Электрофорез в агарозном геле проводят в горизонтальном направлении, так как при этом 1) гель с низкой концентрацией агарозы лучше держится, 2) получается меньшее перекашивание (коллапс) в процессе электрофореза и 3) меньше искажаются полосы ДНК. По-видимому, проще всего работать с системой, когда гель полностью покрыт слоем буфера для электрофореза толщиной около 1 мм. Сопротивление агарозы ненамного превышает сопротивление буфера, так что значительная часть тока течет через агарозу.
Во все буферы с нейтральными значениями рН можно добавлять 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
В процессе электрофореза буфер у анода защелачивается, а у катода закисляется. Поэтому обычно пользуются буферной системой с высокой емкостью. Буферы не содержат ионов Cl — , так как последние не обладают буферной емкостью, и их присутствие может привести к тому, что ДНК в геле утратит биологическую активность.
- Трис-боратный буфер. Обладает высокой буферной емкостью. При его использовании, по-видимому, получаются наиболее узкие полосы. Основной раствор 10 × не зарастает, но при длительном хранении в нем образуется осадок, который растворим в щелочи. В присутствии бората агарозные гели не растворяются при высокой концентрации NaClO4 или KI.
- Трис-фосфатный буфер. Тоже обладает высокой емкостью. При его использовании получаются примерно такие же результаты, что и при использовании трис-боратного буфера. Основной раствор, однако, может зарастать. Его преимущество заключается в том, что такие гели можно растворять в концентрированном растворе NaClO4 или KI.
- Трис-ацетатный буфер. Обладает относительно низкой буферной емкостью, и при длительном электрофорезе может возникнуть необходимость в рециркуляции буфера в аппарате. Использование при электрофорезе высоких напряжений не вызывает нагрева. Исходные растворы могут зарастать. Гели в трис-ацетатном буфере можно растворять в концентрированном NaClO4 или KI. Этот буфер, по-видимому, используется наиболее широко.
- Щелочной буфер. Обладает очень низкой емкостью. Обычно при его использовании необходима рециркуляция буфера в аппарате. Наносимые образцы не должны содержать Mg 2+ , иначе ДНК выпадет в осадок. Ионы Mg 2+ необходимо удалять, добавляя избыточные количества ЭДТА.
Препараты агарозы значительно различаются по твердости, по разрешающей способности при разделении фрагментов ДНК, электрофоретической подвижности ДНК, легкости плавления, прозрачности и наличию вредных примесей. Наиболее вредной примесью являются, по-видимому, сульфонированные агарозы, подавляющие активность многих ферментов, работающих на нуклеиновых кислотах.
Обычно мы пользуемся агарозой фирмы МС/В. Агарозу растворяют в буфере для электрофореза, нагревая до кипения в микроволновой печи. Необходимо убедиться, что раствор стал гомогенным и что в нем не осталось твердых частиц агарозы. Перед тем как залить гель, раствор охлаждают до 50°С. Если заливать гель слишком горячей агарозой, то легко можно повредить аппарат для электрофореза
Лунки для образцов делают с помощью погруженной в расплавленный гель гребенки из оргстекла, полихлорвинила или тефлона. Гребенку устанавливают до заливки геля таким образом, чтобы кончики зубьев находились примерно в 0,5 мм от основания геля. Если лунки достанут дна, то образец может протечь под гель. Когда гель полностью застынет, гребенку вынимают и лунки заполняют буфером для электрофореза.
Г. Нанесение образцов и краски
Наносимые образцы содержат 5-10% глицерола или 5-10% сахарозы и 0,025% красителя, благодаря которому можно проследить за ходом электрофореза. Например, можно добавить в образец 1 /10 объема раствора, содержащего 50% глицерола и 0,25% красителя.
ДНК. Наносите около 10 нг ДНК в расчете на каждую ожидаемую полосу. Гель будет перегружен, если в полосе окажется более чем примерно 100 нг ДНК.
Бромфеноловый синий (распадается в щелочи).
Бромкрезоловый зеленый (обладает одинаковой подвижностью и в нейтральных, и в щелочных растворах). Ксиленцианол FF (распадается в щелочи; подвижность ниже, чем подвижность бромфенолового или бромкрезолового).
Образцы можно наносить, используя автоматическую пипетку и полипропиленовый наконечник или с помощью микрошприца, на который надет тонкий пластиковый шланг.
Подвижность небольших молекул ДНК может быть такой же или даже большей, чем подвижность используемого красителя. Чем ниже концентрация агарозы и (или) выше напряженность, тем больший фрагмент ДНК будет обладать такой же подвижностью, как и краситель. Краситель поглощает флуоресценцию связанного с ДНК бромистого этидия. Это приводит к тому, что в том месте геля, где находится краска, невозможно наблюдать слабые полосы ДНК. Образцы можно наносить и без краски.
источник
Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») —метод разделения макромолекул, различающихся по размеру, молекулярной массе, пространственной конфигурацией, вторичной структурой или электрическому заряду. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.
Молекулы в буферном растворе обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. При пропускании электрического тока через раствор в нем формируется направленное электрическое поле, напряженность которого измеряется разностью потенциалов по концам емкости, в которой производится электрофорез. Под действием поля молекулы начинают движение в направлении катода или анода. Скорость движения зависит от величины заряда, размеров и трения окружающей среды. С течением времени смесь разделяется на фракции, состоящие из молекул, движущихся с одинаковой скоростью. В современных экспериментах рабочий канал приборов для электрофореза заполняют гелем, имеющим структуру сетки. В этом случае основное влияние на подвижность молекул и их степень разделения оказывают их линейные размеры. В некоторых случаях может возникнуть ситуация, при которой особо крупные молекулы не проходят через поры геля.
Электрофорез в агарозном геле в различных модификациях широко применяется для разделения молекул нуклеиновых кислот, белков и других макромолекул в биологии и медицине. На водяной бане или в лабораторной печи плавят смесь агарозы, буфера и воды. Затем ее охлаждают до 50-60 °C и заливают в форму. Лунки для нанесения делаются при помощи гребенки. Исследуемый образец наносят в лунку при помощи дозатора. Когда краситель, помещаемый в лунки в начале эксперимента, достигает конца геля, электрофорез останавливают. Затем гель окрашивают красителем, который связывается с исследуемыми молекулами. Интенсивность окраски полос красителя дает представление о концентрации молекул в образце. Кроме концентрации, метод электрофореза позволяет определить относительную молекулярную массу исследуемых молекул, для этого в крайнюю лунку помещают набор маркеров молекулярной массы, который должен полностью покрывать диапазон молекулярных масс исследуемой системы.
Бромфеноловый синий и ксиленцианол — могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. Краситель Cresol red совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV. OrangeG наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV. Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле.
Самое широкое применение агарозные гели имеют в исследованиях, связанные с разделением нуклиновых кислот. Последние имеют довольно значительные отрицательный заряд, величина которого слабо зависиот от pH раствора, вследствие чего разделение на фракции происходит в основном за счет различия в линейных размеров молекул. В таких экспериментах используют 0.089М Трис-боратный, 0.05 Трсфосфатный и Трис-ацетатный буфер. Стоит отметить, что при обычном электрофорезе в геле можно разделять фрагменты нуклеиновых кислот, размер которых менее 50 тыс п.н. Также часто из эксперимента нужно получить оценку размеров молекул. Для этого используются наборы молекул известной длины. Например, для регистрации продуктов амплификации ДНК применяется электрофорез в агарозном геле в присутствии бромистого эитидия, который образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением длиной волны 290-330 нм.
источник
Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК,таккак выделение, рестрикция,полимеразная цепная реакция(ПЦР),молекулярное клонирование, наиболее частоиспользуютэлектрофорез.
Электрофорез — метод разделения макромолекул (в том числе
молекул и фрагментов ДНК) в геле по размеру и заряду в постоянном электрическом поле. Существует два вида электрофореза: горизонтальный и вертикальный.
Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя ДНК, например бромида этидия.
На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов.
Концентрация агарозы в геле.Агарозный гель — пористая струк-
тура, причем увеличение концентрации агарозы в геле приводит к
уменьшению размеров его пор. Это позволяет при помощи геля с
разной концентрацией агарозы разделять линейные молекулы
ДНКв широком диапазоне их размеров, вплоть до 60 тыс. пар
нуклеотидов (п. н.).
Существует зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК
от концентрации агарозы в геле;
Концен- 0,3 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,2 1,5 2,0
Длина 5-60 1-30 1-20 0,8-12 0,6-10 0,5-8 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2
Заряд молекулы.Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы
ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной
среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода (отрицательный электрод) к аноду (положительный электрод). Электрофоретическая подвижность молекулы ДНК существенно снижается с увеличением ее длины.
Напряженность электрического поля.На скорость движения заряженных молекул ДНК в геле влияет напряженность электрического поля, определяемая напряжением постоянного электрического поля, подаваемого на электроды. Данные, приведенные на
рисунке 1, свидетельствуют о наличии обратно пропорциональной зависимости между длиной пробега ДНК в геле и напряженностью электрического поля. Число полученных электрофореграмм различно, поэтому разделение фрагментов ДНК для
аналитических целей (только с целью детекции ДНК) с максимальным разрешением рекомендуют проводить при напряжении 10—15 В/см, а для препаративных (если ДНК будет в дальнейшем выделена из геля и использована, например, для клони-
рования) — при
Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с
одинаковой скоростью. Однако подвижность суперспирализованных и кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера. Таким образом, методом элект-рофореза можно фракционировать три формы молекул ДНК бактерий:
• суперспирализованную (нативная молекула, стабилизированная белками);
•линейную (расщепленная рестриктазой кольцевая молекула).
Разделение трех типов молекул ДНК в одном геле выглядит следующим образом (по подвижности от катода к аноду):
Кольцевая молекула ДНК
Линейная молекула ДНК
Суперспирализованная молекула ДНК
При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в одну из лунок геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с
известными значениями молекулярных масс).
Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза.
Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания
электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 ч, гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254—400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм), при этом
становится видна ДНК.
Внимание! Используемый в качестве красителя бромид этидия является мутагенным веществом. При работе с ним необходимо использовать резиновые или латексные перчатки.
Методы вертикального и горизонтального электрофореза
принципиально сходны, однако в последнем случае вместо агарозного используют полиакриламидный гель (ПААГ) и процесс электрофореза проходит вертикально. Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью.
Кроме того,акриламид является токсичным веществом. Приготовить ПААГ
значительно сложнее, чем агарозный гель. В связи с этим в работе
с ДНК преимущественно используют метод горизонтального
электрофореза в агарозном геле.
Цель работы. Ознакомиться с методом горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле.
Оборудование и материалы.1. Прибор для горизонтального электрофореза.
2. Источник постоянного тока. 3. Электрическая плитка или СВЧ-печь. 4. Гельдокументирующая видеосистема. 5. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 6. Колба мерная вместимостью 1 л. 7. Колба коническая
вместимостью 0,5 л. 8. Цилиндр мерный вместимостью 250 мл. 9. Кристаллизатор.
10. Набор реагентов для электрофореза (например, производимый ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ»)включает: смесь для приготовления электродного буфера;
навеску агарозы; раствор бромида этидия; раствор краски-лидера (бромфеноловый синий). 11. Проба исследуемой плазмидной ДНК. 12. ДНК-маркер молекулярных масс. 13. Перчатки резиновые или латексные неопудренные. 14. Теплоизолирующая рукавица. 15. Вода дистиллированная.
Ходработы.Приготовлениерабочегобуферногораствора для электрофореза. Содержимое пакета «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мерную колбу, раство-ряют в 600—800 мл дистиллированной воды (для более быстрого
растворения следует подогреть раствор до 40—45 «С при постоян-
ном помешивании) и доводят объем полученного раствора до 1 л
дистиллированной водой.
Подготовка прибора для электрофореза к работе. Пользуясь встроенными уровнями и винтовыми ножками,
прибор устанавливают строго горизонтально. В рабочую камеру
наливают буфер для электрофореза. Для формирования гелевой
пластины собирают кювету, в нее помещают аппликатор (гребенку) для формирования лунок в толще геля (рис. 2). Регулируемую
высоту аппликатора выставляют таким образом, чтобы расстояние
от дна кюветы до каждого из зубцов составляло 1—2 мм. В зависимости от числа анализируемых проб одновременно можно установить одну, две или три гребенки.
Приготовление агарозного геля. Навеску агарозы,
необходимую для приготовления 1%-ного геля, полностью переносят в коническую стеклянную колбу вместимостью 250—500 мл,
добавляют 150 мл рабочего раствора буфера для электрофореза и
перемешивают. Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в
СВЧ-печи или на электроплитке, периодически помешивая (колбу
держать, только надев на руку теплоизолирующую рукавицу). Продолжают нагревание до тех пор, пока содержимое колбы не станет
совершенно прозрачным (обычно еще 1 мин). Расплав охлаждают
до 55—60 °С, добавляют 10 мкл раствора бромида этидия, перемешивают (работу проводят в латексных или резиновых перчатках) и
наливают на столик для заливки геля (см. описание к прибору для
электрофореза), не допуская образования воздушных пузырьков,
так, чтобы толщина слоя была не менее 5 мм, а зубцы гребенок
были погружены в гель не менее чем на 4 мм. Гель полностью застывает через 15—20 мин. Столик с готовым агарозным гелем и гре-
бенками переносят в камеру для электрофореза, в которую нали-
вают рабочий раствор буфера для электрофореза так, чтобы по-
крыть гелевую пластину слоем в 2—3 мм. Извлекают гребенки из
агарозного геля легким и плавным движением вверх, стараясь не
повредить образовавшиеся лунки.
Проведение электрофореза. В лунки застывшего агарозного геля осторожно вносят по 3 мкл раствора исследуемых образцов ДНК. В соседнюю лунку геля вносят 3 мкл маркера молекулярных масс фрагментов ДНК. В одну или
две (по краям пластины геля) свободные лунки вносят 2—3 мкл
краски-лидера. Закрывают крышку прибора для электрофореза и
подключают его к источнику постоянного тока, строго соблюдая
полярность электродов и учитывая, что движение фрагментов
ДНК происходит в направлении от катода к аноду (от «минуса» к
«плюсу»). На вольтметре источника постоянного тока устанавли-
вают напряжение 120—150 В. В таком режиме процесс электрофо-
реза продолжают около 30 мин, ориентируясь на фронт пробега
краски-лидера (приблизительно на 3 см). По окончании электро-
фореза источник напряжения отключают, снимают крышку при-
бора, пластину агарозного геля осторожно переносят на свето-
фильтр (просмотровый столик) УФ-трансиллюминатора для де-
текции Включают трансиллюми-
натор. Зоны ДНК, окрашенные бромидом этидия, светятся при
УФ-облучении.
Внимание! Во избежание повреждения сетчатки глаз ультрафиолетовым излучением наблюдать зоны ДНК следует только через за-щитное стекло из комплекта трансиллюминатора или защитные (стеклянные) очки. Полученные результаты регистрируют визуально или с использованием гель-документирующей видеосистемы,пользуясь инструкцией к ней.
Контрольные вопросы.1. Какой принцип лежит в основе метода электрофоре-
за? 2. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2,5%-ного геля?
3. Какой концентрации агарозный гель нужно использовать для разделения мето-
дом электрофореза фрагментов ДНК размером 350 и 150 п.н.? 4. В каком направ-
лении и почему движутся молекулы ДНК при проведении электрофореза? 5. От
каких факторов зависит скорость движения молекул ДНК в агарозном геле в про-
цессе электрофореза? 6. Почему нужно избегать образования в геле пузырьков
воздуха? 7. За счет чего происходит визуализация ДНК в геле? 8. Каким образом
можно контролировать движение молекул ДНК в геле во время электрофореза?
9. На каких этапах проведения электрофореза необходимо работать в перчатках и
почему?
Задания.1. Поместить схему или фотографию электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Определить и подписать размеры фрагментов ДНК-маркера (согласно описанию к нему). 3. По электрофореграмме определить электрофоретическую подвижность и рассчитать примерную молекулярную массу исследуемой плазмидной ДНК, используя маркеры молекулярных масс. 4. Определить, какой из ДНК нижеперечисленных плазмид соответствует исследуемая ДНК, если ДНК плазмиды РСЕМ-2Гимеет размер 3000 п.н.ДНК плазмиды рВК322 — 4361,а ДНК плазмидыр РСУ002—8560 п.н.
источник
Установка для электрофореза в агарозном геле.На рисунке 7 представлены основные элементы для проведения горизонтального электрофореза в агарозном геле. Схематично, установку можно представить как емкость для электродного буфера, по краям которой расположены два электрода. В пространство между электродами заливается проводящий буфер, в котором проводится электрофорез, и помещают гель. При этом гель может быть залит непосредственно в камере, а может быть залит отдельно на специальном лотке, который помещается в камеру.
Агароза. Природный коллоид, который выделяют из морских водорослей, является линейным полисахаридом, образованным повторяющимся элементом ‒ агаробиозой, которая в свою очередь состоит из чередующихся элементов: галактозы и 3,6-ангидрогалактозы. Агароза очень хрупка, и легко разрушается при манипулировании. Агарозные гели имеют «поры» большого размера и используются преимущественно для разделения больших молекул.
Агарозные гели получают суспендированием сухого порошка агарозы в водном буфере, и кипячением смеси до того момента, когда агароза расплавится и образует прозрачный раствор. Затем раствор наливают на подложку и дают остыть до комнатной температуры, чтобы сформировался прочный гель. При застывании агароза формирует матрикс, плотность которого определяется концентрацией.
Буфер для электрофореза. На электрофоретическую подвижность ДНК воздействуют состав и ионная сила буфера для электрофореза. В отсутствии ионов, электропроводность минимальна, и перемещение ДНК происходит медленно. В буфере с высокой ионной силой электропроводность очень эффективна, и образуется значительное количество тепла. В худшем случае, гель расплавляется и ДНК денатурирует. Существует несколько буферов для электрофореза нативной двухцепочечной ДНК. Они содержат ЕОТА (рН 8,0) и Тгis-ацетат (ТАЕ), Тгis-борат (ТВЕ), или Тгis-фосфат (ТРЕ).
Маркерная ДНК. При заданном напряжении, концентрации агарозного геля и буфера, расстояние перемещения зависит от молекулярного веса исходного материала. Поэтому, маркерная ДНК известного размера должна наноситься на дорожки и с левого, и с правого края геля. Маркер обычно содержит определенный набор известных сегментов ДНК, которые облегчают определение размера исследуемой ДНК, если какое-либо систематическое искривление геля возникнет во время электрофореза.
Буфер для нанесения. Образцы ДНК, которые будут наноситься на агарозный гель, сначала смешивают с буфером для нанесения, обычно содержащим воду, сахарозу и краситель (например ксиленцианол, бромфеноловый синий, бромкрезол зеленый и другие).
Окраска и фиксация
Для анализа результатов электрофореза, после его завершения, требуется, прежде всего, визуализовать картину распределения полос в геле. С этой целью могут применяться два основных подхода. Первый способ состоит в окрашивании ДНК специфическими красителями. Для этой цели существует большое разнообразие красителей, способных специфически окрашивать двунитевые или однонитевые участки ДНК, ДНК в составе различных комплексов или в определённой конформации. К достоинствам такого подхода можно отнести высокую чувствительность, избирательность окрашивания и дешевизну метода. Среди недостатков можно упомянуть относительную трудоёмкость процедуры, невозможность следить за ходом электрофореза в реальном времени, токсичность некоторых из широко применяемых красителей, воздействие красителей на структуру ДНК, и необходимую иногда предварительную фиксацию ДНК в геле.
Другой путь основан на способности самой ДНК поглощать свет в УФ диапазоне. Поэтому можно просканировать гель в УФ-свете и определить местоположение ДНК в геле. В настоящее время промышленностью выпускаются специальные комплексы, позволяющие следить за миграцией ДНК в геле в автоматическом режиме непосредственно в ходе электрофореза и получать оцифрованное изображение в любой момент времени. При использовании этого подхода предварительная фиксация ДНК в геле не требуется. К недостаткам подхода можно отнести малую избирательность метода и относительную дороговизну оборудования.
Наиболее распространенным красителем ДНК в экспериментах по электрофорезу является бромистый этидий. Этот краситель относится к соединениям, способным интеркалировать между парами оснований ДНК. Вещество является сильным канцерогеном и мутагеном, способным проникать через кожу. По этой причине работа с ним требует особой осторожности и соблюдения повышенных мер безопасности. При работе с бромистым этидием всегда необходимо использовать перчатки и маску. Отходы, содержащие бромистый этидий, требуют специальной утилизации.
ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫ
1. Для приготовления 1%-го геля ‒ смешайте 100 мл воды и 1 г агарозы и доведите раствор до кипения. Размешайте до ресуспендирования осевшей агарозы. В пластиковую кювету для геля установите гребенку под будущие лунки. Влейте агарозу в кювету. Агароза должна заполнить куветю полностью. Когда гель затвердеет, осторожно удалите гребенку.
2. Готовим камеру ‒ кладем пластиковую кювету с гелем в камеру, заливаем буфером так, чтобы гель скрылся под ним.
3. Вносим 5–10 мкл образца в лунки и закрываем верхней крышкой.
4. К черному штекеру присоединяем отрицательный полюс, а к красному положительный.
5. Включаем форез ‒ 120 В 20–30 мин. Возле электродов должны быть небольшие пузырьки, как индикатор, что форез пошел. ДНК двигается от минуса к плюсу, поэтому лунки с ДНК должны быть возле черного штекера (минуса).
6. Через 20–30 мин, выключаем прибор, открываем крышку и вытаскиваем кувету с гелем шипцапи или используем перчатки. В случае наличия в образце красителя, разделение можно будет увидеть невооруженным глазом, а при его отсутствии просматривают гель в УФ-свете на трансиллюминаторе и фотографируют.
Сделать вывод о проделанной работе. Зарисовать электрофореграмму.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Дайте понятие электрофорезу.
2. Дайте понятие электрофорезу в агарозном геле.
3. Физические принципы электрофореза в агарозном геле.
4. Перечислите параметры, от которых зависит движение заряженных частиц в агарозном геле.
5. Перечислите компоненты, необходимые для электрофореза в агарозном геле.
6. Основные элементы установки для электрофореза в агарозном геле.
7. Объясните методы анализа результатов электрофореза, их достоинства и недостатки.
8. К какому полюсу происходит движение молекул ДНК при электрофорезе в агарозном геле и почему?
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
источник
Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями.
в плашку для электрофореза залить «подложку» — слой агарозы 1.5-2.0% толщиной
2-3 mm, дать застыть;
ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля. Низкопроцентные гели особенно чувствительны к перегрузке по количеству DNA на дорожку.
Разделение линейных молекул
Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с различной концентрацией агарозы:
|
Меньший предел определяется (в основном) диффузией полосы в геле. Т.е. в гелях с низкой концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы не четкие.
Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более длинные молекулы можно эффективно разделить.
Разделение суперскрученных и кольцевых молекул
К сожалению относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий фореза: % геля, скорость фореза (в частности, это означает, что нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул).
Приведенная таблица дает некоторое представление о соотношении подвижностей при умеренной (
6V/cm) скорости фореза (в скобках — при более быстром разгоне):
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию EtBr.
На 1% агарозном форезе ssDNA бежит чуть быстрее (
10%), чем dsDNA того же размера. ssDNA окрашивается EtBr заметно слабее, чем ds (разница в
4-5 раз). Tо есть, чтобы полосы имели одинаковую интенсивность окраски, требуется взять
Чтобы разделить цепи, нужно либо непосредственно перед форезом прогреть
1′ 100 o C, либо добавить к образцу NaOH до 0.1 М, 5-10′ (NT или 37 o C);
При оценке напряженности поля для горизонтального фореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.
На рисунке показана схема форезов, при разном напряжении. Форезы проводились разное время, так, чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля.
Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для высококачественных или препаративных форезов:
2V/cm(можно меньше для ON форезов). Для аналитических форезов приемлемое качество сохраняется до
DNA особенно легко теряет EtBr при повышенной температуре (что обычно случается, если гонять форезы при высоком напряжении).
EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.
Количество DNA, которое можно наносить на дорожку
Нижний предел определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то не стоит надеяться увидеть 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере
0.005-0.02%) могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. По нашему опыту, элюция фрагмента в РEG вместе с любым из этих красителей не оказывает заметного влияния на меченье, лигирование и трансформацию.
Cresol red (Na соль) — (стоковый раствор 50mM в H 2 O; рабочая концентрация в 1х буфере
0.1mM) совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV.
OrangeG — (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере
0.01-0.05%) наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV.
Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле. Обычно приводимые в методиках
0.025% для бромфенолового синего и ксиленцианола (в 1х буфере) по нашему мнению слишком большое количество.
* буфера с различными красителями.
* различные разведения буфера для внесения (10х, 2х, 1х). При этом образец любого объема собирается из двух компонентов (буфер+образец), а не из трех (буфер+ вода + образец).
1x если объем образца 25-75%;
10x ==> 75%
Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/
| Дополнения, комментарии, вопросы Для оптимального разделения не очень больших фрагментов, можно пользоваться буфером для внесения по рецепту, указанному в каталоге MBI Fermentas: 6x Orange Loading Dye Solution (#R0631) При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. Такой подход позволяет оптимизировать рабочее напряжение, а, соответственно, и разделение. И еще — я человек в мол.биологии непросвещенный, а потому да простят меня профессионалы, если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки. Люди, хелп! Если кто-нибудь знает что-то про технологию внесения биополимеров в гель под названием Shark Teeth, напишите, пожалуйста! А почему бы заодно не добавить в текст, что рабочая концентрация бромистого этидия, например, 0,5 мкг/мл и что его можно добавлять прямо в гель, что гель с добавленным в него EthBr спокойно стоит ночь под электродным буфером без заметного вымывания из него краски? Полезные, вобшем-то факты, хоть и мелкие, но, с моей точки зрения, вполне не лишние. Акульи зубы — не гель. а гребенка в виде этих самых зубок. Втыкается в гель, и не вынимается, а образец наносится тонким-тонким носом в дырки между зубами. См. инструкцию к Макрофору. Только это не про агарозный форез. 2Re: что это гребенка такая, я знаю. Только сейчас вижу, что по формулировке моего вопроса кажется, будто это гель так называется:) Все, спасибо, уже поздно:) Только по моим данным, это имено про форез. Не знаю уж, про агарозный или ПААГ, по-моему, в данном случае не суть важно Народ, а какова длина волны для визуализации ПЦР-фрагментов? народ, а как точно называется маркер мол веса (лестница)? и куда, как ее наносить? а почему в гел Этьбромид а не GelStar ? GelGreen ? GelRed ? SYBRSafe ? а почему ТБЕ ТАЕ а не SB (sodium borate) ? а почему UV а не Blue ( Safe Imager , Dark Reader , FlashGel) А ПОКОЧАНУ )))) ответ от радио Molbiol — Не выпендрюйся Василий Иваныч-слушай свои «Валенки» 1: Biotechniques. 2004 Feb;36(2):214-6. Links Erratum in: Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA. PMID: 14989083 [PubMed — indexed for MEDLINE] All: 1 1: Electrophoresis. 2001 Mar;22(5):814-28.Click here to read Links Clare Chemical Research, Inc, Denver, CO 80206, USA. mseville@clarechemical.com The Dark Reader optical system (Clare Chemical Research, Denver, CO, USA) uses relatively low intensity broad-band visible blue light in combination with broad-band optical filters to detect fluorescence with a level of sensitivity that often surpasses that of UV transilluminators and can rival that of laser-based scanners. Applications of DR (Clare Chemical Research) devices include the detection of DNA and SYBR-stained protein samples following, and also during, electrophoresis. Unlike laser-based imaging systems, the fluorescence is directly visible to the user as well as being fully compatible with charge-coupled device (CCD) and Polaroid camera-based detection and imaging. Additionally, the DR optical system functions well in multicolor fluorophor environments. Because the Dark Reader does not emit any UV light, the extent of DNA damage incurred when visualizing DNA samples is drastically reduced compared to the damage produced by a UV device and this can have a significant benefit on downstream cloning protocols. Furthermore, dye photobleaching is minimal, extending the length of time that a fluorescent sample is visible. The inherent flexibility of the DR optical system allows many different configurations of the Dark Reader to be constructed such as transilluminators, hand lamps and integrated transilluminator-electrophoresis units. PMID: 11332748 [PubMed — indexed for MEDLINE] Today’s Featured Review Until recently Sybr green had been our labs nucleic stain of choice. We have, however, recently migrated to Biotium’s GelRed. GelRed is a newer nucleic acid gel stain that is safer and more temperature stable than other dyes. GelRed is safer because it is non mutagenic and is diluted in water. It is more thermostable than Sybr dyes because it does not degrade with repeated freeze-thaws or long storage (couple months at RT) and can be stored at room temperature, and sensitivity seems to at least equal if not exceed Sybr green when visualized with UV transilluminator. The dye is used similarly to Sybr dyes with staining (available at 10,000X ) or direct sample additions. The technology is not particularly ground breaking or new but the safety profile of this product makes it a viable alternative to potentially more dangerous dyes. Review by Vitelli Using GelGreen ‘In-Gel’ Save even more Time. GelGreen Safety FlashGel™ DNA System The FlashGel System is the fastest way to separate DNA and the only way to watch DNA migration as it happens. This revolutionary new tool separates DNA in 2 – 7 minutes. Monitor gel runs right at the bench, without UV light. The highly sensitive system allows a 5X reduction in DNA levels – saving both time and money. * Get results in 5 minutes or less. The FlashGel System consists of enclosed, disposable, precast agarose gel cassettes and a combination electrophoresis and transilluminator unit. * FlashGel Cassettes contain precast, prestained agarose gels and buffer – no need for gel preparation, buffer addition or gel staining. это все называется «ДНК технология» — не путайте с одноименной фирмой всем привет. Здравствуйте! «. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. « а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации. Скорее всего малая концентрация? Спасибо —Заранее спасибо ответившим, особенно ответившим правильно —. При этом ксиленцианол мигрирует с > 4 kb, а оранжевый — с 50 bp. « —а при какой процентности геля? Я так понимаю, как мигрируют красители именно от этого и зависит. Вроде красители в агарозе мигрируют на одно и тоже Rf не зависимо от процентности. А вот фрагменты сильно зависимо от процентности. Берете 2 маркера 100b и 1000b и в разных процентностях агарозы гоните с красителями и очень хорошо определяете, что с чем бежит. 3 процентный агароз вам уже трудно будет растворить. Я так дУмаю-у Мне кажется это лишняя работа элюировать ДНК из геля для последующей амплификации. Срез геля в воду, заморозить-разморозить и 1-2 мкл на ПЦР. Вы реамплифицируете кг. Спасибо, попробую на следующей неделе. А что если уже выделил из геля с помощью QG и при исходнике с приблизительной количеством 50 нг получил 40 мкг в 40 мкл. На форезе 1,2% в 10 мкл пробы ясен перец ничего не видно, агароза супер. Поставил на ПЦР, отправил 20 мкл в смесь, жду результатов. Сколько приблизительно может быть продукта? Спасибо Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка?? 1% агарозу (в 2% линейная ДНК идет очень близко к суперскрученной, в 0.7% — близко к релаксированной). Если требуется проконтролировать циклизацию 3kbp фрагмента, то надо использовать 2% агарозу. если у Вас не нарабатывается большое кол-во продукта (20 нг в мкл и выше), дело уж конечно не в пирофосфатах- откуда бы им взяться, коли буквы не включились в амплификат (его мало)? Скорее всего проблемы с праймерами- посмотрите, нет ли «бомбы» (димер праймеров) внизу, или полимераза дохнет, что вря ли. Если проблема не лечится «в лоб», то просто замешайте исходно большой объем смеси, грубо говоря, накопите продукт экстенсивным путем, и всех делов. Я наверное перегрелся на солнцепёке (отпуск все-таки) — не понимаю в чем проблема плазмида или вставка, одна пара праймеров. По классике в ПЦР сильнее амплифицмруется всегда более короткий фрагмент. Без бутылки не разберешься, дождусь вечера. Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? И на какой стадии (до или после фиксирования в кислоте). Обязательно ли сушить? -Здравствуйте, подскажите чем красить агарозный гель после щелочного электрофореза? Бромий этидием или сибирским зеленым и иже с ними -до или после фиксирования в кислоте. «если я скажу всем известную вещь: вносить образцы в лунки гораздо проще, если под камеру подложить листок темной (черной или синей) бумаги, чтобы оттеняла лунки» Чем тогда думали в Сигма, если сделали столик в камере для фореза из белого пластика, к тому же скользкого в первом случае можно наклеить синей изоленты под место, где карманы)) Но от скольжения избавиться сложно — гель частенько уплывает от любых дуновений во время фореза. хоть гвоздями прибивай Можно ли заменить ТВЕ-буфер на Трис-СІ+EDTA для фореза ДНК, и какой молярности? За Трис.НСI в форезном буфере ставлю кол. Борная кислота испорчена у нас. Похоже, это ко мне . Поставляем наборы готовых гелей для электрофореза ДНК, рассчитанные на использование в ПЦРных лабораториях. В каждый комплект входит пузырёк ТАЭх20 (50 мл) для приготовления литра электрофоретического буферного раствора (EtBr 0,5 мкг/мл). Если нужно, то эти пузырёчки можно продавать и без гелей . Если интересно, то пишите. Ели реклама здесь неуместна, то удалите. Размер:: 19.19к кол-во скачиваний: 1724 Ну как может испортиться борная кислота? Купите тогда в аптеке. Борная кислота старая и «Ч.» по квалификации чистоты. Надо заказывать новые реактивы. Могу отсыпать сухой (белый порошок) ТВЕ. И дам пропись как самому готовить. Но про Трис.НСI для фореза — забудь. Лучше водопроводную воду. Забудьте и про Трис-HCl, и про все прочие буферы на основе Триса. Наиболее продвинутые пользователи за бугром переходят на Li-борат и Li-ацетат. Давно хотел попробовать карбонатный буфер, но всё руки не доходили. Недавно дошли. Приготовили Li-карбонатный буфер. Форезы получаются отлично! При 10V/см ни перегрева, ни закисления или защелачивания. Очень рекомендую! * ubMed will retrieve 2 records. J Virol Methods. 2010 May 13. [Epub ahead of print]Fast short-fragment PCR for rapid and sensitive detection of shrimp viruses. Mrotzek G, Haryanti, Koesharyani I, Tretyakov AN, Sugama K, Saluz HP. Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute, Beutenbergstrasse 11a, 07745 Jena, Germany; Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany. This article describes a fast short-fragment PCR method for the detection of white spot syndrome virus (WSSV), infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and monodon baculovirus (MBV). Fast two-temperature (95 degrees C denaturation and 60 degrees C annealing/extension) PCRs were performed in 5-10mul volume samples in miniaturized microplates using a fast Peltier thermal cycler. 40 cycles were completed in 25-30min. Rapid high-resolution agarose gel electrophoresis of 70-150bp PCR fragments was performed in 10min. High sensitivity of PCR product detection (50-100pg) was obtained using ultra sensitive dyes such as GelStar(®) and a gel documentation system equipped with a blue-light transilluminator. This novel method is faster and more sensitive than its TaqMan(®) real-time PCR counterparts. Copyright © 2010. Published by Elsevier B.V. да уж сам себя не похвались как оплеванный ходишь. © источник Метод гальванизации под названием электрофорез давно приобрел популярность и значимость среди остальных физиотерапевтических методиках лечения. Ощутить заметный результат от процедуры электрофореза можно практически в каждой клинике России. Этот метод физиотерапии может носить и другие названия – ионофорез, ионогальванотерапия, ионотерапия, гальванотерапия и т.д. Подобный метод физиотерапии был внедрен в общую практику медицины еще в 1802 году, а это значит, что свой неоценимый вклад в медицину он демонстрирует уже на протяжении более двухсот лет. Суть этого метода проста, как и все уникальное, — при помощи попеременно воздействующих токов разной силы и длины лекарственные препараты доставляются в очаг поражения сквозь слои кожи. Гель электрофорез – это разновидность ионофореза, который используется для распределения макромолекул в соответствии с их различиями в размерах, электрическом заряде и ряде других отличительных физических свойств. Само название «электрофорез» — обозначает способность заряженных частиц мигрировать в соответствии с воздействием электрического поля. В случае электрофореза в геле, молекулы, подвергаясь силе электрического тока, двигаются сквозь гелевую массу. Гель электрофорез используется для разделения следующих биологических макромолекул – пептиды, аминокислоты, белки, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты и т.д. Эти макромолекулы содержат больше количество ионизированных групп, и могут существовать, как катионы или анионы в любом заданном рН. Электрофорез нуклеиновых кислот применяют при угнетении нормальной жизнедеятельности макроорганизма, что может проявляться при переизбытки токсинов и шлаков. Исходя из этого, выведение токсинов и шлаков из организма – это прямая профилактика предупреждения всех генерализованных заболеваний, а так как химический состав вредных токсинов близок к белковым соединениям и полипептидам, преимущественным выбором будет гель электрофорез с цинком. Хлористый цинк оказывает ощутимое дезинфицирующее действие, и при выполнении электрофореза проявляется прожигающими ощущениями и активацией рефлекторных реакций. К примеру, самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля. Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК. Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике? Не все лабораторные методы могут разделить некоторые фрагменты ДНК, что мешает получить 100 %-нтный результат исследования. Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом. Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов:
Методика электрофореза с использованием агарозного геля должна учитывать, что «поры» для разделения макромолекул большого размера, и потому подходят только для молекул, молекулярная масса которых не меньше 200 кДа. К преимуществам агарозных гелей можно отнести относительно быстрое перемещение молекул, но полосы имеют ограниченное разрешение, так как склоны к быстрому размытию границ и распространению в разные стороны. Процедура электрофореза с гелем проводиться по следующим этапам:
Ведущие клиники могут провести гальванотерапию с гелем с учетом самых высоких технологий, преследуя следующие цели:
Эффекты после проведения электрофореза с гелем:
Из всего вышеописанного можно сделать заключение, что при правильно выбранной клинике для проведения геля электрофореза, точность и грамотность выполнения будет на высоком уровне. В полученных результатах можно не сомневаться, и активно приниматься за полноценное лечение. источник Впоследствии были предложены технологии разделения на плотных носителях, среди которых особое место заняли гели. Последние сочетали удобства разделения в свободном растворе (в геле 95-99% воды) с возможностью фиксировать результаты электрофореза путем высушивания геля. Среди гелеобразующих веществ вначале получил признание крахмал, затем полисахариды из водорослей агар-агар (агароза) и наконец гели, искусственно получаемые путем полимеризации акриламида. Полиакриламидный гель стал одним из наиболее популярных носителей для электрофореза. Полимеризацию проводят в буферном растворе. Затем гель помещают в электрофоретическую камеру, заполненную буферным раствором и содержащую электроды для образования электрического поля (рис.1.8). рН и другие параметры буферного раствора выбираются из расчета, чтобы разделяемые молекулы несли отрицательный заряд и двигались в электрическом поле слева направо. Поскольку разделяемые молекулы движутся в геле, те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к месту нанесения, чем меньшие. Рис.1.8. Виды проведения электрофореза в полиакриламидном геле (слева — в трубках с гелем, справа — в прямоугольных блоках) Следует иметь ввиду, что этот метод позволяет разделять молекулы большей частью по их размеру, и совсем необязательно, — по их молекулярной массе. Для примера рассмотрим две молекулы белка по 1000 аминокислот каждая. Одна из них представляет вытянутую цепь (А), а вторая (за счет образования связей между соседними участками) имеет форму шпильки (Б): Поскольку они движутся внутри геля, обе молекулы будут вести себя как сферы, диаметр которых равняется длине вытянутой части молекулы. Обе молекулы имеют одинаковую молекулярную массу, однако благодаря тому, что вторичная структура Б де-лает её молекулу короче, чем А, быстрее будет передвигаться Б. Дабы устранить влияние различий по форме и оставить только различия по молекулярной массе, разделяемые молекулы должны иметь развернутую конформацию (без вторичной структуры). Для разрушения вторичной и третичной структуры используются различные методы подготовки препаратов белка. Подготовка белков. Все белки обладают вторичной и третичной структурной организацией. При этом их молекулы не всегда несут отрицательный заряд в растворе. Для разрушения вторичной и третичной структуры и образования на поверхности белков отрицательного заряда их нагревают и обрабатывают детергентом – додецилсульфатом натрия (ДДС-натрий). Если соблюсти вышеприведенные условия, разделение молекул при электрофорезе будет осуществляться в зависимости от их молекулярной массы. При этом удается, например, разделить 2 молекулы полинуклеотида, различающиеся на 1 мононуклеотид. Высокомолекулярные молекулы будут двигаться медленнее низкомолекулярных. Длина пройденного молекулой расстояния будет пропорциональна логарифму величины, обратной её молекулярной массе (log 1/MM). Обычно гели изображают в вертикальном положении, где место нанесения находится вверху, а движение разделяемых молекул направлено сверху вниз. Тогда в верхней части геля располагаются большие молекулы, а в нижней – с меньшей молекулярной массой. Как правило, рядом с опытными пробами на гель наносится смесь белковых (или каких-то других разделяемых) молекул с известной молекулярной массой. Такие стандарты «молекулярной массы» позволяют прокалибровать пробег молекул. Тогда, зная какое расстояние прошло изучаемое вещество, можно установить его молекулярную массу. Ниже на рисунке 1.9 показан гель после обработки его красителем. Молекулы красителя связываются с каким-то определенным классом макромолекул независимо от последовательности расположения мономеров в их составе. Рис.1.9. Результат проведения электрофореза в полиакриламидном геле после окраски геля неспецифическим красителем Изображенный на рис.1.9 образец 1 содержит макромолекулы одного размера. Это может быть очищенный белок. При сравнении с подвижностью стандартов ясно, что молекулярная масса этого соединения около 3. Образец 2. Это может быть смесь белков после окраски геля неспецифическим красителем. Здесь находится так много полос, что среди них невозможно вычленить необходимую. В подобных условиях без зонда (который действует как специфический краситель) нам едва ли удастся получить полезную информацию об интересующем соединении. Учитывая это обстоятельство, для определения индивидуальных белков пользуются сочетанием электрофореза с иммунологическими реакциями (иммуноэлектрофорез) (рис.1.10). Рис.1.10. Схема проведения иммуноблот анализа для обнаружения белка после проведения электрофореза в полиакриламидном геле (описание этапов приведено в гл.13) Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском: Лучшие изречения: На стипендию можно купить что-нибудь, но не больше. 8985 — 195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь. Отключите adBlock! источник |
| 7234 — 
или читать все.