Плазмидная днк на электрофорезе

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Для успешного применения плазмидных векторов в протоколах генной терапии необходима разработка методов получения гомогенных высокоочищенных препаратов рекомбинантной ДНК, не содержащих загрязняющих компонентов, в первую очередь хромосомной ДНК, бактериальных белков, РНК и эндотоксинов. В ходе проведенного исследования нами была проведена оптимизация способа очистки плазмидной суперскрученной ДНК с помощью трех хроматографических этапов из щелочного лизата бактериального штамма E. coli. Были подобраны оптимальные условия для этапа щелочного лизиса в целях увеличения выхода плазмиды и минимизации длительности очистки с помощью гель-фильтрации.

В настоящее время векторные системы созданные на основе плазмид и вирусов применяют в различных протоколах генной терапии ряда заболеваний человека. Методы генной терапии основаны на введение в клетки векторов с генами, кодирующими терапевтические гены [1] . В разрабатываемых схемах генной терапии, находящихся на разных стадиях клинических испытаний, на долю плазмидных векторов приходится 18% [2] . Векторы на основе плазмид считаются наиболее безопасными по сравнению с вирусными системами доставки, поскольку после их введения в клетки не возникает выраженного иммунного ответа, а также отсутствует интеграция в геномом хозяйской клетки, что нивелирует возможный инсерционный мутагенез. В тоже время вопрос эффективной доставки и экспрессии генетического материала в составе плазмидных конструкций остается открытым. Вследствие этого для успешного лечения заболеваний необходимо введение большого количества препарата плазмидной ДНК или использование специфических систем их доставки [3-4] .

Стандартный метод получения плазмид из бактериальных клеток включает несколько ключевых этапов: наработка биомассы рекомбинантного бактериального штамма, лизис клеток, очистку плазмиды от геномной ДНК, РНК, белков и эндотоксинов клеток продуцента [5] . В большинстве современных методов очистки плазмидной ДНК для разрушения клеточной стенки применяется щелочной лизис, который требует тщательного контроля, поскольку превышение времени контакта щелочи со суперскрученной плазмидной ДНК приводит к ее денатурации. Для дальнейшей очистки ДНК из щелочного лизата в основном применяют хроматографические методы – гель-фильтрацию, адсорбционную, ионно-обменную, аффинную, обращенно-фазную и хроматографию гидрофобных взаимодействий. Ряд хроматографических методов имеет существенные недостатки. Например, применение в качестве сорбента гидроксилапатита ограничено тем, что он легко накапливает необратимо адсорбирующие вещества и может применяться лишь после удаления большей части балластного материала [6] . Некоторые из методов, например, аффинная хроматография [7] , не дают возможность увеличить масштабы производства изза высокой стоимости сорбентов, а некоторые методы предполагают применение токсичных реагентов, как, например, при применении обращенно-фазной хроматографии [8] , что недопустимо для медицинских препаратов. В связи с чем, возникает потребность в методах получения высокоочищенных рекомбинантных ДНК, которые можно было бы масштабировать для производства медицинских препаратов нуклеиновых кислот в промышленных объемах.

Материал и методы

Рекомбинантная плазмида. В работе использовался рекомбинантная плазмида pBud-VEGF-FGF2, представлющая собой кольцевую замкнутую молекулу ДНК молекулярной массой 3,7 кДа (5583 п.н.), созданную на основе плазмидного вектора pBudCE4.1 (Invitrogen, США) [9] . За основу метода получения препаративного количества плазмиды с характеристиками, рекомендованными ВОЗ для клинического применения (WHO Technical Report Series No 941, 2007), был принят протокол фирмы «GEHealthcare», разработанный для трехстадийной очистки плазмиды весом 6,2 кДа с помощью фирменных хроматографических колонок (табл. 1) (GE Healthcare Life Sciences, США).

Культивирование штамма продуцента. Культивирование штамма Escherichia coli XL1 Blue, содержащего плазмиду pBud-VEGF-FGF2, проводили на среде Лурия-Бертани c добавлением антибиотика зеоцин в конечной концентрации 25 мкг/мл. Ночную культуру объемом 2000 мл выращивали при соотношении объема воздуха к объему среды 3:1, на качалке при 200 об/мин до значений оптической плотности 2,5. Клетки концентрировали центрифугированием в течение 10 мин при 6000 об./мин.

Щелочной лизис и осаждение плазмидной ДНК. Щелочной лизис проводили согласно стандартной методике [5] . Осажденную бактериальную культуру ресуспендировали в 100 мл буфера (25 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ глюкозы, рН 7,5, 100 мкг/мл РНКаза А). К суспензии добавляли 100 мл лизирующего буфера (200 мМ NaOH, 1% SDS (додецилсульфат натрия)). Спустя 5 мин проводили нейтрализацию с помощью добавления охлажденного ацетатного буфера (3 М CH3CO2K). Полученную взвесь фильтровали через бумажный фильтр (марка «синяя лента»). К отфильтрованному раствору приливали изопропанол в соотношении 1:0,7, выдерживали при комнатной температуре 10 мин. Осадок центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 30 мин при 4°С. Супернатант сливали, осадок промывали 70% этанолом, центрифугировали 15 мин при тех же условиях. Спирт сливали, осадок подсушивали при комнатной температуре и растворяли в 50 мл трис-НСl буфера (50 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, рН 7,5).

Хроматографическая очистка рекомбинантной плазмидной ДНК. Все этапы хроматографической очистки проводили с помощью системы жидкостной хроматографии BioLogicLP («Bio-Rad», США), снабженной градиентным насосом с производительностью до 40 мл/мин, проточным УФ-детектором с двумя длинами волн (254 и 280 нм) и кондуктометром. Очистка проводилась на фирменных колонках «PlasmidSelect Xtra Starter Kit» (GE Healthcare Life Sciences, США). Концентрацию нуклеиновых кислот определяли на спектрофотометре NanoPhotometer Pearl («Implen», Германия). Чистоту препарата анализировали с помощью электрофореза в 0,8 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия. В качестве маркера молекулярной массы использовали «GenRuler 10kb DNALadder» (Fermentas, США).

Результаты и обсуждение

Согласно протоколу «GE Healthcare» полученный щелочной лизат можно было непосредственно использовать для очистки на колонках. Однако такой лизат содержал избыточное количество РНК, что приводило к увеличению продолжительности очистки на первом этапе с помощью Sepharose 6 Fast Flow (рис. 1А). В целях минимизации длительности первого этапа очистки щелочного лизата, перед внесением на хроматографическую колонку, образец подвергали дополнительной обработке РНКазой А для разрушения РНК, плазмиду из раствора осаждали изопропанолом. На колонку, предварительно уравновешенную буфером А, вносили 10 мл образца, с концентрацией нуклеиновых кислот около 1 мг/мл (табл. 2). Плазмиду элюировали тем же буфером со скоростью 4 мл/мин. Сорбент после каждого выхода пика плазмиды промывали дистилированной водой (рис. 1Б).

На следующем этапе с помощью высаливающей хроматографии отделяли суперскрученную замкнутую кольцевую форму плазмиды от открытой линейной формы на колонке PlasmidSelect Xtra, содержащей меркаптопиридиновые лиганды. На колонку, уравновешенную буфером В, наносили образец в количестве 5 мг. Плазмиду, удержанную на колонке, промывали от открытой линейной формы тем же буфером при скорости потока 4 мл/мин, затем плазмиду элюировали буфером С при скорости потока 3 мл/мин.

Полученные после гель-фильтрации фракции плазмиды содержали значительное количество плазмиды линейной формы. Поскольку нахождение плазмиды в растворе при больших значениях рН вызывает необратимую денатурацию плазмиды за короткий промежуток времени, увеличили объем ацетатного буфера (рН 5,0) для более быстрого и однородного смещения рН раствора в кислую сторону. Увеличение объема ацетатного буфера на 35% приводило к заметному уменьшению количества линейной формы плазмиды.

На финальном этапе очистки использовали анионообменную хроматографию на колонке с сорбентом Source 30Q. На колонку, уравновешенную буфером Д, наносили образец в количестве 5 мг, плазмиду, удержанную на колонке, промывали от эндотоксинов тем же буфером при скорости потока 4 мл/мин, затем плазмиду элюировали буфером Е в те же условиях. Чистоту плазмиды определяли с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 2).

Таким образом, были оптимизированы условия очистки препарата плазмидной ДНК pBud-VEGF-FGF2 с помощью трех хроматографических колонок, входящих в состав набора «PlasmidSelect Xtra Starter Kit» (GE Healthcare Life Sciences, США). В качестве дополнительного этапа очистки щелочного лизата была выбрана преципитация плазмиды изопропанолом. Общий выход плазмиды после всех этапов очистки составил 15,4%.

источник

Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК,таккак выделение, рестрикция,полимеразная цепная реакция(ПЦР),молекулярное клонирование, наиболее частоиспользуютэлектрофорез.

Электрофорез — метод разделения макромолекул (в том числе
молекул и фрагментов ДНК) в геле по размеру и заряду в постоянном электрическом поле. Существует два вида электрофореза: горизонтальный и вертикальный.

Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя ДНК, например бромида этидия.

На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов.

Концентрация агарозы в геле.Агарозный гель — пористая струк-
тура, причем увеличение концентрации агарозы в геле приводит к
уменьшению размеров его пор. Это позволяет при помощи геля с
разной концентрацией агарозы разделять линейные молекулы
ДНКв широком диапазоне их размеров, вплоть до 60 тыс. пар
нуклеотидов (п. н.).

Существует зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК
от концентрации агарозы в геле;

Концен- 0,3 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,2 1,5 2,0

Длина 5-60 1-30 1-20 0,8-12 0,6-10 0,5-8 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2

Заряд молекулы.Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы
ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной
среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода (отрицательный электрод) к аноду (положительный электрод). Электрофоретическая подвижность молекулы ДНК существенно снижается с увеличением ее длины.

Напряженность электрического поля.На скорость движения заряженных молекул ДНК в геле влияет напряженность электрического поля, определяемая напряжением постоянного электрического поля, подаваемого на электроды. Данные, приведенные на
рисунке 1, свидетельствуют о наличии обратно пропорциональной зависимости между длиной пробега ДНК в геле и напряженностью электрического поля. Число полученных электрофореграмм различно, поэтому разделение фрагментов ДНК для
аналитических целей (только с целью детекции ДНК) с максимальным разрешением рекомендуют проводить при напряжении 10—15 В/см, а для препаративных (если ДНК будет в дальнейшем выделена из геля и использована, например, для клони-
рования) — при

Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с
одинаковой скоростью. Однако подвижность суперспирализованных и кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера. Таким образом, методом элект-рофореза можно фракционировать три формы молекул ДНК бактерий:

• суперспирализованную (нативная молекула, стабилизированная белками);

•линейную (расщепленная рестриктазой кольцевая молекула).
Разделение трех типов молекул ДНК в одном геле выглядит следующим образом (по подвижности от катода к аноду):

Кольцевая молекула ДНК
Линейная молекула ДНК
Суперспирализованная молекула ДНК

При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в одну из лунок геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с
известными значениями молекулярных масс).

Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза.

Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания
электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 ч, гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254—400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм), при этом
становится видна ДНК.

Внимание! Используемый в качестве красителя бромид этидия является мутагенным веществом. При работе с ним необходимо использовать резиновые или латексные перчатки.

Методы вертикального и горизонтального электрофореза
принципиально сходны, однако в последнем случае вместо агарозного используют полиакриламидный гель (ПААГ) и процесс электрофореза проходит вертикально. Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью.

Кроме того,акриламид является токсичным веществом. Приготовить ПААГ
значительно сложнее, чем агарозный гель. В связи с этим в работе
с ДНК преимущественно используют метод горизонтального
электрофореза в агарозном геле.

Цель работы. Ознакомиться с методом горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле.

Оборудование и материалы.1. Прибор для горизонтального электрофореза.
2. Источник постоянного тока. 3. Электрическая плитка или СВЧ-печь. 4. Гельдокументирующая видеосистема. 5. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 6. Колба мерная вместимостью 1 л. 7. Колба коническая
вместимостью 0,5 л. 8. Цилиндр мерный вместимостью 250 мл. 9. Кристаллизатор.
10. Набор реагентов для электрофореза (например, производимый ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ»)включает: смесь для приготовления электродного буфера;
навеску агарозы; раствор бромида этидия; раствор краски-лидера (бромфеноловый синий). 11. Проба исследуемой плазмидной ДНК. 12. ДНК-маркер молекулярных масс. 13. Перчатки резиновые или латексные неопудренные. 14. Теплоизолирующая рукавица. 15. Вода дистиллированная.

Ходработы.Приготовлениерабочегобуферногораствора для электрофореза. Содержимое пакета «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мерную колбу, раство-ряют в 600—800 мл дистиллированной воды (для более быстрого
растворения следует подогреть раствор до 40—45 «С при постоян-
ном помешивании) и доводят объем полученного раствора до 1 л
дистиллированной водой.

Подготовка прибора для электрофореза к работе. Пользуясь встроенными уровнями и винтовыми ножками,
прибор устанавливают строго горизонтально. В рабочую камеру
наливают буфер для электрофореза. Для формирования гелевой
пластины собирают кювету, в нее помещают аппликатор (гребенку) для формирования лунок в толще геля (рис. 2). Регулируемую

высоту аппликатора выставляют таким образом, чтобы расстояние
от дна кюветы до каждого из зубцов составляло 1—2 мм. В зависимости от числа анализируемых проб одновременно можно установить одну, две или три гребенки.

Приготовление агарозного геля. Навеску агарозы,
необходимую для приготовления 1%-ного геля, полностью переносят в коническую стеклянную колбу вместимостью 250—500 мл,
добавляют 150 мл рабочего раствора буфера для электрофореза и
перемешивают. Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в
СВЧ-печи или на электроплитке, периодически помешивая (колбу
держать, только надев на руку теплоизолирующую рукавицу). Продолжают нагревание до тех пор, пока содержимое колбы не станет
совершенно прозрачным (обычно еще 1 мин). Расплав охлаждают
до 55—60 °С, добавляют 10 мкл раствора бромида этидия, перемешивают (работу проводят в латексных или резиновых перчатках) и
наливают на столик для заливки геля (см. описание к прибору для
электрофореза), не допуская образования воздушных пузырьков,
так, чтобы толщина слоя была не менее 5 мм, а зубцы гребенок
были погружены в гель не менее чем на 4 мм. Гель полностью застывает через 15—20 мин. Столик с готовым агарозным гелем и гре-
бенками переносят в камеру для электрофореза, в которую нали-
вают рабочий раствор буфера для электрофореза так, чтобы по-
крыть гелевую пластину слоем в 2—3 мм. Извлекают гребенки из
агарозного геля легким и плавным движением вверх, стараясь не
повредить образовавшиеся лунки.

Проведение электрофореза. В лунки застывшего агарозного геля осторожно вносят по 3 мкл раствора исследуемых образцов ДНК. В соседнюю лунку геля вносят 3 мкл маркера молекулярных масс фрагментов ДНК. В одну или
две (по краям пластины геля) свободные лунки вносят 2—3 мкл
краски-лидера. Закрывают крышку прибора для электрофореза и
подключают его к источнику постоянного тока, строго соблюдая
полярность электродов и учитывая, что движение фрагментов
ДНК происходит в направлении от катода к аноду (от «минуса» к
«плюсу»). На вольтметре источника постоянного тока устанавли-
вают напряжение 120—150 В. В таком режиме процесс электрофо-
реза продолжают около 30 мин, ориентируясь на фронт пробега
краски-лидера (приблизительно на 3 см). По окончании электро-
фореза источник напряжения отключают, снимают крышку при-
бора, пластину агарозного геля осторожно переносят на свето-
фильтр (просмотровый столик) УФ-трансиллюминатора для де-
текции Включают трансиллюми-
натор. Зоны ДНК, окрашенные бромидом этидия, светятся при
УФ-облучении.

Внимание! Во избежание повреждения сетчатки глаз ультрафиолетовым излучением наблюдать зоны ДНК следует только через за-щитное стекло из комплекта трансиллюминатора или защитные (стеклянные) очки. Полученные результаты регистрируют визуально или с использованием гель-документирующей видеосистемы,пользуясь инструкцией к ней.

Контрольные вопросы.1. Какой принцип лежит в основе метода электрофоре-
за? 2. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2,5%-ного геля?
3. Какой концентрации агарозный гель нужно использовать для разделения мето-
дом электрофореза фрагментов ДНК размером 350 и 150 п.н.? 4. В каком направ-
лении и почему движутся молекулы ДНК при проведении электрофореза? 5. От
каких факторов зависит скорость движения молекул ДНК в агарозном геле в про-
цессе электрофореза? 6. Почему нужно избегать образования в геле пузырьков
воздуха? 7. За счет чего происходит визуализация ДНК в геле? 8. Каким образом
можно контролировать движение молекул ДНК в геле во время электрофореза?
9. На каких этапах проведения электрофореза необходимо работать в перчатках и
почему?

Задания.1. Поместить схему или фотографию электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Определить и подписать размеры фрагментов ДНК-маркера (согласно описанию к нему). 3. По электрофореграмме определить электрофоретическую подвижность и рассчитать примерную молекулярную массу исследуемой плазмидной ДНК, используя маркеры молекулярных масс. 4. Определить, какой из ДНК нижеперечисленных плазмид соответствует исследуемая ДНК, если ДНК плазмиды РСЕМ-2Гимеет размер 3000 п.н.ДНК плазмиды рВК322 — 4361,а ДНК плазмидыр РСУ002—8560 п.н.

источник

Все этапы вроде проходят нормально, а на форезе получается ерунда.
За основу протокола взяли Маниатиса, метод выделения pDNA (минипреп — лизис щелочью) отсюда и общую схему из пары статеек:

I. Выделение pDNA:
1. 1,5мл ночной культуры ЦФ 2’; 12000rpm, супернатант убрать x3
2. ЦФ 0,5’; 12000rpm, отсосать остатки супернатанта
3. +100,0мкл холодного раствора I, ресуспендировать
4. ЦФ 3’, супернатант отсосать
5. +100,0мкл холодного раствора I, ресуспендировать
6. NT, 5’
7. Вортекс 2-4”, +200мкл свежеприготовленного раствора II, встряхнуть 3 раза, через

1’ медленно перевернуть 3 раза, поставить в морозилку на 4 мин.
8. +100мкл. холодного 10M AcONH4, перевернуть 5 раз.
9. Поставить в морозилку на 40 мин.

II. Очистка pDNA:
10. +400мкл фенола*, вортекс 10”
11. ЦФ 2’, 12000rpm
12. Верхнюю фазу (300мкл) – в новую пробирку
13. +150мкл фенола* +150мкл хлороформа-ИАС, вортекс 10”
14. ЦФ 2’, 12000rpm
15. Верхнюю фазу (250мкл) – в новую пробирку
16. +250мкл хлороформа-ИАС, вортекс 10”
17. Верхнюю фазу (200мкл) – в новую пробирку
18. +400мкл 96% EtOH
19. -80°C, 30’
20. ЦФ 15’, 13000rpm
21. Слить 96% EtOH, промыть 70% EtOH
22. Отсосать всю жидкость
23. +20мкл TBEx1

III. Электрофорез pDNA в агарозном геле:
24. +20мкл буфера для внесения (c бромфеноловым синим)
25. 20мкл пробы – в лунки геля (1% агарозный, TBE)
26. E=2,5v/см, 6ч.

И результат:

Legend:
1. Salm. typhimurium бесплазмидный
2. Salm. typhimurium с R-плазмидой массой 50MD
3. Salm. enteritidis «дикий» 1
4. Salm. enteritidis «дикий» 2
Далее — маркеры мол. весов.

И вопросы:
1. Почему в (1) вообще что-то есть?
2. Почему (2) (и вообще все), которая должна быть гораздо тяжелее (в пересчёте с 50МD

76,9kb) лежит в области 20-25kb ?
3. Почему в маркере заводского производства λ/Hind III фрагмент 23130 получается таким размазанным и отсутствуют промежуточный 4361 ?
Длительное/неправильное хранение? Заводской брак? Много ДНК?

Собственные соображения:
1. Загрязнённость культуры. Маловероятно.
2. Загрязнённость РНК. У нас нету РНКазы, но у Маниатиса про РНКазу при выделении и экстракции пДНК ничего нет. И потом: известно, что для сохранения РНК нужны особо чистые условия, а у нас никакой особой стерильности не было.
3. Необратимая денатурация пДНК. Хотя время лизиса (после перемешивания) не превысило 5 мин, но возможно несоблюдён температурный режим (мы просто ставили пробирки в обыкновенную морозилку).
4. Опять же несоблюдение температурного режима, только в обратную сторону: там где написано -20°С, мы, за неимением таких условий, ставили в -80°С.
5. Старый форезный буфер (TBE): мы уже гнали в нём ранее 3 раза, он стоит в камере при комнатной температуре и уже слегка пожелтел. Но маркеры-то гонятся нормально.

P.S. И объясните наконец кто-нибудь: что такое «шмер»? Это не тот ли «быстрый» «мусор» который мы получали при неполноценной очистке:

P.P.S. Анализ не количественный: нам нужно только определить наличие плазмид и их мол.массу.

Сообщение было отредактировано [PPK] Rattus — 26.12.2007 14:17

Картинки:
Salmonellae_2_5v_6h.GIF — (116.77к) 26.12.2007 — 09.01.2008
junk.GIF — (123.2к) 26.12.2007 — 09.01.2008

Terlu
Постоянный участник
Мск, МГУ

Было бы удобнее, если картинки повернуть лунками наверх. А шмер это скорее всего РНК, но при большинстве процедур РНК вам не должна мешать в дальнейшей работе.

П.с. Вы гели фоткаете фотоаппаратом? Попробуйте получить более резкие снимки.

Сообщение было отредактировано Terlu — 26.12.2007 17:48

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

—P.S. И объясните наконец кто-нибудь: что такое «шмер»? Это не тот ли «быстрый» «мусор» который мы получали при неполноценной очистке:

Вопросы:
1. То что на форезе вовсе не похоже на плазмиду я бы не рискнул это назвать плазмидой без рестриктного анализа.
2. Скорее всего это вовсе и не оно, возможно это суперскрученная плазмида, нго маловероятно.
3. Маркер плохой виден недовар или примесь тотальной ДНК, что для фага вообще очень странно.

Для таких больших плазмид нужно брать 0.5-0.8% гель. И то это фигня почестному нужен пульс форез.

Судя по всему, у вас плазмида низкокопийная тогда 1.5мл культуры это очень мало. Нужно брать 30-100мл. Особенно, для неопытного человека.

Мне не нравятся пункты 3-4. Я бы лучше просто сделала пункт 5 и замораживание оттаивание пару тройку раз, потом сразу раствор II.

В пункте 7 раствор II необязательно свежеприготовленный, но и не тухлый, лучше добавлять холодный и вобще не трясти. У вас гигантская плазмида, вы ее порвете нафиг, только мягкое перемешивание переворачиванием.

Между пунктом 9 и 10 что-то должно быть еще, обработка протеазами переосаждение спиртом. В любом случае не известен буфер, в которм вы начинаете фенолить, если это ТЕ или ТВЕ, то у вас ДНК не сядет потом при высаживании спиртом, особенно если ее мало. Или это супер от ацетата аммония?
Вообще-то ацетат аммония это не маниатис, в маниатисе геномную ДНК от плазмидной отделяют кислым ацетатом натрия или калия. С аммонием я не пробовал. Смущает то что, если это просто ацетат аммония, то он не кислый и по идее очистка будет плохая(никакая).

Или вы просто держите раствар с добавленным ацетатом в морозилке и потом его начинаете фенолить?

Поблагодарили (1): [PPK] Rattus

Terlu
Постоянный участник
Мск, МГУ

пункт 9 поморозли, и сразу пункт 10 добавляете фенол? Вроде на этой стадии плазмида остается в супере, а осадок надо удалить.

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

Кто-то из начинающих недавно на форуме, не долго думая, ответил: НЕ СТЫДНО спрашивать. И Вам тоже не стыдно такую «красоту» показывать?
Плазмиду в упор не вижу,- вижу только подразвалившуюся РНК и маркер. Картинки гелей нужно размещать карманами вверх — это так принято, чтобы комментировать на общем языке.
А протокол недавно Куриоус67 выкладывал:
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=113750

PPK Rattus

>1.5мл культуры это очень мало
Там 3 раза, т.е. всего 4,5 мл.

>Нужно брать 30-100мл
У нас, к сожалению, нет центрифуг для больших пробирок.

>необязательно свежеприготовленный
На имеющиеся объёмы приготовить свежий не проблема.

>и вобще не трясти
Спасибо, учту.

>Или вы просто держите раствар с добавленным ацетатом в морозилке и потом его начинаете фенолить?
Да. А так нельзя?

>Вроде на этой стадии плазмида остается в супере
Вот его и фенолим.

>И Вам тоже не стыдно такую «красоту» показывать?
Было бы стыдно, если бы было кому научить непосредственно. А так приходится осваивать по имеющимся немногочисленным «гримуарам».
И потом: лучше за раз увидеть все свои «косяки», чем решать их в день по чайной ложке.
Хоть горшком зовите, только в печь не ставьте. На вас только одна надежда.

Сообщение было отредактировано [PPK] Rattus — 26.12.2007 21:49

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

—У нас, к сожалению, нет центрифуг для больших пробирок.
Это уже слишком ОПН-8 стоит 10000р, СМ-6 что-то около того. Для осаждения бактерий должно хватить 3-5 тыс об мин.

Ацетат калия стоит чуть дороже 100р за кг

—На имеющиеся объёмы приготовить свежий не проблема
Важно его охладить до нуля.

Это бессмысленно. При добавлении ААм у вас должно происходить отделение геномной ДНК от плазмидной. В осадке геномная в супере плазмидная. Если у вас ААм просто нетитрованный уксусом раствор. То при смешении с раствором II он не будет иметь рН ниже 9, это по моим представлениям не будет давать никакой очистки. Осадка просто не будет. Разве что дебрис клеточный.

Это противоречит предыдущему, в предыдущем вы никаких суперов от осадков не отделяли.

В любом случае, если у вас щелочные рН при феноленье и потом при высаживании спиртом это не способствует нормальному осаждению ДНК.

Поблагодарили (1): [PPK] Rattus

Sanya
Участник
Беларусь, Минск

В дорожке 1 (да и во всех остальных тоже) весьма вероятно у Вас хромосомалка, а не плазмидная ДНК. Такое случается при выделении щелочным лизисом. Согласен с МММ, пока не порежете — однозначно сказать ничего нельзя.

Сообщение было отредактировано Sanya — 27.12.2007 01:00

PPK Rattus

>Вы гели фоткаете фотоаппаратом? Попробуйте получить более резкие снимки.
Первый — стандартной камерой от трансиллюминатора, перепробовал различные светофильтры — никак не удаётся убрать контуры УФ-ламп.
Второй — обычным цифровиком, но потом много возни с обработкой получившегося изображения.

>в предыдущем вы никаких суперов от осадков не отделяли.
Хм. Протокол писал сразу, значит забыть не мог. Похоже да — не центрифугировал. Будем исправлять.

Сообщение было отредактировано [PPK] Rattus — 27.12.2007 06:47

Павел
Постоянный участник
Новосибирск

И ответы:
по поводу маркеров. ВЫ училил в школе устройство лямбда фага? Помните, что у него концы оочень такие липкие, аж на 12 (штоле)нуклеотидов? Ну дык, этот отсутвующий 4361 фрагмент залип на 2310 (частично) и образовал не «размазанный» бэнд, а дубль . Причем форез сам по себе у вас отдичный, разделение хорошее, но качество снимков — ниже плинтуса.
Тренируйтесь!! Можно тему замутить про качество картинок, ваше право .
кстати, сразу отвечу на незаданный вопрос — как все-таки увидеть полосу 4362 и убрать дубль сверху(оставив одну полосу).. Хотя, уже сами поняли, думаю..

Поблагодарили (1): [PPK] Rattus

genseq
Постоянный участник

Полностью согласен с предыдущим оратором .

1. В (1) и во всех остальных минипрепах единственную полоску образует фрагментированная ДНК хромосомы. Она присутствует всегда. Гетерогенна, но высокомелекулярные фрагменты (>20. 25 п.о.) агароза не разделяет.
2. Суперспиральную ДНК агароза разделяет даже высокомолекулярную. На 1% геле суперспираль 20. 25 Mb по подвижности совпадает с хромосомой, что создаёт проблемы. В Вашем случае проблем быть не должно. Суперспиральная ДНК 50 Mb идёт выше хромосомы (для Вас — левее).
3. С фрагментом 4361 всё ясно. «Лямбду» нужно прогреть (70 град.С) и резко охладить.

Причина всех проблем — неотработанность методики . Не расстраивайтесь. С первого раза она ни у кого не получается. Бывают, конечно, исключения (дуракам везёт), но редко .

Поблагодарили (1): [PPK] Rattus

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

—Первый — стандартной камерой от трансиллюминатора, перепробовал различные светофильтры — никак не удаётся убрать контуры УФ-ламп.

Оранжевый или красный фильтр на объектив советского фотоаппарата вас спасет.

PPK Rattus

>Оранжевый фильтр на объектив
С ним и делал. Без него вообще ужас.

Guest
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

76 kbp? Тогда выход — до предела возможного снижать концентрацию геля.
А если нужно проверить, есть ли плазмида, — не будет ли логичным поставить с неё ПЦР с какими-нибудь специфичными к ней праймерами, и получить фрагмент, который на обычном форезе можно будет уверенно разглядеть?

Поблагодарили (1): [PPK] Rattus

PPK Rattus

>Мне кажется, или на первой картинке слева (вверху геля) карманы уж больно сильно светятся?
Кажется. Я смотрел глазами — нет никаких следов. А вот в маркере с лямбдой вроде были.

>А если нужно проверить, есть ли плазмида, — не будет ли логичным поставить с неё ПЦР с какими-нибудь специфичными к ней праймерами
1. Нам нужно определить вообще есть ли там плазмида — в диких штаммах (1 и 2 — это «контроли»).
2. Праймеры нужно сначала заказать и ждать пока пришлют. А это небыстро.

PPK Rattus

Ещё вопрос: сколько часов можно форезить в одном боратном буфере?
И сколько времени хранить?

Terlu
Постоянный участник
Мск, МГУ

Если вопрос в том, сколько можно использовать буфер, то я не меняю пока не позеленеет. То есть пару недель вполне использую один буфер. Но естественно перед препаративным форезом — мытье камеры и смена буфера.
А сколько часов форезить — пока не разгонятится все. Плазмиде ничего не будет плохого и от длительного фореза.

papa Karlo
Постоянный участник

И все-таки почему бы не почитать инструкцию? :-))

1.Выделять плазмиду в 75кб из сальмонеллы — это искусство, которое требует много опыта и как уже заметили ранее очень много исходного материала. А у вас даже центрифуги нормальной нет.
2. Если вам нужно просто узнать есть она там или нет, то ничего проще и надежнее ПЦР со специфическими праймерами нет в природе. Хочется еще надежнее — сделайте 2-3-4 ПЦР с разными праймерами к этой плазмиде.
3. Зачем создавать себе проблему на ровном месте?

Поблагодарили (1): [PPK] Rattus

curious67
Постоянный участник

у него даже пластика нормального нет, равно как и всего остального, за исключением знания русского алфавита, на котором он набивает немыслимые вопросы вместо того, чтобы раздобыть немного денег, а также времени, чтобы пойти и поучиться у реально практикующих людей

Sod
Постоянный участник
Москва

В общем выделение плазмид из естественных источников часто большой геморой (у вас ведь естественный источник?), потому как копийность часто оставляет желать лучшего (да и вообще плазмида может быть не в каждой клетке), выделят лучше из большого объема, если нет больших пробирок, всё можно сделать в маленьких, т.е. берёте 12 эпендорфов (или сколько там у вас в цетрефугу влазит),в каждый по 3мл (или сколько вы там предпочитаете) среды это за раз 36 мл (лучше сделать больше чем 36 ).
Вот, в маниатисе есть методика увеличения количества ДНК в клетке при помощи инкубации с хлоамфениколом, то же можно сделать (можно и не делать, но желательно)
Когда получите плазмиду на форезе она будет в том же районе как и хромосома (скока там у вас 50 000пар как я понял? ) вот для того что бы её отличить от хромосомы вам эту вашу пробу нужно порезать какими ни будь рестриктазами, если рестриктазы режут хромосому, будет шлейф на всю дорожку, если рестриктазы режут плазмиду, будет набор полос. Вот

Сообщение было отредактировано Sod — 06.01.2008 18:21

Поблагодарили (1): [PPK] Rattus

curious67
Постоянный участник

а вот хлорамфеникола не надо, Маниатис тут не прав, качество препарата будет плохое

Sod
Постоянный участник
Москва

Это почему? Можно поподробней?

Сообщение было отредактировано Sod — 06.01.2008 23:54

PPK Rattus

>Тогда выход — до предела возможного снижать концентрацию геля.
Т.е., похоже без 0,3% геля мне не обойтись?

Ещё по поводу:
1. Можно ли замораживать раствор II ?
2. Чем опасно недосушивание от спирта кроме уплывания пробы из лунки?
3. Плохо ли, если pH форезного буфера больше 8 (8,3)?

Sod
Постоянный участник
Москва

Эх, ну раз не кто не пишет я напишу
1. Замораживать в процессе выделения с культурой нельзя, а просто замораживать, видимо можно, а вообще его хранить можно в пластиковой таре с плотно завинчивающийся крышкой, или делать каждый раз новый (многие так делают )
2. если спирт останется, то например ферменты могут плохо работать
3. точно не уверен, но вообще, по идеи pH=8,3 без разницы

PPK Rattus

Хехех, да, curious67 был прав. Неправильно было практически всё.
R. наконец потщательнЕЕ T.F.M. Манниатиса, понял, что без диализных трубок мне не видать крупных плазмид в чистом виде как своих ушей.
Но мне ведь, как я уже писал выше, и не надо в чистом, потому я не мудрствуя лукаво взял это http://molbiol.ru/protocol/04_03.html в несколько модифицированном виде:
1. 1,7 мл ночной культуры — в эппендорф, ЦФ 3′ 4200rpm(1.6kg), супер — слить x8 ; короче: открутил содержимое обычной пробирки, полной бульоном чуть более, чем наполовину — на случай если плазмиды низкокопийные.
2. ЦФ 0,5′ 4200rpm, убрать остатки супернатанта.
3. Ресуспендировать в 100мкл ТЕ ;из меньшего объёма не удаётся нормально снять верзнюю фазу, поскольку много исходного материала и соответственно белковых отходов.
4. Внести в пробирку с 100мкл фенола:хлороформа ;SDS не добавляю, потому что с ним всплывают пробы, а как видно ниже, если мы видим даже хромосомалку, значит лизис таки произошел и другие лизирующие реагенты не нужны?
5. Перевернуть 3-4 раза.
6. ЦФ 10′ 4200rpm
7. 25мкл водной фазы — в пробирку с 10мкл 1x буфера для внесения.
8. 25-30мкл — на форез
9. 0,2%агароза, 1xТВЕ, 5v/см, 1ч.

И получилось что-то более похожее на правду:

Слева направо: 1kb; Лямбда; 2 диких S. enteritidis; S. typhimurium с плазмидой, заявляемой как 50MD (в пересчёте на kb

77).
Итак, мы видим сверху, как правильно отметила Sanya, еле заметную «бахромчатую» хромосомалку, а вот посередине — всё не так очевидно: вроде и есть разница: по 2 полоски в немного разных местах у разных enteritidis (второго просто меньше осталось для внесения в лунку, потому он и не такой яркий) и одна у плазмидосодержащего typhimurium. Но что-то уж больно «лёгкие» они. понятно, что нельзя мерить кольцевые DNA (если они ещё кольцевые) по линейным маркерам, но неужели они настолько быстрее?
И может ли ощутимо влиять pH буфера (он у меня вообще получается 8,5, хотя готовится всё точно по прописям — см эту тему: http://molbiol.ru/forums/index.php?showtop. 41#entry627441) на скорость?

Досадный момент в том, что это были разогнаны остатки от прежнего выделения и S. typhimurium, заявляемый как бесплазмидный не осталось, но на других фотографиях там не было всё чисто.

Что скажете: таки оно это или может тоже остатки РНК какие или обломки ДНК?

Сообщение было отредактировано [PPK] Rattus — 11.02.2008 03:28

Картинки:
Salmonellae_1h5v.GIF — (19.47к) 10.02.2008 — 24.02.2008

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

Коллеги, прошу помощи по вопросу выделения и электрофореза плазмид. Можно ли разрушить клетки E.coli с помощью набора для выделения ДНК «ДНК- экспресс» (Литех), согласно инструкции прилагаемой к набору. Далее после центрифугирования и отделения супернатанта идет постановка электрофореза в 1% агарозе. Собственно вопрос в том, можно ли использовать для выделения плазмид набор «ДНК-экспресс» ?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

-Можно ли разрушить клетки E.coli с помощью набора для выделения ДНК «ДНК- экспресс» (Литех)

Это вы не у нас спрашивайте, а у Говоруна В.М., он автор сего чуда и одному ему известно, что он называет волшебным реагентом — воду, воду с ЭГТА или еще что.

Наверное можно, но щелочной лизис или лизоцим должны быть эффективнее

— Собственно вопрос в том, можно ли использовать для выделения плазмид набор «ДНК-экспресс» ?

Но из общих соображений: НЕТ НЕЛЬЗЯ. При таком способе тотальная и плазмидная ДНК оказываются вместе в одной пробе, что черевато тем, что плазмиду на форезе вы просто не заметите.

http://cytokine.ru/temp/files/Plasmid_DNA_extraction.pdf

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

Спасибо !

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

-Можно ли разрушить клетки E.coli с помощью набора для выделения ДНК «ДНК- экспресс» (Литех)

Если кому надо, могу сказать состав «этого чуда» (даже плазмидку пытаются выделить. )

distemper
Постоянный участник

а правда можете. вобщем-то конечно надо, есть соображения что эта смесюха что-то типа смеси низкомолекулярного ПЭГа и сыворотки, а вот в каких пропорциях чего лить.

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

там протеиназа К и еще что-то

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

—Если кому надо, могу сказать состав «этого чуда» (даже плазмидку пытаются выделить.

rmanta@yandex.ru

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

Существуют замечательное вещество (белок) в природе (в крови) у млеков, и называется АЛЬБУМИН, а для подобной работы берут BSA, который является акцептором всякой дряни. Так вот, «ДНК Экспресс» и есть законсервированный раствор БСА. Стоит оговориться, что не всякая БСА подходит для этого. , да и с концентрацией определиться. Кому надо весь состав — элементарно в личку. Ссылок — тьма.
distemper, когда зайдете за Мастермиксами? С ПЭГом 200 + КОН с рН выше 12 не теряйте время. Тоже заманчиво, но лизаты получаются очень разбавленные и 10 копий не вытяните и, к тому же, наблюдал небольшое ингибирование. Не знаю что там нахимичил Комчинский в «ДНК Директе», я лично отбраковал этот метод.
На практике я использую 5% Chelex 100 c Протеиназой К для Экспрессов-ДНК. епревзойденный метод. Лизаты не хуже чистой ДНК, а может быть и лучше.
Использую также Хитозан (это для Восприемника для интеллектуального напряжения) для экспрессов-ДНК.

distemper
Постоянный участник

да вот практика покывает что чем ближе находишься территориально тем меньше времени на куда-то зайти. это я к тому что в москву теперь перебрался (знаю-знаю, не резиновая )
с миксами вроде сам дошел до неплохих-по крайней мере для своих нужд. оказалось все банально просто: оч хорошо работает Tака в Pfu’шном буфере от ферментаса. а для сибра просто без детергента замешиваю. поднимает не 10 копий конечно но.
а что касается днк-экспресса то я с ним недавно столкнулся, и как бы это сказать. просто в восторге. вот на днях буквально 6 kb вытянул без особых усилий.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

-ДНК Экспресс» и есть законсервированный раствор БСА.

предварительно прогретый до +98оС твердотельный термостат и инкубировать при температуре +98оС в течение 10 минут.

После завершения инкубации пробирки центрифугировать при 12000 об/мин при комнатной температуре (+18-25°С) в течение 15 сек.
Полученный супернатант использовать в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации

Ага! Типа, альбумин свернулся и на себе свернул всю бяку, а в супере ДНК остался чизтый. Ню ню, может бяка сама сворачивается неплохо, а БСА просто соосадитель а без него, что хуже сильно.

— Хитозан. А он в соле не растворяется, от него отмыцо, то можно потом.

-Кому надо весь состав — элементарно в личку. Ссылок — тьма.

Я мыльцо дал. Или вы боитесь мне свое мыло показать, напишите с хостинга.

e.coli
Участник
The Сатанів

Классная идея — давайте, будет типа «Фотографии и путешествия» И голосовать можно, т.е. соревновательный момент налицо.

-L-
Участник

Сделайте по Кадо

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

Коллеги, прошу вас прокомментировать фореграмму.
На ней результаты опыта,суть которого: разрушить клетки E.coli и зарегистрировать этот факт по выходу из клеток генматериала,например плазмиды pUC19 (выращиваются бактерии из препарата «эколюм-9»).
—
На изображении
дорожка 1 -контрольный маркер плазмиды на основе pUC 19;
дорожка 2- контрольный образец, клетки не обработанные опытным агентом, но осажденные из суспензии клетки были разрушенны с помощью набора для выделения «ДНК экспресс» (Литех),
дорожка 3 — супернатант этого же контрольного образца ;
дорожки 4-7- клетки и супернатанты опытных образцов, после инкубирования с опытным разрушающим агентом в различных концентрациях.
дорожка 8 — контрольный маркер ДНК
—
Вопрос в том, что получается на фореграмме, что выходит из клеток ? РНК ?почему она растянулась на весь трек ? Помогите комментариями и советами.

Картинки:
_____.jpg — (151.52к) 20.06.2009 — 04.07.2009

guest: ммм
IP-штамп: frCNCa5alkkCM
гость

Вау 2 — это литех? А где ДНК?? Какая гадость! Это ваша заливная рыба.

— что выходит из клеток ? РНК ?почему она растянулась на весь трек ?

Она родимая, судя по ее виду. А растянулась потому что развалилась.

А вы пробу то Литеховскую обработайте РНКазкой-то с EDTA тут то и станет ясны чо це за хрень. Или на худой конец попробуйте литием высадить. Если что повалится, а пятно в надосадке уменьшится значит она родимая РНК.

Нижняя зона маркера 250 или 500b?

Удачи.

afanasev-max
Постоянный участник
Irkutsk-Moscow-Irkutsk

а в слоте что сияет?

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

да в лунках, видимо, ДНК осталась.Ззабыл упомянуть условия фореза: 1 % агароза, время 1,5 часа (5 вольт)

guest: ммм
IP-штамп: frCNCa5alkkCM
гость

Даже если это ДНК. То и ее по отношению к РНК можно считать погрешностью к эксперименту. Ну и вообще нормально выделенная ДНК так не выглядит. Вы это прекрасно знаете.

—Ззабыл упомянуть условия фореза: 1 % агароза, время 1,5 часа (5 вольт)

Не это надо упоминать, а отвечать на вопрос:
«Нижняя зона маркера 250 или 500b?» Но вобщем вам надо поставить контроль с РНКазой и писать рекламации в Литех. Я так думаю.

Жахните по бактерии роданидом аммония 4М и на селикагель потом промойте 70 процентным спиртом с ацетатом и смойте вдой с 1мМ EDTA и будет вам счастие. Я так думаю.

Поблагодарили (1): Entropy

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

Я в шоке! Причем тут ДНК Экспресс. Возмите вместо него водичку и получите то же самое.
А на форезе у вас хорошо прокрашенная и дегрдированная каша РНК и ДНК. Но генмная ДНК частично деградирована и не вся прокрашена и поэтому вы ее не всю видите. Плазмиду развалить не так просто кипячением и она должна быть видна на форезе, но у вас такая перегрузка что весь этидий забрали на себя ошметки РНК и ДНК и плазмида замаскирована.
1. Возьмите в 10 или 100 раз меньше клеток,
2. Делайте лизаты в пробирке (если не умеете в форезной лунке) используя классику: СДС, лизоцим, NaOH. (выбросите Экспресс на помойку и не позорьтесь далее),
3. Рекомендую добавлять этидий в форезный буфер и не гнать так быстро.
Напоминаю, материала (клеток) надо брать очень и очень мало, если хотите увидеть полоску плазмиды на фоне всей остальной «палитры».

Поблагодарили (1): Entropy

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

— Нижняя зона маркера 250 или 500b?

-Напоминаю, материала (клеток) надо брать очень и очень мало,

мой шеф несогласен с этим, он считает, что если плазмида не видна, значит ее мало, так кака мало биомассы, следовательно нужно увеличить кол клеток

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

идея с рнк-азой очень привлекательна,мы попробуем

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

кстати, за что у вас такая «любовь» к продукции Литех ?!

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

— Нижняя зона маркера 250 или 500b?

-Напоминаю, материала (клеток) надо брать очень и очень мало,

Твоего шефа надо уволить за профнепригодность . а подчиненным рекомендую почитать сначала протокол выделения плазмиды, самый элементарный, без наворотов модных и дорогих.
Для скрининга колоний используется простой протокол без лизоцима и РНК-азы. Обойдется в пять копеек. В 80-х годах я проводил лизис колоний прямо в э/ф лунках.
Я «люблю» тех, кто морочат голову людям, пользуясь всеобщей неграмотностью.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

-кстати, за что у вас такая «любовь» к продукции Литех ?!

-а подчиненным рекомендую почитать сначала протокол выделения плазмиды, самый элементарный, без наворотов модных и дорогих.

ООО! Золотые слова! Трех растворов вам вполне хватит чтоб увидеть плазмиду.

-А на форезе у вас хорошо прокрашенная и дегрдированная каша РНК и ДНК. Но генмная ДНК частично деградирована и не вся прокрашена и поэтому вы ее не всю видите.
Рекомендую добавлять этидий в форезный буфер и не гнать так быстро.

А еще лучше докраска этидием после фореза.

-Напоминаю, материала (клеток) надо брать очень и очень мало, если хотите увидеть полоску плазмиды на фоне всей остальной «палитры».

Если плазмида низкокопийная, то вам скорее всего такие упражнения не помогут. НО pUC многокопийная.

Так что предлагаю щелочной лизис и три раствора.

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

Спасибо за помощь !
будем пробовать исходя из ваших советов

Entropy
Участник
Россия, Оренбург

Вот еще вопрос:насколько должна быть разрушена клетка Гр-бактерии,чтобы из нее начал «вываливаться» генетический материал ?Достаточно ли для этого наличие пор (сквозных через все три оболочки) диаметром,скажем, 150-200 нм ?

источник

Плазмиды — дополнительные факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или линейные молекулы ДНК.

Плазмиды — внехромосомные (дополнительные по отношению к хромосоме) генетические структуры бактерий, способные автономно размножаться и существовать в цитоплазме бактериальной клетки. Некоторые плазмиды могут с определенной частотой включаться (интегрироваться) в бактериальный геном и размножаться (копироваться) затем вместе с ним как его составная часть. Термин «плазмида» введен американским генетиком Ледербергом (J. Lederberg) в 1952 г. для обозначения полового фактора бактерий (F-фактора, F-плазмиды), обнаруженного в клетках культуры кишечной палочки и ответственного за их способность быть донорами генетического материала (молекул ДНК) при конъюгации с клетками-реципиентами, не содержащими полового фактора. В дальнейшем у бактерий различных видов были выявлены П., контролирующие их устойчивость к сульфаниламидам, антибиотикам и другим антибактериальным препаратам.

Плазмиды представляют собой молекулы ДНК с молекулярной массой от 1×106 до 200×106.

Эти молекулы, как правило, замкнуты в кольцо и находятся в клетке в сверхспирализованной форме. Неконъюгативные плазмиды, мол, масса которых не превышает 20×106, имеют относительно простую генетическую организацию. Конъюгативные П. имеют более крупные размеры и наряду с генетической областью, контролирующей их репликацию, содержат также так называемую tra-область (англ. transfer перенос). Эта область определяет способность клетки, содержащей П., быть генетическим донором, т.е. вступать в конъюгацию с другой клеткой (реципиентом) и передавать ей свой генетический материал (плазмидную либо хромосомную ДНК). Под контролем tra-генов синтезируются поверхностные «половые» ворсинки (F-пили) клетки-донора, необходимые для ее конъюгации с клеткой-реципиентом, а также ферменты, обеспечивающие метаболизм ДНК в процессе конъюгации. Неконъюгативные П. обычно не содержат tra-области и поэтому не могут самостоятельно передаваться из одной клетки в другую. Однако передача неконъюгативной П. возможна за счет продуктов (белков) tra-генов конъюгативной П., находящейся вместе с неконъюгативной П. в одной и той же клетке. Активность плазмидных генов, ответственных за репликацию, несовместимость П., конъюгативность и другие свойства бактериальных клеток, в той или иной мере находится также под контролем хромосомных систем генетической регуляции.

Значительное место в составе плазмидной ДНК могут занимать различные гены, обеспечивающие бактериям-хозяевам в определенных условиях существования селективные преимущества по сравнению с бесплазмидными бактериями (например, гены, контролирующие устойчивость клеток к действию антибиотиков, солей тяжелых металлов, ионизирующего излучения, бактериоциногенность и др.). Предполагают, что в процессе эволюции бактерий такие гены могли попасть в состав П. в результате генетического обмена (рекомбинации) между различными молекулами ДНК бактериальных клеток. Установлена важная роль в этом процессе мигрирующих (транслоцирующихся) фрагментов ДНК (транспозонов), способных перемещаться из одной генетической структуры клетки в другую (например, из хромосомы в плазмиду, из одной плазмиды в другую плазмиду, из бактериофага в плазмиду и наоборот).

Способность П. быстро копироваться и передаваться из клетки в клетку при внутривидовой, межвидовой и межродовой конъюгации бактерий определяет важную роль плазмид в эволюции этих организмов. П. как автономные единицы репликации (репликоны) широко применяются в экспериментах по генетической инженерии. Их используют для получения в промышленных масштабах биологически активных белков — ферментов, гормона роста, инсулина и др. Способность многих П. выполнять роль половых факторов бактерий дает возможность применять их для экспериментального получения различных гибридных форм и генетического картирования этих организмов. Обнаружение в популяциях различных видов патогенных и условно-патогенных бактерий П., контролирующих их вирулентные свойства, позволяет предположить, что П. имеют определенное значение в инфекционной патологии и развитии эпидемических процессов. Данные о типах R-плазмид и их распространенности в современных сообществах микроорганизмов необходимы для разработки рациональной стратегии использования антибиотиков и других антибактериальных средств при лечении инфекционных болезней. Межвидовой и межродовой перенос П., контролирующих различные метаболические функции клетки (например, способность сбраживать строго определенные углеводы, образовывать сероводород и др.), служит одной из причин образования атипических форм бактерий, что затрудняет диагностику инфекционных болезней.

Плазмиды способны удваиваться (реплицироваться) автономно, но при этом они эксплуатируют репликационную систему клетки хозяина. Большинство плазмид кодирует специальные белки — инициаторы репликации. Эти белки начинают процесс репликации, который затем подхватывается и продолжается репликационной системой клетки.

Для кольцевых плазмид известны несколько механизмов (способов) репликации:

· механизм катящегося кольца (rolling cycle),

источник