Разделение белковой смеси методом электрофореза

Лабораторная работа №8

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ

Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 B.

Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),

Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза

через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 — 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, — уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.

Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 — 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 — 8,9) при градиенте потенциала 3 — 5 В/см (120 — 350 B для полос длиной 40 — 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 — 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге — прогорание бумаги

1. Буферный раствор. Можно использовать:

а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;

б) веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;

в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.

2. Растворы для окраски электрофореграмм:

а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) —0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) — 100 мл + метиловый спирт — 900 мл;

б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;

в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO₄·7H₂O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.

3. Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:

а) уксусная кислота — 2 %-й раствор;

б) уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.

4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:

а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;

б) для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.

Получение сыворотки крови. 2 — 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 — 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.

Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18×45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 —5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы —2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 —8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.

Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 — 0,02 мл (1 — 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 — 24 ч при напряжении 200 — 300 B

Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 — 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 — 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 — 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.

Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α₁-, α₂-, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 —5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.

Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций

Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.

Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат — соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

источник

Изучение физико-химических свойств, химического состава и структуры возможно только при исследовании очищенного белкового препарата. Для выделения и фракционирования индивидуальных белков используются: высаливание, осаждение органическими растворителями, гельфильтрация, электрофорез, ионообменная хроматография, аффинная хроматография.

Высаливание белковосновано на зависимости растворимости белка от свойств среды. В дистиллированной воде протеины растворяются хуже, чем в слабых растворах солей, так как низкие концентрации ионов поддерживают их гидратные оболочки. Но при высоких концентрациях соли молекулы белка теряют гидратные оболочки, агрегируют и образуется осадок. После удаления соли белки вновь переходят в раствор, сохраняя нативные свойства и конформацию.

Изменение растворимости при различных концентрациях соли и рН среды используется для выделения индивидуальных белков. Чаще всего для высаливания белков используют растворы сульфата аммония разной концентрации.

Осаждение белков из раствора без их денатурации осуществляют с помощью дегидрирующих агентов — органических растворителей (этанол, ацетон).

Гель-фильтрацияоснована на разделении белков по величине и форме молекулы. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных гранулами пористого геля (сефадекса, агарозы), в буферном растворе с определенным значением рН. Гранулы геля проницаемы для белков благодаря внутренним каналам (порам) с определенным средним диаметром, размер которого зависит от типа геля (сефадекс G-25, G-200 и т.д.). Смесь белков вносят в колонку и затем вымывают (элюируют) буферным раствором с определенным значением рН. Крупные молекулы белка не проникают в поры геля и перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем. Мелкие молекулы низкомолекулярной примеси (соли) или другого белка удерживаются гранулами геля и вымываются из колонки медленнее (рис. 1.29). На выходе колонки раствор (элюат) собирают в виде отдельных фракций.

Рис. 1.29. Разделение белков методом гель-фильтрации

Электрофорезоснован на свойстве заряженных молекул белка перемещаться в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие при данном значении рН суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду, а положительный — к катоду. Электрофорез проводят на разных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. Скорость перемещения зависит от заряда, массы и формы молекул белка. После завершения электрофореза зоны белков на носителе окрашивают специальными красителями (рис. 1.30, А).

Разрешающая способность электрофореза в геле выше, чем на бумаге, так при электрофорезе белков сыворотки крови на бумаге выделяют 5 фракций (альбумины, α₁-, α₂-, β-, γ-глобулины), а в полиакриламидном геле — до 18 фракций (рис. 1.30, Б).

Рис. 1.30. Электрофореграмма белков сыворотки крови здорового человека

А— электрофореграмма белков сыворотки крови на бумаге;

Б— количество белков плазмы разных фракций.

I — γ-глобулины; II — β-глобулины; III — а₂-глобулины;

IV — а₁-глобулины; V — альбумины

Ионообменная хроматографияоснована на разделении белков, отличающихся суммарным зарядом. Раствор белка с определенным значением рН пропускают через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым сорбентом, при этом часть белков задерживается в результате электростатического взаимодействия. В качестве сорбента используют ионообменные вещества: анионообменники (содержащие катионные группы) для выделения кислых белков; катионообменники (содержащие анионные группы) для выделения основных белков.

При пропускании белка через колонку прочность его связывания с ионообменником зависит от величины заряда, противоположного заряду сорбента. Адсорбированные на ионообменном сорбенте белки элюируют буферными растворами с различной концентрацией соли и рН, получая разные фракции белков.

Аффинная хроматографияоснована на специфичности связывания белка с лигандом, присоединенным к твердому носителю. В качестве лиганда используются субстраты ферментов, простетические группы холопротеинов, антигены и т.д. При пропускании через колонку смеси белков к лиганду присоединяется только комплементарный протеин (рис. 1.31, А), все остальные выходят вместе с раствором. Адсорбированный белок элюируется раствором с другим значением рН (рис. 1.31, Б). Этот метод высокоспецифичен и позволяет получать белковые препараты высокой степени очистки.

Выделение и очистка белка обычно проходят в несколько стадий с использованием различных методов. Последовательность стадий подбирается эмпирическим путем и может различаться для разных протеинов. Высокая степень очистки белков очень важна как при использовании их в качестве лекарственных препаратов (гормон инсулин и т.д.), так и при диагностике различных заболеваний по изменению белкового состава тканей, крови, слюны и др.

Набор белков в клетках различных органов взрослого человека индивидуален и поддерживается относительно постоянным на протяжении жизни. Специализированные ткани могут содержать специфические белки, например гемоглобин в эритроцитах, актин и миозин в мышцах, родопсин в сетчатке глаза, разные типы коллагена в костной и соединительной тканях. Некоторые белки содержатся во многих тканях, но в разных количествах. Отдельные изменения состава

Рис. 1.31. Разделение белков методом аффинной хроматографии

А— связывание выделяемого белка со специфическим лигандом, присоединенным к нейтральному носителю; Б— получение раствора индивидуального белка

белков тканей и крови возможны и связаны прежде всего с режимом питания, составом пищи, физической активностью человека.

При заболеваниях белковый состав крови и клеток тканей может существенно изменяться, часто развивается недостаточность какого-либо белка либо снижение его активности — протеинопатия.Поэтому определение выраженных изменений белкового состава крови и тканей используется для диагностики различных заболеваний в клинических исследованиях.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9336 — | 7292 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Вопрос 5.Методы разделения и очистки белков. Высаливание, диализ, электрофорез, хроматография. Основные методы количественного определения белка в растворах (фотометрия, иммунохимия).

Методы выделения и очистки белков

Получение индивидуальных белков из биосинческого материала (тканей, органов, кле-точных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:

• дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;

• фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;

(■ экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);

• разделение смеси белков на индивидуальные белки.

Методы разрушения тканей ж экстракции белков

Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, ме-год попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.

Гомогенизация биологического материала

Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает я растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

Метод замораживания и оттаивания ткани

В результате попеременного замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.

Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на прото-меры

Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.

Механизм действия детергентов описан в разделе «Денатурация белков» (см. рис. 1-15). При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протоме-рами в олигомерных белках.

Удаление из раствора небелковых веществ

Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.

Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков — их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.

Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах. На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.

Очистка белков избирательной денатурацией

Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50-70 «С или подкисле-нии раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок белки, или осадить их центрифугированием.

Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щё-лочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония — (NH₄)₂S0₄. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Для разделения белков часто используют хро-матографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хром. колонка заполняется гранула пористого вещества .В стрктуре полисахарида образуются полур. связи и формируются гранулы через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной «пор».Неподвижная фаза — жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесения А на хроматографическую колонку, вымывая (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутри гранул и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего движение задерживается. Величина пор опрелЯ ляет размер молекул, способных проникали внутрь гранул

Так как гелевая структура сефадекса легко лея формируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-1 оперл), представляющими сферические грануян с разными размерами пор. Выбор размеров пор! в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет сказано ниже).

Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помешают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой (рис. 1-56). После расслоения белковых фракций дно кюветы прокалывают I иглой и по каплям собирают содержимое не- ‘ большими порциями в пробирки. ‘Электрофорез белков

Метод основан на том, что при определениями -значении рН и ионной силы раствора бел-

ки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки — к катоду (—).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакрила-мидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, а,-глобулины, с^-глобули-ны, Р-глобулины и у-глобулины .Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники — полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анио-нообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника опреДСЛЯОТОЯ шридом выделяемого белка. Так, дли выделения ОТрИШ

тельно заряженного белка используют анионооб-менник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионо-обменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике. можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и I вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постелен- I ное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, при водит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок. \/ Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рис. 1-58). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

источник

Лабораторная работа №8

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ

Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза

1. Буферный раствор. Можно использовать:

2. Растворы для окраски электрофореграмм:

б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;

в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO₄·7H₂O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.

а) уксусная кислота — 2 %-й раствор;

б) уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.

4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:

а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;

б) для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.

Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

источник

Метод электрофореза является одним из самых распространенных, мощных и доступных методов исследования белков. Этот метод широко применяется как в научных исследованиях, так и при экспертизе качества продуктов питания и медицинских препаратах, а также в клинических лабораториях.

С помощью метода электрофореза производят:

1) анализ сложных смесей белков (в генетических исследованиях, при выделении и биотехнологической наработке белков)

2) обнаружение определенного белка (при проведении экспертизы, контроле биотехнологических процессов, клинических анализах)

3) определение молекулярной массы белков (в фундаментальных исследованиях)

4) исследование структуры белков (анализ расположения в биологических мембранах, взаимодействия с другими белками, изучение вопросов фолдинга белков)

В основе метода электрофореза лежит тот факт, что молекулы белков в водных растворах заряжены, то есть фактически представляют собой ионы. Как любая частица, несущая электрический заряд, молекулы белков способны перемещаться в электрическом поле. Таким образом, если к раствору белка приложить электрическое поле (опустить в него электроды и подать постоянное напряжение), то все молекулы белков начнут двигаться. Вследствие разницы в аминокислотном составе разные белки заряжены разноименно — положительно или отрицательно. По этой причине различные белки будут двигаться в разных направлениях: положительно заряженные – к катоду (отрицательный электрод), отрицательно заряженные – к аноду (положительный электрод). Кроме того, величина заряда белковых молекул также неодинакова – молекулы одних белков заряжены сильнее, других – меньше. Белки, молекулы которых имеют больший заряд, будут двигаться быстрее, чем те, что несут меньший заряд. Также на разделение белков методом электрофореза большое влияние оказывает размер молекул белков. Более крупные белки движутся медленнее, чем белки небольших размеров, вследствие того, что вода оказывает сопротивление перемещению (является вязкой средой).

По причине того, что аминокислотный состав белков и их масса различаются достаточно сильно, электрофорез позволят анализировать очень сложные смеси белков. Для решения различных исследовательских задач было предложено множество различных вариантов электрофореза.

4.9 Электрофорез по Леммли

Электрофорез по Леммли — один из методов электрофореза в геле, применяемый для анализа сложных белковых смесей. Данный метод позволяет разделять белки по их молекулярной массе. Также электрофорез по Леммли может быть использован для определения молекулярной массы белков.

Белки, подлежащие анализу методом электрофореза по Леммли, предварительно обрабатывают концентрированным 5%-ным раствором додецилсульфата натрия (рис. 15) при 100С в присутствии β-меркаптоэтанола. При этом белковые молекулы приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий её собственный. При последующем разделении в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофоре граммах в соответствие с логарифмом их молекулярной массы

Рис. 15. Додецилсульфата-анион, присутствует в растворах додецилсульфата натрия

В качестве геля для электрофореза по Леммли используются полиакриламидные гели, что позволяет достичь высокой разрешающей способности данного метода. Полиакриламидный гель представляет собой продукт сополимеризации акриламида (рис. 16)

и сшивающего агента N,N- метиленбисакриламда (рис. 17)

Рис. 17. N,N- метиленбисакриламид

В результате процесса сополимеризации образуется прочный, упругий, термостабильный гель, обладающий высокими механическими свойствами и химической инертностью. Пространственная структура геля представляет собой сетку со структурой (рис. 18). Пористость геля зависит от концентрации мономеров и её можно варьировать в значительных пределах от 40 до 0,1 нм (2-30% мономеров). Регулярно чередующиеся амидные группы делают гель гидрофильным. Отсутствие ионизирующихся групп существенно снижает эндосмос, а также взаимодействие белков со структурой геля.

Рис. 18. Структура полиакриламидного геля

В качестве катализатора реакции сополимеризации применяют источник свободных радикалов — персульфат аммония или калия. Катализатором реакции выступает N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин.

Полимеризацию геля ведут в стеклянных трубочках длиной 70-100 мм с внутренним диаметром 5 мм либо плоских пластинах. Для этого в одной трубке последовательно полимеризуют два геля для электрофореза, располагая их один под другим: 1) верхний – крупнопористый гель в котором образец сжимается в узкую полосу (концентрирующий гель), 2) нижний — мелкопористый гель, в котором происходит разделение белковой смеси на компоненты под действием эффекта «молекулярного сита».

Для проведения электрофореза гелевыми столбиками соединяют расположенные друг над другом резервуары с буферами, в которые введены электроды и подают на электроды напряжение 40-800 вольт.

В качестве отчета о проделанной работе:

1. Зарисуйте структурные формулы додецилсульфата натрия, акриламида, N,N- метиленбисакриламида, структуру полиакриламидного геля

2. Зарисуйте расположение белковых полос, полученных в результате электрофореза по Леммли, сделайте вывод о составе выданного вам раствора белка (количество компонентов, примерная доля главных компонентов и их число, примерная доля минорных компонентов и их число)

Подготовить пробу белка для электрофореза. Для этого в эппендорф объемом 2 мл поместить 100 мкл раствора белка с концентрацией 4 мг/мл и добавить 100 мкл буфера пробы. Содержимое перемешать инжектированием.

Поместить пробирки в поплавок и поместить в водяную баню. Нагреть до кипения и кипятить 5 минут, затем охладить

Растворить навеску персульфата калия в 2,5 мл ДВ. Для этого внести автоматической пипеткой 2,5 мл ДВ и перемешивать инжектированием до полного растворения соли (растворение идет медленно)

Собрать трубку для электрофореза и поместить её вертикально в штатив

В центрифужной пробирке приготовить смесь для разделяющего геля

Раствор Мономеров 1250 мкл

1,5 М Трис-HCl рН8,8 167 мкл

р-ра Персульфата калия 20 мкл

После внесения раствора персульфата калия , содержимое пробирки перемешивают инжектированием и немедленно вносят в трубку для электрофореза

Смесь для разделяющего геля вносят в трубку для электрофореза тремя порциями по 800 мкл. Раствор вносят осторожно, по стенке трубки не вспенивая его.

После внесения в трубку раствора для разделяющего геля поверх него осторожно наслоить примерно 100 мкл ДВ

Оставить трубку на 15-20 мин для полимеризации. Об окончании полимеризации свидетельствует появление четкой границы между раствором для разделяющего геля и наслоенной водой.

По окончании полимеризации слить воду с геля, остатки жидкости убрать с поверхности геля фильтровальной бумагой, скрученной в трубочку

В центрифужной пробирке приготовить смесь для концентрирующего геля

Раствор Мономеров 340 мкл

0,5 М Трис-HCl рН6,8 125 мкл

р-ра Персульфата калия 20 мкл

250 мкл смеси для концентрирующего геля вносят в трубку для электрофореза. Раствор вносят осторожно, по стенке трубки не вспенивая его.

После внесения в трубку раствора для разделяющего геля поверх него осторожно наслоить примерно 100 мкл ДВ

Оставить трубку на 5-10 мин для полимеризации. Об окончании полимеризации свидетельствует появление четкой границы между раствором для разделяющего геля и наслоенной водой.

По окончании полимеризации геля с трубки снимаю заглушку и устанавливают трубки для электрофореза в катодную камеру прибора (рис. 19) так, чтобы граница концентрирующего и разделяющего геля была видна в верхней (катодной камере)

Рис. 19. Прибор для вертикального гель-электрофореза в трубках.

1- верхняя, анодная камера, 2 – нижняя, катодная камера, 3 – трубки с гелем для электрофореза, 4 – положительный электрод, анод, 5 — отрицательный электрод, катод.

Приготовить 1,2 л анодного буфера. Для этого разбавить исходный анодный буфер в 4 раза ДВ с помощью мерного цилиндра объемом 1 л.

Заполнить анодную камеру анодным буфером. Поместить в камеру анод (красный провод). Поместить катодную камеру над анодной и зафиксировать её винтами. При этом нижние концы трубок должны быть погружены в буфер в нижней камере (анодный буфер).

Приготовить 1,2 л катодного буфера. Для этого разбавить исходный катодный буфер в 4 раза ДВ с помощью мерного цилиндра объемом 1 л. заполнить катодную камеру катодным буфером. При этом концы трубок должны оказаться под слоем электродного буфера.

Промыть нижние и верхние концы трубок для удаления остатков растворов для полимеризации гелей и пузырьков воздуха.

60 мкл подготовленного раствора белка в эппендорфе смешивают со 180 мкл ДВ и перемешивают инжектированием. 200 мкл полученной смеси вносят в трубки для электрофореза, осторожно наслаивая на поверхность геля.

Включают напряжение 250 вольт, через 10 минут поднимают его до 300 вольт, а еще через 10 минут до 400.

Примерно через 40 минут, когда фронт бромфенолового синего пройдет практически всю трубку, напряжение выключают, внимают электрод из катодной камеры. Разбирают прибор и выливают катодный буфер. Затем вынимают трубки для электрофореза и выталкивают столбики геля из трубок стеклянным штоком. Концентрирующий гель отрезают скальпелем.

Разделяющий гель окрашивают коллоидным раствором кумасси бриллиантового голубого в течение 20 мин на кипящей водяной бане. Затем переносят окрашенный гель в кипящую воду и отмываю до проявления белковых полос.

Вопросы для самоподготовки

В чем практическое значение электрофореза?

Что можно установить с помощью электрофореза?

В чем суть метода электрофореза?

От каких параметров зависит скорость перемещения молекулы белка?

В чем особенность электрофореза по Леммли?

По какому параметру разделяются белки при проведении электрофореза по Леммли?

Вопросы к коллоквиуму по теме «Белки»

2. Элементный состав белков

3. Какие органические соединения называют аминокислотами, химические свойства аминокислот

4. Кислотно-основные свойства аминокислот (амфотерность аминокислот, биполярные ионы, кривые титрования)

5. Классификация аминокислот (биологическая, физико-химическая, химическая)

6. Физические свойства аминокислот, стереоконфигурация аминокислот

7. Специфические реакции на аминокислоты

8. Связь аминокислот в белках, пептидная связь – структура и свойства

9. Биуретовая реакция. Определение белка биуретовым методом.

10. Аминокислотный анализ. Методы хроматографии аминокислот.

11. Нингидриновая реакция. Практическое значение

12. Первичная структура белка. Методы установления первичной структуры белка

13. Вторичная структура белка, α-спираль, β-слой

14. Третичная и четвертичная структура белка

15. Химические связи, стабилизирующие структуру белка (первичную, вторичную, третичную и четвертичную)

16. Растворимость и осаждение белков. Силы удерживающие белок в растворе, условия осаждения белков.

17. Реакции обратимого и необратимого осаждения белков, их практическое значение.

18. Белки как носители электрических зарядов, кислотно-основные свойства белков, изоэлектрическая точка

19. Диализ. Электрофорез. Изоэлектрическое фокусирование

21. Выделение белков из тканей. Методы выделения и очистки белков

Использованная литература

The protein protocols handbook, 2 nd edition – edited by Walker J.M. – Humana press, 2002

Петров К.П. – Методы биохимии растительных продуктов – Киев: Вища школа, 1978.

Шапиро Д.К. – Практикум по биологической химии, 2-е изд. перераб. и доп. – Минск: Высшая школа, 1976

Практикум по биохимии: учебное пособие, 2-е изд. пререаб и доп. – под ред. Северина — М.: МГУ, 1989

Р.Досон, Д.Элиот и др. – Справочник биохимика, пер. с англ. – М.: Мир, 1991

Скурихин И.М., Нечаев А.П. – Все о пище с точки зрения химика: справочное издание. — М.: высшая школа, 1991

Степин Б.Д. — Техника лабораторного эксперимента в химии: учеб пособи для ВУЗов – М.: Химия, 1999

Химическая энциклопедия ТТ.1-5., гл. ред. Кнунянц И.Л. – М.: Советская энциклопедия, 1988-1998

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2019 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.007 с) .

источник

После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др.

Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. По химическим и физическим свойствам вода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворителя. В частности, температура замерзания ее составляет –40°С. В этой воде хуже растворяются сахара, соли и другие вещества. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок.

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).

На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура. Считают, что главную роль при этом играет валентность ионов. Действие разных ионов принято сравнивать не по молярной концентрации соли, а по так называемой ионной силе (μ), которая равна половине суммы произведений концентрации каждого иона (с) на квадрат его валентности (V):

Более тонкое разделение белков плазмы крови человека на фракции достигается при использовании различных концентраций этанола при низкой температуре (от –3 до –5°С) по методу Кона (рис. 1.2). В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Указанным методом часто пользуются для получения отдельных фракций крови, используемых в качестве кровезаменителей.

Рис. 1.2. Диаграмма фракционирования белков плазмы крови человека этанолом (по методу Кона).

В последнее время наибольшее распространение получили хроматографические и электрофоретические методы разделения белков.

Хроматография. Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству) – в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.

Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку –

Рис. 1.3. Абсорбционнаяхроматография (схема). Разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью.

1 — нанесение образца на колонку; 2 -середина опыта; 3 — окончание опыта.

компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии освобождения – десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты (рис. 1.3). Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

Распределительная хроматография. В отличие от адсорбционной твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Один из типов распределительной хроматографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно вещество, соединяют для выделения этого вещества в чистом виде.

Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ (рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол–уксусная кислота–вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

А – восходящая хроматография; Б – нисходящая хроматография (вид сбоку); В – хроматограмма с разделенными и окрашенными веществами: 1 – фронт растворителя, 2 – разделенные вещества, 3 – место нанесения образца.

Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы, несущие функциональные группы:

Аналогичные функциональные группы содержат триэтиламиноэтил (ТЭАЭ)- и аминоэтил (АЭ)-целлюлозы.

Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами (производные винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллюлозой, имеющими следующие функциональные группы:

В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.

Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко используются в фармакологии (при создании и определении лекарственных веществ), в клинической биохимии (при определении биологически активных веществ в физиологических жидкостях), в биотехнологических процессах и производствах и других областях: они позволяют определять вещества в нано-, пико- и фемтаграммных количествах.

Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи аффинной хроматографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищенные препараты аминоацил-тРНК-синтетаз на полиакрилгидразидагаровом геле, к которому в качестве лигандов были присоединены определенные тРНК (транспортные РНК).

Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек-страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки; небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой:

где V – объем элюирующей жидкости вещества с данным К, мл; V – свободный объем колонки или общий объем внешнего растворителя (вне зерен геля), мл; V_i – объем растворителя внутри геля, мл; K – коэффициент распределения для растворенного вещества между растворителем внутри зерен геля и окружающим растворителем. Если анализируемую пробу, содержащую одно растворенное вещество с К = 1 и второе с К = 0, внести в колонку с сефадексом, то второе вещество появится в элюирующей жидкости сразу после выхода из колонки V , а первое – только после выхода объема V+ V_i.

Поскольку молекулы белков, обладающие большими молекулярной массой и размерами, не диффундируют внутрь зерен сефадекса, они первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колонки V, в то время как все остальные вещества (включая низкомолекулярные примеси) вымываются после выхода объема, равного V+ К • V_i.

Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии. С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной массой.

Электрофорез. Метод свободного электрофореза, детально разработанный лауреатом Нобелевской премии А. Тизелиусом, основан на различии в скорости движения (подвижности) белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества их по сравнению с методом свободного электрофореза состоят в том, что исключается размывание границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, не требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка (подробно эти методы и соответствующая аппаратура рассматриваются в практических руководствах по биохимии).

Рис. 1.5. Гель-хроматография на колонке с сефадексом (схема).

Большие светлые кружки с крестиками — зерна сефадекса; малые черные и красные кружки и треугольники — белки с различной молекулярной массой; А — колонка в начале работы; Б, В, Г — колонка в различные периоды времени. На графике элюции четко видно разделение белковых компонентов.

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. discontinuous – прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле – 10, а в полиакрил-амидном геле – до 18 разных белковых фракций.

Для выявления белков при электрофорезе в гелях их обрабатывают одним из следующих красителей: бромфеноловым синим, амидо черным 10В, кислотным синим 83, кумасси бриллиантовым голубым R-250 и др. Интенсивность окраски и соответственно относительное содержание каждой белковой фракции обычно определяют денситометрически путем прямого сканирования на денситометре. В последние годы стали применять методы электрофореза белков с градиентом концентрации геля, что значительно повышает разрешающую способность, особенно при фракционировании белков с высокой молекулярной массой, превышающей 50000– 100000.

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусирования – изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом рН. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении рН равен нулю. При использовании метода изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) для создания градиента рН в диапазоне от 3,0 до 10,0.

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле – методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций.

Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков . Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.

источник