Гидролитическое расщепление L-аспарагина до L-аспарагиновой кислоты, при участии фермента аспарагиназы, используется в медицине при лечении лейкозов. Лейкозные клетки не могут синтезировать аспарагин и получают его из плазмы крови. Если аспарагин, содержащейся в плазме крови, разрушить реакцией гидролиза, происходит нарушение метаболизма в лейкозных клетках. Напишите реакцию гидролитического превращения L-аспарагина в L-аспарагиновую кислоту проекционными формулами Фишера.
Смесь глицина, аланина, лизина, аргинина, серина и глутаминовой кислоты разделяли методом электрофореза при рН = 6.
Определите направление движения аминокислот при электрофорезе, если изоэлектрические точки этих аминокислот соответственно равны значениям pH: 6,0; 6,0; 9,8; 10,8; 5,7 и 3,2.
В изоэлектрической точке (pI рН) суммарный заряд б-аминокислоты равен нулю. В данных условиях такое соотношение выполняется для аланина, глицина и серина и эти аминокислоты в электрическом поле перемещаться не будут.
При рН > pI преобладает анионная форма и аминокислота (в данном случае глутаминовая кислота) будет перемещаться к аноду.
У лизина И.Э.Т. будет находиться в более щелочной среде, чем у глицина, так как для предотвращения образования второй NH3 + группы требуется дополнительное количество ионов OH.
Написать уравнения реакций аланина:
- а) с водным раствором щелочи;
- б) с водным раствором соляной кислоты;
- в) с бензоилхлоридом в щелочной среде.
Написать уравнения реакций лейцина:
- а) с уксусным ангидридом;
- б) с нитритом натрия в среде соляной кислоты;
- в) с этиловым спиртом в среде серной кислоты;
- г) с карбобензоксихлоридом.
В сильнощелочном растворе аминокислота существует в виде аниона и содержит две основные группы: NH2 и СОО. Учитывая тот факт, что константы основности для NH2-группы и карбоксилат-аниона R СОО соответственно равны 6,3•10 5 и 2,5•10 12 , определите, какая из этих групп будет более основной и к какой группе будет предпочтительно присоединяться протон при прибавлении к раствору кислоты. Какое соединение при этом образуется?
Из приведенных констант основности следует, что аминогруппа является более сильным основанием, чем карбоксильный ион (6,3•10 5 > 2,5•10 12 ), поэтому при добавлении кислоты протон будет присоединяться к аминогруппе, образуя биполярный ион:
В сильнокислом растворе аминокислота существует в виде катиона и содержит две кислотые группы: NH3 + и СООН. Учитывая, что константы кислотности для NH3 + и СООН групп соответственно равны 1,6•10 10 и 4•10 3 , определите, какая из этих групп будет более кислой и какая из них будет легче отдавать протон при прибавлении к исходному раствору щелочи. Какое соединение при этом образуется?
Из приведенных констант кислотности следует, что карбоксильная группа является более сильной кислотой, чем NH3 + ион, так как Kа( NH3 + ) = 1,6•10 10 3 , поэтому при добавлении щелочи карбоксильная группа будет отдавать протон, образуя биполярный ион:
При взаимодействии первичной аминогруппы с азотистой кислотой выделяется азот, по объёму которого по методу Ван-Слайка определяют число аминогрупп в кислоте.
При обработке равных количеств (по 0,001 моль) трех различных аминокислот получили (при н.у.):
- а) в первом случае 22,4 мл азота;
- б) во втором случае 44,8 мл азота;
- в) в третьем случае азот не выделялся вообще.
Какие возможные аминокислоты были взяты для этих экспериментов?
Рассчитаем количество азота, выделившихся в первом и втором опытах:
Таким образом, из 0,001 моль аминокислоты выделилось 0,001 моль азота. Следовательно, это может быть любая моноамино-карбоновая кислота (одно- или двухосновная).
В этом опыте количество выделившегося азота вдвое больше количества исходной кислоты. Следовательно, аминокислота содержит две аминогруппы (это может быть, в частности, лизин или орнитин).
в) В этом опыте азот не выделился вообще, следовательно, аминокислота не содержала свободной первичной аминогруппы. Например, это может быть иминокислота пролин.
Напишите все возможные стереоизомеры треонина в проекциях Фишера. Укажите конфигурацию каждого асимметрического центра. Какие структуры являются энантиомерами, а какие диастереомерами? Есть ли среди приведенных структур мезоформа?
Молекула треонина содержит два асимметрических центра:
следовательно, число оптических изомеров равно 2 n = 2 2 = 4.
I и II, III и IV энантиомеры;
I и III, I и IV, II и III, II и IV диастереомеры.
Среди приведенных структур мезоформы нет, так как каждый стереоизомер имеет свой энантиомер.
Укажите, какие исходные вещества надо взять для синтеза фенилаланина методом прямого аммонолиза и методом циангидринного синтеза. Напишите уравнения всех реакций.
Для синтезов необходимо иметь фенилэтаналь, 2-хлор-3-фенил-пропановую кислоту, аммиак и синильную кислоту.
Фрагментом гормона окситоцина является трипептид цис-тир-иле. Напишите строение этого пептида, выделите пептидные связи и дайте полное название данного пептида.
Проведите синтез дипептида с аминокислотной последовательностью цистир, с предварительной защитой аминогруппы и активацией карбоксильной группы. Укажите все стадии процесса и назовите этот дипептид.
Аминогруппа тирозина будет участвовать в образовании пептидной связи, а аминогруппа цистеина должна быть свободной, поэтому надо проводить «защиту» аминогруппы цистеина карбобензоксихлоридом:
Для того чтобы провести реакцию с тирозином, надо «активировать» карбоксильную группу цистеина:
Тирозин следует «защитить» со стороны карбоксильной группы. Для этого проводят реакцию этерификации:
Полученный сложный эфир тирозина вступает в реакцию нуклеофильного замещения с карбобензоксихлоридом цистеина, защищенного по аминогруппе.
Последняя стадия процесса снятие «защиты» аминогруппы гидрогенолизом и гидролиз сложноэфирной группы в щелочной среде:
Напишите формулу трипептида гис-лиз-три. Дайте полное название этого трипептида, укажите пептидные связи, N- и С-концевые аминокислоты. Определите, в какой области рН находится изоэлектрическая точка данного пептида.
Изоэлектрическая точка этого пептида находится в щелочной среде, так как в данном пептиде число основных групп преобладает над числом карбоксильных групп.
Напишите тетрапептид со следующей последовательностью аминокислот: лизин-аланин-валин-глутаминовая кислота. Отметьте незаменимые аминокислоты, нейтральные и кислые. Выделите пептидную связь и объясните, почему она имеет плоское строение и вокруг каких связей возможно свободное вращение.
Незаменимые кислоты лизин и валин. Кислая кислота глутаминовая, нейтральные валин и аланин.
Плоское строение пептидной связи обусловлено sp 2 -гибридизацией атома углерода карбонильной группы. Сопряжение неподеленной пары электронов атома азота с двойной связью С = О (р-р сопряжение) приводит к частичной двоесвязанности связи С N, что и объясняет плоское строение всей группы СО NH.
Свободное вращение возможно вокруг одинарной связи азота с б-углеродным атомом и вокруг связи б-углеродного атома с атомом углерода карбонильной группы.
В пептидном гидролизате обнаружено четыре аминокислоты в молярном соотношении: гли:ала:фен:сер = 2:1:1:3. Молярная масса этого пептида равна 1438 г/моль. Определите аминокислотный состав данного пептида.
Рассчитаем суммарную массу двух моль глицина, одного моль аланина, одного моль фенилаланина и 3 моль серина:
m=2M(глицина) + 1M(аланина) + 1M(фенилаланина) + 2M(серина)
m = 275 + 89 + 165 + 1053 = 719 г.
Измеренная молярная масса пептида составляет 1438 г/моль, следовательно, число всех аминокислот в пептиде должно быть в два раза больше и тогда состав пептида будет следующим: 4 молекулы глицина, 2 молекулы аланина, 2 молекулы фенилаланина и 6 молекул серина.
В данном случае можно лишь установить количественный состав пептида, но нет возможности установить, в каком порядке эти аминокислоты связаны в пептид.
Как известно, атом галогена прочно привязан к бензольному кольцу, и поэтому ароматические галогениды не склонны реагировать с нуклеофилами. Объясните, почему 2,4-динитро-фторбензол легко реагирует со свободной аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида и не реагирует с атомом азота пептидной группы NН С = О, хотя атом азота этой амидной группы тоже содержит неподеленную пару электронов.
Наличие сильно электроноакцепторных нитрогрупп в орто- и параположениях бензольного кольца и атома фтора, имеющего наибольшую электроотрицательность из всех известных элементов, резко уменьшают электронную плотность у атома углерода бензольного кольца, связанного со фтором, делая тем самым молекулу более восприимчивой к атаке нуклеофилом. В качестве нуклеофила выступает атом азота аминогруппы, содержащий неподеленную пару электронов.
Атом азота амидной группы в этой реакции в роли нуклеофила не может конкурировать со свободной аминогруппой, так как в результате сопряжения неподеленной пары электронов атома азота с двойной связью карбонильной группы, амиды становятся значительно более слабыми нуклеофилами, чем амины.
сопряжение пары электронов азота с двойной связью С = О
Напишите формулу тетрапептид фен-цис-три-глу. С помощью каких цветных реакций можно доказать наличие в этом пептиде бензольного кольца, пептидной связи, серусодержащей аминокислоты и триптофана?
Ароматическое кольцо в пептиде можно обнаружить реакцией с концентрированной азотной кислотой (ксантопротеиновая реакция).
Для качественного и количественного определения триптофана можно использовать реакцию Эрлиха в среде серной кислоты появляется красно-фиолетовое окрашивание.
Наличие пептидной связи доказывается с помощью биуретовой реакции.
Для обнаружения цистеина используют реакцию с ацетатом свинца в щелочной среде.
Укажите направления движения (движутся к катоду или к аноду, не перемещаются в электрическом поле) в процессе электрофореза при рН = 1,9; 3; 6,5 и 13 следующих пептидов:
Изоэлектрическая точка этого пептида находится в щелочной среде, так как число аминогрупп превышает число карбоксильных групп.
В сильнокислой среде при рН = 1,9 и при рН = 3 за счет протони-рования аминогрупп образуются катионы R NH3 + и пептид будет перемещаться к катоду. При рН = 6,5 (среда почти нейтральная) пептид будет перемещаться к катоду, так как его изоэлектрическая точка находится в щелочной среде. В сильнощелочной среде при рН = 13 образуется карбоксилат-ион и пептид будет перемещаться к аноду.
Изоэлектрическая точка этого пептида находится в среде близкой к нейтральной, так как число аминогрупп этого пептида равно числу карбоксильных групп. Поэтому в сильнокислой среде (при рН = 1,9 и рН = 3) диссоциация карбоксильных групп подавлена, а аминогруппы будут протонированы и пептид будет перемещаться к катоду. При рН = 6,5 (среда близкая к нейтральной) пептид в электрическом поле перемещаться не будет, так как он практически находится в изоэлектрическом состоянии. В сильнощелочной среде (при рН = 13) будут преобладать анионы (карбоксилат-ионы), и пептид начнет перемещаться к аноду.
источник
На свойствах аминокислот основаны методы их разделения из смеси. С практической точки зрения разделение аминокислот является необходимой процедурой в выяснении аминокислотного состава белков и пептидов. Наиболее популярными являются хроматографические методы.
Сам термин «хроматография» (греч. сhroma — цвет, graphein — писать) был введен в 1903г. русским ботаником Михаилом Цветом. Ему удалось разделить смесь пигментов листьев растений, используя твердые сорбенты. Современные методы разделения многих соединений базируются на хроматографии. При этом смесь веществ, подлежащих разделению, растворяется в жидкости или газовой среде, составляя «мобильную фазу». Она фильтруется через колонку, заполненную поросодержащим твердым матриксом, получившим название «стационарная фаза». Последний в некоторых типах хроматографии может быть ассоциирован с жидкостью.
Взаимодействие со стационарной фазой каждого из растворенных веществ приводит к задержке его прохождения через матрикс. Сила этой задержки зависит от свойств растворенного вещества. Поэтому если смесь, подлежащая фракционированию, начинает двигаться через колонку, на каждое из находящихся в ней соединений будут действовать задерживающие силы разной интенсивности. В результате такого воздействия постепенно смесь разделится на зоны, содержащие чистые вещества. Разделенные компоненты можно собрать в отдельные фракции для анализа или последующего фракционирования.
В зависимости от мобильной и стационарной фаз различают газожидкостную хроматографию (мобильная фаза — газ, стационарная — жидкость), жидкостно-жидкостную хроматографию (мобильная и стационарная фазы — несмешивающиеся жидкости, одна из которых связана с инертной твердой подложкой). Дальнейшая классификация хроматографических методов основана на природе преобладающего взаимодействия между стационарной фазой и разделяемыми веществами. К примеру, если сила, замедляющая продвижение вещества в твердой фазе, ионная по характеру, хроматография называется ионообменной; если же она является результатом адсорбции растворенных веществ на твердой стационарной фазе — хроматография будет адсорбционной.
Ионообменная хроматография.В процессе ионного обмена ионы, которые электростатически связаны с нерастворимым и химически инертным матриксом, обратимо замещаются ионами из раствора:
где R + A — — анионообменник, а В — — анионы из раствора. Соответственно катионообменник представляет отрицательно заряженные группы, которые обратимо связывают катионы.
Аминокислоты относятся к полиэлектролитам, поскольку они имеют положительный и отрицательный заряд. За счет этого они могут присоединяться к анионо- и катионообменникам в зависимости от суммарного электрического заряда. Принцип разделения аминокислот ионообменной хроматографией представлен на рис. 1.4.
Рис.1.4. Принцип разделения аминокислот ионообменной хроматографией
Различные аминокислоты взаимодействуют и связываются с ионообменниками с различной силой. Колонку промывают, постоянно добавляя жидкость (обычно, буферный раствор) на поверхность сорбента; соответственно, пройдя через твердую фазу, она вытекает из колонки. Этот процесс получил название «элюция». При этом те аминокислоты, у которых низкая связывающая способность к данному ионообменнику, будут продвигаться через колонку быстрее аминокислот с более высокой связывающей способностью (рис.1.5).
Рис.1.5. Сбор аминокислот, разделенных ионообменной хроматографией
Аминокислоты, которые более сильно связаны с ионообменником, можно вымыть, заменив элюирующий буфер на буфер с другим рН или с более высокой концентрацией соли. Такой процесс называется «этапной элюцией» (рис.1.6).
Рис. 1.6. Принцип этапной элюции при проведении ионообменной хроматографии
Весь этот процесс сейчас полностью автоматизирован так, что отдельные его стадии — элюирование, сбор фракций, их анализ и запись данных анализа — осуществляются по заданной программе в специальном приборе — аминокислотном анализаторе.
Прибор был предложен в 1958г. американскими учеными С. Муром и У. Стейном. Принцип его работы заключается в разделении смеси аминокислот ионообменной хроматографией на колонке, заполненной сульфированной полистирольной смолой. Колонка промывается буферными растворами с последовательным повышением их рН и концентрации. Время удержания каждой аминокислоты строго определенно и зависит от степени её ионизации. Выходящий из колонки элюат смешивается с раствором нингидрина и в специальной ячейке нагревается до 100 0 С. Аминокислоты, реагируя с нингидрином, превращаются в аммиак, СО2 и альдегид. Освобождающийся аммиак взаимодействует с другой молекулой нингидрина и дает окрашенное в фиолетовый цвет производное. Интенсивность окраски получающихся в результате реакции продуктов пропорциональна содержанию аминокислот в смеси. Она измеряется с помощью спектрофотометра, показания которого регистрируются самописцем.
Высокоэффективная жидкостная хроматография. В последние годы для разделения аминокислот используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. С этой целью аминокислоты предварительно дансилируют (взаимодействием с дансилхлоридом). Разделение дансилпроизводных аминокислот проводится на силикагеле с ковалентно присоединенными углеводородами с помощью специального жидкостного хроматографа. В его состав входят особым образом упакованные колонки, насос, позволяющий создавать давление до 200 атм, градиентный смеситель, работающий с высокой степенью воспроизводимости и высокочувствительный флюоресцентный детектор. К достоинствам метода следует отнести исключительно высокую скорость разделения (менее 1 ч), воспроизводимость результатов и возможность проводить аналитические опыты на микрограммовых количествах вещества.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Студент — человек, постоянно откладывающий неизбежность. 10527 — 
| 7317 — 
или читать все.
источник
Разделение смесей аминокислот и пептидов имеет исключительно важное значение при анализе аминокислотной последовательности белков. Зональный электрофорез, вообще говоря, не позволяет за один прием разделять сложные смеси из 10 — 20 аминокислот. [1]
Разделение смеси аминокислот методом ионообменной хроматографии основано на различии в их изоэлектриче-ских точках. Аминокислоты можно условно разделить на три группы; основные, нейтральные и кислые. Наконец, кислые аминокислоты являются моноаминодикарбоновыми кислотами. [2]
Разделение смесей аминокислот и пептидов имеет исключительно важное значение при анализе аминокислотной последовательности белков. Зональный электрофорез, вообще говоря, не позволяет за один прием разделять сложные смеси из 10 — 20 аминокислот. [3]
Разделение смесей аминокислот в гидролизатах белков при помощи ионообменивающих смол — наиболее простой и легко осуществимый в промышленности способ получения чистых препаратов аминокислот и пептидов и в особенности лечебных препаратов аминокислот. [4]
Для разделения смеси аминокислот , находящихся в гидролизате белка, и качественного обнаружения отдельных аминокислот широко используется метод распределительной хроматографии на бумаге. [5]
Для разделения смесей аминокислот , а также для идентификации и количественного определения разделенных аминокислот особенно широко применяется метод ионообменной хроматографии. Этот метод тоже основан на различиях кислотно-оснбвных свойств аминокислот, но большой вклад в его эффективность вносят некоторые дополнительные факторы. [7]
Для разделения смеси аминокислот чаще исего применяют метод распределительной хроматографии на бумаге. [8]
Для разделения смесей аминокислот , пептидов и белков Мартин и Сипдж применили систему хлороформ — вода. Применяют также органические основания в смесях со спиртами и водой и буферированные. Примерами служат смеси лутидин — этиловый спирт, лутидин — третичный амиловый спирт, лутидин — третичный амиловый спирт — вода, пиколпн, коллнднн, кол-лидин-буферный раствор, пиридин-амиловый спирт и другие. Бутиловый спирт применяют в смесях с уксусной кислотой, с бензпловым спиртом, с аммиаком, с монохлоргидрином гликоля, с третичным бутиловым спиртом и с другими веществами. Применяют также смесь метилового эфира с муравьиной кислотой, ацетона с водой и мочевиной. [9]
Для разделения смесей аминокислот , пептидов и белков Мартин и Синдж применили систему хлороформ — вода. В настоящее время большее значение имеют фенол, лг-крезол в смесях с водой и буферирующими веществами, такими, как фосфаты, аскорбиновая кислота и др. Применяют также органические основания в смесях со спиртами, водой и буферированные. Например, лутидин — этиловый спирт, лутидин — третичный амиловый спирт, лутидин — третичный амиловый спирт — вода, пиколин, коллидин, коллидин с буфером, пиридин — амиловый спирт и др. Бутиловый спирт применяют в смесях с уксусной кислотой, бензиловым спиртом, аммиаком, монохлоргидрином гликоля, третичным бутиловым спиртом и с другими веществами. Применяют также смесь метилоксида с муравьиной кислотой, смесь ацетона с водой и мочевиной. Для обнаружения аминокислот применяют обычный групповой реагент — нингидрин, позволяющий обнаруживать кроме аминокислот пептиды, белки и первичные амины. [10]
Приведены результаты разделения смесей аминокислот , жирных к-т и стероидов. [11]
Наиболее разработаны методы разделения смесей аминокислот с помощью распределительной хроматографии на бумаге. [12]
В последнее время для разделения смесей аминокислот широко используют метод электрофореза на бумаге, при котором на полосы фильтровальной бумаги наносят смесь аминокислот, бумагу смачивают буферным раствором с определенным значением рН и пропускают через нее электрический ток. Через несколько часов вследствие различия ИЭТ аминокислот и, следовательно, разных скоростей и направлений их движения в электрическом поле смесь аминокислот разделяется на бумаге на индивидуальные аминокислоты, количество которых может быть определено тем или иным методом. В настоящее время электрофорез используется для разделения не только аминокислот, но и белков, нуклеиновых кислот, органических кислот и ряда других соединений. [13]
Нами были проведены опыты по разделению смесей аминокислот на колонках с катионитами или аниопитами различных марок. При этом мы стремились получить данные, характеризующие адсорбционные свойства различных смол и полноту вытеснения адсорбированных аминокислот. [14]
К СЭтот метод можно использовать для разделения смесей аминокислот лизина , аспарагиновой кислоты, аргинина, аланина, глицина, глютаминовой кислоты. [15]
источник
Что такое клинические исследования и зачем они нужны? Это исследования, в которых принимают участие люди (добровольцы) и в ходе которых учёные выясняют, является ли новый препарат, способ лечения или медицинский прибор более эффективным и безопасным для здоровья человека, чем уже существующие.
Главная цель клинического исследования — найти лучший способ профилактики, диагностики и лечения того или иного заболевания. Проводить клинические исследования необходимо, чтобы развивать медицину, повышать качество жизни людей и чтобы новое лечение стало доступным для каждого человека.
У каждого исследования бывает четыре этапа (фазы):
I фаза — исследователи впервые тестируют препарат или метод лечения с участием небольшой группы людей (20—80 человек). Цель этого этапа — узнать, насколько препарат или способ лечения безопасен, и выявить побочные эффекты. На этом этапе могут участвуют как здоровые люди, так и люди с подходящим заболеванием. Чтобы приступить к I фазе клинического исследования, учёные несколько лет проводили сотни других тестов, в том числе на безопасность, с участием лабораторных животных, чей обмен веществ максимально приближен к человеческому;
II фаза — исследователи назначают препарат или метод лечения большей группе людей (100—300 человек), чтобы определить его эффективность и продолжать изучать безопасность. На этом этапе участвуют люди с подходящим заболеванием;
III фаза — исследователи предоставляют препарат или метод лечения значительным группам людей (1000—3000 человек), чтобы подтвердить его эффективность, сравнить с золотым стандартом (или плацебо) и собрать дополнительную информацию, которая позволит его безопасно использовать. Иногда на этом этапе выявляют другие, редко возникающие побочные эффекты. Здесь также участвуют люди с подходящим заболеванием. Если III фаза проходит успешно, препарат регистрируют в Минздраве и врачи получают возможность назначать его;
IV фаза — исследователи продолжают отслеживать информацию о безопасности, эффективности, побочных эффектах и оптимальном использовании препарата после того, как его зарегистрировали и он стал доступен всем пациентам.
Считается, что наиболее точные результаты дает метод исследования, когда ни врач, ни участник не знают, какой препарат — новый или существующий — принимает пациент. Такое исследование называют «двойным слепым». Так делают, чтобы врачи интуитивно не влияли на распределение пациентов. Если о препарате не знает только участник, исследование называется «простым слепым».
Чтобы провести клиническое исследование (особенно это касается «слепого» исследования), врачи могут использовать такой приём, как рандомизация — случайное распределение участников исследования по группам (новый препарат и существующий или плацебо). Такой метод необходим, что минимизировать субъективность при распределении пациентов. Поэтому обычно эту процедуру проводят с помощью специальной компьютерной программы.
- бесплатный доступ к новым методам лечения прежде, чем они начнут широко применяться;
- качественный уход, который, как правило, значительно превосходит тот, что доступен в рутинной практике;
- участие в развитии медицины и поиске новых эффективных методов лечения, что может оказаться полезным не только для вас, но и для других пациентов, среди которых могут оказаться члены семьи;
- иногда врачи продолжают наблюдать и оказывать помощь и после окончания исследования.
- новый препарат или метод лечения не всегда лучше, чем уже существующий;
- даже если новый препарат или метод лечения эффективен для других участников, он может не подойти лично вам;
- новый препарат или метод лечения может иметь неожиданные побочные эффекты.
Главные отличия клинических исследований от некоторых других научных методов: добровольность и безопасность. Люди самостоятельно (в отличие от кроликов) решают вопрос об участии. Каждый потенциальный участник узнаёт о процессе клинического исследования во всех подробностях из информационного листка — документа, который описывает задачи, методологию, процедуры и другие детали исследования. Более того, в любой момент можно отказаться от участия в исследовании, вне зависимости от причин.
Обычно участники клинических исследований защищены лучше, чем обычные пациенты. Побочные эффекты могут проявиться и во время исследования, и во время стандартного лечения. Но в первом случае человек получает дополнительную страховку и, как правило, более качественные процедуры, чем в обычной практике.
Клинические исследования — это далеко не первые тестирования нового препарата или метода лечения. Перед ними идёт этап серьёзных доклинических, лабораторных испытаний. Средства, которые успешно его прошли, то есть показали высокую эффективность и безопасность, идут дальше — на проверку к людям. Но и это не всё.
Сначала компания должна пройти этическую экспертизу и получить разрешение Минздрава РФ на проведение клинических исследований. Комитет по этике — куда входят независимые эксперты — проверяет, соответствует ли протокол исследования этическим нормам, выясняет, достаточно ли защищены участники исследования, оценивает квалификацию врачей, которые будут его проводить. Во время самого исследования состояние здоровья пациентов тщательно контролируют врачи, и если оно ухудшится, человек прекратит своё участие, и ему окажут медицинскую помощь. Несмотря на важность исследований для развития медицины и поиска эффективных средств для лечения заболеваний, для врачей и организаторов состояние и безопасность пациентов — самое важное.
Потому что проверить его эффективность и безопасность по-другому, увы, нельзя. Моделирование и исследования на животных не дают полную информацию: например, препарат может влиять на животное и человека по-разному. Все использующиеся научные методы, доклинические испытания и клинические исследования направлены на то, чтобы выявить самый эффективный и самый безопасный препарат или метод. И почти все лекарства, которыми люди пользуются, особенно в течение последних 20 лет, прошли точно такие же клинические исследования.
Если человек страдает серьёзным, например, онкологическим, заболеванием, он может попасть в группу плацебо только если на момент исследования нет других, уже доказавших свою эффективность препаратов или методов лечения. При этом нет уверенности в том, что новый препарат окажется лучше и безопаснее плацебо.
Согласно Хельсинской декларации, организаторы исследований должны предпринять максимум усилий, чтобы избежать использования плацебо. Несмотря на то что сравнение нового препарата с плацебо считается одним из самых действенных и самых быстрых способов доказать эффективность первого, учёные прибегают к плацебо только в двух случаях, когда: нет другого стандартного препарата или метода лечения с уже доказанной эффективностью; есть научно обоснованные причины применения плацебо. При этом здоровье человека в обеих ситуациях не должно подвергаться риску. И перед стартом клинического исследования каждого участника проинформируют об использовании плацебо.
Обычно оплачивают участие в I фазе исследований — и только здоровым людям. Очевидно, что они не заинтересованы в новом препарате с точки зрения улучшения своего здоровья, поэтому деньги становятся для них неплохой мотивацией. Участие во II и III фазах клинического исследования не оплачивают — так делают, чтобы в этом случае деньги как раз не были мотивацией, чтобы человек смог трезво оценить всю возможную пользу и риски, связанные с участием в клиническом исследовании. Но иногда организаторы клинических исследований покрывают расходы на дорогу.
Если вы решили принять участие в исследовании, обсудите это со своим лечащим врачом. Он может рассказать, как правильно выбрать исследование и на что обратить внимание, или даже подскажет конкретное исследование.
Клинические исследования, одобренные на проведение, можно найти в реестре Минздрава РФ и на международном информационном ресурсе www.clinicaltrials.gov.
Обращайте внимание на международные многоцентровые исследования — это исследования, в ходе которых препарат тестируют не только в России, но и в других странах. Они проводятся в соответствии с международными стандартами и единым для всех протоколом.
После того как вы нашли подходящее клиническое исследование и связались с его организатором, прочитайте информационный листок и не стесняйтесь задавать вопросы. Например, вы можете спросить, какая цель у исследования, кто является спонсором исследования, какие лекарства или приборы будут задействованы, являются ли какие-либо процедуры болезненными, какие есть возможные риски и побочные эффекты, как это испытание повлияет на вашу повседневную жизнь, как долго будет длиться исследование, кто будет следить за вашим состоянием. По ходу общения вы поймёте, сможете ли довериться этим людям.
Если остались вопросы — спрашивайте в комментариях.
источник
Дата добавления: 2015-08-06 ; просмотров: 3610 ; Нарушение авторских прав
Электрокинетическими явлениями назвали процессы, происходящие в дисперсных системах и связанные с перемещением фаз относительно друг друга под действием внешнего электрического поля. Эти явления впервые были обнаружены Ф.Ф. Рейсом в 1807 г. Причиной их является существование двойного электрического слоя на границе гранула – диффузный слой и легкость смещения гранулы относительно диффузного слоя. В электрическом поле при наложении внешней разности потенциалов двойной электрический слой разрывается по границе (поверхности) скольжения и частица получает заряд, соответствующий x-потенциалу. При этом гранула движется к одному полюсу, а противоионы диффузного слоя, увлекая за собой гидратные оболочки, – к другому.
Движение частиц дисперсной фазы относительно дисперсионной среды под действием внешнего электрического поля называется электрофорезом.
Движение дисперсионной среды относительно дисперсной фазы под действием внешнего электрического поля называется электроосмосом.
Позже, в 1859 г, Квинке обнаружил, что при проталкивании под давлением коллоидного раствора через капилляр на его концах возникает разность потенциалов, названная потенциалом протекания. Это явление можно рассматривать как обратное электроосмосу.
Явление, обратное электрофорезу открыл в 1878 г. Дорн. Он установил, что при оседании частиц дисперсной фазы в жидкой среде по высоте сосуда возникает разность потенциалов между верхним и нижним слоями. Ее назвали потенциалом седиментации. Причина этого явления – деформация ДЭС оседающих частиц при трении о дисперсионную среду.
Электрофорез коллоидных растворов.Метод электрофореза позволяет определить знак заряда частиц золя, а также величину x-потенциала. Наблюдать электрофорез коллоидных растворов можно с помощью прибора, изображенного на рис.36. Прибор представляет собой U–образную трубку, в колена которой вставлены электроды. Коллоидный раствор вводят через трубочку Б до уровня А – А. На поверхность раствора налита контактная жидкость, которая является дисперсионной средой золя или имеет одинаковую с ней электропроводность. На электроды подают напряжение. Через некоторое время уровень золя изменится в обоих коленах (В – В).
В электрическом поле противоионы диффузного слоя обычно двигаются в направлении, противоположном движению гранул. При этом в соответствующем колене прибора повышается уровень жидкости, так как ионы диффузного слоя увлекают за собой дисперсионную среду за счет сил межмолекулярного трения (вязкости) между гидратной оболочкой ионов и окружающей жидкостью. То есть в данном колене наблюдается электроосмос.
Но это только в том случае, если на пути передвижения стоит мембрана, препятствующая движению гранул (т.е. фаза закреплена).
При свободном передвижении диффузный слой удерживается гранулой и в виде отстающего «хвоста» следует вместе с ней. Поэтому уровень золя будет повышается в электродном пространстве, имеющим знак заряда, противоположный заряду частиц. Следовательно, в нашем случае частицы золя заряжены отрицательно, так как уровень жидкости повысился в анодном пространстве.
Зная величину смещения уровня (S) за определенный промежуток времени (t), можно экспериментально рассчитать скорость электроосмоса (электрофореза): V = S/t, м/с. С другой стороны, скорость движения частиц дисперсной фазы в электрическом поле по уравнению Гельмгольца – Смолуховского равна:
V = ,
где V – линейная скорость перемещения частиц (или границы золя), м/с; ε – относительная диэлектрическая проницаемость среды; Н – напряженность электрического поля (градиент потенциала), В/м; k – коэффициент, зависящий от формы частиц (k = 4 – для сферических частиц, k = 6 – для цилиндрических);
η – вязкость среды, Н×с/м 2 ; x – электрокинетический потенциал, В.
Как видно из уравнения, скорость электрофореза тем больше, чем выше диэлектрическая проницаемость среды, напряженность электрического поля, величина ξ -потенциала (т.е. заряд частиц) и чем меньше вязкость среды, а также зависит от формы частиц.
Последнее уравнение позволяет рассчитать величину x-потенциала:
x = .
Линейная скорость электрофореза (V) изменяется пропорционально напряженности электрического поля и не может служить характеристикой частиц. Поэтому было введено понятие электрофоретическая подвижность (u):
Следовательно: x = .
Величина x-потенциала позволяет судить об устойчивости коллоидного раствора, поскольку последняя зависит от этой величины.
Уравнение Гельмгольца – Смолуховского также применимо для электрофореза аминокислот и белков, где x-потенциал определяется суммарным зарядом иона.
Электрофорез аминокислот и белков. Разделение белков, аминокислот методом электрофореза основано на способности их молекул принимать определенный знак заряда в зависимости от рН среды.
Аминокислоты, являясь структурной единицей белков, своим строением и последовательностью соединения молекул определяют специфичность и свойства белков. Так как их молекулы содержат и основную (–NH2), и кислотную (–СООН) группы, то они являются амфотерными соединениями и в водных растворах находятся в виде биполярных ионов:
В нейтральной среде заряд иона аминокислоты (или белка) определяется соотношением числа –NH2 и –СООН групп и степенью их диссоциации. Если число карбоксильных групп больше числа аминогрупп, суммарный заряд иона будет отрицательный, если больше аминогрупп – положительный. Если же количество этих групп в ионе одинаково, то суммарный заряд равен нулю.
Ионизация амино- и карбоксильных групп зависит также от рН среды. В кислой среде диссоциация карбоксильной группы подавляется и протонируется аминогруппа. В результате аминокислота (белок) приобретает положительный заряд:
В щелочной среде аминокислота приобретает отрицательный заряд:
При некотором значении рН среды, характерном для данной аминокислоты (белка), суммарный заряд иона равен нулю. Состояние, в котором молекула аминокислоты или белка обладает равенством положительных и отрицательных зарядов, то есть электронейтральна, называется изоэлектрическим состоянием. А значение рН среды, при котором молекула электронейтральна, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ или рJ).
pJ, то молекула заряжается отрицательно и в электрическом поле перемещается к аноду.
ИЭТ белков с преобладанием –СООН групп (кислых белков) находиться в кислой среде, а с преобладанием – NH2 групп (основных белков) – в щелочной. Если число амино- и карбоксильных групп равно, то ИЭТ будет находится приблизительно в нейтральной среде, что зависит от степени диссоциации этих групп. Следовательно, суммарный заряд иона белка (аминокислоты) зависит также от рН среды и ИЭТ белка (аминокислоты).
Любой раствор рН которого меньше, чем ИЭТ, является кислым для молекулы данного белка (аминокислоты), и она, приобретая положительный заряд, в электрическом поле двигается к катоду. Если рН раствора больше чем ИЭТ, то данная среда является щелочной для молекулы, и она, приобретая отрицательный заряд, в электрическом поле двигается к аноду.
Наблюдать электрофорез аминокислот и белков можно с помощью прибора, схема которого изображена на рис.37а. Он представляет собой ванну, состоящую из катодного и анодного отделений, в которые заливается буферный раствор с определенным значением рН. Берется полоска плотной фильтровальной бумаги, пропитанной тем же буферным раствором. На её середину полоски (линия старта) наносят небольшое количество смеси белков, которые необходимо разделить, а на концах ее ставят знаки «+» и «–». Затем полоску помещают на подставке в прибор так, что бы один конец (–) погрузился в раствор катодного отделения, а второй (+) – анодного, и подают внешнее напряжение. Через некоторое время прибор отключают, бумагу вынимают, высушивают и окрашивают красителем, проявляющим белки. На полученной электрофореграмме (рис.37б) будет наблюдаться несколько окрашенных зон. Их число соответствует числу компонентов в смеси. Характер расположения и интенсивность полос на ней определяются качественным и количественным составом белков в смеси.
Так как все компоненты имеют различную электрофоретическую подвижность, то они окажутся на различном расстоянии от линии старта. Причем чем дальше от линии старта оказалась зона, тем выше скорость электрофореза вследствие большей величины ξ-потенциала (заряда) молекулы данного белка (аминокислоты). По направлению движения зон можно судить о заряде молекулы в данной среде. Если зона двигалась к катоду (–), то знак заряда положительный, если к аноду (+) – отрицательный.
Электрофорез и электроосмос широко применяются в медико-биологических исследованиях. Например, методом электрофореза разделяют белки, нуклеиновые кислоты, антибиотики, смеси лекарственных веществ в лекарственных препаратах, очищают от примесей лекарственные сыворотки, определяют белковые фракции в сыворотке крови. Этим методом можно не только разделять аминокислоты и белки, но и определять их ИЭТ. Если проводить электрофорез данного белка (аминокислоты) при разных значениях рН среды, то при рН равном ИЭТ это вещество не будет двигаться ни к катоду, ни к аноду.
Методы электрофореза применяются при диагностике ряда заболеваний и для контроля лечения путем сравнивания фракционного состава (по числу и интенсивности зон на электрофореграмме) нормальных и патологических жидкостей.
Электрофорез и электроосмос происходят при прохождении тока через ткани живых организмов. На поверхности биологических мембран находятся заряженные группы, что обуславливает образование двойного электрического слоя, в котором фиксированный отрицательный заряд клеточной поверхности уравновешивается положительным зарядом, создаваемым ионами межклеточной среды. Поэтому метод электрофореза позволяет определить величину x-потенциала, а следовательно, и заряд эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и других элементов крови. Достаточно хорошо изучен электрокинетический потенциал эритроцитов. Было установлено, что величина x-потенциала является характерной для данного вида животных, а также для человека.
Электрофорез (ионофорез) является одним из методов введения лекарственных препаратов в организм человека. Он широко применяется в физиотерапии, поскольку имеет ряд преимуществ по сравнению с другими способами введения лекарств. При электрофорезе оно поступает непосредственно в ткани зоны воздействия (следовательно, требуются меньшие дозы) и действует медленнее, но продолжительнее.
Устойчивость и коагуляция коллоидных растворов
Коллоидные растворы из-за большой удельной поверхности на границе раздела фаз имеют избыток поверхностной энергии и поэтому термодинамически неустойчивы. И только присутствие стабилизатора придает им устойчивость.
Под устойчивостью дисперсных систем понимают постоянство во времени их свойств, в первую очередь постоянство дисперсности и постоянство равновесного распределения частиц дисперсной фазы в среде. В данном определении имеется в виду способность системы противостоять агрегации (укрупнению) частиц дисперсной фазы – агрегативная устойчивость, и способность системы противостоять седиментации частиц (т.е. их осаждению под действием силы тяжести) – седиментационная (кинетическая) устойчивость.
Способность частиц дисперсной фазы удерживаться во взвешенном состоянии зависит от их дисперсности, вязкости дисперсионной среды, разности плотностей дисперсной фазы и дисперсионной среды. Кинетическая (седиментационная) устойчивость золя тем выше, чем меньше размер частиц, чем ближе значения плотностей фазы и среды, чем выше вязкость дисперсионной среды. Причем степень дисперсности частиц оказывает наибольшее влияние. Поэтому высокодисперсные системы, в которых скорость осаждения взвешенных частиц под влиянием силы тяжести настолько мала, что ею можно пренебречь, принято называть седиментационно (кинетически) устойчивыми.
Агрегативная устойчивость характеризует способность частиц дисперсной фазы оказывать сопротивление их слипанию и тем удерживать определенную степень дисперсности. Основными факторами агрегативной устойчивости дисперсных систем являются наличие у частиц ионной оболочки, т.е. ДЭС, диффузного слоя противоинов, а так же их сольватной (гидратной) оболочки. Эти факторы оценивают величиной электротермодинамического потенциала j коллоидной частицы, толщиной ее диффузного слоя, величиной заряда частицы и ее x-потенциала. Их значения зависят от условий получения золя, а также от природы противоиона (его заряда, радиуса, гидратирующей способности). В зависимости от этих условий изменяется количество противоионов в диффузном слое. Чем больше противоионов в нем, тем больше его толщина и, соответственно, выше заряд и x-потенциал частицы. Это способствует увеличению агрегативной устойчивости. Утрата агрегативной устойчивости приводит к коагуляции.
Коагуляция – это процесс слипания коллоидных частиц и образования более крупных агрегатов, ведущий к выпадению их в осадок под действием сил тяжести и последующему разделению фаз. Другими словами это потеря в начале агрегативной, а затем седиментационной устойчивости, ведущая к разрушению дисперсной системы. В общем смысле под коагуляцией понимают потерю агрегативной устойчивости дисперсной системы.
Коагуляцию могут вызвать различные факторы: изменение температуры, механическое воздействие, действие света, облучение, увеличение концентрации золя, добавление электролитов.
Изменение температуры по-разному влияет на кинетическую и агрегативную устойчивость, а следовательно, и на коагуляцию. Первая при увеличении температуры возрастает в результате усиления броуновского движения. Вторая при этом снижается вследствие уменьшения толщины диффузного слоя. Причем увеличивается и вероятность столкновения (соответственно – слипания) частиц, что способствует коагуляции.
Наиболее изучена и имеет большое практическое значение коагуляция электролитами. Электролиты, с одной стороны, необходимы для стабилизации золя, но с другой – их избыток в растворе вызывает коагуляцию. Поэтому коллоидные растворы, полученные химическими методами, необходимо очищать от примесей электролитов.
Коагуляция коллоидных растворов электролитами.Количественной характеристикой коагулирующей способности электролита служит порог коагуляции – наименьшее количество электролита, которое вызывает коагуляцию I л золя. Он рассчитывается по формуле:
γ = ,
где γ – порог коагуляции, моль/л; С – концентрация электролита, моль/л; V – объем раствора электролита, л; V – объем золя, л.
Порог коагуляции можно рассчитывать и в ммоль/л.
Величина, обратная порогу коагуляции (1/γ), является мерой коагулирующей способности электролита: чем меньше порог коагуляции, тем выше коагулирующая способность электролита.
Практически все электролиты способны вызвать коагуляцию золя, если концентрацию электролита увеличить до значений, соответствующих его порогу коагуляции для данного золя.
Коагулирующее действие электролитов зависит от знака заряда и величины заряда ионов и определяется правилом Шульце – Гарди.Коагуляцию вызывают в основном ионы, имеющие заряд, противоположный знаку заряда частицы (М. Гарди). То есть для золя с положительно заряженными частицами ионами-коагулянтами являются анионы, а коагуляцию отрицательно заряженного золя вызывают катионы добавляемого электролита. Ичем выше заряд иона коагулянта, тем выше его коагулирующая способность(Г. Шульце),т.е. требуется меньшее количество электролита для коагуляции (порог коагуляции меньше). Позже Б.В.Дерягиным было установлено, что если коагуляцию вызываютионы одного знака, но разной величины заряда, то их пороги коагуляции соотносятся как величины, обратные их зарядам в шестой степени:
g+ : g2+ : g3+ = = 730 : 11:1
Поскольку порог коагуляции зависит не только от природы иона-коагулянта, но и от природы иона, сопутствующего ему, а также условий проведения опыта, на практике наблюдаются отклонения от указанного соотношения. В настоящее время установлено, что порог коагуляции пропорционален величине заряда иона-коагулянта в степени от 2 до 9, часто в степени 6.
У ионов одного знака и одинаковой величины заряда пороги коагуляции также отличаются друг от друга, но незначительно.
Коагуляция в ряде случаев зависит от способа прибавления электролита-коагулятора. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что если электролит добавлять к золю небольшими порциями, то в итоге коагуляция наступает при более высокой концентрации электролита, чем при внесении сразу большого его количества. Такое явление называют привыканием золя.
Явление коагуляции электролитами играет существенную роль в живом организме, так как коллоидные растворы клеток и биологических жидкостей соприкасаются с электролитами. Поэтому при введении в организм какого-либо электролита надо учитывать не только его концентрацию, но и заряд ионов. К примеру, физиологический раствор хлорида натрия нельзя заменить изотоничным раствором хлорида магния, поскольку данная соль содержит двухзарядный ион магния, оказывающий более высокое коагулирующие действие.
Кинетика и механизм коагуляции электролитами. Коагуляция любого коллоидного раствора не происходит мгновенно – она протекает во времени. Процесс коагуляции можно наблюдать по изменению оптических свойств раствора. Различают две стадии коагуляции: скрытую и явную. На первой стадии происходит укрупнение частиц без видимых изменений оптических свойств раствора (скрытая коагуляция). На второй стадии идет дальнейшее укрупнение частиц, сопровождающееся видимым изменением золя (явная коагуляция).
На рис.38 показана кривая (OSKN) зависимости скорости коагуляции золя от концентрации добавляемого электролита. Отрезок ОS соответствует скрытой коагуляции,а точка А – концентрации электролита при пороге коагуляции, который можно зафиксировать. Признаками явной коагуляции являются помутнение золя или изменение его окраски.
В начале явной коагуляции (отрезок SКN) скорость ее невелика. Но по мере нарастания концентрации электролита она значительно увеличивается. Поэтому различают медленную (SК) и быструю (КN) коагуляцию. Точка В соответствует концентрации электролита при некотором остаточном значении x-потенциала (в литературе его называют критическим x-потенциалом).
Существуют различные теории, описывающие механизм коагуляции. Из них наиболее удовлетворительной считается теория Дерягина – Ландау, доработанная Э.Фербеем и Дж.Обербеком (теория коагуляции ДЛФО). Согласно этой теории, две коллоидные частицы в процессе броуновского движения могут сблизиться на расстояние, при котором перекрываются их диффузные оболочки. Только в этом случае они начинают испытывать силы межмолекулярного притяжения и силы электростатического отталкивания их диффузных слоев.
В первом приближении механизм ионной стабилизации сводится к электростатическому отталкиванию диффузных слоев, зависящему от их толщины. При большой толщине диффузных слоев (рис.39а) их перекрытие проявляется на расстоянии, когда силы отталкивания одноименно заряженных слоев больше сил межмолекулярного притяжения и коллоидные частицы не слипаются (не агрегируют). При малой толщине диффузных слоев (рис.39б) частицы сближаются до расстояния, на котором межмолекулярное притяжение сильнее отталкивания этих слоев, и тогда происходит их агрегация, т.е. коагуляция.
Согласно теории ДЛФО, введение в дисперсную систему электролита вызывает сжатие ионной оболочки частиц за счет избирательной или ионнообменной адсорбции на их поверхности ионов данного электролита. При этом понижается заряд частицы, ее x-потенциал и, следовательно, толщина диффузного слоя. Уменьшение толщины диффузного слоя приводит к преобладанию сил межмолекулярного притяжения над силами электростатического отталкивания, вследствие чего скорость коагуляции возрастает.
В этом механизме коагуляции золей электролитами учтено взаимодействие сил молекулярного притяжения и электростатического отталкивания, но не учтены силы взаимодействия адсорбционно-сольватных оболочек частиц и другие факторы, что является недостатком теории ДЛФО.
Коагуляция золя смесями электролитов.Коагуляцию золей можно вызвать и смесями электролитов, которые способны оказывать на них различные действия (рис. 40).
1. Коагулирующее действие смеси электролитов суммируется, т.е. смесь электролитов оказывает тоже действие, как один из них, взятый тем же количеством – аддитивное действие.
2. Коагулирующее действие смеси электролитов меньше, чем каждого из них в отдельности, т.е. для коагуляции золя количества смеси потребуется больше чем количества каждого из них в отдельности – антагонизм. Это характерно для смесей ионов, имеющих различную валентность.
3. Коагулирующее действие смеси электролитов большее, чем каждого из них в отдельности, т.е. количества смеси потребуется меньше чем количества одного из электролитов в отдельности – синергизм.
Выше описанные явления очень важны для понимания закономерностей воздействия ионов на органы и ткани живого организма, поскольку биологически активные ионы часто выступают в роли «антагонистов» или «синергистов». Это обстоятельство должно учитываться при составлении кровезамещающих растворов: они должны быть не только изотоническими плазме крови и иметь одинаковую с ней ионную силу, но и быть максимально близкими по ионному составу. Однако описанные явления ни в коем случае нельзя смешивать с явлениями физиологического антагонизма ионов, под которым обычно понимают ослабление одним катионом токсического или иного физиологического действия, вызываемого другим катионом.
Взаимная коагуляция золей. Помимо электролитов, коагуляцию золей можно вызвать путем смешивания одного их них в определенных количественных соотношениях с другим золем, гранулы которого имеют противоположный знак заряда. Это явление носит название взаимной коагуляции. Причем даже при незначительной концентрации противоположно заряженных частиц скорость коагуляции существенно возрастает.
Механизм взаимной коагуляции заключается в следующем. При перекрывании диффузных слоев коллоидных частиц, имеющих заряды разных знаков, эти частицы не отталкиваются, а электростатически притягиваются, и как следствие этого идет быстрая агрегация частиц. Наиболее полно взаимная коагуляция происходит тогда, когда заряды частиц, противоположные по знаку, равны между собой по величине.
Данный процесс широко применяется при очистке природных и промышленных вод. Так, перед поступлением воды на песчаные фильтры к ней добавляют соли алюминия или железа. Образующиеся в результате гидролиза этих солей положительно заряженные золи гидроксида алюминия или железа вызывают быструю коагуляцию взвешенных отрицательно заряженных частиц почвы, микрофлоры и т.д.
источник
Кислотно-основные свойства. Эти свойства аминокислот определяют многие физико-химические и биологические свойства белков. На этих свойствах основаны, кроме того, почти все методы выделения и идентификации аминокислот. Аминокислоты легко растворимы в воде. Они кристаллизуются из нейтральных водных растворов в форме биполярных (амфотерных) ионов (цвиттерионов), а не в виде недиссоциированных молекул (последнюю структуру приводят для удобства представления, однако все аминокислоты при физиологических значениях рН имеют структуру цвиттериона).
При растворении в воде кристаллическая аминокислота, например аланин, может реагировать или как кислота (донатор протона):
Если радикалы аминокислот нейтральные, то они почти не оказывают влияния на диссоциацию α-карбоксильной группы или α-аминогруппы, и величины рК (отрицательный логарифм константы диссоциации) остаются относительно постоянными. Вследствие этого кривые диссоциации почти всех нейтральных аминокислот накладываются друг на друга и могут быть рассмотрены на примере аланина. Если к раствору аланина (например, 0,1 М) в воде постепенно прибавлять сильную кислоту (0,1 М раствор НСl) или сильную щелочь (0,1 М раствор NaOH), то получим кривую титрования аланина, типичную для всех нейтральных аминокислот (рис. 1.6).
Кажущиеся величины рК’ для α-карбоксильной группы и α-аминогрупп (т.е. значения рН, при которых эти группы в среднем наполовину диссоциированы) довольно сильно различаются, составляя pK1 = 2,34 и рК2 = 9,69. При низком значении рН (ниже pK1‘) почти все молекулы аланина являются полностью протонированными и несут положительный заряд. Другими словами, при высокой концентрации водородных ионов в растворе тенденция к диссоциации водорода из структуры аланина оказывается незначительной. Из кривой титрования видно, что точка перехода между ветвями кривой располагается при рН 6,02.
Это означает, что при данном значении рН суммарный (или средний) электрический заряд молекулы аланина равен нулю и она не перемещается в электрическом поле ни к аноду, ни к катоду (изоэлектрическое состояние). Такое значение рН получило название изоэлектрической точки и обозначается pI. Изоэлектрическая точка аминокислот, не содержащих дополнительных NH2— или СООН-групп, представляет собой среднее арифметическое между двумя значениями рК’:
Изоэлектрическая точка ряда других аминокислот, содержащих дополнительные кислотные или основные группы (аспарагиновая и глутаминовая кислоты, лизин, аргинин, тирозин и др.), зависит, кроме того, от кислотности или основности радикалов этих аминокислот. Для лизина, например, рI должна вычисляться из полусуммы значений рК’ для α- и ε-NН2-групп. Таким образом, в интервале рН от 4,0 до 9,0 почти все аминокислоты существуют преимущественно в форме цвиттерионов с протонированной аминогруппой и диссоциированной карбоксильной группой. Следует отметить, что при физиологических значениях рН тканей и крови (7,1 и 7,4 соответственно) аминокислоты (за ислючением гистидина) не обладают измеримой буферной емкостью. Эту способность они приобретают только при значениях рН, близких к величинам их рК (т.е. при рН 1,7-3,2 и 8,6-10,8).
Рис. 1.6. Кривые, полученные при титровании 0,1 М раствора аланина 0,1 М раствором НСl (а) и 0,1 М раствором NaOH (б).
Стереохимия аминокислот. Важнейшим свойством аминокислот, освобождающихся в процессе гидролиза природных белков в условиях, исключающих рацемизацию, является их оптическая активность. Будучи растворенными в воде (или в НСl), они способны вращать плоскость поляризованного луча (исключение составляет глицин). Это свойство связано с наличием в молекуле всех природных аминокислот (за ислючением глицина) в α-положении асимметрического атома углерода (т. е. атома углерода, все четыре валентные связи которого заняты различными заместителями). Величины удельного вращения вправо или влево являются количественной характеристикой оптической активности, и для большинства аминокислот [а] 2 р составляет от 10 до 30°. Примерно половина аминокислот белков оказалась правовращающей, их обозначают знаком «+» (Ала, Иле, Глу, Лиз и др.), а чуть меньше половины — левовращающей (Фен, Трп, Лей и др.), их обозначают знаком «–». Все эти аминокислоты принадлежат к L-ряду, а величина и знак оптического вращения зависят от природы радикалов аминокислот и значения рН раствора, в котором измеряют оптическое вращение.
Стереохимию аминокислот принято оценивать не по оптическому вращению, а исходя из абсолютной конфигурации всех четырех замещающих групп, расположенных вокруг асимметрического атома углерода в вершинах модели тетраэдра. Абсолютную конфигурацию аминокислот принято соотносить стереохимически с соединением, произвольно взятым для сравнения, а именно с глицериновым альдегидом, также содержащим асимметрический атом углерода. Ниже представлены L- и D-стереоизомеры глицеринового альдегида. Рядом показаны пространственные конфигурации L-и D-аланина:
Все аминокислоты, образующиеся при гидролизе природных белков в условиях, исключающих рацемизацию, принадлежит к L-ряду. Таким образом, природные аминокислоты имеют пространственное расположение, аналогичное конфигурации L-глицеринового альдегида. Следует еще раз подчеркнуть, что символы L и D означают принадлежность данной аминокислоты по своей стереохимической конфигурации к L- или D-ряду, в то время как знак «+» или «–» указывает на направление изменения плоскости поляризации светового луча. Среди белковых аминокислот имеются две аминокислоты (треонин и изолейцин), которые содержат по два асимметрических атома углерода. Следовательно, если не в природе, то, во всяком случае, в лаборатории возможно получить четыре стереоизомерные формы этих аминокислот . Для треонина известны все четыре изомера. Если условно обозначить символом L выделенный из природных белков треонин, то его зеркальное отображение называют D-треонином. Два других изомера, получивших наименование диастереоизомеров, или аллоформ, также могут иметь L- и D-формы. Структурные конфигурации всех четырех стереоизомеров треонина можно представить следующими формулами:
Как отмечалось, в белковой молекуле D-аминокислоты не обнаружены , однако в живой природе они широко распространены.
Так, D-изомеры глутаминовой кислоты, аланина, валина, фенилаланина, лейцина и ряда других открыты в клеточной стенке бактерий; в составе некоторых антибиотиков, в частности актиномицинов, бацитрацина, грамицидинов А и S, содержатся аминокислоты D-конфигурации.
Аминокислотный состав (качественный и количественный) многих тысяч белков, полученных из разных источников, выяснен (табл. 1.4).
При анализе данных табл. 1.4 виден ряд закономерностей. На долю дикарбоновых аминокислот и их амидов в большинстве белков приходится до 25–27% всех аминокислот. Эти же аминокислоты вместе с лейцином и лизином составляют около 50% всех аминокислот. В то же время на долю таких аминокислот, как цистеин, метионин, триптофан, гистидин, приходится не более 1,5–3,5%. В протаминах и гистонах отмечено высокое содержание основных аминокислот аргинина и лизина, соответственно 26,4 и 85,2% (см. «Химия простых белков»).
Химические реакции для открытия и определения аминокислот в гидролизатах белков. В курсе органической химии подробно рассмотрено множество химических реакций, характерных для α-амино- и α-карбоксильных групп аминокислот (ацилирование, алкилирование, нитрование, этерификация и др.). Здесь будут рассмотрены общие цветные реакции для обнаружения индивидуальных аминокислот и аминокислот, входящих в состав белков, основанные на химической природе радикалов аминокислот (табл. 1.5).
Для открытия в биообъектах и количественного определения аминокислот успешно применяется реакция их с нингидрином. На I стадии реакции образуется восстановленный нингидрин за счет окислительного дезаминирования аминокислот (параллельно происходит декарбоксилирование аминокислот):
На II стадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя сине-фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570 нм) пропорциональна количеству аминокислоты:
На основе нингидриновой реакции были разработаны методы количественного определения аминокислот, в частности метод распределительной хроматографии на бумаге, впервые внедренный в 1944 г. (А. Мартин и Р. Синдж). Эта же реакция используется благодаря своей высокой чувствительности в автоматическом анализаторе аминокислот. Впервые такой прибор сконструировали Д. Шпакман, С. Мур и У. Стейн (рис. 1.7). После разделения смеси аминокислот в колонках, заполненных специальными ионообменными смолами (сульфополистирольный катионит), ток элюента из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор нингидрина; интенсивность образующейся окраски автоматически измеряется на фотоэлектроколориметре и регистрируется самописцем. Этот метод нашел широкое применение в клинической практике при исследовании крови, мочи, спинномозговой жидкости. С его помощью за 2–3 ч можно получить полную картину качественного состава аминокислот в биологических жидкостях и выявить наличие в них необычных азотсодержащих веществ, что имеет важное диагностическое и прогностическое значение.
Рис. 1.7. Работа автоматического анализатора аминокислот (принципиальная схема
по Шпакману, Муру и Стейну).
1 — смеситель; 2 — фотоэлектроколориметр; 3 — самописец.
Автоматические анализаторы аминокислот все время совершенствуются, повышаются чувствительность методов и скорость проведения анализа. Так, в современных приборах высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) удается проводить анализ гидролизата белка за 45 мин, определяя при этом концентрацию аминокислот в пикомолях (рис. 1.8).
Смесь аминокислот может быть успешно разделена также методом электрофореза на бумаге. При рН 6,0 возможно хорошее разделение кислых и основных аминокислот с нейтральными. В этом случае отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты будут двигаться к аноду, а положительно заряженные – к катоду. Нейтральные аминокислоты остаются на линии старта.
Для их разделения электрофорез обычно проводят при рН 1,8–2,0, когда все они мигрируют к аноду с незначительным, но уловимым различием в подвижности. После электрофореза местоположение аминокислот на электофореграмме выявляют с помощью химических реакций, а после элюции окрашенных продуктов определяют их количественно.
Рис. 1.8. ВЭЖХ аминокислот по Цеху и Вольтеру. Разделение на колонке (3 х 250 мм), наполненной ионообменной смолой – полистиролдивинилбензолом. Концентрация аминокислот 500 пмоль/л, реактив для детектирования – флюорескамин, образующий с аминогруппой сильно флюоресцирующее соединение.
1 — Асп; 2 — Тре; 3 — Сер; 4 — Глу; 5 — Гли; 6 — Ала; 7 — Цис; 8 — Вал; 9 — Мет; 10 -Иле; 11 — Лей; 12 — Тир; 13 — Фен; 14 -Лиз; 15 — Гис; 16 — Арг.
источник