Решение задач на электрофорез

Виртуальный практикум «Электрофорез белков» принадлежит к числу сложных заданий, требующих от школьника как применения полученных в курсе биохимии знаний, так и умение самостоятельно находить решения не ставившихся ранее задач (в режиме самостоятельной работы). Поэтому в том случае, если для каждого ученика в классе будет разработана индивидуальная траектория обучения, к работе с этим практикумом следует привлекать учащихся, наиболее успешно изучающих курс биохимии и проявляющих наибольший интерес к нему. Более слабых учеников можно знакомить с данным практикумом в режиме демонстрации.

Занятие с использованием виртуального практикума может быть организовано как в конце изучения всего курса биохимии, так и в середине курса – сразу после прохождения материалов урока 7 «Методы разделения биологических молекул». В первом случае необходимо дать указание учащимся, которые будут выполнять работу с данным виртуальным практикумом, перечитать материалы урока 7, описывающие теоретические основы метода электрофореза, различные варианты постановки этого метода, их возможности и способы практического применения (стр. 3–6 в данном пособии).

В демонстрационную часть практикума включен показ трёх разновидностей метода электрофореза: электрофорез с додецилсульфатом натрия, позволяющий определить молекулярную массу белка пепсина; неденатурирующий электрофорез с определением ферментативной активности лактатдегидрогеназы, позволяющий увидеть изменения спектра изоформ этого фермента при заболевании инфарктом и гепатитом; двумерный электрофорез, позволяющий увидеть полный спектр белков вируса. В режиме демонстрации виртуальный практикум показывает учащимся, как выглядит в действительности лабораторная техника обработки образцов, проведения самого электрофореза в различных его вариантах, а также последующая окраска гелей и визуализация результатов опыта.

В самостоятельную часть виртуального практикума включены три задачи. В первой из них требуется определить молекулярную массу трипсина. Для решения этой задачи школьник должен выбрать метод электрофореза с додецилсульфатом натрия. Молекулярная масса трипсина составляет 23,8 килодальтон, при правильном выполнении задания полоса данного белка должна находиться выше полосы 5-го сверху стандарта (миоглобин – 17,2 кД) и ниже 4-го сверху (карбоангидраза – 29 кД). Во второй задаче требуется определить, какое заболевание можно предполагать у пациента по спектру изоферментов лактатдегидрогеназы в его сыворотке. Для решения этой задачи школьник должен выбрать метод неденатурирующего электрофореза с определением ферментативной активности. Правильным диагнозом является инфаркт миокарда – при правильном выполнении задания появляются пять полос, соответствующих изоформам лактатдегидрогеназы (номера изоформ соответствуют расположению полос сверху вниз), при этом заметно явное преобладание первой изоформы при большой интенсивности и первой, и второй изоформ. В третьей задаче требуется определить полный спектр белков, содержащихся в вирусной частице. Для решения этой задачи школьник должен выбрать метод двумерного электрофореза. При правильном выполнении задания появляются пятьдесят восемь пятен (проверять их количество не надо), каждое из которых соответствует одной полипептидной цепочке из состава вириона.

В самом начале урока целесообразно среди учащихся, которые будут работать с этим практикумом, провести опрос, проверяющий степень знакомства с материалом. Возможны следующие варианты вопросов.

Почему при использовании метода электрофореза с додецилсульфатом натрия белки разделяются строго по размеру молекул?
Отвечая на этот вопрос, школьники должны знать, что при обычном электрофорезе в неденатурирующих условиях движение молекул белка в геле определяется двумя факторами: отношением заряда к массе белковой глобулы (заряд обеспечивает движение молекулы при воздействии электрического поля, а масса создает инерционность) и размером этой глобулы (от него зависит число столкновений с пространственной решеткой геля, замедляющих движение). Молекулы додецилсульфата натрия, имеющие отрицательный заряд, связываются с белковой глобулой в количестве, пропорциональном её размеру, и в результате отношение заряда к массе становится одинаковым для всех белковых молекул. Теперь единственным фактором, определяющим скорость движения в геле, остаётся размер белковой глобулы.
Почему метод электрофореза с додецилсульфатом натрия, несмотря на высокую разрешающую способность, не применяется в тех случаях, когда требуется сохранение ферментативной активности?
Отвечая на этот вопрос, школьники должны знать, что при обработке раствором додецилсульфата натрия происходит денатурация белка, сопровождающаяся утратой его биологической активности, в данном случае – ферментативной.
Почему метод двумерного электрофореза обладает такой большой разрешающей способностью?
Отвечая на этот вопрос, школьники должны знать, что в ходе двумерного электрофореза белки последовательно разделяются по двум различным свойствам. При разделении в первом направлении методом изоэлектрофокусировки главным параметром является изоэлектрическая точка белка, а при разделении во втором направлении методом электрофореза в додецилсульфата натрия – размер белковой молекулы. В результате двумерный электрофорез сочетает в себе все достоинства этих двух методик и обладает наибольшей разрешающей способностью.

В процессе выполнения заданий самостоятельной части практикума у учащихся могут на нескольких этапах встретиться трудности. Учителю следует всячески поощрять стремление школьников самостоятельно выполнить всё задание, нецелесообразно давать ученикам готовые инструкции по решению возникших проблем. Однако, учитель может, не раскрывая сразу же весь алгоритм решения, помочь учащемуся с помощью наводящих вопросов.

Так, если ученику досталось задание виртуального практикума на определение молекулярной массы белка трипсина, и он испытывает затруднения с выбором варианта метода электрофореза, который следует использовать для решения этого задания, то можно задать наводящий вопрос: «Какой из вариантов метода электрофореза делит белки строго по молекулярной массе?». В случае если школьник ответит, что таким методом является электрофорез в неденатурирующих условиях, то ему необходимо напомнить разбор вопросов, проведённый в начале занятия. В случае если школьник ответит, что таким методом является двумерный электрофорез, учитель должен указать, что двумерный электрофорез, действительно, обеспечивает разделение белков по молекулярной массе, однако, кроме того, он разделяет их и по изоэлектрической точке, чего в данной задаче совершенно не требуется. В итоге получится, что названный учеником метод позволит решить задачу чрезмерно сложным, дорогим и трудоёмким путём, что в реальной лабораторной практике неприемлемо. Если ученик правильно выбрал метод и правильно провёл виртуальный эксперимент, но испытывает трудности с трактовкой полученных результатов, то можно задать наводящий вопрос: «Какие белки при электрофорезе с додецилсульфатом натрия будут двигаться быстрее, а какие медленнее?», что поможет учащемуся правильно идентифицировать стандарты и определить молекулярную массу трипсина.

Если ученику досталось задание виртуального практикума на диагностику заболевания по изменению спектра изоформ фермента лактатдегидрогеназы, и он испытывает затруднения с выбором варианта метода электрофореза, который следует использовать для решения этого задания, то можно задать наводящий вопрос: «Какой из вариантов метода электрофореза позволяет сохранить биологическую активность ферментов?». В случае если школьник ответит, что таким методом является электрофорез с додецилсульфатом натрия, то ему необходимо напомнить разбор вопросов, проведённый в начале занятия. В случае если школьник ответит, что таким методом является двумерный электрофорез, ему необходимо напомнить, что при двумерном электрофорезе белки разделяются во втором направлении с использованием додецилсульфата натрия, и, следовательно, теряют свою активность. Если ученик правильно выбрал метод и правильно провёл виртуальный эксперимент, но испытывает трудности с трактовкой полученных результатов, то можно задать последовательно два наводящих вопроса: «В каком порядке изоформы лактатдегидрогеназы движутся при электрофорезе в неденатурирующих условиях?» и «При каком заболевании повышено содержание изоформ 1 и 2, причём изоформы 1 содержится больше, чем 2?», что поможет учащемуся правильно определить заболевание.

Если ученику досталось задание виртуального практикума на определение полного спектра белков, содержащихся в вирусной частице, и он испытывает затруднения с выбором варианта метода электрофореза, который следует использовать для решения этого задания, то можно задать наводящий вопрос: «Какой из вариантов метода электрофореза обладает наибольшей разрешающей способностью?». В случае если школьник ответит, что таким методом является электрофорез с додецилсульфатом натрия или электрофорез в неденатурирующих условиях, то ему необходимо напомнить разбор вопросов, проведённый в начале занятия.

В конце занятия учителю целесообразно провести анализ выполнения задания каждым учащимся. Такой анализ сильно облегчается тем, что при неправильном выборе метода, неправильном выполнении экспериментальных процедур, а также при неверной трактовке результатов на экране появляется надпись, поясняющая на каком этапе (или на каких этапах) была допущена ошибка. Эти надписи достаточно подробно комментируют ошибки при выполнении экспериментальных процедур (например, добавление раствора уксусной кислоты вместо раствора красителя), так что вмешательство учителя не требуется.

В комментирующих ошибки школьника надписях нет указаний, называющих правильный метод выполнения конкретной задачи, они лишь указывают, что ученик выбрал неверный метод. Учитель может или просто назвать правильный вариант методики, или использовать дополнительные вопросы, приведённые выше. Точно так же обстоит дело с комментариями, касающимися неверной трактовки результатов.

источник

Электрофорез

2. Электрофорез с подвижной границей.

4. Изоэлектрическая фокусировка.

Белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, находясь в растворе несут определенный электрический заряд благодаря наличию групп, способных к электролитический диссоциации. Общий заряд данной частицы определяется, прежде всего, концентрацией Н + -ионов в среде. Под действием электрического тока заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление носит название электрофореза. Скорость движения частиц (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью.Она имеет размерность см 2 /с -1 ·в -1 .

Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ.

Если приложить к электропроводящему раствору равномерное электрическое поле (Е), то на частицу будет действовать сила ускорения:

где d– расстояние между электродами, q – заряд молекулы. Так как молекула перемещается не в вакууме, то на неё действует противоположно направленная сила трения, которая зависит от размеров, формы молекулы, вязкости среды и описывается уравнением Стокса:

где f– коэффициент трения, v – скорость движения молекулы. Для сферических частиц коэффициент трения равен 6πηr, где r – радиус частиц и η – коэффициент вязкости растворителя. В растворе силе ускорения противодействует сила трения, поэтому:

Е/d·q = 6πηrv, преобразуя выражение, получим:

Таким образом, скорость молекулы (v) пропорциональна напряженности электрического поля Е/d и заряду молекулы и обратно пропорциональна размеру молекулы и вязкости среды. Заряд и размер являются строго индивидуальными характеристиками молекулы. Следовательно, и путь, который пройдет та или иная молекула при электрофорезе за определенный интервал времени, тоже будет характерен для данной молекулы.

Существуют три основных типа электрофоретических систем – электрофорез с подвижной границей, зональный электрофорез и стационарный электрофорез.

Элекрофорез с подвижной границей

Электрофорез макромолекул, растворенных в буфере с соответствующим значением рН, проводится в V-образной кювете с прямоугольным поперечным сечением. Раствор макромолекул в буфере заливают в нижнюю часть кюветы, доливают оба конца трубки тем же буфером и монтируют в них электроды. Если вести электрофорез в щелочном буфере, то все белки заряжаются отрицательно и начинают перемещаться к аноду: скорость перемещения данного белка зависит от его рН, и от величины суммарного заряда при данном рН буфера. Как видим, в данном методе электрическое поле прикладывается к исходно разной границе между раствором молекул и буфером. Скорость миграции заряженных частиц определяется путем наблюдения за перемещением этой границы. Если раствор содержит гетерогенную смесь ионизированных макромолекул, то можно увидеть множество движущихся границ. Способы наблюдения за пограничными изменениями концентрации вещества основаны на измерении градиента показателя преломления, который пропорционален градиенту концентрации.

Сконструирование Филпонтом и Свенссоном астигматической фотокамеры со специальной оптической системой, называемой шлирен-оптикой, позволяет непосредственно регистрировать градиент показателя преломления вдоль кюветы.

Электрофорез по методу подвижной границы нашел широкое применение при исследовании белков. Этот метод в основном используется для определения подвижностей и изоэлектрических точек белков, т.к. количественно трудно оценить подвижности. Метод электрофореза с подвижной границей используется редко.

Зональный элекрофорез

В зональном электрофорезе пятно или тонкий слой раствора, нанесенного на полутвердый или гелеобразный материал, помещают в электрическое поле, в результате чего молекулы перемещаются по или через материал носитель. В первую очередь функцией носителя является предотвращение механических воздействий и конвекции, которая происходит в результате температурных или высокой плотности концентрированных растворов.

Однако, носитель может действовать в качестве молекулярного сита, приводя тем самым к хроматографическим эффектам, что может или улучшить разделение, или ухудшать его.

а) электрофорез на бумаге.

В качестве носителя здесь используется фильтровальная бумага, которая должна содержать 96% α-целлюлозы, нерастворимой в концентрированном растворе NaOH. Приборы для электрофореза состоят из двух электродных сосудов и устройства для поддержания полосок фильтровальной бумаги. В качестве электродов обычно применяются платиновые проволоки. Можно использовать и угольные электроды. Для предотвращения чрезмерного испарения всю систему помещают в закрытую камеру, что обеспечивает создание влажной атмосферы.

Перед анализом электрофоретическую бумагу погружают в буферный раствор, слегка промокают между чистыми листами промокательной бумаги, а затем помещают на подставку.

Пробу наносят либо капиллярной пипеткой с закрученным носиком, либо с помощью различных аппликаторов, обеспечивающих быстрое и равномерное нанесение исследуемого раствора.

После нанесения проб к кювете подключают напряжение. Для наблюдения за ходом электрофореза на бумагу наносят пятно определенного стандартного вещества. По окончании процедуры бумагу высушивают при 105-110°С. Макромолекулы затем можно обнаружить при помощи соответствующего метода окрашивания.

Б) электрофорез в ПААГ.

В качестве среды для электрофоретического разделения макромолекул наиболее широкое распространение получил ПААГ, обладающий рядом преимуществ. Среди них можно отметить химическую стабильность, инертность, прозрачность в широком диапазоне длин волн, возможность получения пор с заданной величиной, отсутствием адсорбции. С помощью ПААГ можно разделить вещества с молекулярной массой от 2500 до 2000000 дальтон.

Системы электрофореза в ПААГ можно разделить на две группы по применяемым буферным системам. К первой относятся системы вертикального и горизонтального электрофореза, в которых применяется один тип буфера в электродных камерах и геле. Ко второй группе относятся системы вертикального «диск-электрофореза»: в них используются разные виды буферов (2-3) и гели разной концентрации. Название данного метода происходит от английского слова discontinuty (прерывистый), обозначающего в данном контексте неоднородность электрофоретической среды. Для диск-электрофореза характерны скачкообразные изменения рН, концентрации геля и градиента напряжения.

Прибор для диск-электрофореза состоит из верхнего и нижнего резервуара для электродного буфера и вертикальной стеклянной трубки. Нижняя часть трубки заполняется разделяющим гелем с мелкими порами, которые действуют как молекулярное сито по отношению к изучаемым макромолекулам. Над разделяющим гелем находится концентрирующий гель, имеющий крупные поры и поэтому не обладающий свойствами молекулярного сита, а еще выше расположен стартовый гель, содержащий пробу и краситель, используемый в качестве свидетеля.

Принцип диск-электрофореза основан на эффекте подвижной границы Кольрауша, суть которого состоит в использовании двух разных буферов: в электродных камерах трис-глициновый буфер (рН 8,3) , а в концентрирующих(рН 6,7) и разделяющем гелях(рН 8.9) – трис-НСl. В электродном буфере рН на 1,5-2 единицы выше, чем в концентрирующем. Образец растворяется в том же буфере, который используется в концентрирующем геле. При рН 8,3 глицин находится в виде цвиттериона:

После включения тока все ионы (в том числе белки и краситель) начинают двигаться к аноду в следующей последовательности: Сl — > бромфеноловый синий > белки > глицинат.

Рис. 1. Прибор для диск-электрофореза.

Между ионами хлора и глицината образуется граница раздела. Так как оба эти иона принадлежат к одной и той же электрической системе, то в области глицинатных ионов напряжение, а следовательно, и их скорость, возрастают, а в области ионов хлора напряжение и скорость уменьшаются. Следовательно, замыкающие глицинатные ионы будут стремиться догнать ведущие ионы хлора, а зона белков и красителя, находящаяся между ними, будет сужаться (концентрироваться). Этот процесс происходит в концентрирующем (крупнопористом) геле.

Когда подвижная граница доходит до мелкопористого геля (рН 8,9), то, с одной стороны, подвижность глицинатных ионов возрастает, а с другой – на белки начинает действовать эффект молекулярного сита, и они отстают от подвижной границы. Таким образом, белки попадают в более щелочной трис-глициновый буфер, их отрицательный заряд возрастает, и они разделяются согласно своим индивидуальным характеристикам (заряду, форме молекул, молекулярному весу).

При проведении электрофореза гель полимеризуется непосредственно в стеклянной трубке, которую потом соединяют с сосудами с буфером. Образец суспендируют в концентрированном растворе сахарозы и наносят на поверхность геля в виде тонкого слоя с помощью пипетки. Электрофорез прекращают, когда зона красителя (подвижная граница) проходит 0,8-0,9 длины геля. Затем гель извлекают из трубки и окрашивают специальными красителями обнаружения зон. Каждую зону можно характеризовать по значениям их Rf или по площади пика после денсатометрирования. Диск-электрофоретический метод особенно часто используется для разделения белков.

источник

Примеры решения задач. 1. Вычислить z-потенциал с учетом поверхностной проводимости на границе раздела кварцевая диафрагма — раствор хлорида калия и построить график зависимости z

1. Вычислить z-потенциал с учетом поверхностной проводимости на границе раздела кварцевая диафрагма — раствор хлорида калия и построить график зависимости z от концентрации электролита по следующим данным:


0,05	1,0	10,1	3,25
0,1	2,06	8,5	1,5
0,5	2,24	7,0	1,3
1,0	6,0	3,1	1,05

2. Рассчитать z-потенциал и построить график зависимости от диаметра пор кварцевой диафрагмы в растворе хлорида калия без учета поверхностной проводимости и с учетом ее по следующим данным:


1,2	3,22
1,5	2,25
2,0	1,32
2,8	0,52
3,5	0,12
3,6	0,075

; ; ;

3. Построить графики зависимости z-потенциала от диаметра пор кварцевой диафрагмы без учета поправки на поверхностную проводимость и с учетом ее по следующим данным:


3,0	1,2	3,1
35,0	2,4	2,08
70,0	3,4	1,08
3,7	1,01

; ; ;

4. Рассчитать z-потенциал корундовой диафрагмы в растворе хлорида натрия и построить график зависимости z от диаметра пор диафрагмы по следующим данным:


2,8	1,48
3,2	1,3
3,6	1,15
3,9	1,05
4,0	1,02

; ; ;

.5. Рассчитать z-потенциал керамической диафрагмы в растворе хлорида натрия и построить график зависимости z от диаметра пор диафрагмы по следующим данным:


2,93
2,50
1,71
1,34
1,23
1,08
1,06

; ; ;

6. Рассчитать z-потенциал и построить график зависимости z от диаметра пор корундовой диафрагмы в растворе хлорида калия без учета и с учетом поверхностной проводимости но следующим данным:


3,0	2,0	1,6
10,0	3,2	0,48
25,0	3,9	0,08
75,0	4,0	0,03

; ; ;

7. Рассчитать z-потенциал с учетом и без учета поверхностной проводимости и построить график зависимости z от диаметра пор керамической диафрагмы в растворе хлорида натрия по следующим данным:


1,3	2,9
1,5	2,4
2,0	1,9
2,5	1,5
3,0	1,25
3,5	1,08

; ; ;

8. Построить график зависимости потенциала течения от давления для кварцевой диафрагмы в растворе хлорида калия по следующим данным: р (Па) равно а) 5´10 -3 , б) 10´10 3 , в) 15´ — 10 8 , г) 20´10 3 , д) 25´10 3 ; z=8´10 -2 В; e=81;h=1´10 -3 Пас; c_n=2,1´10 -2 Ом -1 м -1 ; a=1,2.

9. Рассчитать скорость электрофореза частиц оксида алюминия в воде с учетом электрофоретического торможения по следующим данным: z=20´10 -3 В; E =5´10 2 В/м; e=81;h=1´10 -3 Пас; a=5´10 -7 м; c=1´10 7 м -1 .

10. Рассчитать скорость электрофореза частиц оксида алюминия в метаноле с учетом электрофоретического торможения по следующим данным: z=30´10 -3 В; E =8´10 2 В/м; e=33; h=0,8´10 -3 Пас; a=1.5´10 -8 м; c=2´10 8 м -1 .

то скорость электрофореза частиц корунда, образующих диафрагму, в том же растворе без учета электрофоретического торможения равна 24´10 -6 м/с; h=1´10 -3 Па×с; Е=4´10 2 В/м; e=81, a=5´10 -8 м; c= 2´10 8 м -1 ; р=4´10 3 Па; c_n=1,5´10 -2 Ом -1 м- 1 ; a=1,5.

12. Рассчитать потенциал течения через диафрагму из частиц карбоната кальция в водном растворе хлорида натрия, если известно, что скорость электрофореза частиц карбоната в том же растворе без учета электрофоретического торможения равна 10´10 -6 м/с; e=81;h=1´10 -3 Па×с; Е=2´10 2 В/м; а=3´10 -7 м; c=1,5´10 7 м -1 ; р=5´10 3 Па; c_u=2,5´10 -2 Ом -1 м -1 ; a=1,2.

13. Рассчитать электрофоретическую подвижность частиц карбоната стронция в воде, если z, рассчитанный по скорости электрофореза без учета электрофоретического торможения, равен 50´10 -3 В; h=l´10 -3 Па×с; Е =4´10 2 В/м; e=81; c=1,5´10 8 м -1 ; а=2´10 -8 м.

14. Рассчитать скорость электроосмоса раствора хлорида калия через корундовую диафрагму, если известно, что z-потенциал, рассчитанный по скорости электрофореза частиц корунда в том же растворе без учета электрофоретического торможения, равен 35´10 -3 В; h=10 -3 Па×с; e=81; Е=2´10 2 В/м; I=2´10 -2 А; c_u=2´10 -2 Ом -1 м -1 ; a=1,1; cа=3.

15. Вычислить z, если известно, что потенциал течения, определенный при продавливании раствора хлорида калия через корундовую диафрагму под давлением 20´10 3 Па, равен 22,5´10 -3 В. Удельная проводимость раствора c_u=1,37´10 -2 Ом -1 м -1 , коэффициент эффективности диафрагмы a=1,8; вязкость раствора h=1´10 -3 Па×с; e=81

16. Вычислить электрофоретическую подвижность частиц оксида железа по следующим данным; скорость электроосмоса через диафрагму из таких же частиц в том же растворе u=2´10 -8 м 3 /с; c_u=1,2´10 -2 Ом -1 м -1 ; c_s=2´10 -2 Ом -1 м -1 ; I=1,6´10 -2 А; e=81; h=10 -3 Па×с.

17. Рассчитать массу осадка, полученного на цилиндрическом электроде при электрофорезе водной суспензии оксида железа. Длина электрода l=2´10 -2 м; радиус внутреннего электрода r₂=1´10 -3 м; радиус наружного r₁=28´10 -3 м; z=20´10 -3 В; напряжение на электродах U=20В; c=0,5´10 3 кг/м 3 ; h=1´10 -3 Па×с; с_т=1´10 3 кг/м 3 ;e=81; t=15с.

18. Рассчитать массу осадка, полученного на цилиндрическом электроде при электрофорезе водной суспензии СаСО₃. Длина электрода l=2´10 -2 м; радиус внутреннего электрода г₁=1´10 -3 м; радиус наружного r₁=28´10 -3 м; z=25´10 -3 B; U=30B; с=0,3´10 3 кг/м 3 ; c_m=l´10 3 Kr/M 3 ; h=1´10 -3 Па×с; e=81; t=20с.

19. Рассчитать массу электрофоретического осадка, полученного из водной суспензии глины на цилиндрическом электроде длиной l=1´10 -2 м и радиусом r₂=0,5´10 -3 м в ванне с наружным цилиндрическим электродом г₁=14´10 -3 м; z=30´10 -3 В; U=5B; с=0,5´10 3 кг/м 3 ; с_m=1,0´10 3 кг/м 3 ; h=1´10 -3 Па×с; e=81; t=10с.

20. Рассчитать массу осадка, образовавшегося на электроде при электрофорезе водной суспензии корунда при напряженности электрического поля 1´10 2 ; 2´10 2 ; 4´10 2 В/м; концентрация суспензии с =2,0´10 3 кг/м 3 ; продолжительность осаждения t=10с; z-потенциал, определенный по скорости электроосмоса без учета поверхностной проводимости, равен 49,6´10 -3 В; коэффициент эффективности диафрагмы равен 1,8; e=81; поверхность плоского электрода S=1´10 -4 м 2 ; h=1´10 -3 Па×с.

21. Рассчитать электрофоретическую подвижность частиц корунда в воде, если известно, что скорость электроосмоса через корундовую диафрагму в том же растворе составляет 2´10 -8 м 3 /с, удельная электрическая проводимость раствора c_u=1,2´10 -2 Ом -1 м -1 , поверхностная проводимость диафрагмы c_s=2´10 -2 Ом -1 м -1 ; вязкость раствора h=1´10 -3 Па×с; сила тока при электроосмосе I=4,5´10 -2 А; e=81.

22. Рассчитать потенциал седиментации частиц оксида алюминия в водном растворе хлорида калия по следующим данным:
j=0,1; e=81; z=50´10 -3 ; r—r=3´10 3 кг/м 3 ; h=1´10 -3 Па×с; cu=1´10 -2 Ом -1 м -1 .

23. Рассчитать потенциал течения и построить график его зависимости от концентрации электролита с по следующим данным:

0,1	0,5	1,0
2,13	20,6	79,4	154,0
90,0	78,0	66,0	44,0

h=1´10 -3 Па×с; р=5×10 3 Па; e=81; a=1,0.

24. Под каким давлением должен продавливаться раствор хлорида калия через керамическую диафрагму, чтобы потенциал течения U_теч составил 4´10 -3 В; z=30´10 -3 В; c_u=1,3´10 -2 Ом -1 м -1 ; a=1,5; e=81; h=1´10 -3 Па×с.

25. Вычислить z-потенциал по следующим данным: потенциал течения U_теч=45´10 -3 В;p=4´10 4 Па; a=1,8; c_u=l,5´10 -2 Ом -1 м -1 ; e=81; h=1´10 -3 Па×с.

Глава 7. Строение мицеллы гидрофобного золя. Коагуляция гидрофобного золя

Синтез гидрофобных дисперсных систем (суспензий, золей, в том числе аэрозолей, эмульсий) осуществляют методами диспергирования и конденсации. Диспергирование твердых и жидких веществ в выбранных средах проводят в шаровых и коллоидных мельницах вибропомола, ультразвуковых установках и др. Эффект усиливается при введение в среду ПАВ (эффект Ребиндера). Конденсационные методы основаны на физической или химической конденсации атомов или молекул с последующим образованием новой фазы в виде дисперсных частиц, распределенных в объёме среды (газообразной, жидкой или твердой).

Методом физической конденсации получают золи, дымы, дисперсные металлы. При химической конденсации частицы новой фазы образуются в результате протекания в системе химической реакции с образованием малорастворимых соединений.

Гидрофобные дисперсные системы термодинамически неустойчивы, так как частицы дисперсной фазы склонны к агрегации. Их термодинамическая агрегативная неустойчивость обусловлена избытком поверхностной энергии. Межфазное поверхностное натяжение в гидрофобных системах больше рассчитанного по соотношению Ребиндера-Щукина. Поэтому они не могут быть получены самопроизвольным диспергированием как лиофильныесистемы; для их образования должна быть затрачена внешняя энергия.

Укрупнение частиц дисперсной фазы при потере агрегативной устойчивости достигается в результате изотермической перегонки (растворение мелких и рост крупных частиц в соответствии с уравнением Кельвина) или за счет слипания (слияния) частиц – коагуляции. Наиболее распространен процесс коагуляции. В зависимости от природы системы и концентрации дисперсной фазы этот процесс может заканчиваться или осаждением частиц, или структурообразованием.

Гидрофобные дисперсные системы характеризуются кинетической агрегативной устойчивостью, определяемой скоростью процесса коагуляции. Кинетика коагуляции определяется уравнением Смолуховского:

или

где — суммарное число частиц дисперсной фазы ко времени τ; — первоначальное число частиц; — время половинной коагуляции; К – константа скорости коагуляции.

Константа К определяется соотношением

или

где К_б – константа скорости быстрой коагуляции; Р – стерический множитель, учитывающий благоприятные пространственные расположения частиц при столкновении; ΔЕ – энергия взаимодействия частиц, или потенциальный барьер; κ — константа Больцмана; η – вязкость дисперсионной среды.

Константа скорости коагуляции К (константа скорости медленной коагуляции) является мерой кинетической агрегативной устойчивости. Если ΔЕ=0 и Р=1, то эта константа равна константе скорости быстрой коагуляции, зависящей от вязкости среды и температуры системы. Если ΔЕ≠0 и Р≠1, то не все соударения частиц эффективны, и происходит медленная коагуляция. Замедление коагуляции, обусловленное потенциальным барьером, характеризуется фактором устойчивости, или коэффициентом стабильности:

При значительном потенциальном барьере может наступить такое состояние системы, когда скорость агрегации частиц равна скорости дезагрегации и система окажется термодинамически устойчивой к коагуляции.

Таким образом, агрегативная устойчивость коллоидных систем обуславливается термодинамическими и кинетическими факторами. Термодинамические факторы, действие которых направлено на снижение поверхностного натяжения и увеличение энтропии, уменьшают вероятность эффективных соударений между частицами, создают потенциальные барьеры. Кинетические факторы снижают скорость столкновения частиц и связаны в основном с гидродинамическими свойствами системы.

Различают следующие факторы устойчивости (стабилизации) дисперсных систем.

1. Электростатический фактор (термодинамический); заключается в уменьшении поверхностного натяжения вследствие возникновения двойного электрического слоя на поверхности частиц в соответствии с уравнением Липпмана. 2. Адсорбционно-сольватный фактор (термодинамический); состоит в уменьшении поверхностного натяжения в результате взаимодействия частиц с дисперсной средой (уравнение Дюпре) или благодаря адсорбции стабилизаторов (адсорбционное уравнение Гиббса). 3. Энтропийный фактор (термодинамический); проявляется в стремлении дисперсной фазы к равномерному распределению по объёму систему под действием теплового движения. 4. Структурно-механический фактор (кинетический); связан с тем, что на разрушение пленок, образующихся на поверхности частиц и обладающих упругостью и механической прочностью, требуется энергия и время. 5. Гидродинамический фактор (кинетический); заключается в снижении скорости движения частиц при изменении вязкости и плотности дисперсионной среды. 6. Смешанные факторы наиболее характерны для реальных систем; агрегативная устойчивость обеспечивается действием нескольких факторов одновременно.

Каждому фактору устойчивости соответствует специфический метод его нейтрализации. Например, электростатический фактор очень чувствителен к введению электролитов. Действие структурно-механического фактора можно предотвратить с помощью веществ, разжигающих упругие структурированные слои на поверхности частиц, а также механическим, термическим способами и др.

Устойчивость дисперсных систем определяется балансом энергии притяжения и энергии отталкивания между частицами. По теории ДЛФО (Дерягина, Ландау, Фервея, Овербека), учитывающей только электростатическую составляющую расклинивающего давления (давления отталкивания), энергия отталкивания убывает с расстоянием по экспоненциальному закону.

Для области малых электрических потенциалов суммарная энергия взаимодействия частиц (пластин) равна

где φ_δ – электрический потенциал диффузного слоя; χ – величина, обратная толщине диффузного слоя; А * — константа Гамакера; h – расстояние между частицами (пластинами); ε – диэлектрическая проницаемость дисперсной среды; ε – электрическая постоянная.

При больших потенциалах и расстояниях между частицами (пластинами) эта энергия определяется уравнением

Суммарная потенциальная энергия взаимодействия частиц отрицательна на близких и далеких расстояниях (преобладает энергия притяжения). Она может быть положительна на средних расстояниях (преобладает энергия отталкивания). Максимум потенциальной кривой (рис 1.) отвечает потенциальному барьеру ΔЕ. Первый минимум I соответствует непосредственному соприкосновению частиц, а второй II – притяжению частиц, между которыми имеются прослойки среды.

Коагуляция гидрофобныхдисперсных систем может происходить в результате различных внешних воздействий, например при механическом воздействий (ультразвука), действии электрического поля, при нагревании или замораживании системы. Коагуляция гидрофобных золей может быть вызвана также их сильным разбавлением или концентрированием. Наиболее часто коагуляция дисперсных систем происходит при добавлении электролитов. Различают два типа электролитной коагуляции коллоидных систем: 1) нейтрализационную, происходящую в результате снижения поверхностного потенциала частиц; 2) концентрационную, протекающую вследствие сжатия диффузной части двойного электрического слоя (потенциал поверхности в этом случае не изменяется).

Нейтрализационная электролитическая коагуляция характерна для коллоидных систем, содержащих слабо заряженные частицы. Концентрационная коагуляция обычно наблюдается в сильно заряженных дисперсных системах.

Рис.1. Зависимость энергии взаимодействия U двух частиц от расстояния между ними h.

Введение электролитов снижает высоту потенциального барьера, но при небольших концентрациях электролита энергетический барьер остается достаточно велик и коагуляция не происходит. Агрегация наступает при введении определенного для данной системы количества электролита, соответствующего порогу коагуляции. Порок быстрой коагуляции с_к определяет количество электролита, необходимое для коагуляции единицы объёма коллоидной системы при полном исчезновении потенциального барьера ΔЕ. При сохранении небольшого потенциального барьера в системе протекает медленная коагуляция.

При электролитной коагуляции по концентрационному механизму (для сильно заряженных частиц) порок коагуляции с_к в соответствии с правилом Дерягина-Ландау (обоснование эмпирического правила Шульца-Гарди) обратно пропорционален заряду z противоионов в шестой степени, т. е.

При нейтрализационной коагуляции (при малых потенциалах поверхности φ частиц) показатель степени z в уравнении уменьшается до двух (правило Эйлерса-Корфа).

Строение коллоидной мицеллы схематически может быть изображено на примере мицеллы иодида серебра:

Агрегат или кристаллик твердого вещества

Потенциалопределяющие ионы

Ионы адсорбционного слоя

Ионы диффузного слоя

1.Определите, к какому электроду должны перемещаться частицы золя, получаемого при реакции при небольшом избытке H₂S:

Решение. Потенциал определяющими ионами в данном случая могут быть ионы SH — , так как в состав агрегата входят ионы серы. Состав адсорбционного слоя могут входить ионы Н + . Ионы Н + образуют диффузный слой. Таким образом, схематическое строение мицеллы золя можно выразить следующей формулой:

Частица имеет отрицательный заряд, — следовательно, электрофоретическое движение направлено к аноду.

2. Время половинной коагуляции золя иодида серебра при исходном содержании частиц в 1 м 3 , равном 3,2·10 14 , составляет 11,5 с. Определите константу скорости коагуляции.

Решение. Расчет проводим, используя формулу, связывающую константу скорости коагуляции с временем половинной коагуляции:

3. Золь иодида серебра, получаемый по реакции:

при некотором избытке KI , коагулируют растворами сульфата калия и ацетата кальция. Коагулирующее действие какого электролита сильнее?

Решение. Строение мицеллы золя таково:

Ионами, образующими диффузный слой, т.е. противоионами, являются катионы K + . Следовательно, при сравнении коагулирующего действия необходимо сравнивать заряды катионов вводимого электролита. Так как заряд иона Са 2+ выше заряда иона K + , то в соответствии с правилом Шульце-Гарди коагулирующее действие Са(СН₃СОО)₂ сильнее.

Дата добавления: 2015-08-31 ; Просмотров: 2213 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Электрофорез

2. Электрофорез с подвижной границей.

4. Изоэлектрическая фокусировка.

Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ.

Е/d·q = 6πηrv, преобразуя выражение, получим:

Элекрофорез с подвижной границей

Зональный элекрофорез

а) электрофорез на бумаге.

Б) электрофорез в ПААГ.

Рис. 1. Прибор для диск-электрофореза.

источник

Лабораторная работа №8

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ

Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 B.

Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),

Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза

через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 — 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, — уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.

Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 — 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 — 8,9) при градиенте потенциала 3 — 5 В/см (120 — 350 B для полос длиной 40 — 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 — 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге — прогорание бумаги

1. Буферный раствор. Можно использовать:

а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;

б) веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;

в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.

2. Растворы для окраски электрофореграмм:

а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) —0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) — 100 мл + метиловый спирт — 900 мл;

б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;

в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO₄·7H₂O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.

3. Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:

а) уксусная кислота — 2 %-й раствор;

б) уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.

4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:

а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;

б) для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.

Получение сыворотки крови. 2 — 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 — 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.

Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18×45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 —5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы —2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 —8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.

Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 — 0,02 мл (1 — 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 — 24 ч при напряжении 200 — 300 B

Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 — 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 — 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 — 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.

Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α₁-, α₂-, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 —5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.

Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций

Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.

Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат — соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

источник