натрия додецилсульфата 100 г/л
4) 100 г/л APS: раствор аммония персульфата 100 г/л. Аммония персульфат является источником свободных радикалов, которые управляют полимеризацией акриламида и бисакриламида. Таким образом, раствор аммония персульфата должен добавляться медленно.
5) TEMED: тетраметилэтилендиамин.
6) 1,0М Трис (рН 6,8): 1 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 6,8
Гель со вставленной гребенкой оставляют в вертикальном положении при комнатной температуре до окончания полимеризации.
Если в фармакопейной статье нет других указаний, то определение молекулярных масс проводят при нагрузке на лунку 10 мкг общего белка, а определение чистоты – при нагрузке 40 мкг при окрашивании Кумасси бриллиантовым R250, а при окрашивании нитратом серебра достаточно 2–5 мкг белка на лунку.
Толщина гребенки выбирается точно в соответствии с толщиной используемых прокладок, а размер зубцов – в соответствии с предполагаемым объемом образцов. Необходимый и достаточный объем формируемой лунки определяется как произведение длины, ширины и высоты (в микрометрах) одного зубца гребенки: V = L ∙ D ∙ H.
Объем наносимого образца вычисляют следующим образом:
где: k – коэффициент разбавления пробы буферным раствором для образца;
Х – требуемое для нанесения на гель количество белка в зависимости от целей анализа, в мкг;
С – концентрация общего белка, определяемая по методу Лоури, в мкг/мл.
После окончания полимеризации аккуратно удаляют гребенку, немедленно ополаскивают лунку водой, чтобы удалить любые остатки неполимеризованного акриламида. Если необходимо, выправляют зубцы концентрирующего геля при помощи тупой подкожной иглы, насаженной на шприц.
Устанавливают гель в прибор для электрофореза согласно инструкциям изготовителя оборудования. Добавляют электродный буферный раствор в верхнюю и нижнюю буферные емкости. Обычно, если нет других указаний в фармакопейной статье, в качестве электродного буферного раствора используется трис-глициновый буферный раствор с рН 8,3-8,4.
Удаляют любые пузыри, которые могут появиться у основания геля между стеклянными пластинами. Не следует включать электрический ток до внесения образцов, так как это уничтожит неоднородность буферных систем.
Готовят испытуемый раствор и раствор сравнения в рекомендованном буферном растворе для образцов в соотношении, указанном в фармакопейной статье или нормативной документации.
Обычно для обеспечения полной денатурации образец в смеси с буферным раствором подвергают дополнительно температурной обработке, режим которой должен быть указан в фармакопейной статье или нормативной документации.
Наносят соответствующие объемы каждого из растворов в лунки концентрирующего геля. Начинают электрофорез, используя условия, рекомендуемые изготовителем оборудования.
Изготовители оборудования для SDS-ПААГ могут обеспечивать применение гелей различной площади и толщины. Соответственно продолжительность электрофореза и сила тока (или напряжение) могут быть изменены, как описано изготовителем прибора, чтобы достичь оптимального разделения, что проверяют по скорости перемещения фронта индикатора в разделяющем геле.
Когда индикатор достигает основания геля, электрофорез останавливают. Удаляют ячейку с гелем из прибора и отделяют стеклянные пластины. Удаляют прокладки, отрезают и удаляют концентрирующий гель и немедленно проводят процедуру окрашивания. Для того, чтобы можно было выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель рекомендуется обрезать не полностью, оставляя 2–3 мм.
Так называемые, «готовые к использованию» коммерческие гели и наборы реактивов к ним могут быть применены при условии, что они дают результаты, отвечающие валидационным критериям, приведенным ниже в разделе «Оценка пригодности системы».
Окрашивание Кумасси бриллиантовым R250 – наиболее распространенный метод окрашивания белков с пределом обнаружения порядка от 1 до 10 мкг белка в полосе. Окрашивание нитратом серебра – более чувствительный метод окрашивания белков в гелях, позволяющий выявлять до 1 нг белка.
Для селективного окрашивания гликозилированных белков или липопротеидов иногда применяют другие красители или их смеси, о чем должно быть сделано дополнительное указание в фармакопейной статье или нормативной документации.
Все процедуры окрашивания геля проводят, как правило, при комнатной температуре и при слабом перемешивании в любом удобном контейнере. При окрашивании геля следует использовать одноразовые перчатки, иначе на геле могут быть прокрашены отпечатки пальцев.
Погружают гель в большой избыток красящего раствора Кумасси раствора и выдерживают, по крайней мере, 1 ч. Поскольку кислотно-спиртовой состав окрашивающего раствора не позволяет полностью фиксировать белки на геле, это может приводить к потерям некоторых низкомолекулярных белков во время окрашивания и обесцвечивания тонких гелей. Полная фиксация возможна при выдерживании геля в 10 % растворе трихлоруксусной кислоты в течение 1 ч перед погружением в окрашивающий Кумасси раствор.
Для ускорения процедуры окрашивания допускается подогрев геля в окрашивающем растворе в микроволновой печи. Режим подогрева должен быть описан в фармакопейной статье или нормативной документации. Затем окрашивающий раствор удаляют и гель промывают водой.
Обесцвечивают гель избытком обесцвечивающего раствора. Заменяют порции обесцвечивающего раствора несколько раз до тех пор, пока окрашенные полосы белка не станут ясно различимы на прозрачном фоне. Чем более полно обесцвечен гель, тем меньшие количества белка могут быть обнаружены этим методом. Обесцвечивание может быть ускорено при добавлении в обесцвечивающий раствор нескольких граммов анионобменной смолы или маленького кусочка пористого материала.
После обесцвечивания гель промывают водой и либо высушивают, либо оставляют в воде для хранения при температуре от 2 до 8 °С.
Погружают гель в большой избыток фиксирующего раствора и выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий раствор сливают, добавляют новую порцию того же раствора и инкубируют, по крайней мере 1 ч или оставляют на ночь. Сливают фиксирующий раствор и промывают гель в большом избытке воды в течение 1 ч. После этого пропитывают гель в течение 15 мин в 1 % растворе глутарового альдегида. Промывают гель дважды по 15 мин большим количеством воды. Выдерживают гель в темноте в свежеприготовленном 2 % растворе серебра нитрата в течение 15 мин. Промывают гель три раза по 5 мин в большом количестве воды. Погружают гель приблизительно на 1 мин в проявляющий раствор, пока не будет достигнуто удовлетворительное окрашивание. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в треке с минимальным количеством препарата (например, 0,001 мкг). Останавливают развитие окраски погружением в стоп-раствор на 15 мин. Ополаскивают гель водой.
Целесообразно использовать готовые наборы реактивов для окрашивания гелей серебра нитратом.
В зависимости от используемого метода окрашивания подготовку геля к высушиванию проводят различными способами:
– при окраске Кумасси после процедуры обесцвечивания гель выдерживают в смеси 10,0 г глицерина и 92 мл воды очищенной не менее 2 ч (возможна инкубация «на ночь»);
– при окраске нитратом серебра гель после заключительной процедуры ополаскивания выдерживают в течение 5 мин в смеси 2,0 г глицерина и 98 мл воды очищенной.
Погружают два листа пористой целлюлозной пленки в воду и выдерживают в течение 5–10 мин. Растягивают один из листов на рамке для высушивания. Аккуратно помещают пропитанный в глицериновом растворе гель на натянутую целлюлозную пленку. Удаляют все случайно попавшие воздушные пузыри, и заливают вокруг граней геля несколько миллилитров воды. Помещают второй лист пленки сверху и снова удаляют все воздушные пузыри. Заканчивают сборку рамки для сушки геля и помещают ее в сушильный шкаф или оставляют при комнатной температуре до полного высыхания.
Молекулярные массы белков определяют по сравнению их подвижностей с подвижностью нескольких белков-маркеров известной молекулярной массы. Готовые смеси белков с точно известными молекулярными массами (маркеры) для калибрования гелей предлагаются производителями материалов и оборудования для электрофореза в различных диапазонах молекулярных масс. Концентрированные исходные растворы полипептидов известной молекулярной массы готовят в соответствующем буферном растворе для образцов и наносят на гель одновременно с образцом испытуемого белка.
Сразу после того, как электрофорез завершен, следует отметить положение полосы красителя бромфенолового синего, которая соответствует электрофоретическому ионному фронту. Это может быть сделано при помощи меток-надрезов в геле или путем прокола геля в зоне окрашенного фронта иглой, предварительно обмакнутой в черную тушь или другой подходящий контрастный краситель.
После окрашивания геля измеряют расстояния пробега для каждой полосы белка (маркеров и испытуемого образца) от вершины разделяющего геля. Вычисляют отношение расстояния пробега каждого белка к расстоянию пробега фронта красителя. Нормализованные расстояния пробега, вычисленные таким образом, называются относительными подвижностями белков (относительно фронта красителя) и обозначаются как Rf.
где: R – расстояние пробега белка;
RS – расстояние пробега красителя
Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс стандартов белка (Мr) от значения Rf. Неизвестные молекулярные массы могут быть оценены методом линейной регрессии или интерполяцией кривых зависимости logMr от Rf в том случае, если значения, полученные для испытуемых образцов, находятся в линейной части графика.
В тех случаях, когда в фармакопейной статье указан предел примесей, то перед анализом должен быть приготовлен раствор сравнения, соответствующий этому уровню примеси, путем разбавления испытуемого раствора. Например, в случае 5 % предела, раствор сравнения должен быть приготовлен разведением испытуемого раствора в соотношении 1:20. При этом примесь (полоса, отличная от главной полосы) на электрофореграмме с испытуемым препаратом не должны быть интенсивнее, чем полоса, полученная с раствором сравнения. При наличии нескольких полос примесей должно быть предусмотрено требованию к содержанию каждой из них и к содержанию суммы примесей.
Приемлемым условием определения примесей может считаться метод количественной нормализации с использованием денситометрического интегрирования. В этом случае предварительно должна быть показана линейность отклика прибора.
Результаты анализа считаются достоверными только в том случае, если:
- белки маркера молекулярных масс распределены приблизительно на 80 % длины геля и охватывают весь требуемый диапазон разделения (например, диапазон молекулярных масс продукта и его димера или продукта и родственных примесей);
- зависимость логарифма молекулярной массы белков-маркеров и Rf – линейна в необходимом диапазоне.
Дополнительные требования приемлемости результатов анализа должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
1) Приготовление 30% раствора акриламида/бисакриламида. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 29,2 г акриламида и 0,8 г N,N’-метиленбисакриламида, растворяют в воде очищенной при перемешивании, доводят объем раствора водой до 100 мл и вновь перемешивают (при необходимости раствор фильтруют, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации). Раствор хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
2) Приготовление раствора натрия додецилсульфата. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде очищенной при аккуратном перемешивании, избегая вспенивания, доводят объем раствора до 100 мл и вновь перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре.
3) Приготовление раствора аммония персульфата. Растворяют 100,0 мг аммония персульфата в 1,0 мл воды очищенной. Раствор используют свежеприготовленным.
4) Приготовление 1,5М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 8,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 90,8 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 8,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
5) Приготовление 1,0 М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 60,6 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 6,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
6) Приготовление электродного буферного раствора (10×) (рН 8,3). В мерный стакан, вместимостью 1000 мл помещают 30,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 144,0 г глицина и 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Фильтруют и измеряют рН раствора, который должен быть 8,3 — 8,4. Доводить рН раствора кислотой или щелочью до необходимого значения не допускается.
Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.
Непосредственно перед анализом 1 часть приготовленного раствора смешивают с 9 частями воды очищенной.
7) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанавливающих условиях с 2-меркаптоэтанолом. В химическом стакане смешивают 4,7 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,4 мл 2-меркаптоэтанола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 1 мес.
8) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в восстанвливающих условиях с дитиотреитолом. В химическом стакане тщательно перемешивают 5,0 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,06 г 1,4-дитиотреитола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор используют свежеприготовленным.
9) Приготовление буферного раствора для образцов (4×) для электрофореза в невосстанвливающих условиях. В химическом стакане тщательно смешивают 5,1 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4–6 °С не более 3 мес.
10) Приготовление красящего раствора Кумасси. Раствор готовят по одному из способов приготовления (№ 1 или № 2):
Раствор № 1. Растворяют 0,3 г Кумасси бриллиантового R250 в смеси 100 мл спирта метилового или этилового и 100 мл воды очищенной. Перемешивают до полного растворения (в течение 1 ч). Добавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 250 мл и перемешивают. Хранят окрашивающий раствор в темной бутыли при комнатной температуре. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.
Раствор № 2. 1,0 г Кумасси ярко-голубого R-250 помещают в химический стакан, доводят до объема 250,0 мл этиловым спиртом, перемешивают не менее 3,5 часов до полного растворения красителя, добавляют 100,0 мл кислоты ледяной уксусной и доводят объем деионизованной водой до 1000,0 мл. Раствор хранят при температуре 18-25 0 С в течение 2 мес.
11) Приготовление обесцвечивающего раствора. К 400 мл спирта метилового или этилового добавляют 100 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора до 1000 мл и перемешивают.
12) Приготовление фиксирующего раствора. К 250 мл спирта метилового или этилового добавляют 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.
13) Приготовление 1 % раствора глутарового альдегида. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 4 мл 25 % глутарового альдегида или 2 мл 50 % глутарового альдегида, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают.
14) Приготовление раствора серебра нитрата. Смешивают 2,75 мл 25 % раствора аммиака и 40 мл 1 М раствора натрия гидроксида, прибавляют по каплям при постоянном перемешивании 8 мл 20 % раствора серебра нитрата, доводят объем раствора водой очищенной до 200 мл и перемешивают.
15) Приготовление 20 % раствора серебра нитрата. Растворяют в воде очищенной 2,0 г (точная навеска) серебра нитрата, доводят объем раствора водой до 10 мл и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
16) Приготовление проявляющего раствора. Смешивают 2,5 мл 2,0 % раствора лимонной кислоты и 0,27 мл 37 % раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают.
17) Приготовление стоп-раствора. К 50 мл воды прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 100 мл и перемешивают.
В случае использования других реактивов и растворов они должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
источник
После окончания синтеза и удаления защитных групп олигонуклеотиды содержат ряд примесей:
- низкомолекулярные фрагменты защитных групп
- олигонуклеотиды с неполной цепью,
- олигонуклеотиды с деградированными фрагментами флуоресцентных красителей и тушителей флуоресценции
- продукты апуринизации и другие.
В зависимости от последующего применения олигонуклеотидов существуют оптимальные методы очистки, которые позволяют получить продукт достаточной чистоты с минимальными затратами. Причем нужно подчеркнуть, что чем лучше проведен синтез, тем меньше примесей, и, как следствие, проще очистка. Среди наиболее еще методов очистки олигонуклеотидов можно выделить:
- осаждение органическими растворителями
- гель-фильтрация (обессоливание)
- обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ, RP-HPLC), как упрощенный вариант — очистка на ОФ картриджах
- ионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография (ИО ВЭЖХ, IEX-HPLC)
- электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ, PAGE)
Ниже мы кратко опишем принципы методов и возможные варианты их использования. Более подробно с общими принципами этих методов можно ознакомиться в замечательной книге с иллюстрациями Л.А.Остермана [1].
Самым простым методом очистки является осаждение олигонуклеотидов спиртами (этанол, н-бутанол) или ацетоном из водных растворов. Это позволяет убрать некоторые соли, а также мочевину, продукты удаления защитных групп и другие примеси. Чаще всего используется осаждение ацетоном с перхлоратом лития или натрия. Осаждение этанолом позволяет проводить очистку от ацетатов, то есть использовать осаждение для очистки олигонуклеотидов после аммиачного деблокирования или после стадии очистки с помощью ВЭЖХ. Применение бутанола дает минимальные потери олигонуклеотида, однако неорганические соли при этом убрать нельзя.
Гель-фильтрация. Принцип метода заключается в том, что большие молекулы (олигонуклеотиды) свободно проходят сквозь гель, тогда как небольшие молекулы неорганических солей и остатков защитных группировок диффундируют внутрь пористого геля и, как следствие, дольше удерживаются. Таким образом, при нанесении раствора олигонуклеотида с солями на колонку первые фракции содержат раствор олигонуклеотида, а последующие — растворы низкомолекулярных соединений. Важно подчеркнуть, что при этом отделения полноразмерных олигонуклеотидов от укороченных не происходит. Очистку можно проводить вручную (колонки типа NAP-10, GE Healthcare), с использованием центрифугирования (колонки типа MicroSpin G-25, GE Healthcare) или ВЭЖХ (колонки типа HiTrap, GE Healthcare). В последнем случае возможна автоматизация процесса, что актуально при проведении синтеза в 96-луночных планшетах.
Обращено-фазовая ВЭЖХ основана на использовании гидрофобных сорбентов и водно-органических растворов, что позволяет разделять олигонуклеотиды в зависимости от их гидрофобности. Несмотря на то, то гетероциклические основания гидрофобны [2] и при определенных условиях возможно разделение олигонуклеотидов, отличающихся на одно звено вплоть до 60-меров [3], это возможно реализовать лишь в условиях анализа. При очистке, то есть при увеличении загрузки колонки, эффективность разделения падает, что делает невозможным использовать такой подход. Однако, 5’-DMT защитная группа весьма гидрофобна и может быть удалена после очистки водным раствором уксусной кислоты. Используя это свойство, удается эффективно отделять полноразмерные олигонуклеотиды от более коротких. Как правило, водный раствор олигонуклеотида наносят на колонку и далее вещество элюируют градиентом ацетонитрила или метанола. Обычно используют ацетатный буфер с рН 7, так как впоследствии олигонуклеотид можно отделить от избытка солей высаживанием этанолом, но для G-богатых олигонуклеотидов эффективность разделения вырастает при рН 11. Часто красители сами достаточно гидрофобны, что позволяет эффективно очищать такие олигонуклеотиды с использованием ОФ ВЭЖХ, несмотря на отсутствие DMT-группы [4]. Альтернативой в случае необходимости высокопроизводительной очистки праймеров являются ОФ картриджи [5], которые являются ОФ колонками, но с размером частиц сорбента гораздо большим, чем в случае ВЭЖХ. С одной стороны, это не позволяет эффективно разделять молекулы с близким временем удерживания, с другой для работы с ними не требуется высоких давлений. Кроме того, возможно совмещение процесса очистки и последующего удаления DMT-защиты, что резко уменьшает затраты времени при высокопроизводительном синтезе в 96-луночном формате. Для олигонуклеотидов, длиной до 40-50 оснований, чистота обычно составляет около 90-95%, что вполне достаточно для проведения рутинной ПЦР, в том числе и в реальном времени, а также для многих других приложений. Достоинством метода очистки на ОФ картриджах является его дешевизна, высокая скорость очистки, а также возможность автоматизации. К недостаткам следует отнести не очень высокую степень очистки и ограничения по типам олигонуклеотидов. Из-за отсутствия 5′-DMT-группы или повышенной гидрофобности конъюгированной молекулы на картриджах не могут быть очищены многие модифицированные олигонуклеотиды.
Ионообменная ВЭЖХ — разделение веществ в методе основано на отличии в их заряде. Разбавленный раствор олигонуклеотида с низкой ионной силой наносят на колонку и далее проводят разделение за счет увеличения концентрации солей [6,7]. Более длинные олигонуклеотиды лучше удерживаются на колонке, что позволяет отделить как укороченные олигонуклеотиды, так и продукты апуринизации и ветвления олигонуклеотидной цепи. Также на время удерживания олигонуклеотида влияют гидрофобные взаимодействия, поэтому наличие красителей и/или DMT-группы в составе олигонуклеотида также приводит к увеличению времени удерживания. Как правило, чтобы нивелировать этот эффект, в буфер добавляют 5-20% ацетонитрила. Следует отметить, что оптимально использовать соли, дающие высокую хаотропность, например, бромид или перхлорат натрия. Метод подходит для эффективного разделения олигонуклеотидов длиной до 40 оснований.
Ещё одним распространенным методом очистки олигонуклеотидов является денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), который позволяет разделить молекулы за счет различий в их массе и заряде. Короткие олигонуклеотиды, имеющие меньшую плотность заряда, движутся в геле быстрее, чем полномерные олигонуклеотиды и отделяются от целевого продукта. Метод хорошо подходит для длинных и модифицированных олигонуклеотидов, позволяет получать олигонуклеотиды очень высокой чистоты, но при этом теряется значительная часть вещества. Очистка методом гель-электрофореза не требует дорогостоящих реагентов и оборудования, позволяет параллельно очищать большое количество олигонуклеотидов, но процесс достаточно трудоемок, не может быть автоматизирован и с трудом масштабируется.
Несмотря на то, что специфичность и селективность определения ДНК или РНК мишени с помощью ПЦР в значительной степени определяется именно праймерами, в большинстве случаев требования к их качеству минимальны. Для проверки эффективности и специфичности амплификации достаточно просто осаждения праймера этанолом или ацетоном. В случае использования праймеров для работы с клиническими образцами, за редким исключением, достаточно очистки с использованием обращено-фазовых картриджей. Если такой подход дает низкий выход продукта или большое количество примесей (например, в случае G-богатых олигонуклеотидов), тогда предпочтительным является использование ОФ ВЭЖХ. Если для простых олигонуклеотидов, как правило, можно подобрать один оптимальный метод очистки, то для олигонуклеотидов имеющих сложные модификации требуется комбинация из нескольких методов. Так, в случае зондов для количественного ПЦР требуется двойная очистка с использованием двух разных методов – гель-электрофорез в ПААГ (или ионо-обменная ВЭЖХ) + ОФ ВЭЖХ. Для удаления избыточного количества солей после очистки обычно достаточно высаживания олигонуклеотида этанолом, однако в ряде случаев (например, после ПААГ) оптимально использовать гель-фильтрацию.
- Л.А.Остерман. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Пособие для студентов. М.: МЦНМО, 2002. 248c.
- M.Gilar. Analysis and purification of synthetic oligonucleotides by reversed-phase high-performance liquid chromatography with photodiode array and mass spectrometry detection. Anal. Biochem. 298 (2), 196-206 (2001).
- Z.Huang, S.Jayaseelan, J.Hebert, H.Seo, L.Niu. Single-nucleotide resolution of RNAs up to 59 nucleotides by high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 435 (1), 35-43 (2013).
- K.J.Fountain, M.Gilar, Y.Budman, J.C.Gebler. Purification of dye-labeled oligonucleotides by ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B 783 (1), 61-72 (2003).
- M.Gilar, E.S.P.Bouvier. Purification of crude DNA oligonucleotides by solid-phase extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A 890 (1), 167-177 (2000).
- J.Shanagar. Purification of a synthetic oligonucleotide by anion exchange chromatography: method optimisation and scale-up. J. Biochem. Biophys. Methods 64 (3), 216-225 (2005).
- B.Noll, S.Seiffert, F.Hertel, H.Debelak, P.Hadwiger, H.P.Vornlocher, I.Roehl. Purification of small interfering RNA using nondenaturing anion-exchange chromatography. Nucleic Acid Ther. 21 (6) 383-393 (2011).
Научная база, накопленный опыт и техническое оснащение, позволяют быстро оптимизировать наши технологии под индивидуальные решения в области олигосинтеза.
источник