Как приготовить мазок из мокроты

Микроскопическое исследование мокроты, промывных вод бронхов, лаважной жидкости для диагностики гельминтозов.

Исследование мокроты

Необходимые реактивы и оборудование
1. Раствор NaOH или КОН 0,5 %-ный
2. Центрифужные пробирки
3. Предметные стекла, большие предметные стекла
4. Центрифуга
5. Микроскоп

Подготовка к работе
Мокроту, представляющую собой патологический секрет дыхательных путей вместе с отделяемым носоглотки и полости рта, собрать в стерильную (можно прокипяченную стеклянную емкость с крышкой и исследовать сразу после доставки в лабораторию. Исследуется мокрота, выделенная при откашливании (не слюна и не слизь с носоглотки).
При слизисто-гнойной мокроте для лучшего растворения слизи, гноя:
• мокроту смешать с равным объемом 0,5 %-ного раствора едкой щелочи;
• слегка подогреть пробирку на водяной бане;
• пробирку энергично встряхивать в течение 5 мин.

Исследование нативного мазка мокроты

Ход исследования
• Мокроту из стеклянной емкости пипеткой переносят на предметное стекло (лучше большое).
• Приготовить мазок путем равномерного растирания между двумя предметными стеклами или нанесения и равномерного растирания палочкой на большом предметном стекле.
• Микроскопировать при увеличении: объектив х8 или х10, окуляр х10, для уточнения морфологических особенностей окуляр х40.

Исследование мокроты с центрифугированием
Ход исследования
• Перелить мокроту в центрифужные пробирки.
• Центрифугировать в течение 3—5 мин при 1500 об/мин.
• Слить надосадочную жидкость.
• Перенести осадок пипеткой или сразу из пробирки на предметное стекло.
• Микроскопировать при увеличении: объектив х 8 или х 10, окуляр х 10, для уточнения
морфологических особенностей окуляр х 40.
Эффективность метода
• Эффективен для выявления яиц гельминтов, паразитирующих в легких, бронхах (яйца парагонимуса томинкса), иногда яиц шистосом.
• Менее эффективен при диагностике личиночных стадий кишечных нематод в период миграции через легкие (личинки аскарид, анкилостомид, стронгилоидеса).
• Иногда можно обнаружить личиночные стадии эхинококков (сколексы эхинококка, альвеококка) при поражении легких и прорыве пузырей в бронх.
Применение метода
• Для диагностики легочных гельминтозов.

Исследование окрашенных мазков на пневмоцистоз
Необходимые реактивы и оборудование
Химреактивы
1.Для приготовления мазков — муколитики (0,3 %-ный дитиотреитол в 0,02 М ЭДТА, рН=7,0) или ацетилцистеин, или 4 %-ный р-р NaOH; формалин, спирт.
2. Для окраски мазков по Романовскому-Гимзе — смесь Никифорова; сульфатно-уксусный реагент (45 мл ледяной уксусной кислоты и 15 мл концентрированной серной кислоты) -10 %-ная краска Романовского-Гимзы в фосфатном буфере рН=7,2.
3. Для окраски мазков толуидиновым синим — толуидиновый синий 0,15 %-ный (75 мг толуидинового синего + 15 мл дистиллированной воды + 0,5 мл концентрированной соляной кислоты + 35 мл абсолютного спирта); водный метиловый желтый 0,25 %-ный,
4. Для окраски по Гомори-Грохотту — формалин 10 %-ный; дистиллированная вода; раствор хромовой кислоты (5 г хромовокислого оксида + 95 мл дистиллированной воды), 1 %-ный раствор метабисульфита калия (или натрия); рабочий раствор серебра (100 мл водного 3 %-ного раствора метенамина или
уротропина + 5 мл водного 5 %-ного нитрата серебра) — готовится непосредственно перед употреблением; 5 %-ный водный тетраборат натрия (бура); диметилсульфоксид; раствор хлорного золота 0,2 %-ный; водный раствор тиосульфата соды 2 %-ный; лихтгрюн (0,02 г лихтгрюна + 100 мл дистиллированной воды + 5 капель ледяной уксусной кислоты).
5. Для окраски акридиновым оранжевым — маточный раствор: 100 мл акридина оранжевого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, рабочий раствор готовится при разведении маточного раствора в 10—100 раз физиологическим раствором, абсолютный метанол (получают обезвоживанием с помощью окиси кальция с последующей дистилляцией).

Оборудование
1. Центрифужные пробирки
2. Стеклянные палочки
3. Предметные стекла
4. Термостат
5. Центрифуга
6. Микроскоп

Подготовка к работе
• Мокроту или другой материал рекомендуется исследовать немедленно. В исключительных случаях возможно временное сохранение лаважной жидкости с помощью консервации:
а) лаважную жидкость слить в стоящую во льду посуду с 50 мл раствора Хенкса коммерческого, рН=7,2—7,4;
б) лаважную жидкость заморозить до -4° С.
• Подготовка предметных стекол: желательно использовать альбуминизированные стекла.

Ход исследования
Приготовление мазков мокроты

Поместить мокроту в центрифужную пробирку.
Добавить равное количество муколитика.
Полученную смесь быстро перемешать.
Поместить в термостат при температуре 37 °С на 5—15 мин,
Развести смесью формалина и спирта (1:1).
Центрифугировать 10 мин при 1500 об/мин.
Слить надосадочную жидкость.
Осадок перенести на 4—8 предметных стекол.
Осадок нанести на стекло в виде тонкого мазка.
Мазок высушить на воздухе.

Приготовление мазков лаважной жидкости

Поместить лаважную жидкость в центрифужную пробирку.
Добавить равное количество 50°-ного спирта и перемешать.
Центрифугировать 20 мин при 2500 об/мин.
Слить надосадочную жидкость.
Осадок перенести на 4—8 предметных стекол.
Осадок нанести на стекло в виде тонкого мазка.
Мазок высушить на воздухе.

A) Скрининговая окраска по Романовскому-Гимзе

Высушенный мазок фиксируют в смеси Никифорова в течение 10—15 мин.
Опустить мазок в сульфатно-уксусный реагент на 10 мин.
Промывать проточной водой в течение 5 мин.
Высушить мазок на воздухе.
Окрашивать 10 %-ной краской Романовского-Гимзы в течение 30 мин.

Результат: цитоплазма трофозоитов голубоватая, ядро — розовое, внутрицист тельца имеют фиолетовое ядро.

Б) Окончательная или специфическая окраска толуидиновым синим

Высушенный мазок фиксируют в 10 %-ном растворе формалина.
Промыть дистиллированной водой.
Опустить мазок в сульфатно-уксусный реагент на 5 мин.
Реагент перемешать стеклянной палочкой.
Оставить мазок в сульфатно-уксусном реагенте еще на 10 мин.
Промыть проточной водой.
Высушить мазок на воздухе.
Окрашивать 0,15 %-ным толуидиновым синим в течение 3 мин.
Промыть проточной водой.
Высушить мазок на воздухе.
Докрашивать в 0,25 %-ном растворе водного метанилового желтого в течение 2 мин.
Промыть водой.

Результат: четко дифференцируется стенка пневмоцист, но не дает представление клеточном содержимом; цисты сине-фиолетовые, тканевые элементы и фон — зелен: желтые.

Б) Окончательная или специфическая окраска по Гомори-Грохоту
Высушенные мазки фиксируют в 10 %-ном растворе формалина в течение 5—10 мин Промыть дистиллированной водой.
Быстро подогреть раствор хромовой кислоты в стакане до 65 °С. В нагретый раствор быстро погрузить мазки на 1 мин. Промыть дистиллированной водой.

Опустить мазки в 1 %-ный раствор метабисульфита калия на 1 мин.
Приготовить раствор: 25 мл рабочего раствора серебра + 25 мл дистиллированной воды +2 мл 5 %-ного водного тетрабората натрия + 15 мл диметилсульфоксида.
Опустить мазки в приготовленный раствор.
Подогреть до 90—95 °С, пока мазки не станут темно-коричневыми, а раствор светло-серым.
Прополоскать мазки в трех сменах дистиллированной воды.
Опустить мазки в 0,2 %-ный водный раствор тиосульфата соды
Промыть дистиллированной водой.
Окрашивать лихтгрюном в течение 5 мин.
Промыть дистиллированной водой.

Результат: цисты светло- или темно-коричневые (цвет зависит от толщины мазка), округлой или чашеобразной формы, окружающий фон и тканевые элементы зелено-желтые.

Г) Окраска акридином оранжевым.

Высушенные мазки фиксируют в абсолютном метаноле в течение 2 мин.
Окрасить рабочим раствором акридина оранжевого 10 мин.
Промыть дистиллированной водой.
Высушить окрашенные мазки на воздухе.
Микроскопировать под масляной иммерсией при увеличении: объектив х90 или х100, окуляр х7 или х10.

Метод эффективен при условии немедленного исследования материала и использования двух вариантов окрашивания параллельно.

Метод применяют для диагностики пневмоцистоза.
Другой материал на пневмоцистоз (слизь из горла и гортани, аспираты из бронхов, биоптаты и мазки-отпечатки легочной ткани) исследуется так же, как и мокрота.

источник

Бактериоскопическое исследование мокроты

КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ОБРАЗОВАНИЯ МОКРОТЫ

Кристаллы Шарко-Лейдена – блестящие бесцветные ромбы различной величины, напоминающие стрелки компаса. Образуются из распадающихся эозинофилов. Часто свежевыделенная мокрота не содержит кристаллов Шарко-Лейдена, они образуются в ней через 24 часа. Присутствие этих кристаллов в мокроте характерно для бронхиальной астмы, встречается также при глистных поражениях легких.

Кристаллы гематоидинаимеют вид ромбов или иголок золотисто-желтого цвета. Являются продуктом распада гемоглобина. Образуются в глубине гематом, в некротизированной ткани. В препаратах мокроты располагаются на фоне детрита, эластических волокон.

Кристаллы холестерина — бесцветные четырехугольные пластинки с обломанным углом, образуются при распаде жироперерожденных клеток, задержке мокроты в полостях. Встречаются при кавернозном туберкулезе, опухолях и абсцессах легких.

Для исследования морфологии клеточных элементов мокроты используют обычные гематологические методы окраски – по Романовскому, Паппенгейму и др. В окрашенных препаратах дифференцируются нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты, базофилы, альвеолярные макрофаги, эпителиальные клетки, клетки злокачественных опухолей.

Этот этап исследования мокроты в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети включает в себя микроскопию препаратов, окрашенных:

— по Цилю-Нильсену для выявления микобактерий туберкулеза (кислотоустойчивых микобактерий, КУМ);

— по Грамму для изучения микрофлоры мокроты (выявления стрептококков, стафилококков, пневмококков и др.). Бактериоскопическое исследование окрашенных по Грамму препаратов имеет ориентировочное значение. Правильность выявления этих бактерий должна подтверждаться бактериологическим исследованием (посевом).

Бактериоскопическое исследование мокроты необходимо проводить в соответствии с правилами, изложенными в приложении №10 к приказу Минздрава России от 21.03.2003г. №109. Сбор мокроты для анализа на кислотоустойчивые микобактерии (КУМ) изложен в общих правилах сбора мокроты.

Процедура приготовления мазков для бактериоскопического исследования начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые стекла ГОСТ 9284-75 , отмытые и обезжиренные в спирте или смеси Никифорова (96% этиловый спирт + эфир в соотношении 1:1), без царапин и сколов. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды, промывают в 1% растворе соляной кислоты, а затем в проточной воде и протирают насухо. Для обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически закрытые емкости со смесью Никифорова или с 96% этиловым спиртом не менее чем на 1 сутки. Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно протираются насухо.

Техника приготовления мазков из мокроты изложена выше.

При приготовлении мазка необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат. Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании. Через правильно приготовленный неокрашенный мазок можно читать газетный шрифт, расположенный позади стекла на расстоянии 5-10см.

Фиксация мазков.Приготовленные мазки помещают на 15-30 минут на лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, и высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу или при его отсутствии — на столе, в специально отведенном месте. Ни в коем случае не допускается фиксация сырых мазков над пламенем горелки. Стекла с высохшими мазками пинцетом или специальными щипцами берут за конец, на который нанесена маркировка, и трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания мазка в пламени не должна превышать 3-5 секунд. Затем стекла помещают на специальную подставку («рельсы») для окрашивания.

В плане охраны труда оптимальным является метод Хайна, согласно которому предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при 37°C, а затем температуру повышают до 105°C и через 10 минут шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу и гибель микобактерий, как находящихся в материале мазка, так и случайно попавших на поднос. Фиксирующая температура не должна превышать 105°С, чтобы не изменить свойства микобактерий.

Высушенные и фиксированные мазки должны сразу же окрашиваться. Нефиксированные мазки ни в коем случае не должны оставляться открытыми на ночь, так как это увеличивает опасность распространения инфекции и возможность переноса ее насекомыми. Фильтровальная бумага, которой был выстлан лоток (поднос), по окончании фиксации каждой серии мазков подлежит обязательному сжиганию или автоклавированию, а лоток обжигается спиртом. Лотки ежедневно выстилаются чистой бумагой.

Дата добавления: 2014-11-29 ; Просмотров: 2522 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Существует целый ряд заболеваний, клинический диагноз которых (малярия, возвратный тиф и др.) может быть подтвержден при помощи микроскопических исследований фиксированных и окрашенных тонких мазков из периферической крови или в препаратах «толстой капли» крови.

Кровь берут из пальца, предварительно протертого спиртом, уколов его стерильной иглой. Для приготовления тонкого мазка хорошо обезжиренное предметное стекло прикладывают к месту укола на пальце и получают небольшую каплю крови .

К переднему краю капли ставят шлифованное предметное стекло под углом 45 градусов. После того как кровь растечется по краю стекла, его продвигают вперед так, чтобы на предметном стекле получился равномерный тонкий мазок. Мазки крови вначале высушивают на воздухе, а затем фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова.

В том случае, когда концентрация микроорганизмов в крови невелика и их не удается обнаружить в тонких мазках, необходимо приготовить препарат «толстой капли». Для этого на предметное стекло наносят 2 – 3 капли крови, полученной при проколе мякоти пальца, и распределяют на стекле в виде пятно 10 – 15 мм. Препарат высушивают на воздухе и для разрушения эритроцитов (чтобы они не мешали обнаруживанию микробов) на мазок осторожно наносят 1 – 2 капли дистиллированной воды. Через несколько минут высушенный и зафиксированный препарат окрашивают, промывают струей воды, высушивают и изучают при помощи иммерсионного микроскопа.

При исследовании кроваво – слизистого или жидкого стула с целью выявления кишечных патогенных простейших начинать исследования необходимо со слизи. Отобранный кусочек слизи, наносят на предметное стекло. Для того, чтобы слой слизи был тонким, его необходимо расправить препаровальными иглами. После этого препарат накрывают покровным стеклом и исследуют микроскопически.

Таким же способом готовят мазок и из жидкого калового стула.

Мазок из оформленного или густого кашицеобразного стула готовится следующим образом: в капле физиологического раствора, предварительно нанесенной на предметное стекло, ополаскивают конец тонко заостренной деревянной палочки, предварительно погруженной в кал. Полученная взвесь накрывается покровным стеклом и производится просмотр при помощи микроскопа для первоначальной ориентировки. Точное определение паразитов осуществляется в фиксированных и окрашенных препаратах.

Исследование не окрашенных и окрашенных препаратов начинают с просмотра мазков при помощи малого увеличения. Малое увеличение дает возможность охватить большее поле зрения, и, следовательно, быстрее могут быть обнаружены паразиты. Детальное же изучение паразита проводится при помощи иммерсионного объектива.

Для исследования мокроты ее выливают в чашку Петри из емкости, в которой она находится. Бактериологической петлей выбирают гнойные комочки и размазывают их тонким слоем по поверхности предметного стекла.

При исследовании мочи ее собирают в сосуд. Дают ей отстояться на холоду или центрифугируют. Из полученного осадка готовят микропрепараты.

При микроскопическом исследовании спинномозговой жидкости микропрепараты готовят из фибринозного сгустка или из осадка, полученного при отстаивании или центрифугировании жидкости.

Препараты следует готовить с большой осторожностью. После того как препараты высохнут, их фиксируют и окрашивают.

Необходимость приготовления мазка – отпечатка из селезенки, печени, костного мозга, лимфоидной ткани возникает по разным причинам: определить первостепенность обсеменения того или иного органа в зависимости от пути и времени проникновения возбудителя в макроорганизм, активности ответной реакции иммунокомпетентных органов, вирулентных особенностей возбудителя (отношение к капсулообразованию) и пр.

Для приготовления мазка – отпечатка необходимо стерильно сделать горизонтальный срез органа и на свежий срез быстро и аккуратно без приложения усилий накладывается стерильное обезжиренное предметное стекло. И также быстро поднимается вертикально вверх, без смещения в какую – либо сторону.

Препарат высушивается на воздухе, фиксируется в жидком фиксаторе, промывается осторожно проточной водой, высушивается, окрашивается и микроскопируется.

источник

Как указывалось выше, мазок может быть приготовлен непосредственно из нативного (необработанного) материала или его осадка (при исследовании жидких материалов).

Если мазок будет окрашиваться по методу Ziehl-Neelsen и исследоваться в световом микроскопе, рН мазка не корригируется.

В случае окраски флуорохромными красителями для исследования в люминесцентном микроскопе перед нанесением материала на предметное стекло необходимо добиться нейтрального значения рН (6,8-7,0). Уровень рН осадка определяют с помощью бумажной индикаторной полоски.

Перед приготовлением мазка на один конец стекла (или его матовую часть) наносят полный номер пробы исследуемого материала, под которым он зарегистрирован в лабораторном регистрационном журнале при приеме материала. Номер наносят с помощью алмазного карандаша или несмываемого маркера с таким расчетом, чтобы в процессе окраски этот номер сохранился.

Не следует касаться чистой поверхности стекла руками или перчатками.

Приготовление мазков для прямой микроскопии из нативной мокроты.

Если материал поступил в емкости, в которой невозможно обнаружить и выбрать частицы для приготовления мазка, его переносят в чашку Петри, под дно которой подложена черная бумага. При этом проявляют известную осторожность, чтобы избежать образования аэрозолей.

Так как в необработанной нативной мокроте микобактерии наиболее часто располагаются в плотных комочках распада тканей, следует иметь в виду, что результат микроскопического исследования в значительной степени зависит от правильности выбора этих гнойных комочков.

При приготовлении мазков наиболее удобно пользоваться деревянной палочкой, которую перед работой разламывают пополам.

Затем из разных участков образца мокроты выбирают 2-3 наиболее плотных гнойных небольших комочка, переносят их на стекло, при необходимости разминают его и равномерно распределяют тонким слоем в центре стекла на поверхности приблизительно размером 1×2 см в виде овала. Забор комочков производят с помощью сломанных концов палочки, что обеспечивает более надежную фиксацию материала к палочке и облегчает последующее его нанесение на поверхность предметного стекла и приготовление мазка посредством растирания.

На одно предметное стекло следует наносить только один мазок.

Использованные для приготовления мазка палочки удаляют в банку с дезинфицирующим раствором или в контейнер с отработанным заразным материалом. Для каждой порции мокроты используется новая чистая палочка.

Практикуется также приготовление мазков с помощью бактериологических петель или препаровальных игл. Удобно пользоваться двумя петлями или иглами. В случае, когда мазок готовят с помощью бактериологической петли, она может быть использована повторно после очистки от остатков мокроты путем 2-Зх кратного погружения ее в банку с песком, залитым спиртом, и последующего прожигания в пламени горелки до появления красного цвета. После прокаливания петлю следует охладить, оставив ее на 1-2 минуты в штативе-петледержателе.

Песок для очистки петель может использоваться длительное время при условии периодического обновления раствора спирта с таким расчетом, чтобы его уровень превышал уровень песка не менее чем на Зсм.

Приготовления мазка из осадка необработанного нативного материала.Такие мазки приготавливают из полученного после центрифугирования осадка любого жидкого диагностического материала (бронхоальвеолярные смывы, промывные воды бронхов или желудка, моча, пунктаты из закрытых полостей, экссудаты и др.). Осадок представляет собой обогащенную фракцию диагностического материала и значительно чаще позволяет получить положительные результаты. Особенностью существования М. tuberculosis в жидкостях является способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии. В связи с этим рекомендуется производить центрифугирование при 3000 g (см. Приложение № 11 настоящего приказа).

Для приготовления мазка, надосадочную жидкость аккуратно удаляют, полученный в пробирке осадок перемешивают и с помощью пипетки наносят на стекло 1-2 капли осадка, распределяя его тонким слоем в центре стекла на площади не менее 1 см х 2 см.

Необходимо иметь в виду, что мазки из осадка жидких материалов (моча, промывные воды бронхов, экссудаты и пр.) легко смываются в процессе окраски. Поэтому мазки из осадка жидких материалов желательно приготавливать на стеклах, предварительно обработанных яичным белком.

Для этого белок куриного яйца в течение 30 — 40 минут взбивают с чистыми стерильными стеклянными бусами в стерильной посуде и оставляют на 1 — 1,5 часа при комнатной температуре. Затем жидкую часть взбитой смеси отбирают пипеткой, переносят ее в другую посуду и, смачивая в ней ватный тампон, аккуратно наносят ее на чистые обезжиренные предметные стекла, равномерно распределяя по 2/3 их поверхности. 1/3 предметного стекла оставляется необработанной белком для последующего нанесения на нее номера пробы. Обработанные белком стекла раскладывают на чистой фильтровальной бумаге и высушивают при комнатной температуре. Стекла готовят накануне их использования. Срок хранения не превышает 2-х суток.

Другим способом закрепления осадка жидкого материала является использование сыворотки крови. На чистом стекле каплю сыворотки смешивают с 1-2 каплями осадка материала и распределяют смесь по стеклу.

При приготовлении мазка для микроскопического исследования необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат.

Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании.

Не рекомендуется готовить мазки способом «растяжки» материала между двух предметных стекол. Такой способ сопровождается образованием биологически опасного аэрозоля.

Через правильно приготовленный не окрашенный мазок можно читать газетный шрифт, расположенный позади стекла на расстоянии 5 -10 см.

Ограниченная площадь мазка (

1 см х 2 см в центре стекла) значительно повышает безопасность манипуляции и последующей микроскопии, так как периферические части и ребра предметного стекла остаются незагрязненными инфекционным материалом.

источник

Методические указания к практическому занятию

По дисциплине ОП.06 Основы микробиологии и иммунологии

для студентовспециальности 34.02.01 Сестринское дело

Тема: Приготовление микробиологических препаратов

Цель занятия:научиться готовить микробиологические мазки из агаровой культуры, бульонной культуры, крови, гноя, мокроты и трупного материала.

После выполнения практической работы студенты должны уметь:

— готовить микробиологические препараты из нативного материала;

— готовить микробиологические препараты из бульонной и агаровой культуры;

— владеть навыками фиксации мазка.

Студенты должны знать:

— правила работы в микробиологической лаборатории;

— меры безопасности при работе с инфицированным материалом;

— методы микробиологического исследования;

-терминологию, используемую для характеристики микробиологических препаратов.

Практическая работа способствует формированию следующих компетенций:

ОК 1. Понимать сущность и социальную значимость своей будущей профессии, проявлять к ней устойчивый интерес;

ОК 3. Принимать решения в стандартных и нестандартных ситуациях и нести за них ответственность.

ОК 4. Осуществлять поиск и использование информации, необходимой для эффективного выполнения профессиональных задач, профессионального и личностного развития.

ОК 6. Работать в коллективе и команде, эффективно общаться с коллегами, руководством.

ПК 2.5. Соблюдать правила использования аппаратуры, оборудования и изделий медицинского назначения в ходе лечебно-диагностического процесса.

План занятия

II. Инструктаж к практической работе. Демонстрация манипуляций по теме.

III. Самостоятельная работа студентов. Оформление дневников по практике

IV. Отчет о проделанной работе. Выходной контроль

Ход занятия.

I. Ответьте на вопросы входного контроля:

1. Правила работы в микробиологической лаборатории.

2. Какие существуют особенности работы с инфицированным материалом?

3.Какая лабораторная посуда и оборудование используются для приготовления микробиологических препаратов?

4.Какие существуют основные формы бактерий?

5.Цели и способы фиксации мазка.

6.Техника приготовления мазков.

II.Инструктаж к практической работе

Используя методические указания, изучите правила приготовления микробиологических мазков из агаровой культуры, бульонной культуры, крови, гноя, мокроты и трупного материала.

III. Самостоятельная работа студентов:

Приготовьте мазок с плотной питательной среды.

А) Обезжирить предметное стекло. Для чего предметные стекла помещают на 2-3 дня в смесь Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирт.

Б) На положенное на стол стекло, прокаленной на спиртовке петлей наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия (0,9%).

В) Берут левой рукой пробирку с культурой.

Г) Правой рукой берут бактериологическую петлю и прожигают ее в пламени спиртовки.

Д) Вынимают мизинцем правой руки пробку из пробирки. Прожигают горло пробирки над пламенем спиртовки.

Е) вводят петлю в пробирку. Охлаждая ее о стенки пробирки, если она горячая.

Ж) Захватывая петлей небольшую часть культуры, выводят ее из пробирки, не касаясь стенок.

З) Закрывают пробирку пробкой над пламенем спиртовки и ставят ее в штатив.

И) Петлю с культурой опускают на стекло и растирают культуру рядом с каплей изотонического раствора, а затем постепенно эмульгируют в этом растворе.

К) Остатки культуры на петле сжигают в пламени спиртовки.

Л) Мазок высушивают, фиксируют, окрашивают.

2. Приготовьте мазок с жидкой питательной среды.

Приготовление мазка из жидкой культуры отличается от выше описанного способа приготовления только тем, что здесь можно использовать не только петлю, но и Пастеровскую пипетку, которую обязательно после использования опускают в дезинфицирующий раствор.

3. Приготовьте мазок из гноя или мокрот.

Материал забирают стерильной петлей или пипеткой и наносят на середину предметного стекла. Затем вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы остались свободными треть первого и второго стекол. Стекла раздвигают в стороны и получают два отдельных мазка.

Рисунок 1 – Приготовление мазка из гноя и мокроты

4. Приготовьте мазок из крови.

Каплю крови наносят ближе к краю стекла. Затем краем второго отшлифованного стекла прикасаются к капле крови, располагая стекло под углом 45 0 . Прижимая отшлифованное стекло к предметному, продвигая его. Хорошо сделанный мазок имеет желтоватый цвет.

Рисунок 2 –Приготовление мазка из крови (стрелка показывает направление движения шлифовального стекла)

5. Приготовьте мазок из трупного материала.

Раскаленным скальпелем прижигают поверхность орган и из этого участка вырезают кусочек материала, затем поверхностью этого кусочка прикасаются к предметному стеклу в двух – трех местах, делая ряд мазков-отпечатков.

Высушивание – мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в термостате.

Фиксация. Мазки фиксируют после полного высыхания с целью закрепить мазок на стекле и обезвредить (убить) микроорганизмы. Для этого применяют спиртовку. Держа стекло вверх мазком, его трижды проводят через пламя спиртовки (6 сек).

Мазки из крови и трупного материала лучше фиксировать жидкостью, т.к. клеточные элементы в мазках при действии высокой температуры разрушаются.

а) метиловый спирт – 5 минут

в) смесь Никифорова – 10-15 мин

Окраска препарата может быть простой и сложной.

Бактериальная петля состоит из трех частей: ручки (петледержателя), головки и самой петли (проволочки).

источник

Анализ мокроты — показание, как правильно собрать и сдавать, расшифровка результатов и показатели нормы

При бронхите и других воспалительных заболеваниях необходимо сдавать общий анализ мокроты, проанализировав результаты которого, врач сможет определить характер и причину развития патологического процесса. При поражениях дыхательных органов выделяется слизистый секрет, который несет в себе информацию о возбудителях, ставших катализаторами ухудшения состояния организма. Это могут быть микробактерии туберкулеза, клетки злокачественных опухолей, примеси гноя или крови. Все они влияют на количество и состав выделяемой пациентом мокроты.

Исследование мокроты является одним из самых эффективных методов, позволяющих определить характер заболевания дыхательных путей. Многие недуги представляют серьезную угрозу для жизни человека, например, такие болезни как актиномикоз, гнилостный бронхит, гангрена легкого, пневмония, бронхиальная астма, абсцесс легкого и т.д. Попадая в организм человека, вредоносные микроорганизмы способствуют развитию патологического процесса, который стимулирует выделение секрета из органов дыхания.

Чтобы диагностировать болезнь, врачи проводят общий анализ, который включает несколько этапов: бактериологический, макроскопический, химический и микроскопический. Каждое исследование содержит важную информацию о секрете, на основе чего происходит итоговое составление медицинского заключения. Анализы подготавливают около трех рабочих дней, в некоторых случаях возможны задержки на более длительный срок.

Микроскопия мокроты проводится среди пациентов, страдающих заболеваниями легких или других органов дыхания, с целью выявления причины недуга. Слизистый секрет выделяется только при наличии патологических отклонений в работе организма, поэтому при появлении выделений из дыхательных путей следует как можно скорее обратиться к врачу. Отхождение мокроты происходит во время кашля, микроскопический анализ слизи помогает получить всю необходимую информацию о локализации и стадии воспалительного процесса.

Цвет и консистенция мокроты могут быть разными в зависимости от болезни. Исходя из полученных данных, врачи определяют возбудителя патологии и подбирают рациональный курс лечения. Присутствие в секрете патогенных микроорганизмов способствует подтверждению или опровержению наличия злокачественных опухолей, что немаловажно при постановке окончательного диагноза.

Сдавать посев мокроты для проведения общего анализа необходимо тем пациентам, у которых присутствует подозрение на хронические или острые заболевания дыхательной системы. Например, бронхит, рак легкого, туберкулез, пневмония. Данная группа людей находится в категории риска, поэтому регулярные исследования секрета являются неотъемлемой частью комплексной терапии заболеваний. Собирать слизь приходится даже после прохождения курса лечения, поскольку некоторые недуги имеют тенденцию к временному прекращению активности.

Данная процедура требует от пациентов соблюдения определенных правил, которые гарантируют «чистоту» проведения исследования. Ротовая полость человека содержит особую флору, которая может смешиваться с патогенным секретом. Чтобы предоставить корректные данные медицинской комиссии, пациент должен придерживаться следующих рекомендаций:

Пить много теплой воды.
Принимать отхаркивающие средства.
Почистить зубы и прополоскать рот перед процедурой.

Перед тем, как сдавать мокроту на анализ, ее необходимо собрать в домашних или амбулаторных условиях. Пациенту выдают стерильную баночку, которую следует открывать непосредственно перед процедурой. Лучше всего собирать секрет с утра, поскольку в это время суток он является самым свежим. Мокроту для исследования нужно постепенно выкашливать, но, ни в коем случае, не отхаркивать. Чтобы улучшить выделение слизи, врачи рекомендуют:

Сделать 3 медленных вдоха и выдоха, задерживая дыхание между ними на 5 секунд.
Откашляться и сплюнуть накопившуюся мокроту в баночку для анализов.
Убедиться, что слюна из ротовой полости не попала в емкость.
Повторять вышеуказанные действия до тех пор, пока уровень секрета не достигнет отметки 5 мл.
В случае неудачи, можно подышать паром над кастрюлей с горячей водой для ускорения процесса отхаркивания.

Как только сбор мокроты завершен, баночку следует отвезти в лабораторию для проведения анализа. Важно, чтобы секрет был свежим (не более 2 часов), поскольку в человеческой слизи очень быстро начинают размножаться сапрофиты. Данные микроорганизмы мешают правильной постановке диагноза, поэтому все время от сбора до транспортировки емкость со слизью необходимо хранить в холодильнике.

Длительный кашель, который не прекращается на протяжении трех недель, считается показанием для исследования мокроты. Подозрение на туберкулез – серьезный диагноз, поэтому патогенную слизь собирают только под присмотром врача. Данный процесс может происходить в стационарных или амбулаторных условиях. Сдавать мокроту при подозрении на туберкулез приходится 3 раза.

Первый сбор проходит рано утром, второй – по прошествии 4 часов, а последний – на следующий день. Если пациент по какой-то причине не может самостоятельно прийти в больницу для сдачи анализов, к нему домой наведывается медсестра и доставляет полученный секрет в лабораторию. При обнаружении бактерий Коха (микробактерий туберкулеза) врачи ставят диагноз – открытая форма туберкулеза.

Расшифровка анализа мокроты состоит из трех этапов. Сначала лечащий врач проводит визуальный осмотр пациента, оценивает характер, цвет, слоистость и другие показатели патогенного секрета. Полученные образцы изучают под микроскопом, после чего наступает черед бактериоскопии. Завершающим исследованием является посев на питательные среды. Бланк с результатами выдается в течение трех дней по завершению сдачи анализов, исходя из полученных данных, специалист делает вывод о характере заболевания.

Чтобы правильно поставить диагноз пациенту, мокроту оценивают по трем разным показателям. Проводится макроскопический, бактериоскопический и микроскопический анализ, результаты по каждому исследованию дают четкое представление о состоянии человека. Цвет, консистенция, запах, деление на слои и наличие включений – это основные показатели макроскопического анализа секрета. Например, прозрачная слизь встречается у людей с хроническими заболеваниями дыхательных путей.

Ржавый оттенок секрета обусловлен кровянистыми примесями (распад эритроцитов), что часто свидетельствует о наличии туберкулеза, крупозной пневмонии, рака. Гнойная мокрота, которая образуется при скоплении лейкоцитов, характерна для абсцесса, гангрены или бронхита. Желтый или зеленый цвет выделений является показателем патологического процесса в легких. Вязкая консистенция секрета может быть следствием воспаления или приема антибиотиков.

Спирали Куршмана в мокроте, которые представляют собой белые извитые трубочки, свидетельствуют о наличии бронхиальной астмы. Результаты микроскопического и бактериоскопического анализа предоставляют информацию о содержании в слизи болезнетворных микроорганизмов или бактерий. К ним относятся: диплобациллы, атипичные клетки, стафилококки, эозинофилы, гельминты, стрептококки. Серозная мокрота выделяется при отеке легких, пробки Дитриха встречаются у пациентов, страдающих гангреной или бронхоэктазами.

У здорового человека железы крупных бронхов образуют секрет, который проглатывается при выделении. Данная слизь обладает бактерицидным эффектом и служит для очищения дыхательных путей. Однако появление даже незначительного количества мокроты свидетельствует о том, что в организме развивается патологический процесс. Это может быть застой в легких, острый бронхит или пневмония. Единственным исключением являются курильщики, поскольку у них слизь выделяется постоянно.

Наличие единичных эритроцитов при анализе секрета является нормой и не оказывает влияния на диагностические результаты. Объем ежедневно вырабатываемой трахеобронхиальной слизи у человека должен находиться в переделах от 10 до 100 мл. Превышение указанной нормы свидетельствует о необходимости проведения дополнительных анализов. При отсутствии отклонений мазок на МТБ должен показать отрицательный результат.

В норме у человека не должно происходить отхождение мокроты, поэтому при появлении слизи подозрительного характера необходимо сразу же обратиться за помощью к специалисту. С помощью бактериоскопического исследования определяется тип возбудителя, мазок с грамположительными бактериями окрашивается в синий цвет, а с грамотрицательными – в розовый. Микроскопический анализ помогает обнаружить опасные патологии, к которым относятся опухолевые клетки, эластичные волокна, альвеолярные макрофаги и т.д. Исходя из полученных результатов слизи, врач назначает терапию.

При микроскопическом исследовании мокроты часто встречаются клетки плоского эпителия, однако это никак не влияет результаты анализа. Обнаружение клеток цилиндрического эпителия может свидетельствовать о наличии таких недугов, как астма, бронхит или рак легкого. В большинстве случаев вышеупомянутые образования являются примесями слизи из носоглотки и не имеют диагностического значения.

Клетки ретикулоэндотелия можно обнаружить у людей, которые длительное время находились в контакте с пылью. Протоплазма альвеолярных макрофагов содержит фагоцитированные частицы, которые называют «пылевыми» клетками. Некоторые из вышеуказанных микроорганизмов включают продукт распада гемоглобина – гемосидерин, поэтому им было присвоено название «клетки сердечных пороков». Такие образования возникают у пациентов с диагнозами инфаркт легкого, митральный стеноз, застой легкого.

Любой секрет содержит небольшое количество лейкоцитов, однако скопление нейтрофилов свидетельствует о том, что имеются гнойные выделения. При бронхиальной астме у пациента можно обнаружить эозинофилы, что также характерно и для следующих заболеваний: рак, туберкулез, инфаркт, пневмония, гельминтоз. Большое число лимфоцитов встречаются у тех людей, которые болеют коклюшем. Иногда причиной повышения их количества выступает туберкулез легких.

Слизь человека может содержать единичное количество эритроцитов, что никак не влияет на состояние его здоровья. При развитии таких патологических процессов, как легочное кровотечение, количество эритроцитов сильно возрастает, что приводит к кровохарканью. Наличие свежей крови в слизистых выделениях говорит о наличии неизменных эритроцитов, но если кровь задерживалась в дыхательных путях, то по ней определяют выщелоченные клетки.

При распаде легочной ткани образуются так называемые эластичные волокна. Их появление в секрете свидетельствует о наличии абсцесса, туберкулеза, рака или гангрены легких. Последнее заболевание может протекать без присутствия эластичных волокон, поскольку они иногда растворяются под действием ферментов слизи. Отличительной особенностью бесцветных кристаллов Шарко-Лейдена является высокое содержание эозинофилов, что характерно для таких заболеваний как бронхиальная астма и эозинофильная пневмония.

Кристаллы Шарко-Лейдена – не единственный представитель эластичных волокон. В мокроте многих пациентов, страдающих заболеваниями дыхательных путей, часто встречаются спирали Куршмана. Они представляют собой трубчатые тела, которые иногда заметны даже невооруженным глазом. В остальных случаях кристаллы обнаруживают с помощью микроскопического исследования слизи. Трубчатые тела могут предвещать развитие пневмонии, бронхиальной астмы, туберкулеза легких.

Эозинофилы считаются признаками астмы, но данное утверждение верно лишь для некоторых случаев. Микроорганизмы этого типа содержат специфический белок, который способен не только защищать организм от паразитов, но и разрушать эпителий дыхательных путей. Эозинофилы считаются одной из главных причин развития патологии органов дыхания, однако исследования по данному вопросу все еще не завершены. Эти клетки невозможно полностью удалить из дыхательных путей, однако можно существенно снизить их количество при соответствующем лечении антителами.

источник

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла.

Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.

Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов:

1.Приготовление мазка на обезжиренном предметном стекле.

В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой.

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала (моча и др.)

Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.

Приготовление мазков из крови

На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе, шлифованное, стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45°, затем подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении.

Приготовление толстой капли

На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в “толстой капле” распределяется не равномерно, образуя неровный край.

Приготовление мазка из вязкого материала

Материал, нанесенный на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу. После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределённым материалом, занимающим большую часть.

Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред

На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу.

Приготовление мазков из органов и тканей

Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем пли бактериальной петлей. Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу несколько раз последовательно, получая, таким образом, ряд мазков-отпечатков.

Рис. 4 Схема приготовления препарата-мазка

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2019 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.001 с) .

источник

Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.

Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.

Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.

Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.

Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.

Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.

Рис. 7. Игла и петли для посева. 1 — игла; бактериальные петли: 2, 3 — петли приготовлены неправильно; 4 — петля приготовлена правильно

Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и извлечении оттуда сохраняет водную пленку.

Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.

Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.

Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с двухкопеечную монету).

Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.

Приготовление мазка из гноя или мокроты. Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка.

Приготовление мазка из крови. Каплю крови наносят на предметное стекло на расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.

Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов трупов и пищевых продуктов твердой консистенции. Поверхность органа или пищевого продукта прижигают раскаленным скальпелем и из этого участка вырезают кусочек материала. Пинцетом осторожно захватывают этот кусочек и поверхностью среза прикасаются к предметному стеклу в двух — трех местах, делая ряд мазков-отпечатков.

Высушивание мазка

Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.

Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение структуры клеток.

Фиксация мазка

Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.

Способы фиксации. 1. Физический — в пламени горелки: стекло берут пинцетом или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки в течение 6 с.

2. Химический — в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и мазках-отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом- 5 мин; б) этиловым спиртом — 10 мин; в) смесью Никифорова — 10-15 мин; г) ацетоном — 5 мин; д) парами кислоты и формалина — несколько секунд.

Окраска препаратов

После фиксации приступают к окраске препарата.

Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.

Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.

Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).

Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.

Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь препарат.

Рецепты красителей

1. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):

красителя — 1 г спирта 96% — 10 мл

Смесь помещают в термостат до полного растворения на несколько дней. Взбалтывают ежедневно. Хранят в склянках с притертыми пробками.

2. Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, спор и капсул):

насыщенного спиртового раствора основного фуксина — 10 мл раствора карболовой кислоты 5% — 90 мл

Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот.

Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют и сливают во флакон для хранения.

3. Фуксин Пфейффера (для окраски по Граму и для простого метода окраски):

Фуксина Циля — 1 мл воды дистиллированной — 9 мл

Краситель готовят непосредственно перед применением.

4. Карболовый генциановый фиолетовый (для окраски по Граму):

насыщенного спиртового раствора

генцианового фиолетового — 10 мл

карболовой кислоты 5% — 100 мл

Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

5. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал):

йодида калия — 2 г кристаллического йода — 1 г дистиллированной воды — 10 мл

Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды.

6. Щелочной раствор метиленового синего Леффлера:

насыщенного спиртового раствора метиленового синего — 30 мл раствора гидроксида калия 1% — 1 мл дистиллированной воды — 100 мл

7. Бумажки по Синеву (для окраски по Граму):

1% спиртовой раствор кристаллического фиолетового

Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.

Методы окраски делят на ориентировочные (простые) и дифференциальные (сложные), выявляющие химические и структурные особенности бактериальной клетки.

Простой метод окраски

Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3-5 мин, фуксином Пфейффера — 1-2 мин (см. рис. 4).

На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Сложные методы окраски

Окраска по Граму (универсальный метод). Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.

В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы — грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.

1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.

2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.

3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Окраска по Цилю — Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий). Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.

1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.

2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.

3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные — в синий (см. рис. 4).

Окраска по Ожешко (выявление спор). 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.

2. Окрашивают по способу Циля — Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка — в голубой цвет (см. рис. 4).

Окраска по Бурри — Гинсу (выявление капсулы). Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.

1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.

2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.

3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.

Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки — красные, капсулы — неокрашенные (см. рис. 4).

Дата добавления: 2016-11-22 ; просмотров: 1151 | Нарушение авторских прав

источник