Подготовка образцов для электрофореза

Что такое клинические исследования и зачем они нужны? Это исследования, в которых принимают участие люди (добровольцы) и в ходе которых учёные выясняют, является ли новый препарат, способ лечения или медицинский прибор более эффективным и безопасным для здоровья человека, чем уже существующие.

Главная цель клинического исследования — найти лучший способ профилактики, диагностики и лечения того или иного заболевания. Проводить клинические исследования необходимо, чтобы развивать медицину, повышать качество жизни людей и чтобы новое лечение стало доступным для каждого человека.

У каждого исследования бывает четыре этапа (фазы):

I фаза — исследователи впервые тестируют препарат или метод лечения с участием небольшой группы людей (20—80 человек). Цель этого этапа — узнать, насколько препарат или способ лечения безопасен, и выявить побочные эффекты. На этом этапе могут участвуют как здоровые люди, так и люди с подходящим заболеванием. Чтобы приступить к I фазе клинического исследования, учёные несколько лет проводили сотни других тестов, в том числе на безопасность, с участием лабораторных животных, чей обмен веществ максимально приближен к человеческому;

II фаза — исследователи назначают препарат или метод лечения большей группе людей (100—300 человек), чтобы определить его эффективность и продолжать изучать безопасность. На этом этапе участвуют люди с подходящим заболеванием;

III фаза — исследователи предоставляют препарат или метод лечения значительным группам людей (1000—3000 человек), чтобы подтвердить его эффективность, сравнить с золотым стандартом (или плацебо) и собрать дополнительную информацию, которая позволит его безопасно использовать. Иногда на этом этапе выявляют другие, редко возникающие побочные эффекты. Здесь также участвуют люди с подходящим заболеванием. Если III фаза проходит успешно, препарат регистрируют в Минздраве и врачи получают возможность назначать его;

IV фаза — исследователи продолжают отслеживать информацию о безопасности, эффективности, побочных эффектах и оптимальном использовании препарата после того, как его зарегистрировали и он стал доступен всем пациентам.

Считается, что наиболее точные результаты дает метод исследования, когда ни врач, ни участник не знают, какой препарат — новый или существующий — принимает пациент. Такое исследование называют «двойным слепым». Так делают, чтобы врачи интуитивно не влияли на распределение пациентов. Если о препарате не знает только участник, исследование называется «простым слепым».

Чтобы провести клиническое исследование (особенно это касается «слепого» исследования), врачи могут использовать такой приём, как рандомизация — случайное распределение участников исследования по группам (новый препарат и существующий или плацебо). Такой метод необходим, что минимизировать субъективность при распределении пациентов. Поэтому обычно эту процедуру проводят с помощью специальной компьютерной программы.

• бесплатный доступ к новым методам лечения прежде, чем они начнут широко применяться;
• качественный уход, который, как правило, значительно превосходит тот, что доступен в рутинной практике;
• участие в развитии медицины и поиске новых эффективных методов лечения, что может оказаться полезным не только для вас, но и для других пациентов, среди которых могут оказаться члены семьи;
• иногда врачи продолжают наблюдать и оказывать помощь и после окончания исследования.

• новый препарат или метод лечения не всегда лучше, чем уже существующий;
• даже если новый препарат или метод лечения эффективен для других участников, он может не подойти лично вам;
• новый препарат или метод лечения может иметь неожиданные побочные эффекты.

Главные отличия клинических исследований от некоторых других научных методов: добровольность и безопасность. Люди самостоятельно (в отличие от кроликов) решают вопрос об участии. Каждый потенциальный участник узнаёт о процессе клинического исследования во всех подробностях из информационного листка — документа, который описывает задачи, методологию, процедуры и другие детали исследования. Более того, в любой момент можно отказаться от участия в исследовании, вне зависимости от причин.

Обычно участники клинических исследований защищены лучше, чем обычные пациенты. Побочные эффекты могут проявиться и во время исследования, и во время стандартного лечения. Но в первом случае человек получает дополнительную страховку и, как правило, более качественные процедуры, чем в обычной практике.

Клинические исследования — это далеко не первые тестирования нового препарата или метода лечения. Перед ними идёт этап серьёзных доклинических, лабораторных испытаний. Средства, которые успешно его прошли, то есть показали высокую эффективность и безопасность, идут дальше — на проверку к людям. Но и это не всё.

Сначала компания должна пройти этическую экспертизу и получить разрешение Минздрава РФ на проведение клинических исследований. Комитет по этике — куда входят независимые эксперты — проверяет, соответствует ли протокол исследования этическим нормам, выясняет, достаточно ли защищены участники исследования, оценивает квалификацию врачей, которые будут его проводить. Во время самого исследования состояние здоровья пациентов тщательно контролируют врачи, и если оно ухудшится, человек прекратит своё участие, и ему окажут медицинскую помощь. Несмотря на важность исследований для развития медицины и поиска эффективных средств для лечения заболеваний, для врачей и организаторов состояние и безопасность пациентов — самое важное.

Потому что проверить его эффективность и безопасность по-другому, увы, нельзя. Моделирование и исследования на животных не дают полную информацию: например, препарат может влиять на животное и человека по-разному. Все использующиеся научные методы, доклинические испытания и клинические исследования направлены на то, чтобы выявить самый эффективный и самый безопасный препарат или метод. И почти все лекарства, которыми люди пользуются, особенно в течение последних 20 лет, прошли точно такие же клинические исследования.

Если человек страдает серьёзным, например, онкологическим, заболеванием, он может попасть в группу плацебо только если на момент исследования нет других, уже доказавших свою эффективность препаратов или методов лечения. При этом нет уверенности в том, что новый препарат окажется лучше и безопаснее плацебо.

Согласно Хельсинской декларации, организаторы исследований должны предпринять максимум усилий, чтобы избежать использования плацебо. Несмотря на то что сравнение нового препарата с плацебо считается одним из самых действенных и самых быстрых способов доказать эффективность первого, учёные прибегают к плацебо только в двух случаях, когда: нет другого стандартного препарата или метода лечения с уже доказанной эффективностью; есть научно обоснованные причины применения плацебо. При этом здоровье человека в обеих ситуациях не должно подвергаться риску. И перед стартом клинического исследования каждого участника проинформируют об использовании плацебо.

Обычно оплачивают участие в I фазе исследований — и только здоровым людям. Очевидно, что они не заинтересованы в новом препарате с точки зрения улучшения своего здоровья, поэтому деньги становятся для них неплохой мотивацией. Участие во II и III фазах клинического исследования не оплачивают — так делают, чтобы в этом случае деньги как раз не были мотивацией, чтобы человек смог трезво оценить всю возможную пользу и риски, связанные с участием в клиническом исследовании. Но иногда организаторы клинических исследований покрывают расходы на дорогу.

Если вы решили принять участие в исследовании, обсудите это со своим лечащим врачом. Он может рассказать, как правильно выбрать исследование и на что обратить внимание, или даже подскажет конкретное исследование.

Клинические исследования, одобренные на проведение, можно найти в реестре Минздрава РФ и на международном информационном ресурсе www.clinicaltrials.gov.

Обращайте внимание на международные многоцентровые исследования — это исследования, в ходе которых препарат тестируют не только в России, но и в других странах. Они проводятся в соответствии с международными стандартами и единым для всех протоколом.

После того как вы нашли подходящее клиническое исследование и связались с его организатором, прочитайте информационный листок и не стесняйтесь задавать вопросы. Например, вы можете спросить, какая цель у исследования, кто является спонсором исследования, какие лекарства или приборы будут задействованы, являются ли какие-либо процедуры болезненными, какие есть возможные риски и побочные эффекты, как это испытание повлияет на вашу повседневную жизнь, как долго будет длиться исследование, кто будет следить за вашим состоянием. По ходу общения вы поймёте, сможете ли довериться этим людям.

Если остались вопросы — спрашивайте в комментариях.

источник

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии мяса и мясопродуктов, может быть использовано в ветеринарии.

Чтобы обеспечить наилучшие результаты для проявления активности гистохимически выявляемого фермента, необходимо, чтобы в среде поддерживалось значение pH, оптимальное для данного фермента. Это условие достигается введением в среду инкубации буферных растворов с заданными значениями pH. Наиболее распространенными буферными растворами являются фосфатный, ацетатный и трис-буфер.

Известен способ проведения электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, в котором описана предварительная пробоподготовка белков для электрофореза с использованием буферного раствора 0,015 М Трис HCl+0,15 М NaCl (Усанова О.Е. / Диссертация. Изучение протеомных изменений мышечной ткани свинины под воздействием технологических факторов // О.Е. Усанова — М. 2011. — 138, с. — 68) [1]. Буферный раствор приготавливали следующим образом:

1. 0,2 г Триса растворили в небольшом количестве воды;

2. Добавили 0,2 мл (200 мкл) HCl и довели до 100 мл водой;

3. Для приготовления 2N HCl — 18,2 мл HCl довели до 100 мл водой;

4. К раствору 0,015 М Трис HCl прилили 0,3 мл (300 мкл) 0,15 М NaCl.

Образцы мяса и мясных изделий измельчали до состояния фарша в блендаре, 10-20 г полученной массы гомогенизировали при комнатной температуре в течение 2-3 мин в 50 мл буферного раствора 0,015 М Трис HCl+0,15 М NaCl. Полученные гомогенаты центрифугировали при 20°C со скоростью 15000 оборотов в течение 30 мин. После центрифугирования образцы полученных проб хранили в замороженном состоянии при -18°C.

Расход времени составил 3-4 часа.

Недостатком данного способа является сложность проведения пробоподготовки из-за длительного и дорогостоящего процесса приготовления буферного раствора.

Задачей предлагаемого способа является упрощение пробоподготовки белков для электрофореза, использование более дешевого реактива.

Техническим результатом является сокращение времени на приготовление раствора 0,015 М Трис HCl+0,15 М NaCl для подготовки белков для электрофореза путем замены на 10% р-р сахарозы.

Для решения поставленной задачи и указанного технического результата в известном способе предварительной пробоподготовки белков для электрофореза, заключающемся в измельчении образцов мяса и мясных изделий до состояния фарша, гомогенизации, центрифугировании гомогенатов при температуре 20°C в течение 30 мин и последующей заморозке полученных образцов, согласно изобретению гомогенизацию проводят с 10% раствором сахарозы, центрифугирование проводят со скоростью 10000 оборотов в мин и хранят полученные образцы при температуре -4°C±2°C.

Сущность метода заключается в следующем: мясо и мясные изделия измельчают в блендаре, полученную массу гомогенизируют при комнатной температуре 5 мин с 50 мл раствора -10 г сахарозы на 100 мл воды. Полученные гомогенаты центрифугируют при температуре 20°C со скоростью 10000 оборотов в мин в течение 30 мин. Подготовленные таким образом полученные образцы для последующего хранения охлаждают при температуре -4°C±2°C.

Пример. Сыровяленый продукт (Суджук) из говядины в количестве 20 г измельчали в блендаре, 10 г полученной массы гомогенизировали в 50 мл 10% р-ра сахарозы при комнатной температуре, далее центрифугировали при температуре 20°C в течение 30 мин со скоростью 10000 оборотов в мин. Подготовленные таким образом экстракты охлаждали при температуре -4°C± 2°C для последующего хранения. Результаты целесообразности применения 10% раствора сахарозы показана в таблице 1.

Согласно результатам, приведенным в таблице 1, можно сделать следующие выводы: использование 10% раствора сахарозы для предварительной пробоподготовки белков для электрофореза более целесообразно, чем 5 и 15% растворы сахарозы.

Согласно данным, приведенным в таблице 2, можно сделать следующий вывод:

1. При использовании буферного раствора 015 М Трис HCl+0,15 М NaCl и 10% р-ра сахарозы идет экстрагирование веществ, а раствор сахарозы используется и как катализатор процессов;

2. При центрифугировании в известном способе количество гомогенатов на 2 мл меньше, чем в предлагаемом способе;

3. В известном способе полученные гомогенаты хранят в замороженном виде и образцы нужно размораживать и дополнительно центрифугировать;

4. Предлагаемый способ не требует размораживания и центрифугирования, что значительно сокращает время приготовления раствора в целом на 1,5 ч;

5. Кроме того, экспериментальные данные показали, что при использовании 10% раствора сахарозы в среде поддерживается требуемый уровень pH для электрофоретических исследований.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить пробоподготовку белков для электрофореза и использовать более дешевые реактивы.

Способ предварительной пробоподготовки белков для электрофореза, заключающийся в измельчении образцов мяса и мясных изделий до состояния фарша, гомогенизации, центрифугировании гомогенатов при температуре 20°C в течение 30 мин с последующим хранением полученных образцов, отличающийся тем, что гомогенизацию проводят с 10% раствором сахарозы, центрифугирование проводят со скоростью 10000 оборотов в мин, полученные образцы хранят при температуре -4°C±2°C.

источник

Алгоритм проведения гальванизации

1. Ознакомиться с назначением врача.

2. Подготовить аппарат «Поток – 1» к проведению процедуры.

3. Подготовить свинцовые электроды и гидрофильные прокладки.

4. Уложить или усадить пациента в удобное положение для проведения процедуры, обнажив участок, подлежащий воздействию.

5. Тщательно осмотреть кожные покровы в области воздействия, убедиться в их целостности и отсутствии признаков воспаления и раздражения (места повреждений накрыть клеёнкой).

6. Смочив прокладки теплой водопроводной водой, поместить их на область воздействия, соединив соответствующие провода с клеммами аппарата, зафиксировать электроды с прокладками мешочками с песком или резиновыми бинтами и укрыть пациента одеялом;

7. Предупредить пациента об ощущениях во время процедуры (покалывание, пощипывание).

9. Плавным вращением ручки регулятора тока установить необходимый ток в цепи пациента, ориентируясь на показания миллиамперметра и ощущения пациента.

10. Установить на процедурных часах время процедуры, или перевернуть песочные часы для отсчета времени.

11. По окончании процедуры плавным вращением ручки регулятора уменьшить ток пациента до нуля и выключить аппарат нажатием кнопки «Сеть».

12. Убрать одеяло, снять фиксацию электродов, снять электроды с прокладками с места воздействия, протереть участки кожи салфеткой, при явлениях раздражения смазать кожу вазелином или нейтральным маслом.

1. Прокладки отправить на обработку.
2. Сделать отметку о выполнении процедуры в карте пациента физиокабинета.

Алгоритм проведения лекарственного электрофореза

1. Ознакомиться с назначением врача.

2. Подготовить аппарат «Поток – 1» к проведению процедуры.

3. Уложить или усадить пациента в удобное положение для проведения процедуры, обнажив участок, подлежащий воздействию;

4. Тщательно осмотреть кожные покровы в области воздействия, убедиться в их целостности и отсутствии признаков воспаления и раздражения (места повреждений накрыть клеёнкой)

5. Приготовить гидрофильные прокладки, соответствующие размеру и форме места воздействия, намочить их в теплой воде и отжать. При электрофорезе одного лекарственного препарата его раствором смачивают одну гидрофильную прокладку соответствующей полярности. При одновременном введении двух веществ различной полярности («биполярный» электрофорез) ими смачивают обе прокладки (анод и катод). При необходимости введения двух лекарств одинаковой полярности используют две прокладки, соединенные сдвоенным проводом с одним полюсом тока. При этом одну прокладку смачивают одним, вторую — другим лекарством.

6. Наложить теплые прокладки на тело пациента на проекцию пораженного органа. Сверху гидрофильной прокладки наложить свинцовую пластину, соединенную с токонесущим проводом с соответствующим проводом на аппарате.

7. Закрепить мешочком с песком или резиновым бинтом.

9. Предупредить пациента об ощущениях во время процедуры (покалывание, пощипывание);

11. Плавным вращением ручки регулятора тока установить необходимый ток в цепи пациента, ориентируясь на показания миллиамперметра и ощущения пациента;

12. Установить на процедурных часах время процедуры.

13. По окончании процедуры плавным вращением ручки регулятора уменьшить ток пациента до нуля и выключить аппарат нажатием кнопки «Сеть»;

14. Убрать одеяло, снять фиксацию электродов, снять электроды с прокладками с места воздействия, протереть участки кожи салфеткой, при явлениях раздражения смазать кожу вазелином или маслом;

1. Прокладки отправить на обработку.

16. Сделать отметку о выполнении процедуры в карте пациента физиокабинета.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Для студента самое главное не сдать экзамен, а вовремя вспомнить про него. 10034 — | 7498 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Подготовка пациента к процедуре гальванизации, лекарственный электрофорез. Построение схемы проведения процедуры.

Гальванизация— это метод воздействия на человека постоянным током малой силы (до 50 мА) и низкого напряжения (80В) с лечебной целью. Процедура отпускается с помощью аппаратов: поток 1,2, АГН, АГР.

· На процедуру необходимо приходить отдохнувшим не ранее 40 минут после завтрака и 1,5 часа после обеда.

· При себе иметь простыню, пеленку. Это нетепловой метод лечения.

· Процедура выполняется на обнаженном теле.

· Ощущение пациента: жжение, покалывание.

· Во время процедуры нельзя спать, читать.

· При появлении сильного жжения позвать м/с.

· Самому касаться аппарата и регулировать силу тока нельзя.

· После процедуры отдых необходим отдых 20-30минут.

Алгоритм проведения процедуры гальванизация или электрофорез.

· Перед началом работы проверить исправность аппарата «Поток-1» или ГР-1 или АГН-55.

· Ознакомиться с назначением врача.

· Получить устное согласие пациента на проведения процедуры.

· Объяснить ощущения пациента во время процедуры.

· Придать пациенту наиболее удобное положение для проведения процедуры.

· Осмотреть целостность кожных покровов, при необходимости обработать кожу спиртом или вымыть мылом.

· Приготовить гидрофильные прокладки, соответствующие размеру и форме места воздействия, намочить их и отжать в теплой воде.

· Наложить теплые прокладки на тело пациента на проекцию пораженного органа.

· Сверху гидрофильной прокладки наложить свинцовую пластину, соединенную токонесущим проводом с соответствующим проводом на аппарате.

· Закрепить мешочком с песком или резиновым бинтом.

· Рассчитать силу тока для данной методики.

· Проверить, чтобы регулятор силы тока находился в крайнем левом положении.

· Включить аппарат в сеть (должна загореться сигнальная лампочка).

· Переключатель шунта переключить на 5 или 50 (5- применяется на «голову» и детям, 50 -«шея и ниже» у взрослых).

· Медленно и плавно поворачивая регулятор силы тока, увеличить силу тока до необходимой величины, которая рассчитывается по формуле: плотность тока умножить на площадь гидрофильной прокладки. |

· При хорошей переносимости процедуры накрыть пациента, проинформировать, что при появлении неприятных ощущений он должен сообщить об этом медицинской сестре.

· Засечь время процедуры на процедурных часах.

· По истечению времени процедуры плавно повернуть регулятор силы тока в крайнее левое положение (стрелка миллиамперметра должна быть на 0).

· Отключить кнопку сеть (погаснет сигнальная лампочка).

· Снять с тела пациента электроды.

· Осмотреть кожные покровы после процедуры (на коже может остаться гиперемия, но раздражения или других изменений быть не должно).

· Сообщить пациенту о времени его следующей явки и отметить о прохождении процедуры в листе назначений.

· Прокладки отправить на обработку.

Реакция бывает —

· пульс увеличивается на 50 -75%

· пульс увеличивается на 75 -100%

· пульс увеличивается на 200%

· пульс увеличивается на 100%

· СД резко увелич. До 180 — 200 мм.рт.ст.

· пульс резко увеличивается

· ДД падает до 0 (феномен бесконечного тона)

· когда после нагрузки АД ниже, чем до нагрузки. Через 3-5 минут

восстанавливается до исходных величин. Бывает при ИБС, перетренированности.

Проведение и оценка ортостатической пробы и клиностатической пробы.

Клиностатическая проба. Данную пробу проводят в обратном порядке: ЧСС определяется после 3 — 5 минут спокойного стояния, потом после медленного перехода в положение лежа, и после 3 минут пребывания в горизонтальном положении. Пульс подсчитывают также по 15-ти секундным интервалам времени, умножая результат на 4.

Для нормальной реакции характерно снижение ЧСС на 8-14 ударов за 1 минуту сразу после перехода в горизонтальное положение и некоторое повышение показателя после 3 минут пребывания в положении лежа, однако ЧСС при этом на 6-8 ударов на 1 минуту остается ниже, чем в вертикальном положении. Большее снижение пульса свидетельствует о повышенной реактивности парасимпатического отдела вегетативной нервной системы, меньшее — о сниженной реактивности.

При оценке результатов орто- и клиноста-тической проб необходимо учитывать, что непосредственная реакция после изменения положения тела в пространстве указывает главным образом на чувствительность (реактивность) симпатичного или парасимпатического отделов вегетативной нервной систем, тогда как отставленная реакция, измеряемая через 3 минуты характеризует их тонус. (Сакрут В.Н., Казаков В.Н.)

Ортостатическая проба

Данная проба характеризует возбудимость симпатического отдела вегетативной нервной системы. Ее суть заключается в анализе изменений ЧСС и АД в ответ на переход тела из горизонтального в вертикальное положение.

Существует несколько вариантов проведения данной пробы:

1. Оценка изменений ЧСС и АД или только ЧСС за первые 15-20 с после перехода в вертикальное положение;

2. Оценка изменений ЧСС и АД или только ЧСС спустя 1 мин пребывания в вертикальном положении;

3. Оценка изменений ЧСС и АД или только ЧСС за первые 15-20 с после перехода в вертикальное положение, а затем по окончании 3 минут пребывания в вертикальном положении.

В практике спортивной медицины наиболее часто применяют третий и второй варианты проведения

Методика. После пребывания в положении лежа на протяжении не менее чем 3-5 минут у исследуемого подсчитывают частоту пульса за 15 с и результат умножают на 4. Тем самым определяют исходную частоту сердечных сокращений за 1 мин после чего исследуемый медленно (за 2-3 с) встает. Сразу после перехода в вертикальное положение, а затем через 3 минуты стояния (то есть когда показатель ЧСС стабилизируется) у него снова определяют частоту сердечных сокращений (по данным пульса за 15 с, умноженным на 4).

Оценка результатов при третьем варианте:

Нормальной реакцией на пробу является увеличение ЧСС на 10-16 ударов за 1 мин сразу после подъема. После стабилизации этого показателя через 3 мин стояния ЧСС несколько уменьшается, но остается на 6-10 ударов за 1 мин выше, чем в горизонтальном положении.

Более сильная реакция свидетельствует о повышенной реактивности симпатичного отдела вегетативной нервной системы, что присуще недостаточно тренированным лицам.

Более слабая реакция наблюдается в случае сниженной реактивности симпатичного отдела и повышенного тонуса парасимпатического отдела вегетативной нервной системы. Более слабая реакция, как правило, является следствием развития состояния тренированности.

Оценка результатов при втором варианте пробы (по П.И.Готовцеву):

· Нормосимпатикотоническая отличная -прирост ЧСС до 10 уд/мин;

· Нормосимпатикотоническая хорошая -прирост ЧСС на 11-16 уд/мин;

· Нормосимпатикотоническая удовлетворительная — прирост ЧСС на 17-20 уд/мин;

· Гиперсимпатикотоническая неудовлетворительная — прирост ЧСС более 22 уд/мин;

· Гипосимпатикотоническая неудовлетворительная — снижение ЧСС на 2-5 уд/мин.

источник

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

источник

Для подведения постоянного тока к пациенту используют электроды из металлических пластин (свинца, станиоля) или токопроводящей графитизированной ткани и гидрофильных матерчатых прокладок.

Последние имеют толщину 1-1,5 см и выступают за края металлической пластаны или токопроводящей ткани на 1,5-2 см.

Существуют другие виды электродов: стеклянные ванночки для глаз, полостные — в гинекологии, урологии. Гидрофильные прокладки предназначены для исключения возможности контакта продуктов электролиза (кислоты, щелочи) с кожей и изготавливаются из белой ткани (фланели, байки, бумазеи).

Нельзя пользоваться прокладками из шерстяной или окрашенной ткани. Гидрофильные прокладки сшивают из 5-6 слоев материн (для удобства прополаскивания в воде, кипячения и сушки), пришивают карман из одного слоя фланели, в который вкладывают свинцовую пластинку, соединенную с токонесущим проводом, металлическим зажимом или припаянную непосредственно к проводу.

В кабинете целесообразно иметь набор свинцовых пластин различной площади от 4 до 800-1200 см2 или такой же площади углеграфитовых. В последние годы выпускают одноразовые электроды. Используют электроды специальной формы (в виде полумаски для лица, «воротника» для верхней части спины и надплечий, двухлопастные, круглые на область глаз и др.).

Следует знать, что ионы свинца вредно действуют на организм, поэтому медицинские сестры, постоянно работающие в этом кабинете, должны получать пектин или мармелад. Свинцовые пластины периодически необходимо чистить наждачной бумагой и протирать спиртом для снятия налета окиси свинца, а также тщательно разглаживать металлическим валиком перед процедурой. Электроды фиксируют с помощью эластичных бинтов, мешочков с песком или тяжестью тела больного.

Перед процедурой медицинская сестра должна ознакомить больного с характером ощущений под электродами: равномерное покалывание и легкое жжение. При появлении неприятных болезненных ощущений или неравномерного жжения на определенном участке кожи больной, не двигаясь и не меняя положения, должен вызвать сестру. Не рекомендуется во время процедуры читать, разговаривать, спать. После процедуры необходим отдых в течение 20-30 мин.

Перед процедурой следует убедиться в отсутствии царапин, ссадин, мацерации, сыпи на коже. Гидрофильные матерчатые прокладки хорошо смачивают теплой водопроводной водой и располагают на коже пациента, свинцовая пластина с токонесущим проводом находится при этом в кармашке. Желательно под матерчатый электрод положить на кожу фильтровальную бумагу, чтобы предохранить прокладку от загрязнения.

Расположение электродов на теле больного определяется локализацией, остротой и характером патологического процесса. Различают поперечную, продольную и поперечно-диагональную методики. При поперечном расположении электроды помещают на противоположных поверхностях тела — один против другого (живот и спина, наружная и внутренняя поверхности коленного сустава и т. д.), что обеспечивает более глубокое воздействие. При продольной методике электроды лежат на одной поверхности тела: один — более проксимально, другой — дистально (продольно по позвоночнику, по ходу нерва, мышцы).

В этом случае оказывается влияние на более поверхностные ткани. Для поперечно-диагональной методики характерно расположение электродов на разных поверхностях тела, но один -в проксимальных его отделах, другой — в дистальных. При близком расположении расстояние между электродами должно быть не меньше половины их диаметра.

Методом электрофореза в организм чаще всего вводят лекарства-электролиты, диссоциирующие в растворах на ионы. Положительно заряженные ионы (+) вводят с положительного полюса (анода), отрицательно заряженные (-) — с отрицательного полюса (катода). При лекарственном электрофорезе можно использовать различные растворители, универсальным и лучшим из них является дистиллированная вода. При плохой растворимости лекарства в воде в качестве растворителя применяют димексид, который также оказывает и противовоспалительное действие.

Для электрофореза сложных органических соединений (белки, аминокислоты, сульфаниламиды) используют буферные растворы. Лекарственные вещества, например, лидаза или ронидаза, растворенные в кислом (ацетатном) буферном растворе с рН = 5,2, вводят с положительного полюса. Пропись его: ацетат (или цитрат) натрия И,4 г, ледяной уксусной кислоты 0,91 мл, дистиллированной воды 1000 мл, 64 единицы лидазы (0,1 г сухого вещества). 0,5-1 г ронидазы растворяют в 15 или 30 мл ацетатного буфера.

Для электрофореза трипсина и химотрипсина используют боратный буфер с рН = 8,0-9,0 (щелочная среда), который вводят с отрицательного полюса. Его состав: борной кислоты 6,2 г, калия хлорида 7,4 г, натрия (или калия) гидроксида 3 г, дистиллированной воды 500 мл. 10 мг трипсина или химотрипсина растворяют в 15-20 мл боратного буфера. Учитывая сложность приготовления указанных буферов, B.C. Улащик и Д.К. Данусевич (1975) предложили пользоваться дистиллированной водой, подкисляемой 5-10% раствором соляной кислоты до рН = 5,2 (для введения с анода) или подщелачиваемой 5-10% раствором едкой щелочи до рН = 8,0 (для введения с катода).

Приводим табл. 1, где указывается необходимое количество едкой щелочи или соляной кислоты в различных разведениях для подщелачивания и подкисления. Например: берем 10 мл 0,5 раствора глютаминовой кислоты и добавляем 0,16 мл едкой щелочи, получаем раствор с рН — 8,0 и вводим с отрицательного полюса. При добавлении соляной кислоты создается рН = 5,0.

Концентрация растворов лекарственных веществ, применяемых для электрофореза, колеблется чаще всего в пределах от 0,5 до 5,0%, так как доказано, что большие количества вводить не следует. Расход лекарства на каждые 100 см2 площади прокладки составляет ориентировочно от 10-15 до 30 мл раствора. Сильнодействующие средства (адреналин, атропин, платифиллин и др.) вводятся из растворов в концентрации 1:1000 или наносятся на прокладку в количестве, равном высшей разовой дозе.

Лекарственные вещества готовятся не более, чем на неделю, сильнодействующие — непосредственно перед введением. С целью экономии лекарственные препараты наносятся на фильтровальную бумагу, которую располагают на коже пациента, а сверху располагают матерчатую прокладку, смоченную теплой водой. Лекарственные вещества, используемые для электрофореза, приведены в табл. 2.

При электрофорезе одного лекарственного препарата его раствором смачивают одну гидрофильную прокладку соответствующей полярности. При одновременном введении двух веществ различной полярности («биполярный» электрофорез) ими смачивают обе прокладки (анод и катод). При необходимости введения двух лекарств одинаковой полярности используют две прокладки, соединенные сдвоенным проводом с одним полюсом тока. При этом одну прокладку смачивают одним, вторую — другим лекарством.

Для электрофореза антибиотиков и ферментов, чтобы избегать инактивации их продуктами электролиза, применяют специальные многослойные прокладки, в середине которых помещают 3-4 слоя фильтровальной бумаги, смоченной «предохранительным» раствором глюкозы (5%) или гликоколя (1%). Можно пользоваться и обычными гидрофильными прокладками, но толщина их должна составлять не менее 3 см.

После каждой процедуры необходимо тщательно промывать прокладки проточной водой из расчета 8-10 л на одну, для удаления из них лекарственных веществ. В «кухне» должно быть 2 раковины: одна для индифферентных прокладок, другая — для активных, т. е. смоченных лекарственным веществом. Для сильнодействующих препаратов целесообразнее иметь отдельные прокладки, на которых можно вышить название лекарства.

Промывать и кипятить прокладки, смоченные различными лекарственными веществами следует раздельно, чтобы избежать загрязнения их вредными для организма ионами. В конце рабочего дня гидрофильные прокладки кипятят, отжимают и оставляют в сушильном шкафу.

Введение лекарственных веществ на димексидс с помощью тока называется суперэлектрофорезом. Диметилсульфоксиду (ДМСО) присуща способность усиливать действие многих лекарств и повышать устойчивость организма к повреждающему действию низких температур и радиации. ДМСО обладает выраженным транспортирующим свойством. ДМСО считается биполярным, однако более выражен перенос в сторону катода.

Можно применять димсксид в виде аппликаций на кожу, так как при этом он обнаруживается в крови уже через 5 мин. Максимальная концентрация наблюдается через 4-6 час, удерживается препарат в организме не более 36-72 часов. Выраженное действие оказывают 70-90% растворы, однако они редко применяются из-за выраженной аллергической реакции. Чистый димсксид лучше применять в виде компрессов, а при электрофорезе использовать как растворитель.

Труднорастворимыс лекарственные вещества, приготовленные на ДМСО, проникают в большем количестве и на большую глубину (дерма и подкожножировая клетчатка). При этом они быстрее поступают в кровь, а их фармакологический эффект значительно возрастает.

Для электрофореза водорастворимых лекарств рекомендуется использовать 20-25% водные растворы димексида, а для трудно- и водонерастворимых препаратов — 30-50% водные растворы. Для приготовления последних лекарство сначала растворяют в концентрированном растворе ДМСО, а затем при постоянном взбалтывании добавляют до нужной концентрации дистиллированную воду.

Для электрофореза из среды ДМСО используют 5-10% раствор аспирина в 50% ДМСО, 5-10% раствор анальгина в 25% ДМСО, 1-2% раствор трипсина в 25% ДМСО, 32-64 ЕД лидазы в 25% растворе ДМСО, 2-5% раствор адебита в 25% ДМСО. Все перечисленные препараты вводятся биполярно. Димсксид у некоторых пациентов вызывает аллергическую реакцию, поэтому перед первой процедурой следует нанести на небольшой участок кожи 25% раствор препарата и посмотреть реакцию через 30-40 мин. Если на коже появилась отечность, краснота, зуд, то ДМСО применять не следует.

Порядок назначения. В назначении указывают название метода (гальванизация или электрофорез с обозначением концентрации раствора и полярности иона), место воздействия, применяемую методику (продольная, поперечная и др.), силу тока в миллиамперах, продолжительность в мин, последовательность (ежедневно или через день), число процедур на курс лечения.

Боголюбов В.М., Васильева М.Ф., Воробьев М.Г.

источник

Содержимое (Table of Contents)

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Электрофорез ОФС.1.2.1.0023.15

в полиакриламидном геле Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии – электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счёт различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также в зависимости от конфигурации молекул. Изменяя концентрацию полимера, можно получать гели с широким диапазоном размеров пор, позволяющих проводить разделение белков и пептидов с молекулярными массами от 2 до 300 тыс. кДа. Можно также изменять электрический заряд макромолекул (путем вариации рН буферного раствора) и их конформацию за счет введения в буферный раствор денатурирующих агентов или детергентов.

Протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима с целью исключения изменений вязкости, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов.

Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними, причем скорость миграции наиболее подвижных макромолекул пробы должна быть несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда фронт красителя достигает противоположной границы геля, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и выдерживают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты фиксируются в том самом месте, где закончилась их миграция. После фиксации или одновременно с ней проводят окрашивание зон путем выдерживания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.

Вместо окрашивания или наряду с ним могут использоваться радиоактивные метки и приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.

Гель полиакриламида имеет ряд преимуществ, определяющих его широкое использование. Он прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей, и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос.

Разделяющие свойства полиакриламидных гелей (ПААГ) определяются трехмерной сетью волокон и пор, которая сформирована за счет бифункциональных бисакриламидных связей между смежными полиакриламидными цепями. Полимеризация катализируется системой, производящей свободные радикалы, составленной из аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина.

С увеличением концентрации акриламида в геле эффективный размер пор уменьшается. Эффективный размер пор геля определяет его разделяющие свойства, то есть сопротивление геля к перемещению макромолекул. Существуют пределы концентраций акриламида, которые могут использоваться. При высоких концентрациях акриламида гели становятся более ломкими и трудны в обращении. С уменьшением размера пор геля уменьшается скорость перемещения белка через гель. Регулируя размер пор геля путем изменения концентрации акриламида, можно оптимизировать разрешающую способность метода для конкретного анализируемого образца. Таким образом, физическое состояние ПААГ характеризуется по составу акриламида и бисакриламида. Обычно используются гели, в которых общая концентрация мономера и сшивающего агента находится в диапазоне от 3 до 30 %, а количество сшивающего агента обычно составляет от одной десятой до одной двадцатой от количества мономера. При этом содержание сшивающего агента тем меньше, чем выше общая концентрация геля.

Электрофорез в полиакриламидных гелях с использованием натрия додецилсульфата (SDS) – наиболее распространенный способ электрофореза, используемый для оценки подлинности и чистоты белковых продуктов. Денатурированные под воздействием высокой температуры полипептиды, связываясь с анионным детергентом SDS, становятся отрицательно заряженными и приобретают конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы независимо от типа белка. Поскольку количество связанного SDS почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от последовательности аминокислот в полипептиде, SDS-полипептидные комплексы мигрируют через полиакриламидные гели с подвижностью, прямо пропорциональной молекулярной массе полипептида.

Молекулярная масса белка может быть оценена по его относительной подвижности на прокалиброванном геле, и обнаружение отдельной полосы в таком геле является критерием чистоты.

Однако, наличие у полипептида радикалов типа N- или O-связанных гликозидов оказывает существенное влияние на оценку молекулярной массы белка, поскольку SDS не связывается с углеводной частью молекулы так же, как с полипептидной. Таким образом, пропорциональность отношения «заряд к массе» не выдерживается и электрофоретическая подвижность белков, подвергшихся посттрансляционным модификациям, не является истинным отражением молекулярной массы полипептидной цепи.

Трехмерная структура белков часто поддерживается за счет дисульфидных связей. Цель анализа SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить эту структуру путем расщепления дисульфидных связей. Денатурация и дезагрегация белков заключается в обработке их 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (DTT), в результате которой происходит разрыв S-S связей, разворачивание полипептидной цепи и последующее связывание с SDS. В этих условиях молекулярная масса полипептидных субъединиц может быть рассчитана методом линейной регрессии при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.

Без обработки восстанавливающими агентами типа 2-меркаптоэтанола или DTT дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Невосстановленные белки не могут полностью насыщаться SDS и, следовательно, не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Это делает определение молекулярных масс этих молекул методом SDS-ПААГ менее стандартизованным, чем исследование полностью денатурированных полипептидов. Однако, выявление одной полосы в таком геле (т.е. отсутствие любых компонентов, отличных от основного компонента) является показателем чистоты белка.

Электрофорез белков в полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом (SDS-PAGE), как правило, проводится в неоднородной буферной системе, которая описывается ниже.

Электрофорез в геле с неоднородной буферной системой (диск—электрофорез)

Метод диск-электрофореза, благодаря своей высокой разрешающей способности, рекомендуется для характеристики смесей белков и для обнаружения примесей, которые могут иметь подвижность, близкую к подвижности главного компонента.

Метод подразумевает использование прерывистой системы, состоящей из двух отличных гелей: разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего) геля. Эти два геля имеют различную пористость (верхний – крупнопористый, нижний – мелкопористый). Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. Пористость, длина и тип буфера для нижнего геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза.

Отличительной особенностью данного вида электрофореза является обязательное использование в составе электродного буферного раствора подвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки; например, применение иона Cl — для щелочных буферных растворов или иона K + – для кислых. В этом буферном растворе подвижность иона, мигрирующего в том же направлении, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для этого удобно использовать цвиттерионы: например, простые аминокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки лежат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97).

Под действием электрического поля ионы глицина, входящие в состав электродного буферного раствора, следуют за белками в концентрирующий гель. Область перемещающихся границ быстро формируется под действием высоко подвижных хлорид-ионов во фронте и относительно медленных замыкающих ионов глицина. Хлорид-ион из-за его небольшого размера мигрирует быстрее, чем любой из белков, присутствующих в образце. Величина рH образца и концентрирующих слоев выбирается так, чтобы быть приблизительно на 3 единицы ниже, чем верхнее значение pK_a глицина. Поэтому, на пересечении этих слоев только около 0,1% глициновых молекул имеют отрицательный заряд. Таким образом, быстродвижущиеся хлорид-ионы постепенно замещаются ионами глицина, которые при рН 6,8 в концентрирующем геле нейтрализуются и перестают участвовать в проведении тока. Сопротивление верхней части концентрирующего геля резко возрастает, а вместе с ним возрастает и напряженность поля. Локализованные зоны высоковольтового градиента между передним и задним ионными фронтами вызывают относительно высокую скорость миграции белков в концентрирующем геле, которая не ограничивается благодаря крупнопористой структуре этого геля.

На границе концентрирующего и разделяющего гелей белки достигают высокоплотных слоев геля и замедляются из-за уменьшающегося размера пор разделяющего геля. Более высокое значение pH, с которым фронт электродного буферного раствора встречается в разделяющем геле, также заставляет глицинат мигрировать быстрее, и напряженность поля падает, что также снижает скорость движения белков. Таким образом, происходит концентрирование пробы и все компоненты образца, независимо от первоначальной высоты столбика пробы в лунке, входят в нижний гель практически одновременно в виде узкой зоны с высокой концентрацией белка.

В мелкопористом разделяющем геле начинается процесс медленной миграции белков и их фракционирования в зависимости от молекулярных масс, а то обстоятельство, что процесс разделения начинается с узкой исходной зоны, обеспечивает высокую разрешающую способность системы вцелом.

Прибор для электрофореза состоит из:

1) источника постоянного тока с регулируемым напряжением и со стабилизатором напряжения;

2) камеры для электрофореза, служащей для размещения пластинки или трубки геля и поддержания постоянных условий проведения анализа. Камера обычно имеет прямоугольную форму, изготовлена из стекла или твердой пластмассы с двумя изолированными буферными резервуарами (анодным и катодным), содержащими раствор электролита. В каждый резервуар погружен электрод (например, платиновый), подключенный к соответствующему полюсу источника тока. Должен поддерживаться одинаковый уровень электролитов в резервуарах, чтобы предотвратить поток жидкости и гидростатическое давление на гель. Камера для электрофореза оснащена крышкой, которая предотвращает испарение растворителей и обеспечивает равномерно насыщенную влагой атмосферу во время всего процесса. Предпочтительно использование предохранителя для отключения электропитания, когда крышка камеры снята. Если мощность тока, приложенного к электрофоретической пластинке, превышает 10 Вт, то рекомендуется применять охлаждение камеры.

3) устройства для заливки геля, представляющего собой стеклянную трубку, стеклянную пластину или пару прямоугольных пластин (ячейку), служащих для формирования поддерживающей среды, в которой непосредственно проводится процесс электрофоретического разделения. Пластины могут быть расположены в камере вертикально или горизонтально (вариант горизонтального электрофореза обычно применяется для агарозных гелей) и должны быть погружены или иметь контакт посредством фитилей с катодным и анодным изолированными буферными резервуарами, содержащими раствор электролита. Преимуществом пластин для проведения процесса является возможность сравнения образцов в одной общей ячейке геля, что более информативно по сравнению с набором гелей из ряда трубок. Преимущество горизонтальных пластин по сравнению с вертикальными заключается в отсутствии проблемы герметизации швов, а недостаток – в большой поверхности контакта с воздухом и, соответственно, риске испарения жидкости.

Сборку прибора и его очистку после использования проводят в соответствии с инструкцией производителя.

Перед заливкой геля основание и боковые стороны ячейки закрывают подходящими прокладками, толщина которых определяет толщину рабочего геля (при этом после полимеризации геля прокладку в основании убирают). Ячейку заполняют раствором мономера с поперечно-сшивающим агентом и катализатором. Растворы должны быть дегазированы перед полимеризацией и гели должны использоваться свежеприготовленными. Заливку растворов проводят таким образом, чтобы исключить попадание внутрь ячейки пузырьков воздуха.

Гребенку, имеющую зубцы соответствующего размера (в зависимости от объемов наносимого образца), устанавливают в верхнюю часть ячейки на разделяющий гель и оставляют там до окончания полимеризации геля. Формирование геля обычно занимает не менее 30 мин и может считаться законченным, когда между гелем и водным слоем появляется четкая граница. После удаления гребенки из геля, прошедшего полимеризацию, остается ряд лунок.

Заполняют нижний и верхний резервуары камеры предписанным электродным буферным раствором. Готовят испытуемый и стандартный растворы, содержащие краситель и сахарозу или другой плотный и вязкий растворитель. Наносят образцы шприцем или микропипеткой в основания лунок, сразу включают электрический ток и начинают электрофорез, соблюдая предписанные условия (температуру и величину напряжения).

После окончания процесса (когда краситель достигает нижней границы пластины) ток выключают, пластину удаляют из камеры, зоны фиксируют, окрашивают и при необходимости пластину высушивают.

Подготовка полиакриламидного геля для вертикального электрофореза с SDS в неоднородной буферной системе

Сначала готовят и заливают в подготовленную ячейку нижний разделяющий гель, а затем сверху наслаивают концентрирующий гель.

В конической колбе готовят рассчитанное в зависимости от объема ячейки количество раствора для разделяющего геля, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в Таблице 1. Смешивают компоненты в указанном порядке. В тех случаях, где требуется, перед добавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (TEMED) раствор фильтруют, и, если необходимо, дегазируют раствор через мембрану из ацетата целлюлозы (с диаметром пор
0,45 мкм) под вакуумом при перемешивании. Добавляют соответствующие количества раствора аммония персульфата и TEMED как указано в табл. 1, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки. Оставляют достаточное место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя суженную стеклянную пипетку, тщательно наслаивают на гель сверху воду или изобутанол. Оставляют гель в вертикальном положении при комнатной температуре до завершения полимеризации.

После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой.

В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл.2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04 8% акриламида Вода очищенная 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2 Раствор акриламида 1) 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03 10% акриламида Вода очищенная 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8 Раствор акриламида 1) 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 12% акриламида Вода очищенная 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5 Раствор акриламида 1) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 14% акриламида Вода очищенная 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8 Раствор акриламида 1) 2,3 4,6 7,0 9,3 11,6 13,9 18,6 23,2 1,5 М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 15% акриламида Вода очищенная 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5 Раствор акриламида 1) 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0 1,5М Трис

(рН 8,8) 2)

1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 100 г/л SDS 3 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 100 г/л APS 4 ) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5 TEMED 5 ) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02