Меню Рубрики

Для чего окраска мазка мокроты по граму

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

  1. Предметные и покровные стекла.
  2. Шпатели и иглы.
  3. Смесь Никифорова.
  4. Газовая или спиртовая горелка.
  5. Пастеровская пипетка с резиновым баллончиком.
  6. Водяная баня с мостиком.
  7. Иммерсионное масло.
  8. Микроскоп.
  9. Фильтровальная бумага.
  10. Пинцеты Корне.
  11. Бумажки Синева.
  12. Основной фуксин.
  13. 96° этиловый спирт.
  14. Фенол.
  15. Глицерин.
  16. Концентрированная соляная кислота.
  17. Метиленовая синька.
  18. Дистиллированная вода.
  19. Генцианвиолет.
  20. Реактив Люголя.
  21. Едкий натр (NaOH).
  22. Бензин или ксилол.

Для бактериоскопического исследования готовят обычно два препарата: один для обнаружения микобактерий туберкулеза и другой для обнаружения прочих микроорганизмов. Для первого препарата отбирают те же частицы, которые были предназначены для микроскопии, для второго — гнойные частицы. Взятый материал распределяют по предметному стеклу до получения достаточно тонкой ажурной сеточки (материал на первом стекле распределяют на 2/3 его поверхности, на втором — в центре).

Оба препарата фиксируют троекратным проведением над пламенем горелки. Первый препарат окрашивают по Цилю — Нильсену, второй — по Граму.

Для окраски препаратов по Цилю-Нильсену необходимы следующие краски и реактивы:

  1. Фуксин Циля: основного фуксина 1 г, глицерина 4 капли, этилового спирта 96° 10 мл, карболовой кислоты (5% раствор фенола) 5 мл, дистиллированной воды 90 мл. К фуксину, помещенному в фарфоровую ступку, прибавляют глицерин, хорошо растирают, постепенно приливают карболовую кислоту, спирт и воду. Фильтруют.
  2. 3% раствор солянокислого спирта: 3 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 и 97 мл 96° этилового спирта.
  3. 0,2 % водный раствор метиленовой синьки — 1 г метиленовой синьки растворяют в 500 мл дистиллирован- вой воды.

Техника окраски . На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги (уже и короче предметного стекла), на которую наливают в избытке фуксин Циля. Затем препарат нагревают до появления паров (достаточно троекратно медленно провести его над пламенем горелки), дают ему остыть в течение 3-5 минут, сбрасывают с помощью пинцета бумажку, промывают препарат водой и наливают на него 3% раствор солянокислого спирта для обесцвечивания на 20 секунд. После этого препарат промывают водой и вновь повторяют обесцвечивание. Материал должен быть серовато-розового цвета. Затем на препарат на 20-30 секунд наливают 1: 500 водный раствор метиленовой синьки, краску сливают, препарат промывают водой и высушивают, установив в вертикальном положении на полоску фильтровальной бумаги.

Высушенный препарат рассматривают под микроскопом с иммерсией, с поднятым конденсором.

В препарате микобактерии туберкулеза (рис. 60) красного цвета, нежные, тонкие, слегка изогнутые, иногда зернистые. Иногда обнаруживают микобактерип туберкулеза в виде так называемых осколков (в составе тетрады Эрлиха).

Рис. 60. Микобактерии туберкулеза в мокроте. 1 — окраска по Цилю-Нильсену, 2 — в люминесцентном микроскопе.

Все остальные элементы, в том числе и другие микроорганизмы, окрашены в синий цвет. С целью обнаружения мпкобактерий туберкулеза препарат тщательно исследуют, продвигая от одного продольного края к другому и поперек мазка. Во всех сомнительных случаях рекомендуют обработать препараты жавелевой водой
Результат исследования оформляют, используя следующую формулировку: «микобактерип туберкулеза не обнаружены» или «микобактерип туберкулеза обнаружены», и отмечают приблизительное их количество, например, «единичные в препарате», «единичные в поле зрения» и т. д.

В настоящее время находит все большее распространение люминесцентный способ обнаружения микобактерий туберкулеза в мокроте. Микобактерип туберкулеза имеют золотисто-желтое свечение на черном фоне препарата (рис. 60, 2).

В тех случаях, когда количество микобактерий туберкулеза в мокроте незначительно, для их обнаружения применяют метод обогащения (флотация), который состоит в следующем. В бутылку с нешироким горлышком (емкостью 250 мл) помещают 12-20 мл мокроты, добавляют равный объем 0,5% раствора КОН и встряхивают 5-10 минут. Затем приливают около 10 мл дистиллированной воды и 0,5-1 мл бензина или ксилола, взбалтывают 10-15 минут и доливают дистиллированную воду гак, чтобы горлышко бутылки было заполнено. Смесь оставляют на 1-2 часа до образования на поверхности жидкости сливкообразного слоя. На два предметных стекла, заранее расположенных на мостике над водяной баней, нагретой до 60-65°, каплями, с помощью пастеровской пипетки, 5-6 раз наносят сливкообразный слой, каждый раз после подсыхания предыдущей капли. Мазки окрашивают фуксином Циля на водяной бане (без дополнительной фиксации) в течение 10 минут, промывают водой, 3-4 минуты обесцвечивают 3% раствором солянокислого спирта, вновь обмывают водой, докрашивают 0,2% водным раствором метиленовой синьки, высушивают и исследуют под микроскопом.

Для окраски препаратов по Граму требуются следующие краски и реактивы:

  1. Разведенный фуксин Циля (фуксин Пфейффера): 1 часть фуксина Циля + 9 частей дистиллированной воды.
  2. Реактив Люголя.
  3. 1 % спиртовой раствор генцианвиолета — 1 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 96° этилового спирта. Этот раствор краски можно заменить бумажкой, приготовленной по методу Синева (белую фильтровальную бумажку пропитывают 1% спиртовым раствором генцианвиолета, затем высушивают и разрезают на мелкие квадратики соответственно размеру мазка).

Техника окраски . На фиксированный препарат накладывают бумажку Синева и смачивают ее водой (при отсутствии бумажки Синева ее заменяют белой фильтровальной бумажкой, на которую наносят несколько капель 1% спиртового раствора генцианвнолета). Через 1-2 минуты бумажку сбрасывают и на препарат наливают 1-2 капли реактива Люголя. Через 1-2 минуты препарат обесцвечивают 1-2 каплями 96° этилового спирта до появления бледно-серой окраски материала, смывают водой, на 10-15 секунд наносят сруксин Пфейффера, после чего вновь смывают водой и высушивают. В препаратах могут быть обнаружены (рис. 61) стафилококки, стрептококки, диплококки, палочки Пфейффера, спирохеты Плаута-Венсана, актиномицеты и другие микроорганизмы.

Рис. 61. Различные микроорганизмы в мокроте: диплококки (1), палочки Пфейффера (2), стрептококки (3), стафилококки (4), диплобациллы Фридлендера (5), симбиоз Венсана (6), мицелий актиномицет (7).

После проведенного исследования мокроту сжигают или обеззараживают. Последнее достигается следующими способами: а) автоклавированием в течение одного часа при 1,5 атм.; б) кипячением в течение одного часа в 1-2% растворе соды; в) обработкой 5% раствором лизола, карболовой кислоты или смесью, состоящей из равных объемов 5% раствора хлорамина и 5% раствора сернокислого аммония, в течение 12-24 часов. После обеззараживания посуду тщательно моют водой и высушивают.

Металлические предметы (шпатели, иглы) обеззараживают прокаливанием над огнем. Во избежание переноса микроорганизмов из одной порции мокроты в другую шпатель и иглу немедленно прокаливают после отбора соответствующих частиц.

Покровные стекла опускают в небольшую плоскую чашечку с 40% раствором серной кислоты на 12-24 часа. Затем кислоту сливают, а стекла неоднократно промывают водопроводной и дистиллированной водой. Вымытые стекла высушивают и используют для последующих исследований.

источник

Исследование мокроты предусматривает определение физи­ческих свойств мокроты, ее микроскопическое исследование в нативном мазке и бактериологическое исследование в окрашен­ных препаратах.

Мокроту, получаемую при откашливании утром до приема пи­щи, собирают в чистую сухую склянку. Перед исследованием боль­ной должен почистить зубы и тщательно прополоскать рот водой.

Мокроту помещают в чашку Петри, рассматривают на светлом и темном фоне, описывают ее свойства. Количество мокроты за сутки при различных патологических процессах может быть раз­лично: так например, при бронхите — скудное (5-10 мл), при абсцессе легкого, бронхоэктазах — большое количество (до 200—300 мл).

Деление на слои наблюдается в случаях опорожнения боль­ших полостей в легком, например, абсцесса легкого. В этом случае мокрота образует 3 слоя: нижний слой состоит из детри­та, гноя, верхний слой — жидкий, на поверхности его иногда имеется третий — пенистый слой. Такую мокроту называют трехслойной.

Характер: характер мокроты определяет содержание слизи, гноя, крови, серозной жидкости, фибрина. Характер ее может быть слизистый, слизисто-гиойный, слизисто-гнойно-кровянистый и т.п.

Цвет: зависит от характера мокроты, от выдыхаемых частиц, которые могут окрашивать мокроту. Так например, желтоватый, зеленоватый цвет зависит от наличия гноя, «ржавая» мокрота -от распада эритроцитов, встречается при крупозной пневмонии. Прожилки крови в мокроте или красная мокрота может быть при примеси крови (туберкулез, бронхоэктазы). Серый и черный цвет придает мокроте уголь.

Консистенция: зависит от состава мокроты, жидкая — в ос­новном от наличия серозной жидкости, клейкая — при наличии слизи, вязкая — фибрина.

Запах: свежевыделенная мокрота обычно без запаха. Непри­ятный запах свежевыделенной мокроты обычно появляется при абсцессе легкого, при гангрене легкого — гнилостный.

Нативные препараты готовят, выбирая материал из разных мecт мокроты, берут также для исследования все частицы, выде­ляющиеся окраской, формой, плотностью.

Отбор материала производят металлическими палочками, по­мещают его на предметное стекло и покрывают покровным. Мате­риал не должен выходить за покровное стекло.

Лейкоциты: всегда содержатся в мокроте, количество их зависит от характера мокроты.

Эозинофилы: распознаются в нативном препарате по более темной окраске и наличию в цитоплазме четкой, одинаковой, пре­ломляющей свет зернистости. Часто располагаются в виде больших скоплений. Эозинофилы встречаются при бронхиальной астме, других аллергических состояниях, гельминтозе, эхинококке лег­кого, новообразованиях, эозинофильном инфильтрате.

Эритроциты: имеют вид дисков желтого цвета. Единичные эритроциты могут встречаться в любой мокроте, в большом коли­честве — в мокроте, содержащей примесь крови: новообразовани­ях легкого, туберкулезе, инфаркте легкого.

Клетки плоского эпителия: попадают в мокроту из полости рта, носоглотки, большого диагностического значения не тлеют.

Цилиндрический мерцательный эпителий: выстилает слизистую оболочку гортани, трахеи, бронхов. В большом количестве обнаруживается при острых катарах верхних дыхательных путей, бронхитах, бронхиальной астме, новообразованиях легкого, пневмосклерозе и др.

Альвеолярные макрофаги: большие клетки различной величи­ны, чаще круглой формы, с наличием в цитоплазме включений черно-бурого цвета. Встречаются чаще в слизистой мокроте с небольшим количеством гноя. Обнаруживаются при различных па­тологических процессах: пневмонии, бронхитах, профессиональ­ных заболеваниях легких и др. Альвеолярные макрофаги, содер­жащие гемосидерин, старое название — «клетки сердечных поро­ков», имеют в цитоплазме золотисто-желтые включения. Для их выявления применяют реакцию на берлинскую лазурь. Ход реакции: кусочек мокроты помещают на предметное стекло, прибавляют 2 капли 5% раствора соляной КИОЛОТЫ и 1-2 капли 5% раствора желтой кровяной соли. Перемешивают стеклянной палочной и по-крывают покровным стеклом. Гемосидерин, лежащий внутриклеточно, окрашивается в голубой или синий цвет. Эти клетки обнару­живаются в мокроте при застойных явлениях в легких, инфарктах легкого.

Жирное перерождение клетки (липофаги, жировые шары): чаще округлые, цитоплазма их заполнена жиром. При прибавлении к препарату судана Ш капли окрашиваются в оранжевый цвет. Группы таких клеток встречаются при новообразованиях легкого, актиномикозе, туберкулезе и др.

Эластические волокна: в мокроте имеют вид извзитых блес­тящих волокон. Как правило располагаются на фоне лейкоцитов и детрита. Наличие их указывает на распад ткани легкого. Обнаруживаются при абсцессе, туберкулезе, новообразованиях легко­го.

Коралловые волокна: Грубые ветвящиеся образования с буг­ристыми утолщениями вследствие отложения на волокнах жирных кислот и мыл. Их обнаруживают в мокроте при кавернозном тубер­кулезе.

Обызвествленные эластические волокна — грубые, пропитанные солями извести палочковидные образования. Обнаруживают при распаде петрифицированного очага, абсцессе легкого, ново­образованиях, Элемента распада петрифицированнго очага носят название тетрады Эрлиха: I) обызвествленные эластические во­локна; 2)аморфные соли извести; 3) кристаллы холестерина; 4) микобактерии туберкулеза.

Спирали Куршмана_- уплотнены, закрученные в спираль слизевые образования. Центральная часть резко преломляет свет и выглядит спиралью, по периферии свободно лежащая слизь обра­зует мантию. Спирали Куршмана образуются при бронхиальной астме.

Кристаллические образования: кристаллы Шарко-Лейдена, вы­тянутые блестящие ромбы, можно обнаружить в желтоватых кусоч­ках мокроты, содержащих большое количество эозинофилов. Их образование связывают с распадом эозинофилов,

Кристаллы гематоидина: имеют форму ромбов и иголок золо­тистого цвета. Образуются при распаде гемоглобина при крово­излияниях, распаде новообразований. В препарате мокроты видны обычно на фоне детирита, эластических волокон.

Кристаллы холестерина: бесцветные четырехугольники с обло­манными ступенеобразным углом, обнаруживаются при распаде жирно перерожденных клеток, в полостях. Встречаются при туберку­лезе, абсцессе легкого, новообразованиях.

Пробки Дитриха: мелкие желтовато-серые зернышки с непри­ятным запахом, содержатся в гнойной мокроте. Микроскопически представляют собой детрит, бактерии, кристаллы жирных кислот в виде игл и капелек жира. Образуются при застое мокроты в полостях при абсцессе легкого, бронхоэктазах.

Исследование на туберкулезные микобактерии: Препарат готовят из гнойных частиц мокроты, высушивают

на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Окрашивают по

Методика окрашивания: Реактивы:

2) 2% спиртовой раствор соляной кислоты,

3) водный раствор 0,5% метиленового синего.

1. На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина.

2. Препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (так 3 раза).

3. С остывшего стекла снимают фильтровальную бумагу. Обесцвечивают мазок в солянокислом спирте до полного отхождения краски.

5. Докрашивают препарат метиленовнм синим 20-30 секунд.

6. Промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. Туберкулезные микобактерии окрашиваются в красный цвет,

все остальные элементы мокроты и бактерии — в синий. Туберку­лезные микобактерии имеют вид тонких, слегка изогнутых пало­чек с утолщениями на концах или посередине.

При окраске по Цилю-Нильсону в красный цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. Дифференциальная диагностика туберкулезных микробактерий и кислотоупорных сапрофитов ведет­ся методами посева и заражения животных.

Исследование мокроты может проводиться также методом фло­тации. Метод Потенжера: ход исследования:

Читайте также:  Цвет мокроты при муковисцидозе

1. Свежевыделенную мокроту (не более 10-15 мл) помещают в узкогорлую бутылку, приливают двойное количество едкой ще­лочи, смесь энергично встряхивают (10-15 мин).

2. Приливают I мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 100 мл дистиллированной вода для разжижения мокроты. Снова встряхивают 10-15 мин.

3. Доливают дистиллированную воду до горлышка бутылки и оставляют стоять на 10-50 мин.

4. Образовавшийся верхний слой (беловатый) снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предвари­тельно нагретые до 60°. Каждую последующую каплю наносят на подсохшую предыдущую.

5. Препарат фиксируют и красят по Цилю-Нильсону.

Исследование на другие бактерии:

Другие бактерии, встречающиеся в мокроте, например, стрептококки, стафилококки, диплобациллы и др. могут быть распознаны только методом посева. Бактериологическое иссле­дование препарата в этих случаях имеет только ориентировоч­ное значение. Препараты красят метиленовым синим, фуксином или по граму. Окраска по Граму: Реактивы: I) карболовый раствор генцианвиолета,

4) 40% раствор карболового фуксина.

1. На фиксированный препарат кладут полоску фильтроваль­ной бумаги, наливают раствор генцианвиолета, красят 1-2 мин.

2. Бумажку снимают и препарат заливают раствором Люголя на 2 минуты.

3. Раствор Люголя сливают и прополаскивают препарат в спирте до серого цвета.

4. Промывают водой и окрашивают 10-15 секунд раствором фуксина.

5. МОКРОТА ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ПАТОЛОГИИ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ
Нозологическая форма Колич. Макрос. Хар-р изучен. Микроскопия
I
Бронхит Скудное,за- Цилиндрический эпи-
тем боль- телий ,лейкоциты,иног-
шое. Слизи — да эритроциты,много
стая или флоры,макрофаги .
слизисто-
гнойная
Бронхопневмо- Большое Цилиндрический эпите-
ния количество лий, альвеолярный эпи-
слизистой телий, лейкоциты,
-или слизис- пневмококки
ТО-ГНОЙНОЙ
Крупозная Скудное,за- Свертки Макрофаги, лейкоциты,
пневмония тем обиль- фибрина, эритроциты, кристал-
ное к-во изменен- лы гематоидина,
ржавой мо- ная гемосидерин, пневмо-
кроты кровь кокки
Бронхиальная Скудное, Спирали Цилиндрический эпи-
астма слизистая Куршмана телий, кристаллы
Шарко-Лейдена,
эозинофилы
Бронхоэктати- Обильное Пробки Лейкоциты сплошь,
ческая бо- (утром- Дитриха кристаллы жирных
лезнь полным кислот,гематоидина,
ртом) холестерина, обильная разнообразная флора

Приложение: посуда и оборудование: Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Смотрят с иммерсией.

2. Инструменты для отбора мокроты: металлические палоч­ки с расплющенными концами, препаровальные иглы и др.

7. Дезинфицирующая жидкость.

Абсцесс лег­кого Обильное, гнойная, со зловонным запахом Обрывки ткани легкого. Сплошь лейкоциты, эла­стические волокна, кристаллы жирных кис­лот, гематоидина, хо-лестерша, разнообраз­ная обильная флора

Различное, рисовидные тельца слизисто-гнойная, иногда с примесью кро­ви Микобактерии тубер­кулёза, эластические волокна, различные кристаллы

Различное, слизисто-кровянистое Обрывки ткани. Атипические клетки.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Для студента самое главное не сдать экзамен, а вовремя вспомнить про него. 9937 — | 7458 — или читать все.

193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

источник

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) — сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных — от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий — периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами — β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом — антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У грамотрицательных бактерий присутствует дополнительная структура — внешняя мембрана.

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют — предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий — с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

  1. На фиксированный мазок накладывают небольшие кусочки фильтровальной бумаги и наливают основной краситель — генцианвиолет или метиленовый синий.
  2. Спустя 3-5 минут снимают окрашенную фильтровальную бумагу и заливают мазок раствором Люголя на 1 минуту. При этом препарат темнеет.
  3. Сливают раствор Люголя и обрабатывают мазок чистым этиловым спиртом: капают несколько капель на препарат, спустя 20 секунд сливают. Процедуру повторяют 2-3 раза.
  4. Промывают стекло с исследуемым препаратом дистиллированной водой.
  5. Производят дополнительное окрашивание — докрашивают препарат фуксином. Спустя 1-2 минуты краситель смывают.
  6. После высыхания воды изучают мазок под микроскопом. Грамположительные бактерии будут иметь сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные — розовый или красный.

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными — окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

источник

В микробиологии окраска по Граму имеет большое значение. Ее применяют для диагностики инфекционных заболеваний, выявления патогенности бактерий. Метод позволяет определить сходные по форме и размеру бактерии, которые относятся к различным видам и родам.

Окраска бактерий по Граму – сложный метод, в котором применяют два вида окраса: основной и дополнительный. В процессе выполнения манипуляции применяют обесцвечивающие вещества, к которым относятся спирты и кислоты.

В микробиологии окраску по Граму проводят трифенилметановой группой красителей. К ней относятся генциановые, метиловый синий, кристаллвиолет. Разные виды бактерий дают разные окрасы, образуя прочные соединения с красителями.

В микробиологии окраска по Граму бывает двух видов: грамположительная и грамотрицательная. В первом случае микроорганизмы дают прочные соединения с красителями и йодом. Во время анализа они не обесцвечиваются при воздействии со спиртом, из-за чего не изменяют своего первоначального фиолетового оттенка.

Грамотрицательные окрасы образуются при воздействии с йодом и легко разрушаются под действием йода. В результате микробы обесцвечиваются, а затем приобретают красный оттенок.

По правилам микробиологии, окраска по Граму требует предварительной подготовки материалов. Его необходимо распределить тонким слоем по поверхности стекла. Затем мазок подсушивают и после полного высыхания фиксируют. При этом мазок закрепляется на стекле, что позволяет исключить смывание бактерий красителями. К тому же мертвые микроорганизмы окрашиваются лучше, чем живые.

После подготовки материала подбирают метод окрашивания: физический или химический. Первый предполагает воздействие высокой температуры на микробную клетку. Во время химического способа применяют различные химические вещества, которые вызывают коагуляцию протеинов цитоплазмы.

Подготавливают набор для окраски по Граму, предметные стекла с бактериями. Их берут пинцетом или аккуратно пальцами за ребра мазком вверх, затем проводят пару раз над верхом пламени горелки. Процесс должен занимать пару секунд.

Процесс фиксации химическим методом предполагает использование ацетона, спирта, специальных смесей, жидкость Карнуа. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в фиксирующее вещество на пятнадцать минут, затем просушивают на воздухе.

Окраска мазков по Граму проводится по определенному алгоритму.

  • Сначала на фиксированный мазок наносят основной краситель на пару минут. Во избежание появления осадка процедуру выполняют с использованием фильтровальной бумаги.
  • Краситель удаляется (сливается), убирается бумага. Мазок погружается в раствор Люголя на две минуты или в йодистый раствор по Граму до почернения препарата.
  • Мазок поласкают спиртовым раствором или ацетоном, наливая и сливая его до тех пор, пока и мазок не обесцветится, и жидкость не станет чистой. Это занимает примерно от 30 до 60 секунд.
  • Стекла тщательно промывают дистиллированной водой.

    Чтобы определить, есть ли в мазке грамотрицательные бактерии, проводят дополнительно окрашивание фуксином или сафранином. Препараты наносят на две минуты. В конце процедуры стекло промывают, высушивают.

    Все грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в красный. Шарообразные формы обычно относятся к грамположительным видам, а извитые формы – отрицательно окрашиваются. Палочковидные бактерии могут быть грамотрицательными и грамположительными.

    Чтобы получить максимально достоверные результаты исследований, рекомендуется применять суточные культуры, а также свежеприготовленные растворы для окрашивания.

    Механизм окраски позволяет увидеть и оценить физико-химические особенности строения цитоплазмы, клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. У первых содержится много рибонуклеиновой кислоты, белков в цитоплазме, а в клеточных стенках – пептидогликана. Из-за этого во время обработки мазков генцианвиолетом и Люголем у грамположительных видов бактерий образуется прочное соединение ионов йода и красителя.

    При обработке спиртами грамположительные микроорганизмы удерживают краситель, а грамотрицательные – обесцвечиваются и окрашиваются дополнительно разведенным фуксином в красный оттенок. Некоторые бактерии способны окрашиваться только на стадии роста.

    Окраску по Граму проводят при анализе вида микроорганизмов в мазках из влагалища и слюны. Этот способ позволяет определить вид микроорганизмов в кале, в плевральной, перитонеальной жидкости и не только. Любые жидкости, где могут содержаться бактерии, исследуют данным методом. После проведения окрашивания врачи подбирают метод лечения, назначая препараты, способные воздействовать на грамположительные или грамотрицательные бактерии.

    источник

    Микроскопическое исследование нативных и фиксированных окрашенных препаратов мокроты позволяет подробно изучить ее клеточный состав, и известной степени отражающий характер патологического процесса в легких и бронхах, его активность, выявить различные волокнистые и кристаллические образования, также имеющие важное диагностическое значение, и, наконец, ориентировочно оценить состояние микробной флоры дыхательных путей (бактериоскопия).

    При микроскопии используют нативные и окрашенные препараты мокроты. Для изучения микробной флоры (бактериоскопии) мазки мокроты обычно окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Граму, а для выявления микобактерий туберкулеза но Цилю-Нильсену.

    Из клеточных элементов, которые можно обнаружить в мокроте больных пневмонией, диагностическое значение имеют эпителиальные клетки, альвеолярные макрофаги, лейкоциты и эритроциты.

    Эпителиальные клетки. Плоский эпителий из полости рта, носоглотки, голосовых складок и надгортанника диагностического значения не имеет, хотя обнаружение большого количества клеток плоского эпителия, как правило, свидетельствует о низком качестве образца мокроты, доставленного в лабораторию и содержащего значительную примесь слюны.

    У больных пневмониями мокрота считается пригодной к исследованию, если при микроскопии с малым увеличением количество эпителиальных клеток не превышает 10 в поле зрения. Большее количество эпителиальных клеток указывает на недопустимое преобладание в биологическом образце содержимого ротоглотки.

    Альвеолярные макрофаги, которые в незначительном количестве также можно обнаружить в любой мокроте, представляют собой крупные клетки ретикулогистиоцитарного происхождения с эксцентрически расположенным крупным ядром и обильными включениями в цитоплазме. Эти включения могут состоять из поглощенных макрофагами мельчайших частиц пыли (пылевые клетки), лейкоцитов и т.п. Количество альвеолярных макрофагов увеличивается при воспалительных процессах в легочной паренхиме и дыхательных путях, в том числе при пневмониях.

    Клетки цилиндрического мерцательного эпителия выстилают слизистую оболочку гортани, трахеи и бронхов. Они имеют вид удлиненных клеток, расширенных с одного конца, где расположено ядро и реснички. Клетки цилиндрического мерцательного эпителия обнаруживаются в любой мокроте, однако их увеличение свидетельствует о повреждении слизистой бронхов и трахеи (острый и хронический бронхит, бронхоэктазы, трахеит, ларингит).

    Лейкоциты в небольшом количестве (2-5 в поле зрения) обнаруживаются в любой мокроте. При воспалении ткани легкого или слизистой бронхов и трахеи, особенно при нагноительных процессах (гангрена, абсцесс легкого, бронхоэктазы) их количество значительно увеличивается.

    Читайте также:  Мокрота в горле с черными точками

    При окраске препаратов мокроты по Романовскому-Гимзе удается дифференцировать отдельные лейкоциты, что имеет иногда важное диагностическое значение. Так, при выраженном воспалении легочной ткани или слизистой бронхов увеличивается как общее число нейтрофильных лейкоцитов, так и количество их дегенеративных форм с фрагментацией ядер и разрушением цитоплазмы.

    Увеличение числа дегенеративных форм лейкоцитов является важнейшим признаком активности воспалительного процесса и более тяжелого течения заболевания.

    Эритроциты. Единичные эритроциты можно обнаружить практически и любой мокроте. Значительное их увеличение наблюдается при нарушении сосудистой проницаемости у больных пневмониями, при разрушении ткани легкого или бронхов, застое в малом круге кровообращения, инфаркте легкого и т.д. В большом количестве эритроциты в мокроте обнаруживаются при кровохарканье любого генеза.

    Эластические волокна. Следует упомянуть также еще об одном элементе мокроты пластических волокнах, которые появляются в мокроте при деструкции легочной ткани (абсцесс легкого, туберкулез, распадающийся рак легкого и др.). Эластические волокна представлены в мокроте в виде тонких двухконтурных, извитых нитей с дихотомическим делением на концах. Появление эластических волокон в мокроте у больных с тяжелым течением пневмонии свидетельствует о возникновении одного из осложнений заболевания — абсцедировании ткани легкого. В ряде случаев при формировании абсцесса легкого эластические волокна в мокроте можно обнаружить даже несколько раньше, чем соответствующие рентгенологические изменения.

    Нередко при крупозной пневмонии, туберкулезе, актиномикозе, фибринозном бронхите в препаратах мокроты можно обнаружить тонкие волокна фибрина.

    Признаками активного воспалительного процесса в легких являются:

    1. характер мокроты (слизисто-гнойная или гнойная);
    2. увеличение количества нейтрофилов в мокроте, в том числе их дегенеративных форм;
    3. увеличение количества альвеолярных макрофагов (от единичных скоплений из нескольких клеток в поле зрения и больше);

    Появление в мокроте эластических волокон свидетельствует о деструкции легочной ткани и формировании абсцесса легкого.

    Окончательные выводы о наличии и степени активности воспаления и деструкции легочной ткани формируются только при их сопоставлении с клинической картиной заболевания и результатами других лабораторных и инструментальных методов исследования.

    [1], [2], [3], [4], [5], [6]

    Микроскопия мазков мокроты, окрашенных по Граму, и изучение микробной флоры (бактериоскопия) у части больных пневмонией позволяет ориентировочно установить наиболее вероятного возбудителя легочной инфекции. Этот простой метод экспресс-диагностики возбудителя недостаточно точен и должен использоваться только в комплексе с другими (микробиологическими, иммунологическими) методами исследования мокроты. Иммерсионная микроскопия окрашенных мазков мокроты иногда бывает весьма полезной для экстренного подбора и назначения адекватной антибактериальной терапии. Правда, следует иметь в виду возможность обсеменения бронхиального содержимого микрофлорой верхних дыхательных путей и ротовой полости, особенно при неправильном сборе мокроты.

    Поэтому мокроту считают пригодной для дальнейшего исследования (бактериоскопии и микробиологического исследования) только в том случае, если она удовлетворяет следующим условиям:

    • при окраске по Грамму в мокроте выявляется большое количество нейтрофилов (более 25 в поле зрения при малом увеличении микроскопа);
    • количество эпителиальных клеток, больше характерных для содержимого ротоглотки, не превышает 10;
    • в препарате имеется преобладание микроорганизмов одного морфологического типа.

    При окраске по Граму в мазке мокроты иногда можно достаточно хорошо идентифицировать грамположительные пневмококки, стрептококки, стафилококки и группу грамотрицательных бактерий — клебсиеллу, палочку Пфейффера, кишечную палочку и др. При этом грамположительные бактерии приобретают синий цвет, а грамотрицательные — красный.

    Бактериальные возбудители пневмоний

    1. Пневмококки Streptococcus pneumoniae.
    2. Стрептококки Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans.
    3. Стафилококки: Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus.
    1. Клебсиеллы (Klebsiella pneumoniae)
    2. Гемофильная палочка (Пфейфера) Haemophilius influenzae
    3. Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa)
    4. Легионелпа
    5. Кишечная палочка (Escherichia coli)
  • Предварительная бактериоскопия мокроты является наиболее простым способом верификации возбудителя пневмонии и имеет определенное значение для выбора оптимальной терапии антибиотиками. Например, при обнаружении в мазках, окрашенных по Грамму, громположительных диплококков (пневмококков) или стафилококков вместо антибиотиков широкого спектра действия, увеличивающих риск селекции и распространения аитибиотикорезистентных микроорганизмов, возможно назначение целенаправленной терапии, активной в отношении пневмококков или стафилококков. В других случаях выявление преобладающей в мазках грамотрицательной флоры может указывать па то, что возбудителем пневмонии являются грамотрицательные энтеробактерии (клебсиелла, кишечная палочка и т.п.), что требует назначения соответствующей целенаправленной терапии.

    Правда, ориентировочное заключение о вероятном возбудителе легочной инфекции при микроскопии можно сделать только па основании значительного увеличения бактерий в мокроте, в концентрации 10 6 — 10 7 м.к./мл и больше (Л.Л. Вишнякова). Низкие концентрации микроорганизмов ( 3 м.к./мл) характерны для сопутствующей микрофлоры. Если концентрация микробных тел колеблется от 10 4 до 10 6 м.к./мл, это не исключает этиологическую роль данного микроорганизма в возникновении легочной инфекции, но и не доказывает ее.

    Следует также помнить, что «атипичные» внутриклеточные возбудители (микоплазма, легионелла, хламидии, риккетсии) не окрашиваются по Грамму. В этих случаях подозрение на наличие «атипичной» инфекции может возникнуть, если в мазках мокроты обнаруживают диссоциацию между большим количеством нейтрофилов и чрезвычайно малым количеством микробных клеток.

    К сожалению, метод бактериоскопии и целом отличается достаточно низкой чувствительностью и специфичностью. Hе предсказательная ценность даже в отношении хорошо визуализируемых пневмококков едва достигает 50%. Это означает, что в половине случаев метод дает ложноположительные результаты. Это связано с несколькими причинами, одной из которых является то, что около 1/3 больных до госпитализации уже получали антибиотики, что существенно снижает результативность бактериоскопии мокроты. Кроме того, даже в случае положительных результатов исследования, указывающих на достаточно высокую концентрацию в мазке «типичных» бактериальных возбудителей (например, пневмококков), нельзя полностью исключить наличие ко-инфекции «атипичными» внутриклеточными возбудителями (микоплазмой, хламидиями, легионеллой).

    Метод бактериоскопии мазков мокроты, окрашенных по Грамму, в отдельных случаях помогает верифицировать возбудителя пневмонии, хотя в целом отличается весьма низкой предсказательной ценностью. «Атипичные» внутриклеточные возбудители (микоплазма, легионелла, хламидии, риккетсии) вообще не верифицируются методом бактериоскопии, так как не окрашиваются по Грамму.

    Следует упомянуть о возможности микроскопической диагностики у больных пневмониями грибкового поражения легких. Наиболее актуальным для больных, получающих длительное лечение антибиотиками широкого спектра действия, является обнаружение при микроскопии нативных или окрашенных препаратов мокроты Candida albicans в виде дрожжеподобных клеток и ветвистого мицелия. Они свидетельствуют об изменении микрофлоры трахеобронхиального содержимого, возникающем под влиянием лечения антибиотиками, что требует существенной коррекции терапии.

    В некоторых случаях у больных пневмониями возникает необходимость дифференцировать имеющееся поражение легких с туберкулезом. С этой целью используют окраску мазка мокроты по Цилю-Нильсену, что в отдельных случаях позволяет идентифицировать микобактерии туберкулеза, хотя отрицательный результат такого исследования не означает отсутствия у больного туберкулеза. При окраске мокроты по Цилю-Нильсену микобактерии туберкулеза окрашиваются в красный цвет, а все остальные элементы мокроты — в синий. Туберкулезные микобактерии имеют вид топких, прямых или слегка изогнутых палочек различной длины с отдельными утолщениями. Они располагаются в препарате группами или поодиночке. Диагностическое значение имеет обнаружение в препарате даже единичных микобактерий туберкулеза.

    Для повышения эффективности микроскопического выявления микобактерий туберкулеза используют ряд дополнительных методов. Наиболее распространенным из них является так называемый метод флотации, при котором гомогенизированную мокроту взбалтывают с толуолом, ксилолом или бензином, капли которых, всплывая, захватывают микобактерии. После отстаивания мокроты верхний слой пипеткой наносят на предметное стекло. Затем препарат фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену. Существуют и другие методы накопления (электрофорез) и микроскопии бактерий туберкулеза (люминесцентная микроскопия).

    Микроскопическое исследование (анализ) мокроты позволяет обнаружить слизь, клеточные элементы, волокнистые и кристаллические образования, грибы, бактерии и паразиты.

    • Альвеолярные макрофаги — клетки ретикулогистиоцитарного происхождения. Большое количество макрофагов в мокроте выявляют при хронических процессах и на стадии разрешения острых процессов в бронхолёгочной системе. Альвеолярные макрофаги, содержащие гемосидерин («клетки сердечных пороков»), выявляют при инфаркте лёгкого, кровоизлиянии, застое в малом кругу кровообращения. Макрофаги с липидными каплями — признак обструктивного процесса в бронхах и бронхиолах.
    • Ксантомные клетки (жировые макрофаги) обнаруживают при абсцессе, актиномикозе, эхинококкозе лёгких.
    • Клетки цилиндрического мерцательного эпителия — клетки слизистой оболочки гортани, трахеи и бронхов; их обнаруживают при бронхитах, трахеитах, бронхиальной астме, злокачественных новообразованиях лёгких.
    • Плоский эпителий обнаруживают при попадании в мокроту слюны, он не имеет диагностического значения.
    • Лейкоциты в том или ином количестве присутствуют в любой мокроте. Большое количество нейтрофилов выявляют в слизисто-гнойной и гнойной мокроте. Эозинофилами богата мокрота при бронхиальной астме, эозинофильной пневмонии, глистных поражениях лёгких, инфаркте лёгкого. Эозинофилы могут появиться в мокроте при туберкулёзе и раке лёгкого. Лимфоциты в большом количестве обнаруживают при коклюше и, реже, при туберкулёзе.
    • Эритроциты. Обнаружение единичных эритроцитов в мокроте диагностического значения не имеет. При наличии свежей крови в мокроте определяют неизменённые эритроциты, если же с мокротой отходит кровь, находившаяся в дыхательных путях в течение длительного времени, обнаруживают выщелоченные эритроциты.
    • Клетки злокачественных опухолей обнаруживают при злокачественных новообразованиях.
    • Эластические волокна появляются при распаде ткани лёгкого, который сопровождается разрушением эпителиального слоя и освобождением эластических волокон; их обнаруживают при туберкулёзе, абсцессе, эхинококкозе, новообразованиях в лёгких.
    • Коралловидные волокна выявляют при хронических заболеваниях лёгких, таких как кавернозный туберкулёз.
    • Обызвествлённые эластические волокна — эластические волокна, пропитанные солями кальция. Обнаружение их в мокроте характерно для распада туберкулёзного петрификата.
    • Спирали Куршмана образуются при спастическом состоянии бронхов и наличии в них слизи. Во время кашлевого толчка вязкая слизь выбрасывается в просвет более крупного бронха, закручиваясь спиралью. Спирали Куршмана появляются при бронхиальной астме, бронхитах, опухолях лёгких, сдавливающих бронхи.
    • Кристаллы Шарко-Лейдена — продукты распада эозинофилов. Обычно появляются в мокроте, содержащей эозинофилы; характерны для бронхиальной астмы, аллергических состояний, эозинофильных инфильтратов в лёгких, лёгочной двуустки.
    • Кристаллы холестерина появляются при абсцессе, эхинококкозе лёгкого, новообразованиях в лёгких.
    • Кристаллы гематоидина характерны для абсцесса и гангрены лёгкого.
    • Друзы актиномицета выявляют при актиномикозе лёгких.
    • Элементы эхинококка появляются при эхинококкозе лёгких.
    • Пробки Дитриха — комочки желтовато-серого цвета, имеющие неприятный запах. Состоят из детрита, бактерий, жирных кислот, капелек жира. Они характерны для абсцесса лёгкого и бронхоэктатической болезни.
    • Тетрада Эрлиха состоит из четырех элементов: обызвествлённого детрита, обызвествлённых эластических волокон, кристаллов холестерина и микобактерий туберкулёза. Появляется при распаде обызвествлённого первичного туберкулёзного очага.

    Мицелий и почкующиеся клетки грибов появляются при грибковых поражениях бронхолёгочной системы.

    Пневмоцисты появляются при пневмоцистной пневмонии.

    Сферулы грибов выявляют при кокцидиоидомикозе лёгких.

    Личинки аскарид выявляют при аскаридозе.

    Личинки кишечной угрицы выявляются при стронгилоидозе.

    Яйца лёгочной двуустки выявляются при парагонимозе.

    Элементы, обнаруживаемые в мокроте при бронхиальной астме. При бронхиальной астме обычно отделяется малое количество слизистой, вязкой мокроты. Макроскопически можно увидеть спирали Куршмана. При микроскопическом исследовании характерно наличие эозинофилов, цилиндрического эпителия, встречаются кристаллы Шарко-Лейдена.

    источник

    В продолжение микробиологической темы — окраска бактериальных клеток по методике Грама. Текст дублирует комментарии в видео (вдруг у кого-то сию минуту нет возможности проиграть ролик, а приобщиться к образованию хочется).

    В микробиологии широко применяются различные методы окраски бактерий. Конечно, можно производить наблюдение и без этих сложных манипуляций, но тогда при микроскопировании вы почти ничего не увидите, ведь коэффициент светопреломления бактерий близок к коэффициенту светопреломления жидкости, в которой они живут. Для того, чтобы бактерии или какие-то их внутренние или внешние структуры чётко выделялись на фоне, применяют различные красители. Сегодня мы рассмотрим методику окраски по Граму, разработанную в 1884 году датским врачом Гансом Кристианом Грамом.

    Исполнение методики начинается с приготовления фиксированного мазка культуры микроорганизмов. На предметное стекло наносится капля физиологического раствора, в которую микробиологической петлёй, прожжённой в пламени горелки, вносятся изучаемые бактерии. Это может быть как сиюминутный соскоб или мазок, так и заранее выращенная колония. Все этапы должны производиться в условиях асептики, желательно в зоне пламени горелки. Демонстрируемый способ выполнения методики призван лишь отразить последовательность внесения необходимых для окраски веществ и разъяснить роль каждого этапа.

    Суть методики в визуальном разделении бактерий на две группы – грамположительные и грамотрицательные. Первые в итоге дифференциации выглядят под микроскопом как окрашенные в синий или фиолетовый цвет, а вторые – в розовый. Основная разница между ними в том, что грамотрицательные бактерии хуже воспринимают краситель из-за более сложного строения оболочки. В частности, у них имеется дополнительная мембрана поверх клеточной стенки, препятствующая проникновению ненужных веществ. При этом пептидогликановый слой у них тоньше, чем у грамположительных бактерий. Именно эти особенности позволяют им проявлять патогенность. В медицинской микробиологии почти не изучаются грамположительные бактерии, поскольку очень немногие из них способны вызывать болезни.

    Нанесённый на стекло мазок высушивается на воздухе или высоко над пламенем горелки, чтобы не допустить закипания и денатурации белка, а затем фиксируется путём пронесения через пламя в течение короткого времени. Таким образом микроорганизмы погибают и надёжно приклеиваются к стеклу.

    Теперь наступает время внесения красителя. Сперва происходит окраска генцианвиолетом. Это основной краситель трифенилметанового ряда: смесь пента- и гексаметилпараозанилинов с небольшим количеством декстрина и фуксина. Он используется в медицине не только как краситель, но и как антисептическое средство. Противомикробные свойства объясняются высокой проницаемостью сквозь бактериальные оболочки и воздействием на окислительно-восстановительные процессы.

    Читайте также:  В мокроте лейкоциты норма у женщин таблица

    Окраска длится 1-2 минуты, после чего генцианвиолет сливают и заливают образцы раствором Люголя. Это вещество, думаю, хорошо знакомо всем – им обрабатывают горло при ангине. Раствор Люголя – это соединение йода с йодидом калия, что придаёт ему хорошую водорастворимость. Соединяясь с кусочками генцианвиолета, который проник в клеточные стенки бактерий, йод образует прочное соединение сине-фиолетового цвета. Реакция тоже длится 1-2 минуты.

    Теперь пришло время дифференциации, то есть разделения грамположительных и грамотрицательных бактерий. Для этого стекло с мазком несколько раз погружают в сосуд с 96%-ным этиловым спиртом до тех пор, пока стекающие капли не сравняются по цвету со спиртом в стакане. При этой процедуре сине-фиолетовый комплекс вымывается из стенок грамотрицательных бактерий, оставаясь только в стенках грамположительных.

    Для того, чтобы грамотрицательные бактерии не казались бесцветными, мазок промывается водой и дополнительно окрашивается водным раствором фуксина в течение тех же магических 1-2 минут. Поскольку в стенке грамположительных бактерий уже есть краситель, они фуксином не окрашиваются. А грамотрицательные бактерии приобретают розовый цвет. Мазок окончательно промывается водой, высушивается и препарат готов к микроскопированию.

    источник

    Для микроскопического исследования мокроты прежде всего готовят неокрашенные (нативные) препараты мокроты. Полноценность исследования зависит от правильного приготов¬ления и количества просмотренных препаратов. Материал для исследования выбирают из разных мест и переносят металлической иглой на предметное стекло, затем покрывают покровным стеклом так, чтобы мокрота не выступала за его края.
    Препараты должны быть тонкими, элементы в них должны располагаться однослойно. Микроскопию проводят сначала при малом увеличении микроскопа (объектив 8Х, окуляр 10Х), просмотр с малым увеличением дает представление о качестве выбранного материала, позволяет обнаружить скопление клеток, кристаллических образований, найти эластические волокна, спирали Куршмана, элементы новообразования. Дальнейшее исследование производится при большом увеличении микроскопа (объектив 40Х, окуляр 10Х).
    При этом в мокроте можно обнаружить в большем или меньшем количестве лейкоциты и среди них по более темной окраске и наличию в цитоплазме обильной, четкой, преломляющей свет зернистости различить эозинофилы, наличие которых характерно для бронхиальной астмы и других аллергических состояний. Эритроциты в мокроте имеют вид желтоватых дисков. Единичные эритроциты встречаются в каждом виде мокроты, большое же их количество характерно для кровянистой мокроты и встречается при инфаркте легкого, легочных кровотечениях, застое в малом круге кровообращения.

    В мокроте всегда можно обнаружить эпителий. Плоский эпителий попадает в мокроту из полости рта и носоглотки. Большое число клеток говорит о недостаточно хорошем туалете полости рта перед взятием мокроты для исследования.
    Обнаружение в мокроте цилиндрического мерцательного эпителия, выстилающего слизистую оболочку гортани, трахеи и бронхов, свидетельствует о поражении соответствующих отделов. Клетки имеют удлиненную форму, расширение с одного конца, где расположено округлое ядро, и мерцательные реснички. Располагаются эти клетки группами, и в свежевыделенной мокроте можно наблюдать активное движение ресничек. При воспалительных процессах (бронхиты, пневмонии, профессиональные заболевания легких) в мокроте встречаются альвеолярные макрофаги — клетки гистиоцитарной системы. Это крупные клетки округлой формы с наличием в цитоплазме включений. Если альвеолярные макрофаги содержат гемосидерин, то их называют сидерофагами или образно «клетками сердечных пороков», так как они могут появиться при застое крови в легких, при декомпенсированных пороках сердца. С достоверностью выявить эти клетки можно реакцией обра¬зования берлинской лазури.

    Бактериоскопия.

    Этот этап исследования мокроты включает в себя микроскопию препаратов, окрашенных по Цилю—Нильсену, для выявления микобактерий туберкулеза и препаратов, окрашенных по Граму, для изучения микрофлоры мокроты. Иногда для выявления микобактерий туберкулеза прибегают к обогащению методом флотации. Препараты мокроты для бактериоскопического исследования, приготовленные на предметном стекле, высушивают, фиксируют над пламенем горелки и затем окрашивают.

    Окраска по Цилю—Нильсену.

    Реактивы:
    Карболовый фуксин: 1 г основного фуксина растворяют в 10мл этилового спирта, раствор выливают в 100мл 5% раствора карболовой кислоты.
    3% солянокислого спирта: 3 мл НСl и 97 мл этилового спирта
    Водный 0,5% раствор метиленового синего

    На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина, затем препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (3 раза). После остывания препарата сбрасывают фильтровальную бумагу и опускают его в солянокислый спирт для обесцвечивания. Обесцвечивают до полного удаления краски, промывают водой и докрашивают метиленовым синим 20—30с. Снова промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой.
    Туберкулезные микобактерий окрашиваются в красный цвет, все остальные элементы мокроты и бактерии — в синий. Туберкулезные микобактерий имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке.
    При окраске по Цилю—Нильсену в красный-цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. Дифференциальная диагностика туберкулезных микобактерий и кислотоупорных сапрофитов ведется бактериологическими методами исследования

    При исследовании следует избегать:
    приготовления толстых мазков мокроты;
    фиксации плохо высушенных мазков;
    недостаточной фиксации;
    обугливания препарата при длительной фиксации.

    Если микобактерий выделяется мало, то в обычных мазках их не находят и прибегают к методу накопления.

    Метод флотации (всплывание) по Поттенджеру.

    Свежевыделенную мокроту (не более 10—-15 мл) помещают в узкогорлую бутылку, приливают двойное количество 0,5% раствора едкой щелочи,-смесь энергично встряхивают 10—15 мин. Затем добавляют 1 мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 30 мл дистиллированной воды для разжижения мокроты и снова встряхивают 10— 15 мин. Доливают дистиллированную воду в таком количестве, чтобы уровень жидкости поднялся до горлышка бутылки. Оставляют на 1 — 2 ч для отстаивания. Образовавшийся верхний беловатый слой снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предварительно подогретые до 60 °С (стекла для подогревания можно положить на металлический подносик и покрыть им водяную баню). Каждую последующую каплю наносят на предыдущую подсушенную. Препарат фиксируют и красят по Цилю—Нильсену.
    Наиболее достоверные результаты в обнаружении микобактерий туберкулеза дают бактериологические методы исследования. Другие бактерии, встречающиеся в мокроте, например стрептококки, стафилококки, диплобациллы, палочки Фридлендера и пр., могут быть распознаны только методом посева. Бактериоскопическое исследование препарата в этих случаях имеет только ориентировочное значение. Препараты красят метиленовым синим, фуксином или по Граму.

    Окраска по Граму.

    Реактивы:
    Карболовый раствор генцианового фиолетового: 1 г генцианового фиолетового растворяют в 10 мл 96 % спирта,, раствор выливают в 100 мл 1 — 2 % карболовой кислоты, взбалтывают
    Ра¬створ Люголя: 1 г йода, 2 г йодида калия и 300 мл дистиллированной воды; йод и йодид калия расстворяют сначала в 5—8 мл воды, а затем: приливают остальную воду
    96 % спирт или сырец
    10 % раствор карболового фуксина: 10 мл карболового фуксина и 90 мл дистиллированной воды

    На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианового фиолетового. Красят 11/2—2 мин. Бумажку сбрасывают и заливают препарат раствором Люголя на 2 мин, а потом прополаскивают препарат в спирту до сероватого цвета. Промывают водой и окрашивают 10% раствором карболового фуксина 10—15 с. После этого препарат опять промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионным объективом.

    источник

    Поскольку ни клинические, ни рентгеноскопические исследования не дают возможности установить специфическую этиологию большинства видов пневмонии, для клиницистов имеют большое значение другие методы лабораторного обследования. Наиболее полезными из лабораторных анализов являются: посевы крови, мокроты и плевральной жидкости, окраска мокроты по Граму. Действительно, положительный результат посева крови или плевральной жидкости остается определяющим методом идентификации этиологического агента, если только не может быть получена для посева ткань легкого. К сожалению, посевы крови дают положительный ответ приблизительно лишь в одной четверти случаев пневмонии, кроме тех инфекций легкого, которые имеют метастатический характер и вторичны по отношению к бактериемии из других органов.

    Мазок мокроты весьма информативен, если на нем обнаружено много клеток, принимающих участие в воспалительном процессе (особенно ПМЯЛ), и однотипная микрофлора, например грамположительные кокки или грамотрицательные палочки. Результат особенно показателен, если микроорганизмы находятся внутри или около ПМЯЛ.

    Посев мокроты сам по себе менее информативен, чем окраска мазка по Граму, по нескольким причинам: анаэробные кокки, палочки, пневмококки, стафилококки, стрептококки, Haemophilus и Branhamella могут являться частью нормальной микрофлоры, высеваемой из носоглотки. Кроме того, грамотрицательные палочки нередко не обнаруживаются в верхних дыхательных путях даже тяжелых стационарных больных. Таким образом, положительный результат посева мокроты без одновременной окраски по Граму, выявляющей присутствие в мазках ПМЯЛ, легочных макрофагов и доминирующего типа бактериальной микрофлоры, мало способствует установлению диагноза. Кроме того, довольно часто вообще не удается выявить пневмококки в посевах мокроты больных пневмококковой пневмонией, подтвержденной положительными результатами высевов из крови. Это показывает опасность ориентации только на результаты посевов мокроты без окраски мазков по Граму.

    Между тем при окраске мокроты по Граму встречаются свои сложности. Прежде всего необходимо быть уверенным, что вы имеете дело с мокротой, а не со слюной. Лучшее доказательство того, что изучаемый образец действительно мокрота,— присутствие в нем альвеолярных макрофагов. Образцы материала с большим количеством эпителиальных клеток не следует брать для анализа, так как они происходят из верхних дыхательных путей. Качество окраски контролируется по цвету ядер ПМЯЛ, который должен быть бледно-сиреневым, а не синим. Чтобы проверить, правильно ли произошло обесцвечивание, можно сделать параллельный контроль с известными грамотрицательными и грамположительными микроорганизмами. При проведении окраски по Граму хорошим контролем может служить анализ взятого у врача (здорового человека) образца зубного налета, который должен содержать как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии.

    Итак, особенно внимательному изучению на предмет выявления возбудителя следует подвергнуть поля мазка с многочисленными ПМЯЛ. При активной инфекции иногда видны ПМЯЛ, содержащие фагоцитированные бактерии. Если внутрилейкоцитов обнаруживается присутствие большого количества грамположительных кокков, то более вероятно, что это стафилококки, а не пневмококки, так как:

    1) пневмококки — обычно хорошо инкапсулированные бактерии — с большим трудом фагоцитируются на ранней стадии инфекции (до выработки специфических антител);

    2) будучи фагоцитированы, пневмококки быстро уничтожаются. Обнаружение в мазках, окрашенных по Граму, многочисленных ПМЯЛ и смешанной микрофлоры с множеством плеоморфных грамотрицательных палочек, которые не растут в аэробных условиях, служит наиболее значимым критерием при постановке диагноза анаэробной пневмонии. Присутствие большого количества лейкоцитов при одновременной скудости бактериальной микрофлоры свидетельствует в пользу либо небактериального процесса, либо бактериальной инфекции, возбудители которой не выявляются при окраске по Граму. В последнем случае следует прежде всего подозревать микоплазмоз или легионеллез, хотя нельзя исключать и другую этиологию, в частности туберкулез, вирусную пневмонию, лихорадку Ку, орнитоз и хламидиоз.

    В последнее время в диагностику пневмонии по анализам мокроты активно внедряются молекулярно-биологические методы, такие как ДНК-зонды или полимеразная цепная реакция. Круг возбудителей, определяемых этими методами, постоянно расширяется и включает патогенные грибы, микобактерии, бактерии и вирусы, однако их применимость зависит в первую очередь от их доступности и стоимости.

    Хотя микроскопическое исследование мокроты является очень полезным неинвазивным методом, который позволяет сделать предположение о природе этиологического агента, может возникнуть необходимость в других диагностических процедурах. В случаях, когда пациент неспособен сам отхаркивать мокроту, применяется транстрахеальная вытяжка, которая также дает возможность избавиться от загрязнения образца микрофлорой носоглотки. Бронхоскопия и назофаринге-альная аспирация позволяют опуститься ниже обычно стерильного киля трахеи и менее инвазивны, чем транстрахеальная аспирация, но фарингеальное загрязнение в этом случае неизбежно.

    В заключение следует сделать несколько замечаний по поводу лечения пневмонии. Обычно антимикробная терапия пневмонии основывается на этиологии заболевания, установленной с помощью окраски мазков по Граму, но иногда лечение необходимо начать при отсутствии мазков мокроты и до проведения других лабораторных исследований. В таких случаях лечение следует назначать, имея в виду наиболее вероятную этиологию. Например, у студента колледжа с локализованным инфильтратом, непродуктивным кашлем и лихорадкой, который не выглядит тяжелобольным, следует подозревать прежде всего микоплазменную пневмонию. Хотя не стоит исключать при таких симптомах и возможности вирусной или пневмококковой этиологии заболевания. В этом случае для лечения может быть применен эритромицин, эффективный как в отношении микоплазмы, так и пневмококков. Если же болезнь протекает тяжело, с острой лихорадкой , гипоксией и множественными инфильтратами, совершенно необходимо получить мокроту для окраски по Граму. Если и это не даст определенных результатов, то первоначальный спектр антибиотиков следует расширить путем назначения препаратов эффективных не только против пневмококков, но и против стафилококков, грамотрицательных палочек, анаэробов и, возможно, легионелл. Для дополнительных диагностических заключений следует принять во внимание возраст больного, его иммунный статус и возможные контакты с определенными возбудителями.

    источник