Принцип разделения биомолекул методом электрофореза

Лабораторная работа №8

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ

Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 B.

Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),

Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза

через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 — 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, — уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.

Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 — 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 — 8,9) при градиенте потенциала 3 — 5 В/см (120 — 350 B для полос длиной 40 — 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 — 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге — прогорание бумаги

1. Буферный раствор. Можно использовать:

а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;

б) веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;

в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.

2. Растворы для окраски электрофореграмм:

а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) —0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) — 100 мл + метиловый спирт — 900 мл;

б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;

в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO₄·7H₂O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.

3. Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:

а) уксусная кислота — 2 %-й раствор;

б) уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.

4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:

а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;

б) для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.

Получение сыворотки крови. 2 — 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 — 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.

Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18×45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 —5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы —2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 —8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.

Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 — 0,02 мл (1 — 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 — 24 ч при напряжении 200 — 300 B

Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 — 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 — 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 — 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.

Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α₁-, α₂-, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 —5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.

Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций

Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.

Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат — соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

источник

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

источник

Электрофорез в агарозном геле.

Принцип метода электрофореза.

Электрофорез – метод разделения макромолекул, различающихся по таким параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пр о- странственная конфигурация, вторичная структура и элек трический заряд.

Физический принцип метода заключается в следующем. Наход я- щиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым су м- марным электрическим зарядом, величина и знак которого зависит от рН среды. Если через этот раствор, зак люченный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т.е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью поте н- циалов по концам канала, отнесен ной к его длине (В/с). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом м и- грируют в направлении катода или анода, причем их трение об окр у- жающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от в е- личины заряда и размеров мол екулы приобретают различные скорости. Постепенно исходный препарат, состоящий из различных молекул, ра з- деляется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой скоростью. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем, наличие сетки которого вн осит важную дополнительную деталь в эле к- трофоретическую миграцию молекул. Фракционируемые молекулы сталкиваются с нитями полимера, образующую сетку геля, что увел и- чивает сетку геля и снижает скорость движения молекул. Препятствия для миграции становятся о собенно серьезными, если средний размер пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами ма к- ромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линей ных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот в о- обще не могут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекр а- титься.

В настоящее время используют ПААГ и агарозный гель. В а- рьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень шир оким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрич еские заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигур ацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.

В ходе электрофореза зоны макромолекул остаются невид и- мыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же зн а-

ка, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость м и-

грации наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их дифф у- зии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси, кислоты выпадают в осадок в том мес те, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачив а- ния геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.

Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат ра з- деляется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. Кроме того, поскольку гель заливают в форму для п о- лимеризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содерж а- ние добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следовательно, плотность тока и напряжение электрического поля также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия фракционирования ра з- ных препаратов и дает возможность достоверного сопоставления их с о- става путем сравнения положения полос в параллельных треках.

Особенности агарозного геля.

Агароза – это особо чистая фракция природного линейного пол и- сахарида агара, который получают из морских красных водорослей

(Gracilaria, Gelidium, Ahnfeltia).

Агароза состоит из строго чередующихся остатков 3-О- замещенной-β-D-галактопиранозы и 4-О-замещенной 3-6-ангидро-α-L- галактопиранозы. Молекулярная масса ее составляет 10 4 -10 5 . Гелеобразование идет путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обр а- зуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.

При температурах 84 -96 o (а у специальных типов – уже при 70 o ) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – «плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10 -15 с П, что примерно соответствует вязкости 50% -ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выр а- женным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значител ь- но более низких температурах (36 -42 o ). У легкоплавких типов агарозы

эта температура снижается до 30 o . Такая особенность облегчает ман и- пуляции с расплавленной агарозой — можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную агарозу пре д- варительно охлаждают до 50 -55 o и уже при этой температуре заливают

в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных те п- ловых деформаций.

Гели агарозы не вполне прозрачны, что обусловлено «кристалл и- зацией» геля.

Затвердевший гель представляет собой н е вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жи д- кость. Температура плавления и гелеобразования зависят от с одержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3 -4%. Наличие этих групп затрудняет гелеоб разование.

В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Чем меньше в агарозе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электр о- статического отталкивания между молекулами полимера и выше их способность к связыванию водородными связями. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза. В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе

в гелях агарозы явление эндосмоса, суть которого в след ующем: отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные ионы, находясь в водной фазе под действием электрического поля м и- грируют в направлении катода. Их место занимают катионы, которые увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и вместе с ней – растворенные в водной фазе геля макромолекулы. Эле к- трофорезом в агарозном геле чаще всего разделяют отрицательно зар я- женные макромолекулы, а эндосмос направлен в про тивоположную сторону и ухудшает разделение. Поэтому агарозу подвергают спец и- альной очистке, и содержание иона сульфата в продажных препаратах не превышает 0,5%.

Рис. 1. Влияние эндосмоса в агарозном геле на характер фракционирования двунитевых ДНК одина кового разме-

1 — сверхскрученная ДНК; 2 — линейная; 3 — кольцевая; степень эндосмоса увеличивается слева направо

Типы агарозы, отличающиеся слабо выраженным эндосмосом, с о- держат менее 0,3% сульфата. В случае необходимости мо жно провести дополнительную очистку агарозы от сульфата обработкой 1М NаОН в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаждением 50% -ным этанолом. Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и не специфическую сорбцию белков на агарозе, в результате чег о полосы расплываются с образованием «хвостов». Степень эндосмоса колич е- ственно оценивают с помощью коэффициента относительной миграции

(-m r ) – представляющего собой отношение скоростей миграции незаряженного полимера (за счет только эндосмоса) и сходного с ним по структуре полианиона при электрофорезе в агарозе данного типа.

Некоторые типы агарозы по номенклатуре фирмы « Miles»: тип LE – малая степень эндосмоса -m r =0,1-0,15;

тип HE – сильно выраженный эндосмос -m r =0,23-0,26.

Агароза с повышенными темпера турами плавления и гелеобразования (тип HGT) имеет -m r r >0,3) , но не за счет увеличения сульфатов, б лагодаря чему неспецифической сорбции белков на агарозе этого типа почти не происходит.

Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентр а- ции навеску порошка растворяют в соответствую щем буфере и нагре-

вают до 90-95 o . Перед заливкой в форму раствор агарозы охлаждают до 50 o .

Выбор концентрации агарозы, т.е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2% — ного геля агарозы приблизительно соот ветствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель -фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для м о- лекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрич е- ском поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют аг а-

розные гели с концентрацией 0,4 -2%. Ниже представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %) для некоторых распространенных объектов фракционирования:

Высокомолекулярная ДНК вирусов и пла з-

Рестрикты ДНК (5-20 тыс. пар оснований)

Реовирусная двунитевая РНК (500 -5000 пар

Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100 -1000

Разновидности электрофореза в агарозном геле.

Современные варианты электрофореза используют пластинки или колонки с агарозным гелем.

В зависимости от цели исследований эоектрофорез в агарозном геле может быть аналитическим и/или препаративным.

Аналитический электрофорез в агарозном геле имеет целью электрофоретическое разделение макромолекул с последующей визуализ а- цией и анализом полученных результатов.

Агарозный электрофорез применяют в препаративных целях. Для извлечения из геля разделенных компо нентов используют несколько способов: агарозный гель подвергают элюции буферными растворами, центрифугированию, замораживанию и оттаиванию.и др.

Вертикально расположенные трубки

Вертикальное расположение гелей и меет то преимущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность геля. Затруднение при вертикал ь-

ном расположении могут возникать при недостаточной сцепле нности геля со стеклом, он будет сползат ь вниз.

Все приборы для с вертикальным расположением гелей ко н- структивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположением, т.к. верхний электродный резервуар должен быть поднят над гелем.

Необходимо уплотнение в местах сочленения его с трубками или пл а- стинами.

Трубки (12-18штук) с уже заполимеризованным в них гелем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верхние концы выступали над дном резервуара. Если используют не все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе с трубками в ерхний электродный резервуар устанавливают на нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором расстоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар электродным буфером до такого уровня, что трубки оказываются почти полностью погруженными в буфер. Это делается для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза. С этой же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой или вводят допо л-

нительную охлаждающую систему. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной формы изготавливают из плексигласа , что позволяет следить за продвижением фронта красителя. В резервуарах должны быть закреплены электроды из платиновой проволоки. Нижний эле к- трод при этом должен располагаться так, чтобы поднимающиеся от н е- го пузырьки газа не попадали на нижние торцы трубо к, что создавало бы помехи протекания через них тока. Объемы электродных резерву а- ров достаточно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изм е- нялся под влиянием продуктов электролиза.

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок з а- клеивают парафильмом и устанавливают строго вертикально в штатив. Заливают гель. Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный резервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой наслаивают препарат, в который добавляют предварительно 5 -10% сахарозы. При любом варианте эле к- трофореза надо быть уверенным в том, что исходный препарат своб о- ден от взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соб и- раться на торце геля и однородность тока по его сечению, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон. В этом случае препарат сл е- дует отфильтровать или очистить центрифугированием.

По окончанию электрофореза гель из трубки извлекают. В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и зату п- ленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов трубки, кр у- говыми движениями отслаивая гель от ее стенок. Если необходимо т а- кую операцию проводят и с другого конца. Через иглу при этом пост у- пает вода из закрепленного выше резервуара. Если гель отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5 -1% раствор детергента. Во избеж а-

ния поломки следует дать гелю возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над которым проделывают эти манипуляции. Иногда д ля удаления геля из очень длинных трубок по его периферии с концов впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой из присоединя е- мого к трубке шприца. Если гель высокой концентрации вынуть не уд а- ется, его приходится замораживать, а трубку разбивать моло тком. Иногда можно решить проблему путем вымачивания трубки с гелем в мет а- ноле: гель постепенно съеживается и отстает от стенки.

Основным недостатком электрофореза в трубках является з а- трудненный отвод тепла даже при диаметре 5мм. На оси геля темпер а- тура оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности.

Это приводит к изгибу зон и соответственно окрашенных полос, п о- скольку электрофоретическая подвижность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотвода можно вести микроэлектрофорез в к а- пиллярах диаметром 0,7 -1,5мм.

Вертикально расположенные пластины

Для электрофореза белков обычно используют пластины ш и- риной 8-14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 -28 см.

Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а затем и электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зе р- кального стекла толщиной 5 -6мм. Расстояние между пластинами зад а- ется толщиной прокладок из тефлона или плексигласа («спейсеров») и определяет толщину геля. Прокладки шириной 10 -15мм устанавливают вдоль боковых краев стекол. Эти же прокладки можно использовать и для уплотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердевш е- го геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно такой же толщины по нижнему краю стекол и плотно прижимают ее к фрезер о- ванным торцам боковых прокладок.

При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить проще — заклеить торцы стекол липкой лентой. Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать. Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с прокладками и лент ой быстро застынет и заметного ее вытекания не будет. Для надежности можно сначала залить н е- большой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а п о- том залить остальной ее объем.

Собранную и уплотненную форму устанавливают вертикал ь- но и заливают в нее раствор мономеров ПААГ или расплавленную аг а- розу.

В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно затем с о- поставить при идентичных условиях разделения. Сопоставляемые пр е- параты фракционируют в параллельных друг другу «треках». В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы — «карманов», в которые затем вн о-

сят исследуемые препараты. Для этого в еще незаполимеризовавшийся

гель или горячую агарозу вставляют гребенку из тефлона или плекс и- гласа. Прямоугольные зубцы гребенки и формируют карманы.

Гель или агарозу заливают между пластинами с таким расч е- том, что при опускании гребенки до упора жидкий гель заполнил пр о- межутки между ее зубцами. Гре бенку начинают вставлять с некоторым перекосом, чтобы под ее зубцами не задерживались пузырьки воздуха. Когда гель готов, вынимают нижнюю прокладку или снимают липкую ленту и осторожно вытаскивают гребенку. При работе с концентрир о- ванным ПААГ гель может прилипать к зубцам гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться неровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос в геле. В таком случае имеет смысл вв е- сти еще один слой геля пониженной концентрации, и гребенку устана в- ливают в него.

Для проведения электрофореза чаще всего используются приборы конструкции, предложенной Стадиером. Верхний и нижний резервуары прямоугольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой имеется вырез, ведущий в полость верхнего резе рвуара. Такой

же вырез имеет и одна из двух стеклянных пластин, меду которыми п о- лимеризуется гель. Пластины прижимаются пружинными зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпадали. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, чтобы он через в ырез покрывал верхний торец геля. При этом вторая, не вырезанная, стеклянная пл а- стинка выступает в роли передней стенки резервуара. В месте совм е- щения двух вырезов, между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осуществлено уплотнение, препятствующее вытеканию верхне го буфера. В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой пр о- волоки. При установке в прибор форму с гелем частично погр ужают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец оказывается приподнят ым над дном резервуара. После погружения необходимо удалить пузырьки воздуха.

По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаивая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают между пласт и- нами со стороны карманов и слегка поворачивают. Со вто рой пластины гель снимают руками и переносят в ванночку для фиксации или окр аски. Необходимо проводить манипуляции в перчатках, т.к. случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверхности геля при современных чувствительных методах окрашивания может остави ть на геле артефактное белковое пятно.

Горизонтально расположенные пластины

Преимущество-отсутствие проблемы уплотнения. Оба эле к- тродных буфера находятся в резервуарах, расположенных ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель.

Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке или плашке из плексигласа, помещают на столик открытой поверхн о- стью кверху, поскольку препарат вносят не с торца, а в ряд специал ь- ных «колодцев», расположенных на некотором расстоянии от края. Электрофорез проводят в форезных камерах. Препараты вносят в «к о- лодцы» вместе с красителем — бромфеноловым синим, содержащим также глицерин, который «прижимает» краситель и препарат, не позв о- ляя им диффундировать в геле или в буфере.

Пластины для горизонтального элект рофореза в агарозе можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально установленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло определенного размера и на него выливают расплавленный раствор агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB рекомендует наносить препараты прямо на поверхность

агарозы через прорези наложенного на пластину специального шаблона со щелями. Препарат объемом 2 — 4 мкл вносят в щель шаблона, откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравнительно пр о- стое приспособление, смонтированное на столике для заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при з аливке агарозы образовать колодцы для препаратов. Перед использованием пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфере в течение суток.

Итак, электофорез в агарозном геле позволяет идентифицировать большое количество белковых фракций. Пример – электрофоретическое разделение белков сыворотки крови.

Электрофорез проводят в 1% -ном агарозном геле в мединал — вероналовом буфере рН=8,6 с ионной силой 0,05. Все белки сыворотки крови при рН=8,6 заряжаются отрицательно заряд и движутся от катода к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую молекулярную массу, затем располагаются 1 -, 2 -, — и -глобулины. Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на н е- сколько подфракций. Первоначальная оценка результатов электрофор е- тического разделения сывороточных белков (выявление нормы или п а- тологии) должна проводиться визуально, путем сравнения с картиной нормальной сыворотки, а количественные данные предназначены тол ь- ко для документирования результатов и динамического наблюдения.

Для электрофореза белков используются различные аппараты, как ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных мембран или гелевых пластинок (определения относительного колич е- ства белков в каждой фракции) используется электронный цветной ск а-

нер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность

и воспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает во з- можность усредненного расчета оптической плотности отдельных фракций путем автоматического определения границ «дорожек» и мн о- гократного сканирования каждой из них в нескольких «разрезах», что позволяет исключить ошибки из -за локальных микродефектов и неро в- ного положения носителя, а также до определенной степени нивелир о- вать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится график — денситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций. При необходимости маркеры границ фракций на графике можно ско р- ректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофор е- грамм; их можно в любое время извлечь и просмотреть. Электрофорез белков, позволяющий определить их количественные сдвиги и физико — химические характеристики, помогает выявить заб олевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразов а- ния (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетически е поломки

Методика электрофореза в агарозном геле.

Для приготовления агарозного геля в СВЧ-печи или на водяной бане расплавляют смесь агарозы, буфера и воды. Охлажденную до 50-60 о С смесь тонким слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле лунки для нанесения образца. Исследуемый препарат (раствор белка, ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля — полужидкой среды с сетчатой пространственной структурой (обычно для электрофореза используют тонкие пластины геля). Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещаются в электрическом поле. Молекулы одинакового размера (и одинакового заряда) движутся единым фронтом, образуя в геле дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся. Постепенно исходный препарат, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распределенные по длине пластинки. За ходом электрофореза следят по перемещению в геле красителя — заряженного низкомолекулярного вещества, которое вносят в каждую лунку перед началом электрофореза. Когда краситель достигает конца пластины, электрофорез останавливают, а гель окрашивают красителем, прочно связывающимся с белками или нуклеиновыми кислотами. Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после электрофореза получается набор четких полос, расположенных одна под другой. Если же распределение молекул по размеру более или менее непрерывно, то получается смазанная картина. По интенсивности окраски полос можно судить о концентрации макромолекул в образце. Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров

источник

Все живое на нашей планете состоит из огромного количества биологических молекул — ДНК, РНК, липидов, углеводов, — объединенных в сложные системы. Для того чтобы понимать, как эти системы работают, нам надо уметь разбирать их на отдельные компоненты — так получается гораздо проще. Если вы хотите узнать, как можно подойти к анализу сложных композиций биомолекул — читайте эту статью!

Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Партнер этой статьи — «Галахим»

«Галахим» специализируется на продаже, установке и сервисном обслуживании аналитических и препаративных хроматографов. Самый широкий в России ассортимент хроматографических колонок для ГХ и ВЭЖХ, сорбентов, пластин для ТСХ, фильтров и фильтровальной бумаги, реактивов, биохимических реагентов, микробиологических сред и стандартных образцов.

Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?

И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!

Основой жизни на нашей планете являются клетки, а каждая клетка состоит из огромного количества самых разных химических веществ — сложных и не очень [1], [2]. В химии живого есть несколько уровней сложности системы (рис. 1):

• самый нижний уровень, представленный низкомолекулярными соединениями (неорганическими и органическими ионами, аминокислотами, липидами, моносахаридами, нуклеотидами);
• средний уровень — биополимеров (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот) и их комплексов, включая и живую клетку как совокупность различных биологических молекул;
• высшим уровнем сложности биологической системы оказывается живой организм, составленный из множества самых различных клеток (ну или одна клетка в случае одноклеточных организмов).

Рисунок 1. «Лестница масштабов»: каждый последующий объект крупнее предыдущего в 10 и более раз.

Для того чтобы исследовать химические процессы, связанные с жизнедеятельностью клетки и организма, необходимо уметь выделять из невероятного многообразия компонентов живого вещества то, что планируется исследовать, и уже с этим материалом работать дальше [3]. Собственно, появление вечно молодой бабушки современной молекулярной биологии — биологической химии (на заре ее становления она называлась физиологической химией), — стало возможным только после разработки методов выделения отдельных компонентов живого, для их исследования сперва in vitro, а потом и in vivo.

Разделение сложных смесей молекул и выделение из биологического материала отдельных его компонентов было известно человеку задолго до появления биохимии:

• разделение молока на молочную сыворотку, содержащую белок, и на сливки, содержащие преимущественно жиры-триглицериды;
• сворачивание молока сычужным ферментом в сыроварении с отделением от сыворотки практически всего белка — казеина;
• получение крахмала из зерна и клубней картофеля отмыванием его от других компонентов исходного сырья;
• выделение душистых масел из цветков, коры и плодов растений путем перегонки или экстракции жирами и маслами;
• получение жира для мыловарения вытапливанием.

Все эти практические способы были методами выделения отдельных фракций тех или иных биологических молекул из природного материала. Кратко история развития методов выделения и разделения молекул суммирована на рисунке 2.

Рисунок 2. История развития методик очистки и разделения молекул. 1833 г. — открытие амилазы (диастазы), грубая очистка из солода (А. Пайен и Ж. Персо). 1842 г. — первая книга по химии живого (Ю. Либих). 1842 г. — расщепление гемоглобина (Й. Берцелиус). 1862 г. — кристаллизация гемоглобина (Ф. Хоппе-Зейлер). 1869–1871 гг. — выделение липидов и нуклеиновых кислот (Ф. Мишер). 1877 г. — термин «биохимия» (Э. Бюхнер). 1907 г. — открытие возможности брожения сахаров в бесклеточных системах (Э. Бюхнер). 1926 г. — кристаллизация первого фермента (уреазы) (Дж. Самнер). 1926 г. — изобретение и применение ультрацентрифуги (Т. Сведберг). 1955 г. — применение электрофореза для разделения белков (О. Смитис). 1956 г. — открытие гель-хроматографии (Дж. Порат и П. Флодин) [5], [12]. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Пожалуй, первое «настоящее» и хорошо документированное выделение индивидуального биологического компонента — белка гемоглобина (рис. 3) — предпринял основоположник физиологической химии, профессор Тюбингенского университета (Германия) Феликс Хоппе-Зейлер (1825–1895 гг.). В 1862 году он совершил прорывное открытие, впервые выделив из крови человека в чистом кристаллическом виде окрашенный дыхательный белок гемоглобин [4]. До этого он назывался просто «Blutfarbstoff» — «окрашивающее кровь вещество». Иенс Берцелиус (1779–1848 гг., Швеция), автор термина «органическая химия», до этого смог расщепить грубый препарат гемоглобина на органическое вещество глобулин, и на содержащий железо пигмент, способный связывать кислород.

Рисунок 3а. Гемоглобин — от структуры к кристаллу. Четыре субъединицы объединяются в компактную кубическую структуру.

Рисунок 3б. . — и посмотрите, как кристаллы гемоглобина снаружи напоминают молекулы, их составляющие!

Рисунок 3в. Кристаллы гемоглобина под микроскопом.

Хоппе-Зейлер характеризовал полученный им белок с различных сторон — например, впервые применив ранее предложенный Бунзеном и Кирхгофом спектроскоп для описания спектров поглощения гемоглобина как в чистом виде, так и в комплексе с различными физиологически значимыми газами (кислород, углекислота, угарный газ). Далее Хоппе-Зейлер измерил способность гемоглобина к специфическому связыванию кислорода, и подтверждил современную гипотезу тканевого дыхания, согласно которой газообмен в органах осуществляется через кровь посредством гемоглобина, предложенную ранее Юлиусом Лотаром Мейером (1830–1895 гг., Германия).

Чистые препараты нуклеиновых кислот впервые выделил сотрудник Феликса Хоппе-Зейлера Фридрих Мишер (1844–1895 гг.), ранее работавший с известным немецким химиком Адольфом Штрекером (1822–1871 гг.), специалистом в области органической химии, впервые синтезировавшим аминокислоту аланин из уксусного альдегида, аммиака и циановодорода. В 1869 и 1871 годах Мишер первым указал на то, что белки и липиды являются основными химическими веществами, составляющими цитоплазму клетки, и предпринял первую попытку классификации белков — однако не преуспел в этом из-за недостаточно развитых на тот момент методов анализа. При исследовании гистологически однородной популяции лейкоцитов из гноя он впервые выделил из этих клеток вещество, названное им «нуклеин», выпадавшее в осадок при добавлении кислот и растворявшееся обратно при добавлении щелочей (рис. 4).

Рисунок 4. Микропрепарат гноя человека. Ядерный материал лейкоцитов (ДНК и белки) окрашен в розово-синий цвет красителем азур II, вокруг лейкоцитов лежат лишенные ядра эритроциты. Как можно видеть, ДНК в гное очень много. Справа — поведение «нуклеина», комплекса ДНК и белков, в растворах кислоты (выпадение в осадок) и щелочи (растворение).

Это вещество представляло собой первый грубый препарат ДНК в истории человечества — а вернее, комплекс ДНК с белками (дезоксирибонуклеопротеид). «Согласно имеющимся гистохимическим данным, я предполагаю, что это вещество содержится в ядре клетки», — пишет Мишер, и далее фокусируется на ядре клетки — органелле, о которой тогда было известно очень мало. Нуклеин Мишера радикально отличался от всех известных на тот момент белков тем, что после осаждения не растворялся в воде, уксусной кислоте, разбавленной соляной кислоте и в растворах солей. Мишер разработал протокол выделения клеточных ядер выдерживанием клеток на холоде в растворах соляной кислоты и протокол экстракции нуклеина из ядер щелочами с последующим осаждением. После получения чистого нуклеина Мишер сделал ряд основополагающих открытий о ДНК — например, определил отношение фосфора к другим компонентам, оказавшееся весьма близким к нынешним данным (22,5% против 22,9%), установил природу ДНК как многоосновной кислоты, предположил, что нуклеин является носителем наследственных свойств [5].

Со времени исторических работ первых биохимиков методы выделения и разделения различных молекул, важных для биологии, претерпели значительные изменения, но в целом их содержание осталось примерно тем же. При работе с биологическим объектом первым этапом всегда оказывается разрушение тканей и их предварительное фракционирование [3]. При этом стоит задача максимально предотвратить разрушение целевых молекул, и избавиться от максимального количества загрязняющих примесей.

Для разрушения тканей применяют различные методы — механическую гомогенизацию (например, проворачивание материала в мясорубке), гомогенизацию ультразвуком (при которой клетки разрушаются кавитацией в растворе), продавливание через небольшое отверстие под высоким давлением, замораживание-оттаивание и др. (рис. 5). В среду для разрушения тканей добавляют различные защитные реагенты — например, бета-меркаптоэтанол для предотвращения окисления белков, ингибиторы ферментов (преимущественно гидролаз, разрушающих биополимеры или меняющих их свойства), а саму работу проводят на холоде для максимального снижения скорости действия ферментов в гомогенате.

Рисунок 5. Гомогенизация. Общая схема разрушения биологического материала для получения отдельных субклеточных фракций.

Для выделения макромолекул — белков и нуклеиновых кислот — наиболее часто используют механическую гомогенизацию. Ее можно осуществлять вручную или с помощью специальных устройств — гомогенизаторов.

Метод измельчения образца выбирают в зависимости от метода анализа и объекта исследования. При этом важно избежать перекрестной контаминации образцов, особенно если образец измельчается для последующего молекулярно-генетического анализа.

Например, для измельчения тканей насекомых, хрящей, опухолевого биоптата используют гомогенизаторы, работающие по принципу шаровой мельницы (например, FastPrep 24).

В гомогенизаторах этого типа к образцу добавляют специальные матриксы — шарики разного диаметра из твердых инертных материалов (металл, стекло, керамика, гранатовый или кварцевый песок). При интенсивной вибрации шарики ударяют по образцу, тем самым перемалывая его.

Измельчение происходит в стерильных пробирках объемом 2, 15 или 50 мл. Для предотвращения перегрева образца предусмотрено охлаждение образцов сухим льдом.

Преимущества FastPrep 24:

• измельчение образцов в течение одной минуты;
• одновременное измельчение до 24 образцов;
• отсутствие риска перекрестной контаминации.

Для измельчения сухих образцов (например, семян) использует ножевые мельницы Tube Mill. Фактически это аналог кофемолки, но измельчение происходит в индивидуальной стерильной сменной камере, что позволяет избежать загрязнения образца. Данный вариант идеален при работе с сухими сыпучими продуктами (например, измельчении зерна или комбикорма для анализа на наличие ГМО).

Избежать перекрестной контаминации очень важно и при измельчении ультразвуком. Как правило, при использовании данного метода специальный стержень — зонд — погружают в образец, и здесь возникает высокая вероятность загрязнения образца. При длительном использовании наконечник погружного зонда разрушается, и на нем образуются микротрещины, где могут оставаться вещества, которые легко могут попасть в анализируемый образец.

Чтобы избежать кросс-контаминации, компания Qsonia разработала технологию опосредованного воздействия ультразвукового импульса на образцы.

Суть технологии проста: импульс от зонда, расположенного снизу, передается к образцу в пробирке опосредованно, через жидкость (воду), в которую помещена пробирка с образцом. Эта жидкость, помимо передачи импульса, осуществляет функцию термостатирования образцов, оберегая чувствительные макромалекулы от излишнего перегрева. Данное решение позволяет измельчать до 12 образцов одновременно в одинаковых условиях.

Конечно же это далеко не все варианты гомогенизаци. C другим оборудованием для измельчения образцов вы можете ознакомиться на сайте «Диаэм»:

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Следующим шагом разделения обычно оказывается центрифугирование (рис. 6). Дробное центрифугирование, при котором гомогенат подвергается действию всё бóльших центрифужных полей, позволяет не только отделить неразрушенные клетки, но и выделить отдельные интересующие исследователя компоненты клеток — например, ядра, митохондрии, рибосомы, мембраны. Центрифугирование существенно обогащает препарат целевыми молекулами, сильно упрощая последующие шаги по разделению сложнейшей смеси биокомпонентов, и может быть проведено для большого количества биоматериала — это очень важно для выделения минорных компонентов из смесей [6].

Рисунок 6. Центрифугирование. Вверху — устройство центрифуги. В зависимости от скорости вращения ротора и его размера центрифуга способна генерировать значительные ускорения. Роторы могут быть угловыми и бакет-роторами (с качающимися стаканами), они отличаются направлением действия центробежной силы. Внизу — схема дифференциального центрифугирования. В зависимости от силы приложенного поля мы можем получать различные фракции клетки — от самых крупных органелл (например, ядер), садящихся при небольших значениях относительного ускорения, до самых мелких (рибосом и пр.), осаждающихся большими ускорениями.

Рисунок 7. Ультрацентрифуга. Прибор, способный создавать в пробирках с биоматериалом огромные перегрузки — до 1 000 000 g. В таком центробежном поле можно осадить даже ионы, не говоря уже про крупные белки или органеллы клетки. Центрифужный ротор сделан из особо прочного материала (титана), камера охлаждается точным холодильником (для исключения конвекции образца), ротор вращается в глубоком вакууме (для предотвращения разогрева из-за трения о молекулы воздуха). Можно сказать, что образец летит на искусственном метеорите.

Центрифуги очень широко применяются как в промышленности (например, в молочной для отделения сливок от обрата или для разделения смесей твердых и жидких веществ), так и в лаборатории. Основные параметры центрифуги — максимальный объем вещества, помещающийся в ее ротор, и создаваемое ей центрифужное поле. Обычно это поле выражают как относительное центробежное ускорение — в единицах, кратных гравитационному показателю Земли g (ускорению свободного падения), и данная величина оказывается пропорциональна скорости вращения ротора центрифуги. Для разных целей применяют центрифуги с разными максимальными ускорениями — от сотен и тысяч g для разделения грубых смесей до сотен тысяч g для осаждения индивидуальных белков из раствора. Ультрацентрифуга (рис. 7), создающая высокие ускорения, была долгое время единственным способом определения молекулярной массы крупных белков — эта масса была пропорциональна скорости движения молекул белка в центрифужном поле.

Как вы можете догадаться, центрифугирование образцов на высокой скорости имеет ряд нюансов. В первую очередь — это обеспечение сохранности образцов, чувствительных к нагреву. Для предотвращения перегрева образцов из-за трения, ультрацентрифуги оснащают системами вакуумирования и охлаждения. Так что на выходе мы имеем весьма громоздкий напольный агрегат.

Но время и технологии не стоят на месте. Компания Thermo Fisher Scientific выпустила компактную настольную версию микроультрацентрифуги Sorvall MTX 150. Центрифуга дает 1 048 680 g, имеет встроенный компрессор для термостатирования образцов и при этом обладает весьма скромными габаритами и весом: габариты 582×590×408 мм; вес — 97 кг.

Другие виды центрифуг:

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

После центрифугирования препарат можно подвергнуть или экстракции отдельных интересующих исследователя химически близких групп компонентов (например, смесью эфира и метанола можно количественно извлечь из мембран липиды), или предпринять дальнейшие усилия по отделению примесей. Наиболее сложным вопросом при таком разделении оказывается разделение белковых смесей — необходимо выделить зачастую весьма немногочисленный компонент смеси, при этом он не должен потерять своей естественной биологической активности. Выделенный фермент должен работать не хуже, чем он это делает в клетке, выделенный фактор транскрипции должен хорошо и специфично связываться с ДНК, иными словами, выделенные белки должны оставаться нативными — такими же, как в живой клетке.

Рисунок 8. Высаливание белка. При определенном значении рН среды белки имеют различную растворимость в растворах неорганических солей — и, повышая содержание соли в растворе, мы можем переводить определенные белки из растворенного состояния в осадок, который потом отделять центрифугированием.

Для первичного разделения смесей белков можно применять различия растворимости белков в растворах солей. Феномен высаливания белка (рис. 8) известен давно — так, кристаллы яичного белка овальбумина добавлением насыщенного раствора сульфата аммония получил Франц Гофмейстер в 1890 году. То, что белки по-разному растворимы в растворах солей, активно используется и в промышленности — например, рассольные сыры делаются более плотными за счет засаливания в концентрированном рассоле. Если мы добавим к раствору белка насыщенный раствор хорошо растворимой соли — сульфата аммония, — достигнув, например, 10% насыщенной концентрации, то некоторые белки выпадут в осадок, то есть обратимо денатурируют. Если мы разведем этот осадок водой или не содержащей сульфата аммония буферной средой, осадок растворится, а белки из него вернутся от денатурированной к нативной конформации. Если мы будем повышать концентрацию сульфата аммония ступенчато, и всякий раз отделять осадок белка центрифугированием, мы сможем грубо фракционировать исходную смесь, а целевой белок обнаружить в определенной фракции по его свойствам, например, цвету или ферментативной активности. Именно возможность фракционирования белковых смесей высаливанием позволила разделить белки плазмы крови на фракции глобулинов (выпадающих в осадок при более низкой концентрации сульфата аммония) и альбуминов (остающихся в растворе белков меньшего, чем глобулины, размера), и именно высаливанием до сих пор пользуются для приготовления как отдельных фракций сывороточных белков для медицины, так и для выделения фракции иммуноглобулинов — антител [7].

Рисунок 9. Изоэлектрическая точка. Заряд белковой молекулы зависит от рН среды вокруг него — когда количество отрицательных и положительных зарядов у белковой молекулы равно, ее общий заряд равен нулю. Белковые молекулы в растворе перестают отталкиваться друг от друга, начинают слипаться и могут образовать осадок. Растворимость белка в изоэлектрической точке минимальна.

Белки и их смеси — особенно сложные для работы объектами, так как физико-химические свойства разных белков сильно отличаются друг от друга благодаря различному аминокислотному составу. Белки состоят из аминокислот, в боковой цепи которых могут встречаться полярные группы — например, кислотные или основные остатки. В зависимости от водородного показателя (рН) среды, в которой находится белок, то есть от кислотности среды, белок может иметь различный заряд, то есть белковая молекула может быть отрицательно заряжена в щелочной среде, иметь нулевой заряд в нейтральной среде и перезаряжаться (становиться положительно заряженной). Точка рН, соответствующая нулевому заряду белка, называется его изоэлектрической точкой (рис. 9), и белки в ней обычно имеют минимальную растворимость. Навязывая белку определенную кислотность среды, мы можем получить выпадение белка в осадок — и именно это заставляет скисшее молоко, в котором лактобактерии сбродили молочный сахар до молочной кислоты, разделяться на сыворотку и белковые сгустки. Изоэлектрическая точка основного белка молока, казеина, лежит как раз в области кислых значений рН.

Рисунок 10. Диализная очистка. Раствор высокомолекулярного вещества (белка, синие точки) и соли (красные точки) помещен в мешочек из целлофана (целлюлозной мембраны, поры которой пропускают ионы соли и задерживают крупные молекулы белка). Если такой мешочек поместить в раствор, не содержащий соли, то соль начнет выходить из мешочка через поры, а белок останется внутри. Примерно так устроены и наши почки — соль и низкомолекулярные продукты обмена уходят в мочу, а белки остаются в плазме крови.

При выделении отдельных макромолекул — ДНК, белков, полисахаридов — часто встает задача отделения от них низкомолекулярных примесей. Так, например, после высаливания белка необходимо удалить из осадка избыток сульфата аммония, одновременно переведя белок в нативное растворимое состояние. Если мы поместим наш осадок в мешочек из полупроницаемой мембраны (например, целлофана — химически обработанной целлюлозы, поры которой пропускают ионы соли и другие низкомолекулярные вещества, но слишком узки для больших молекул белка или ДНК), а сам мешочек опустим в дистиллированную воду или буферный раствор с небольшим содержанием соли, осадок начнет растворяться, а соль выходить в раствор снаружи мешочка. Так будет происходить до момента, пока концентрации соли по разные стороны мембраны не сравняются. Если мы будем менять раствор снаружи, мы сможем полностью удалить все низкомолекулярные примеси из препарата — они выйдут через поры мешочка, а биополимеры останутся внутри. Такой прием называется диализом (рис. 10) — и именно по этому принципу у нас работают почки, удаляющие из организма лишние соли, продукты азотистого обмена и другие низкомолекулярные вещества, но сохраняющие в организме все высокомолекулярные белки.

«Диаэм» предлагает широкий выбор продукции для диализа производства Thermo Fisher Scientific — диализные мешки, кассеты, флаконы, спин-колонки и др. Они предназначены как для диализа в классическом понимании, так и для концентрирования или обессоливания белковых растворов. Важная характеристика диализной мембраны — отсечка молекулярной массы (размера молекул, способных проходить через поры мембраны). Обычно она варьирует от 2 до 20 кДа. Объем образца может варьировать от 10 мкл до 500 мл — в зависимости от типа диализной емкости.

Емкость для диализа используют при работе с небольшим количеством образца, в диапазоне от 10 мкл до 2 мл. Кассеты для диализа необходимы, когда количество образца составляет от 0,5 мл до 30 мл. При больших объемах (от 150 до 250 мл) используют колбы для диализа. Планшеты для диализа предназначены для обработки от 1 до 96 образцов объемом от 10 до 100 мкл. Также в разделе представлены традиционные мешки для диализа в виде трубочек объемом от 2 мл до 9,6 мл.

Одно из популярных устройств для диализа — диализные кассеты Slide-A-Lyzer производства Thermo Fisher Scientific. В отличие от традиционных диализных мешков кассеты Slide-A-Lyzer не требуют зажимов и гарантируют отсутствие потери диализуемого образца из-за протечек. Кроме того, кассеты снабжены поплавком, удерживающим их в вертикальном плавучем положении при погружении в раствор.

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Смесь белков иногда можно весьма эффективно разделить и способами, при которых примесные белки денатурируют (рис. 11) — превращаются в нерастворимый осадок, а целевой белок остается в растворе. Например, если мы синтезируем в клетках кишечной палочки термостабильный белок, ген которого взят из живущих в горячих источниках архей (например, фермент ДНК-полимеразу из Thermus aquaticus, температурный оптимум которого находится около 72 °С), мы можем отделить практически 99% всех белков кишечной палочки от нужного нам белка, просто прогрев гомогенат клеток при 80 градусах. Не обладающие термостабильностью белки кишечной палочки денатурируют, а нужный нам рекомбинантный белок останется в растворе.

Рисунок 11. Различные способы денатурации белков. Тепловая денатурация белков при приготовлении пищи — так еда становится вкуснее, а денатурированный белок доступнее для пищеварительных ферментов. Механическая денатурация — взбивание белков — сродни тепловой, только происходит из-за механического «запутывания» белковых молекул. Высаливание — обратимая денатурация, рассмотренная ранее.

Рисунок 12. Гель-хроматография. Смесь белка (синие точки) и соли (красные точки) нанесена на колонку с носителем, поры которого не пропускают белок внутрь. При промывании колонки буферным раствором соль «застревает» в носителе, свободно диффундируя в его гранулы, а белок выходит, не задерживаясь. Так можно быстро и просто разделить как смеси белков и соли, так и смеси белков разного размера (подбирая диаметр пор носителя).

Важным способом разделения смесей биомолекул по размеру является гель-хроматография [8], или проникающая хроматография (рис. 12).

В 1959 году шведские ученые Порат и Флодин впервые предложили новый метод разделения сложных смесей белков по молекулярной массе, и это стало возможно благодаря полученному им новому материалу под торговой маркой Sephadex. Длинные линейные молекулярные цепочки полисахарида декстрана сшивали между собой так, что удавалось получить молекулярные сита — материал с контролируемым в широком диапазоне размером пор. Этот материал был доступен в виде гранул разного размера — от микрон до сотен микрон. Белки и другие биомолекулы не адсорбировались этим материалом и не теряли своей нативной активности. Материал замачивали в буферном растворе — гранулы набухали, поры заполнялись раствором и начинали напоминать маленькие поролоновые шарики.

Дальше ими наполняли длинную трубку с воронкой сверху и краном снизу, закрывали кран, и наносили сверху смесь биологических макромолекул. Крупные молекулы белка были слишком велики для того, чтобы проникнуть в поры молекулярных сит, ну а низкомолекулярные вещества (соли, витамины, коферменты, нуклеотиды) свободно диффундировали вглубь шариков сита через поры. Через воронку начинали пропускать буферный раствор, а из крана вытекал раствор, который до того был внутри шариков сита и между ними. Крупные молекулы, не вошедшие в шарики, двигались с раствором между шариками, в исключенном объеме, равном примерно объему жидкости между шариками, а низкомолекулярные вещества задерживались материалом колонки и выходили сильно позже — с объемом, примерно равным объему колонки, то есть с полным объемом. Так удалось отделить крупные молекулы от мелких (чем-то похоже на диализ, правда?), а при подборе размера пор у молекулярного сита удалось достичь и хорошего разделения смесей биомолекул на размерные классы — длинные участки ДНК от коротких, крупные белки от мелких. Этот метод до сих пор активно применяется и при определении молекулярной массы белков и ДНК — для этого колонку с носителем сперва калибруют по смеси белков или ДНК известного размера.

Рисунок 13. Ионобменная хроматография. Белки с различным зарядом наносят на колонку, содержащую заряженный определенным образом сорбент. Белки с противоположным заряду сорбента зарядом задерживаются в колонке, с одноименным зарядом — выходят из нее. Задержавшиеся белки можно снять с сорбента определенной концентрацией низкомолекулярной соли, растворенной в буферном растворе. Маленькие ионы соли, находящиеся в большом молярном избытке по сравнению с крупными белковыми молекулами белка, «сталкивают» их с сорбента в раствор, занимая их место.

Если взять похожий носитель с крупными порами, но сделать его поверхность заряженной положительно или отрицательно (например, химически присоединив к носителю различные заряженные группы — аминогруппу, сульфогруппу и пр.), можно использовать его для другого вида разделения — ионообменной хроматографии [9] (рис. 13). Например, ДНК, представляющая собой поликислоту, заряженную в нейтральных или щелочных условиях отрицательно, будет взаимодействовать с положительно заряженным носителем — анионообменником, связываясь с группами на его поверхности. При добавлении в систему избытка соли ее анионы будут конкурировать с ДНК за группы на носителе, и вытеснять ДНК из комплекса с носителем, причем соли потребуется тем больше, чем длиннее молекулы ДНК, связанные с носителем. Та же картина будет наблюдаться и с белками, заряженными отрицательно. Для связывания положительно заряженных белков необходим носитель с отрицательными группами на поверхности — катионообменник. Этот метод позволяет отсеять из сложной смеси молекулы, не имеющие в данных условиях заряда, или заряженные так же, как носитель — связывание окажется невозможным, и эти молекулы просто выйдут из колонки с носителем.

Партнером этой публикации является «Галахим» — компания, специализирующаяся на продаже, установке и сервисном обслуживании аналитических и препаративных хроматографов.

Говоря о хроматографии, невозможно не упомянуть высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) — наиболее эффективный метод разделения сложных смесей веществ, часто используемый в аналитической химии и химической технологии. Принцип жидкостной хроматографии основан на различии компонентов в их равновесном распределении между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элюент). Слово «высокоэффективная» подразумевает, что разделение ведется при высоком давлении (до 400 бар) и с использованием мелкозернистых сорбентов (обычно 3–5 мкм, но бывает и менее 2 мкм). Как правило, время анализа занимает от 3–5 до 30 минут, в зависимости от условий и анализируемой смеси.

Аналитическая ВЭЖХ применяется для качественного и количественного определения веществ. Но если задача шире, например, нужно выделить и очистить целевой продукт, а также иметь возможность масштабировать этот процесс вплоть до килограммов, на помощь может прийти препаративная хроматография. Ее активно применяют в молекулярной биологии и химии, в промышленном фармацевтическом производстве и для многих других задач, перечисленных в таблице.

Рисунок 14. Базовый принцип препаративной хроматографии на примере метода, предложенного Кларком Стилом. Колонка, заполненная песком и силикагелем, оснащенная также краником для дозирования элюата.

Препаративную хроматографию как метод впервые разработал в 1978 г. профессор Колумбийского университета У. Кларк Стил. Он же ввел в обиход термин флэш-хроматография (рис. 14) [10]. Эта методика позволяла ускорить процесс разделения даже относительно сложных смесей, но имела существенные недостатки, главные из которых:

• самостоятельная упаковка колонок, приводящая к низкой воспроизводимости результатов;
• необходимость переупаковки колонки для каждого нового процесса;
• сложность ввода в колонку труднорастворимых образцов;
• невозможность контроля разделения веществ, не поглощающих в видимой области спектра.

Большинство из перечисленных проблем к концу семидесятых годов успешно решалось классической ВЭЖХ. Но очистка вещества при помощи ВЭЖХ — всегда компромисс между получением желаемой чистоты вещества, объемом загрузки и производительностью хроматографической системы. Другие недостатки препаративной ВЭЖХ: высокая стоимость колонок и сорбентов, необходимость самостоятельной упаковки колонок большого объема, что может существенно влиять на воспроизводимость результатов.

Таким образом, к концу XX века образовался разрыв между недорогим, но не самым эффективным методом флэш-хроматографии, и эффективным, но весьма дорогостоящим методом препаративной ВЭЖХ. Французская компания Interchim SA (производитель материалов для хроматографии и твердофазной экстракции) успешно решает эту проблему, выпуская хроматографы серии puriFlash (рис. 15), выгодно отличающиеся от аналогичного оборудования других производителей. Идеология этих приборов основана на современной концепции Ultra-Performance Flash Purification (UPFP), то есть «Ультрапроизводительной флэш-очистки».

Рисунок 15. Устройство препаративного хроматографа puriFlash — блок управления, коллектор фракций, насос, камера смешения, детектор и другие элементы прибора отмечены на схеме. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Основное отличие UPFP от традиционной флэш-хроматографии заключается в использовании сорбентов со сферическими частицами малого размера, что максимально сближает такие материалы с сорбентами ВЭЖХ-качества. Применение в качестве хроматографических колонок пластиковых картриджей, уже заполненных сорбентом, позволяет существенно увеличить скорость потока элюента и снизить давление в системе. Это обеспечивает столь востребованную воспроизводимость процесса при смене картриджа. Кроме того, увеличение максимального давления в приборах PuriFlash до 250 бар позволяет работать и с металлическими препаративными ВЭЖХ-колонками.

Группа компаний «Галахим» осуществляет поставку, пуско-наладку и сервисное обслуживание препаративных хроматографов Interchim puriFlash и аналитического оборудования ЖХ/МС, ЖХ/МС/МС, ГХ/МС, ВЭЖХ-систем, спектрофотометров, спектрофлюориметров. В «Галахиме» большой выбор расходных материалов и реактивов от лучших производителей, а наши менеджеры всегда проконсультируют вас по продукции и подберут оптимальный вариант по критерию «цена-качество». Доставка по всей России!

Полезные ссылки на брошюры на русском языке: хроматографы Hitachi для ВЭЖХ и УВЭЖХ, флэш-хроматографы Interchim, специальные цены на расходные материалы для хроматографии для читателей «Биомолекулы»!

Материал предоставлен партнёром — компанией «Галахим»

Рисунок 16. Гель-электрофорез. Чем молекулы ДНК объемистее, тем сложнее им бегать — все как у людей!

Разделение смесей биомолекул в электрическом поле называется электрофорезом (рис. 16, 17, 18). Молекулы будут двигаться в сторону соответствующего полюса в поле постоянного тока, и скорость их движения будет зависеть как от степени их заряда, так и от их размера. Если мы поместим смесь биомолекул в буферный раствор и приложим постоянное напряжение, молекулы сперва начнут делиться, а потом немедленно перемешаются благодаря конвекции — водный раствор будет выполнять функции резистора, полностью рассеивая всю приложенную энергию электрического тока в виде тепла. Для предотвращения конвекции и в качестве молекулярного сита обычно используют гели агарозы (полисахарида, линейного компонента агара) или полиакриламида (полимеризованного амида простейшей непредельной карбоновой кислоты — акриловой).

Рисунок 17. Гель-электрофорез. На этом рисунке виден гель — молекулярное сито, «полоса препятствий» для заряженных молекул. Все молекулы ДНК будут двигаться по направлению к аноду, но скорость их движения будет различаться — чем молекула крупнее, тем труднее ей будет преодолевать препятствия.

Подбирая концентрацию этих веществ, можно получать гели с заданной величиной пор, оптимизируя их для разделения тех или иных смесей. В геле биомолекулы движутся со скоростью, пропорциональной их длине — чем мельче, тем быстрее, — и заряду. Такой вариант электрофореза хорошо подходит для разделения химически однородных смесей, содержащих молекулы одного типа, но разной длины — например, смеси фрагментов нуклеиновых кислот. ДНК будет двигаться в поле постоянного тока от отрицательного полюса к положительному, и ее движение можно видеть в ультрафиолетовом свете — после добавления в гель особого красителя бромистого этидия, комплекс которого с ДНК флуоресцирует ярко-оранжевым светом. Отдельные компоненты смеси разделяются на полоски, содержащие популяцию молекул одной длины. Гель напоминает по текстуре мармелад или студень — и нужную полоску можно вырезать из геля, а молекулы из нее исследовать другими способами.

Для смесей белков такой вариант электрофореза — нативный — подходит далеко не всегда: при том, что белки состоят из аминокислот, их заряд может существенно отличаться при различных значениях рН среды, да и форма/размер белков могут варьировать в широких пределах. Представим, что мы поместили в поле постоянного тока смесь белков с положительным, нейтральным и отрицательным зарядами. Каждый из заряженных белков пойдет к своему противоположному по заряду полюсу, а нейтральные незаряженные белки останутся на месте. Более того, крупные белки могут вообще оказаться крупнее пор геля и не войти в них, несмотря на свой заряд. Для того чтобы все белки стали заряжены одноименно, и превратились в частицы примерно одинаковой формы, мы можем обработать белок анионным детергентом — поверхностно-активным веществом додецилсульфатом натрия. Именно он является основой практически всех стиральных порошков и моющих средств для бытовых нужд. Белки под его воздействием разворачиваются и становятся похожи на ниточки, плотно облепленные молекулами додецилсульфата натрия, и заряд у этих ниточек оказывается отрицательным за счет сульфогруппы детергента.

Такие белки не будут обладать нативной биологической активностью — денатурируют, но будут разделяться в геле по размерам — скорость движения таких частиц пропорциональна их длине, и все белки пробы будут двигаться в электрическом поле строго в одном направлении, от катода к аноду. Такой вариант — денатурирующий электрофорез — активно применяется для анализа белковых смесей любой сложности (рис. 18). И в нативном, и в денатурирующем электрофорезе есть задача увидеть бесцветные белки, разделенные на геле. Обычно для этого используют органические красители — например, кумасси бриллиантовый синий, плотно связывающийся с белками и окрашивающий их в синий цвет, но отмывающийся от не содержащего белки геля. Синие белковые полосы на бесцветном фоне отлично читаются, и по стандартам молекулярной массы на том же геле можно определить примерную молекулярную массу неизвестного белка.

Рисунок 18. Схема проведения белкового гель-электрофореза. Белки денатурируют бета-меркаптоэтанолом, при этом они утрачивают все виды структуры выше первичной, превращаясь в отдельные ниточки — полипептидные цепи. Эти цепи оказываются плотно покрыты детергентом — додецилсульфатом натрия, молекулы которого маскируют собственный заряд белка. Таким образом, все белки пробы будут в электрическом поле двигаться к аноду.

Электрофорез широко применяют в качестве препаративного метода для выделения макромолекул заданного диапазона. При этом лаборант после идентификации нужной полосы на геле вырезает скальпелем нужный фрагмент и выделяет из него белки или нуклеиновые кислоты.

Метод не очень удобен тем, что весьма трудоемок и результат зависит от того насколько «тверда» рука лаборанта.

Компания Sage Science выпустила систему препаративного электрофореза белков и нуклеиновых кислот BluePippin. Принцип метода тот же, что и в классическом электрофорезе: движение макромолекул в геле, который заполняет тонкий Y-образный капилляр, от одного электрода к другому. Но в нужный момент направление тока меняется, и заданная фракция собирается в отдельной лунке.

Таким образом, лаборанту остается только внести образец в лунку, задать диапазон интересующих масс и дождаться, когда система соберет нужную фракцию в отдельную лунку.

Данная концепция стала довольно популярна в лабораториях генетического анализа (для подготовки библиотек ДНК/РНК с заданным диапазоном длин фрагментов), а также в лабораториях, где используют метод времяпролетной масс-спектрометрии при анализе белковых молекул.

Видео. Система BluePippin: принцип метода.

В последнее время все большим спросом пользуются готовые полиакриламидные гели для электрофореза белков. Преимущества готовых гелей:

• экономия времени;
• возможность выбора геля, оптимально отвечающего исследовательской задаче;
• воспроизводимость результатов;
• сведение к минимуму ошибок, связанных с человеческим фактором при заливке геля.

Выбор гелей велик. Ниже приведена схема, которая позволит выбрать подходящий гель для различных экспериментальных задач:

• анализа низко- и высокомолекулярных белков;
• нативного и денатурирующего электрофорезов;
• изоэлектрофокусирования, двумерного электрофореза;
• анализа протеиназ (узкоспециализированные гели).

Помимо готовых гелей и реагентов для их приготовления, «Диаэм» предлагает источники тока, камеры для вертикального и горизонтального электрофорезов, а также вспомогательные реагенты (буферные растворы и маркеры молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот, красители белковых гелей).

Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»

Используя примерно одну и ту же схему эксперимента — колонку, наполненную носителем, через которую можно пропускать раствор разделяемой смеси и другие растворы, — можно получить еще несколько вариантов хроматографического разделения сложных смесей. Например, если на поверхность носителя нанесены специфичные к белку антитела, белок будет связываться с ними и оставаться на поверхности носителя, откуда потом его можно снять. Такой метод называется иммунохроматографией, и это один из вариантов аффинной хроматографии — хроматографии по сродству (рис. 19). Любое вещество, связанное с носителем, и способное взаимодействовать с целевым белком — лиганд, — в принципе можно использовать для выделения целевого белка из смесей [11]. Гликопротеины (белки, содержащие углеводную часть) могут быть выделены на носителях, покрытых лектинами — белками, узнающими углеводы. Ферменты можно выделять по связыванию с иммобилизованными на носителе субстратами этих ферментов.

Рисунок 19. Аффинная хроматография. Колонка наполнена сорбентом, покрытым веществом, которое способно узнавать интересующую нас молекулу, или самими интересующими нас молекулами — смотря что мы хотим выудить из пробы. После пропускания через колонку смеси веществ в ней задержится только то, что способно специфически связаться с сорбентом. Потом это вещество можно снять с колонки или высокой концентрацией соли, или другим значением рН среды, или денатурантом — условиями, нарушающими специфическое сродство связанной молекулы и сорбента.

Практически любое исследование в биомедицинской области включает в себя то или иное разделение сложных смесей биологических молекул. Разберем диагностику инфекционного заболевания, вызванного патогенными микробами, по шагам (рис. 20).

1. Взятие пробы у пациента. Биологический материал из области воспаления тщательно измельчают, смешивают с инактивирующим бактерии реагентом, а затем растворяют содержащиеся в нем клетки (патогена и пациента) так, чтобы ДНК из клеток перешла в раствор.
2. Выделение ДНК. Для выделения ДНК к лизированному препарату биоматериала добавляют носитель, специфично связывающий ДНК. Носитель несколько раз отмывают от прочих компонентов пробы, не связавшихся с ним, и снимают ДНК с его поверхности.
3. Амплификация ДНК. Фрагменты ДНК патогенного микроба специфически амплифицируют с помощью ПЦР, получая фрагмент ДНК определенной длины. В реакции параллельно участвует положительный контроль — ДНК патогена — и отрицательный контроль, не содержащий ДНК (он нужен для контроля чистоты реагентов).
4. Электрофорез ДНК. Полученные продукты ПЦР разделяют гель-электрофорезом и анализируют результат. Наличие в продуктах ПЦР фрагмента ДНК, соответствующего ожидаемой длине и совпадающего по длине с фрагментом, полученным амплификацией с ДНК патогена (положительным контролем), подтверждает наличие ДНК патогена в исследуемой пробе.

Рисунок 20. Схема определения методом ПЦР наличия ДНК патогенного микроорганизма в пробе биоматериала пациента. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

В этом простейшем исследовании применяются два приема разделения смесей биомолекул — сперва для выделения ДНК, а потом для анализа продуктов ПЦР. Любой биомедицинский анализ включает в себя разделение смесей на этапе подготовки пробы, а далее на этапе получения данных. Возможны комбинации самых разных подходов к разделению смесей биомолекул, и каждый новый вариант таких систем немедленно включается в практику исследований.

Несмотря на почтенный возраст большинства методов разделения сложных смесей биологических молекул, эти методы нисколько не утрачивают своей актуальности. Развитие новых методов исследования, способных работать в микромасштабе, разработка новых приборов для анализа сделает разделения быстрее и удобнее, и позволит прийти к созданию новых диагностических и терапевтических приборов и подходов. Совершенству не может быть предела.

На основе статей спецпроекта мы решили сделать календарь «12 методов биологии» на 2019 год. Эта статья представляет январь.

источник