Окраска мазка мокроты по грамму

Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы.

Красители применяемые в микробиологии, являются солями двух типов: 1) кислые красители – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий).

Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).

Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl)/

Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).

Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале.

В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы

Существуют простые и сложные методы окрашивания микропрепаратов.

Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.

Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов.

Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные организмы длительное время остаются живыми и способными к размножению. Существует несколько способов прижизненной окраски, в том числе и способ Nakanischi.

При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет.

Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.

Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.

К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.

Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.

Раствор А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл.

Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой.

Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.

Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.

Очень часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью («негативный способ» Burri).

По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается как бы негативное их изображение.

При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2.

Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости.

Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец а темном фоне препарата.

Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.

Простой метод позитивного или негативного способа окраски микроорганизмов очень удобен для самых разнообразных целей (изучение формы и расположения клеток, определение размеров, обнаружение капсул у микробных клеток в мазках – отпечатках из органов инфицированного организма и пр.).

Однако простой метод окраски не позволяет дифференцировать микроорганизмы (в том числе и бактерии) сходные по форме и размерам, но принадлежащие к различным видам, простой метод окраски не позволяет обнаружить зрелые споры и цисты, высыпавшиеся из клетки в окружающуюся среду, простой метод окраски не позволяет обнаружить клетки со сложной структурой оболочки и пр.

В силу этого большую ценность представляют сложные методы окраски, позволяющие получить представление не только о форме, размерах, расположении клеток друг относительно друга, по позволяющие дифференцировать микробы и определять структурные детали микробных клеток.

Среди сложных методов окраски большую ценность представляет способ окраски разработанный датским ученым Граммом, позволяющий дифференцировать микроорганизмы на две большие группы, называемые «грамположительными» и «грамотрицательными», что имеет большое значение при идентификации микроорганизмов.

Этот способ окраски называют дифференциальной окраской. В основе дифференциации микробов по Грамму лежит свойство клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны.

Основой клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов является пептидогликан. У грамположительных микробов пептидогликан имеет несколько слоев, у грамотрицательных — он однослоен.

У грамположительных микробов, обладающих плотным и многослойным пептидогликаном, образовавшийся комплекс при окраске кристаллическим фиолетовым и последующей обработке йодным раствором не вымывается спиртом, и клетки не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовый цвет. В то время как грамотрицательные микробы, имея тонкий слой пептидогликана, обесцвечиваются спиртом. При дополнительной окраске фуксином или сапранином грамотрицательные клетки окрашиваются в сиреневато – красный цвет.

Микроорганизмы, которые сохраняют окраску, называются «грамположительными» и обозначаются «Г+», а обесцвеченные – «грамотрицательными» и обозначаются «Г-».

Показатели дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов:

Грамположительные микроорганизмы не чувствительны к действию желудочного сока, имеют не сложную структуру. Резистентные к щелочам, чувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Иммуногенные свойства выражены слабо, оптимум роста при относительно высоком рН. В живом состоянии более проницаемы для красителей, чувствительны к электролитам. Могут быть кислотоустойчивыми и могут образовывать споры. Имеют многослойный пептидогликан и могут содержать тейхоевые кислоты. Клеточная стенка пористая, содержит мало белков, пептиды по составу аминокислот однообразны. Липидов мало, много гликопротеидов (99%).

Грамотрицательные микроорганизмы в большинстве случаев растворяются под действием желудочного сока, растворяются в 1% растворе КОН, чувствительны к кислотам. Малочувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Хорошо выражены иммуногенные свойства. Оптимум роста при низком рН среды. В живом состоянии плохо проницаемы для анилиновых красителей. Резистентны к слабым электролитам, спор не образуют. Основой клеточной стенки является однослойный пептидогликан, тейхоевая кислота отсутствует. Клеточная стенка малопористая, имеет сложную структуру, содержит все аминокислоты. Липидов много (до 22%), гликопротеидов мало (5 – 9%).

Растворы для окраски по методу Грамма:
1. Раствор А – кристаллический фиолетовый – 2,0г, этиловый спирт 95% — 20,0мл.
2. Раствор Б – щавелевокислый аммоний – 0,8г, дистиллированная вода – 80,0 мл.
Раствор А разводят дистиллированной водой (1:5) и затем смешивают его с равным объемом раствора Б.
3. Раствор Люголя – йод кристаллический – 1г, йодистый калий – 2,5г, дистиллированная вода – 80,0мл. Эту смесь оставляют на 24 часа для растворения йода.
4. Раствор для дополнительной окраски – сапранин или фуксин (2,5% раствор в 95% спирте) – 25 мл. Дистиллированная вода – 75мл.

Методика окраски по методу Грамма:
1. Фиксированный мазок, содержащий микробные клетки, окрасить генцианвиолетом (2 минуты).
2. Слить генцианвиолет, после чего нанести на препарат раствор Люголя (2 минуты).
3. Осторожно слить раствор Люголя и промыть препарат 95% этиловым спиртом (30 секунд. Клетки с многослойным пептидогликаном останутся окрашенными генцианвиолетом, с однослойным пептидогликаном – обесцветятся).
4. Препарат осторожно промыть струей воды.
5. Мазок окрасить раствором фуксина или сапранина (1 – 2 минуты).
6. Препарат осторожно промыть струей воды, высушить на воздухе при комнатной температуре или в потоке теплого воздуха над пламенем горелки, или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
7. Препарат исследовать при помощи микроскопа.

К сложным дифференциально – диагностическим методам окраски относится также и окраска по методу Циль – Нильсена (Ziehl – Naelsen), позволяющая отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от других, не обладающих этим свойством.

Этот метод применяется главным образом для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, имеющих своеобразный химический состав, а именно – высокое содержание в клетке липидов. Окраска по Циль – Нильсену применяется для окраски микобактерий туберкулеза и родственных им микроорганизмов из рода Mycobacterium.

Приготовление и окраска микопрепарата по Циль – Нильсену проводится следующим образом:
1. Готовят обычным способом фиксированный мазок из исследуемого материала (мокрота больного или чистая культура).
2. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу и на нее наливают раствор карболового фуксина. Предметное стекло зажимают в пинцет Корне и препарат в течение 4-х минут нагревают над пламенем горелки (по мере испарения жидкости раствор красителя добавляется).
3. Через 4 минуты (по окончанию прогревания) фильтровальную бумагу осторожно снимают с препарата и на мазок на 30 секунд наносится 5 – 10% раствор серной или соляной кислоты приготовленный на 95% этиловом спирте.
4. Через 30 секунд препарат осторожно промывают струей холодной воды и дополнительно докрашивают раствором метиленовой сини.

Механизм окраски кислотоустойчивых микроорганизмов по Циль – Нильсену можно объяснить следующим образом: во время нагревания препарата воск, входящий в состав оболочки, размягчается, и благодаря этому краситель проникает в бактериальную клетку. Остывая, этот воск удерживает краситель, поэтому спирт, с кислотой вымывают краситель только из клеток, не обладающих кислотоустойчивостью. При дополнительной окраске метиленовым синим окрашиваются обесцвеченные клетки и на этом синем фоне будут отчетливо видны кислотоустойчивые бактерии, окрашенные в красный цвет.

Растворы для окраски по Циль – Нильсену:
1. Раствор А – основной фуксин – 0,3г, этилдовый спирт 95% — 10,0мл.
2. Раствор Б – фенол (расплавленные кристаллы) – 5,0г, дистиллированная вода – 95,о мл.
3. Раствор метиловой сини Леффлера или бриллиантовой зелени.
Растворы А и Б смешивают (карболовый фуксин). Смесь хорошо сохраняется.

В микроскопической практике при изучении мазков – отпечатков из органов, мазки из крови, при изучении спирохет, простейших, хламидий, культур тканей широко применяется еще один сложный метод окраски – окраска по Романовскому – Гимза.

Методика окраски по Романовскому – Гимза:
1. Препарат высушивается, фиксируется в жидком фиксаторе (метанол 3 – 5 минут).
2. Препарат высушивают и помещают в стаканчик с рабочим раствором красителя (экспозиция 20 25 минут при 37 градусах , концентрация раствора краски и экспозиция должны быть титрованы). Перекрашенный мазок дифференцируется этиловым спиртом (50 – 60 градусным), споласкивается осторожно водой, высушивается и микроскопируется.

Растворы красителей для окраски по Романовскому – Гимза:
1. Вариант А. Готовят раствор – 3,8г сухой краски, состоящей из смеси эозина и метиленовой сини, растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Раствор оставляют на несколько дней, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем добавляют 250 мл чистого глицерина и оставляют на 3 – 5 дней часто взбалтывая. Полученный раствор – краска Романовского – Гимза.
Перед употреблением краску оттитровывают в разведениях 1:1, 1:2, 1:3 и т.д., приготовленных на дистиллированной воде в течении 20 – 25 минут.
2. Вариант Б. Применяют окраску азур – эозином.
а) 1 г сухой краски Романовского – Гимза (азур и метиленовая синь) растворяют в одном литре дистиллированной воды.
б) 1 г эозина растворяют в одном литре дистиллированной воды.

Эти два раствора хранят отдельно в темном месте в стеклянных емкостях с притертыми пробками.

Для окрашивания препаратов ex tempore готовят рабочий раствор:
10 мл дистиллированной воды
4 мл раствора эозина
8 мл раствора краски Романовского

Необходимым условием для получения хорошей окраски препаратов является качество воды (рН воды должно быть нейтральным).

источник

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) — сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных — от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий — периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами — β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом — антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У грамотрицательных бактерий присутствует дополнительная структура — внешняя мембрана.

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют — предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий — с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

На фиксированный мазок накладывают небольшие кусочки фильтровальной бумаги и наливают основной краситель — генцианвиолет или метиленовый синий.
Спустя 3-5 минут снимают окрашенную фильтровальную бумагу и заливают мазок раствором Люголя на 1 минуту. При этом препарат темнеет.
Сливают раствор Люголя и обрабатывают мазок чистым этиловым спиртом: капают несколько капель на препарат, спустя 20 секунд сливают. Процедуру повторяют 2-3 раза.
Промывают стекло с исследуемым препаратом дистиллированной водой.
Производят дополнительное окрашивание — докрашивают препарат фуксином. Спустя 1-2 минуты краситель смывают.
После высыхания воды изучают мазок под микроскопом. Грамположительные бактерии будут иметь сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные — розовый или красный.

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными — окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

источник

Микроскопическое исследование нативных и фиксированных окрашенных препаратов мокроты позволяет подробно изучить ее клеточный состав, и известной степени отражающий характер патологического процесса в легких и бронхах, его активность, выявить различные волокнистые и кристаллические образования, также имеющие важное диагностическое значение, и, наконец, ориентировочно оценить состояние микробной флоры дыхательных путей (бактериоскопия).

При микроскопии используют нативные и окрашенные препараты мокроты. Для изучения микробной флоры (бактериоскопии) мазки мокроты обычно окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Граму, а для выявления микобактерий туберкулеза но Цилю-Нильсену.

Из клеточных элементов, которые можно обнаружить в мокроте больных пневмонией, диагностическое значение имеют эпителиальные клетки, альвеолярные макрофаги, лейкоциты и эритроциты.

Эпителиальные клетки. Плоский эпителий из полости рта, носоглотки, голосовых складок и надгортанника диагностического значения не имеет, хотя обнаружение большого количества клеток плоского эпителия, как правило, свидетельствует о низком качестве образца мокроты, доставленного в лабораторию и содержащего значительную примесь слюны.

У больных пневмониями мокрота считается пригодной к исследованию, если при микроскопии с малым увеличением количество эпителиальных клеток не превышает 10 в поле зрения. Большее количество эпителиальных клеток указывает на недопустимое преобладание в биологическом образце содержимого ротоглотки.

Альвеолярные макрофаги, которые в незначительном количестве также можно обнаружить в любой мокроте, представляют собой крупные клетки ретикулогистиоцитарного происхождения с эксцентрически расположенным крупным ядром и обильными включениями в цитоплазме. Эти включения могут состоять из поглощенных макрофагами мельчайших частиц пыли (пылевые клетки), лейкоцитов и т.п. Количество альвеолярных макрофагов увеличивается при воспалительных процессах в легочной паренхиме и дыхательных путях, в том числе при пневмониях.

Клетки цилиндрического мерцательного эпителия выстилают слизистую оболочку гортани, трахеи и бронхов. Они имеют вид удлиненных клеток, расширенных с одного конца, где расположено ядро и реснички. Клетки цилиндрического мерцательного эпителия обнаруживаются в любой мокроте, однако их увеличение свидетельствует о повреждении слизистой бронхов и трахеи (острый и хронический бронхит, бронхоэктазы, трахеит, ларингит).

Лейкоциты в небольшом количестве (2-5 в поле зрения) обнаруживаются в любой мокроте. При воспалении ткани легкого или слизистой бронхов и трахеи, особенно при нагноительных процессах (гангрена, абсцесс легкого, бронхоэктазы) их количество значительно увеличивается.

При окраске препаратов мокроты по Романовскому-Гимзе удается дифференцировать отдельные лейкоциты, что имеет иногда важное диагностическое значение. Так, при выраженном воспалении легочной ткани или слизистой бронхов увеличивается как общее число нейтрофильных лейкоцитов, так и количество их дегенеративных форм с фрагментацией ядер и разрушением цитоплазмы.

Увеличение числа дегенеративных форм лейкоцитов является важнейшим признаком активности воспалительного процесса и более тяжелого течения заболевания.

Эритроциты. Единичные эритроциты можно обнаружить практически и любой мокроте. Значительное их увеличение наблюдается при нарушении сосудистой проницаемости у больных пневмониями, при разрушении ткани легкого или бронхов, застое в малом круге кровообращения, инфаркте легкого и т.д. В большом количестве эритроциты в мокроте обнаруживаются при кровохарканье любого генеза.

Эластические волокна. Следует упомянуть также еще об одном элементе мокроты пластических волокнах, которые появляются в мокроте при деструкции легочной ткани (абсцесс легкого, туберкулез, распадающийся рак легкого и др.). Эластические волокна представлены в мокроте в виде тонких двухконтурных, извитых нитей с дихотомическим делением на концах. Появление эластических волокон в мокроте у больных с тяжелым течением пневмонии свидетельствует о возникновении одного из осложнений заболевания — абсцедировании ткани легкого. В ряде случаев при формировании абсцесса легкого эластические волокна в мокроте можно обнаружить даже несколько раньше, чем соответствующие рентгенологические изменения.

Нередко при крупозной пневмонии, туберкулезе, актиномикозе, фибринозном бронхите в препаратах мокроты можно обнаружить тонкие волокна фибрина.

Признаками активного воспалительного процесса в легких являются:

характер мокроты (слизисто-гнойная или гнойная);
увеличение количества нейтрофилов в мокроте, в том числе их дегенеративных форм;
увеличение количества альвеолярных макрофагов (от единичных скоплений из нескольких клеток в поле зрения и больше);

Появление в мокроте эластических волокон свидетельствует о деструкции легочной ткани и формировании абсцесса легкого.

Окончательные выводы о наличии и степени активности воспаления и деструкции легочной ткани формируются только при их сопоставлении с клинической картиной заболевания и результатами других лабораторных и инструментальных методов исследования.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]

Микроскопия мазков мокроты, окрашенных по Граму, и изучение микробной флоры (бактериоскопия) у части больных пневмонией позволяет ориентировочно установить наиболее вероятного возбудителя легочной инфекции. Этот простой метод экспресс-диагностики возбудителя недостаточно точен и должен использоваться только в комплексе с другими (микробиологическими, иммунологическими) методами исследования мокроты. Иммерсионная микроскопия окрашенных мазков мокроты иногда бывает весьма полезной для экстренного подбора и назначения адекватной антибактериальной терапии. Правда, следует иметь в виду возможность обсеменения бронхиального содержимого микрофлорой верхних дыхательных путей и ротовой полости, особенно при неправильном сборе мокроты.

Поэтому мокроту считают пригодной для дальнейшего исследования (бактериоскопии и микробиологического исследования) только в том случае, если она удовлетворяет следующим условиям:

при окраске по Грамму в мокроте выявляется большое количество нейтрофилов (более 25 в поле зрения при малом увеличении микроскопа);
количество эпителиальных клеток, больше характерных для содержимого ротоглотки, не превышает 10;
в препарате имеется преобладание микроорганизмов одного морфологического типа.

При окраске по Граму в мазке мокроты иногда можно достаточно хорошо идентифицировать грамположительные пневмококки, стрептококки, стафилококки и группу грамотрицательных бактерий — клебсиеллу, палочку Пфейффера, кишечную палочку и др. При этом грамположительные бактерии приобретают синий цвет, а грамотрицательные — красный.

Бактериальные возбудители пневмоний

Пневмококки Streptococcus pneumoniae.
Стрептококки Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans.
Стафилококки: Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus.

Клебсиеллы (Klebsiella pneumoniae)
Гемофильная палочка (Пфейфера) Haemophilius influenzae
Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa)
Легионелпа
Кишечная палочка (Escherichia coli)

Предварительная бактериоскопия мокроты является наиболее простым способом верификации возбудителя пневмонии и имеет определенное значение для выбора оптимальной терапии антибиотиками. Например, при обнаружении в мазках, окрашенных по Грамму, громположительных диплококков (пневмококков) или стафилококков вместо антибиотиков широкого спектра действия, увеличивающих риск селекции и распространения аитибиотикорезистентных микроорганизмов, возможно назначение целенаправленной терапии, активной в отношении пневмококков или стафилококков. В других случаях выявление преобладающей в мазках грамотрицательной флоры может указывать па то, что возбудителем пневмонии являются грамотрицательные энтеробактерии (клебсиелла, кишечная палочка и т.п.), что требует назначения соответствующей целенаправленной терапии.

Правда, ориентировочное заключение о вероятном возбудителе легочной инфекции при микроскопии можно сделать только па основании значительного увеличения бактерий в мокроте, в концентрации 10 6 — 10 7 м.к./мл и больше (Л.Л. Вишнякова). Низкие концентрации микроорганизмов ( 3 м.к./мл) характерны для сопутствующей микрофлоры. Если концентрация микробных тел колеблется от 10 4 до 10 6 м.к./мл, это не исключает этиологическую роль данного микроорганизма в возникновении легочной инфекции, но и не доказывает ее.

Следует также помнить, что «атипичные» внутриклеточные возбудители (микоплазма, легионелла, хламидии, риккетсии) не окрашиваются по Грамму. В этих случаях подозрение на наличие «атипичной» инфекции может возникнуть, если в мазках мокроты обнаруживают диссоциацию между большим количеством нейтрофилов и чрезвычайно малым количеством микробных клеток.

К сожалению, метод бактериоскопии и целом отличается достаточно низкой чувствительностью и специфичностью. Hе предсказательная ценность даже в отношении хорошо визуализируемых пневмококков едва достигает 50%. Это означает, что в половине случаев метод дает ложноположительные результаты. Это связано с несколькими причинами, одной из которых является то, что около 1/3 больных до госпитализации уже получали антибиотики, что существенно снижает результативность бактериоскопии мокроты. Кроме того, даже в случае положительных результатов исследования, указывающих на достаточно высокую концентрацию в мазке «типичных» бактериальных возбудителей (например, пневмококков), нельзя полностью исключить наличие ко-инфекции «атипичными» внутриклеточными возбудителями (микоплазмой, хламидиями, легионеллой).

Метод бактериоскопии мазков мокроты, окрашенных по Грамму, в отдельных случаях помогает верифицировать возбудителя пневмонии, хотя в целом отличается весьма низкой предсказательной ценностью. «Атипичные» внутриклеточные возбудители (микоплазма, легионелла, хламидии, риккетсии) вообще не верифицируются методом бактериоскопии, так как не окрашиваются по Грамму.

Следует упомянуть о возможности микроскопической диагностики у больных пневмониями грибкового поражения легких. Наиболее актуальным для больных, получающих длительное лечение антибиотиками широкого спектра действия, является обнаружение при микроскопии нативных или окрашенных препаратов мокроты Candida albicans в виде дрожжеподобных клеток и ветвистого мицелия. Они свидетельствуют об изменении микрофлоры трахеобронхиального содержимого, возникающем под влиянием лечения антибиотиками, что требует существенной коррекции терапии.

В некоторых случаях у больных пневмониями возникает необходимость дифференцировать имеющееся поражение легких с туберкулезом. С этой целью используют окраску мазка мокроты по Цилю-Нильсену, что в отдельных случаях позволяет идентифицировать микобактерии туберкулеза, хотя отрицательный результат такого исследования не означает отсутствия у больного туберкулеза. При окраске мокроты по Цилю-Нильсену микобактерии туберкулеза окрашиваются в красный цвет, а все остальные элементы мокроты — в синий. Туберкулезные микобактерии имеют вид топких, прямых или слегка изогнутых палочек различной длины с отдельными утолщениями. Они располагаются в препарате группами или поодиночке. Диагностическое значение имеет обнаружение в препарате даже единичных микобактерий туберкулеза.

Для повышения эффективности микроскопического выявления микобактерий туберкулеза используют ряд дополнительных методов. Наиболее распространенным из них является так называемый метод флотации, при котором гомогенизированную мокроту взбалтывают с толуолом, ксилолом или бензином, капли которых, всплывая, захватывают микобактерии. После отстаивания мокроты верхний слой пипеткой наносят на предметное стекло. Затем препарат фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену. Существуют и другие методы накопления (электрофорез) и микроскопии бактерий туберкулеза (люминесцентная микроскопия).

Микроскопическое исследование (анализ) мокроты позволяет обнаружить слизь, клеточные элементы, волокнистые и кристаллические образования, грибы, бактерии и паразиты.

Альвеолярные макрофаги — клетки ретикулогистиоцитарного происхождения. Большое количество макрофагов в мокроте выявляют при хронических процессах и на стадии разрешения острых процессов в бронхолёгочной системе. Альвеолярные макрофаги, содержащие гемосидерин («клетки сердечных пороков»), выявляют при инфаркте лёгкого, кровоизлиянии, застое в малом кругу кровообращения. Макрофаги с липидными каплями — признак обструктивного процесса в бронхах и бронхиолах.
Ксантомные клетки (жировые макрофаги) обнаруживают при абсцессе, актиномикозе, эхинококкозе лёгких.
Клетки цилиндрического мерцательного эпителия — клетки слизистой оболочки гортани, трахеи и бронхов; их обнаруживают при бронхитах, трахеитах, бронхиальной астме, злокачественных новообразованиях лёгких.
Плоский эпителий обнаруживают при попадании в мокроту слюны, он не имеет диагностического значения.
Лейкоциты в том или ином количестве присутствуют в любой мокроте. Большое количество нейтрофилов выявляют в слизисто-гнойной и гнойной мокроте. Эозинофилами богата мокрота при бронхиальной астме, эозинофильной пневмонии, глистных поражениях лёгких, инфаркте лёгкого. Эозинофилы могут появиться в мокроте при туберкулёзе и раке лёгкого. Лимфоциты в большом количестве обнаруживают при коклюше и, реже, при туберкулёзе.
Эритроциты. Обнаружение единичных эритроцитов в мокроте диагностического значения не имеет. При наличии свежей крови в мокроте определяют неизменённые эритроциты, если же с мокротой отходит кровь, находившаяся в дыхательных путях в течение длительного времени, обнаруживают выщелоченные эритроциты.
Клетки злокачественных опухолей обнаруживают при злокачественных новообразованиях.

Эластические волокна появляются при распаде ткани лёгкого, который сопровождается разрушением эпителиального слоя и освобождением эластических волокон; их обнаруживают при туберкулёзе, абсцессе, эхинококкозе, новообразованиях в лёгких.
Коралловидные волокна выявляют при хронических заболеваниях лёгких, таких как кавернозный туберкулёз.
Обызвествлённые эластические волокна — эластические волокна, пропитанные солями кальция. Обнаружение их в мокроте характерно для распада туберкулёзного петрификата.

Спирали Куршмана образуются при спастическом состоянии бронхов и наличии в них слизи. Во время кашлевого толчка вязкая слизь выбрасывается в просвет более крупного бронха, закручиваясь спиралью. Спирали Куршмана появляются при бронхиальной астме, бронхитах, опухолях лёгких, сдавливающих бронхи.
Кристаллы Шарко-Лейдена — продукты распада эозинофилов. Обычно появляются в мокроте, содержащей эозинофилы; характерны для бронхиальной астмы, аллергических состояний, эозинофильных инфильтратов в лёгких, лёгочной двуустки.
Кристаллы холестерина появляются при абсцессе, эхинококкозе лёгкого, новообразованиях в лёгких.
Кристаллы гематоидина характерны для абсцесса и гангрены лёгкого.
Друзы актиномицета выявляют при актиномикозе лёгких.
Элементы эхинококка появляются при эхинококкозе лёгких.
Пробки Дитриха — комочки желтовато-серого цвета, имеющие неприятный запах. Состоят из детрита, бактерий, жирных кислот, капелек жира. Они характерны для абсцесса лёгкого и бронхоэктатической болезни.
Тетрада Эрлиха состоит из четырех элементов: обызвествлённого детрита, обызвествлённых эластических волокон, кристаллов холестерина и микобактерий туберкулёза. Появляется при распаде обызвествлённого первичного туберкулёзного очага.

Мицелий и почкующиеся клетки грибов появляются при грибковых поражениях бронхолёгочной системы.

Пневмоцисты появляются при пневмоцистной пневмонии.

Сферулы грибов выявляют при кокцидиоидомикозе лёгких.

Личинки аскарид выявляют при аскаридозе.

Личинки кишечной угрицы выявляются при стронгилоидозе.

Яйца лёгочной двуустки выявляются при парагонимозе.

Элементы, обнаруживаемые в мокроте при бронхиальной астме. При бронхиальной астме обычно отделяется малое количество слизистой, вязкой мокроты. Макроскопически можно увидеть спирали Куршмана. При микроскопическом исследовании характерно наличие эозинофилов, цилиндрического эпителия, встречаются кристаллы Шарко-Лейдена.

источник

Исследование мокроты предусматривает определение физических свойств мокроты, ее микроскопическое исследование в нативном мазке и бактериологическое исследование в окрашенных препаратах.

Мокроту, получаемую при откашливании утром до приема пищи, собирают в чистую сухую склянку. Перед исследованием больной должен почистить зубы и тщательно прополоскать рот водой.

Мокроту помещают в чашку Петри, рассматривают на светлом и темном фоне, описывают ее свойства. Количество мокроты за сутки при различных патологических процессах может быть различно: так например, при бронхите — скудное (5-10 мл), при абсцессе легкого, бронхоэктазах — большое количество (до 200—300 мл).

Деление на слои наблюдается в случаях опорожнения больших полостей в легком, например, абсцесса легкого. В этом случае мокрота образует 3 слоя: нижний слой состоит из детрита, гноя, верхний слой — жидкий, на поверхности его иногда имеется третий — пенистый слой. Такую мокроту называют трехслойной.

Характер: характер мокроты определяет содержание слизи, гноя, крови, серозной жидкости, фибрина. Характер ее может быть слизистый, слизисто-гиойный, слизисто-гнойно-кровянистый и т.п.

Цвет: зависит от характера мокроты, от выдыхаемых частиц, которые могут окрашивать мокроту. Так например, желтоватый, зеленоватый цвет зависит от наличия гноя, «ржавая» мокрота -от распада эритроцитов, встречается при крупозной пневмонии. Прожилки крови в мокроте или красная мокрота может быть при примеси крови (туберкулез, бронхоэктазы). Серый и черный цвет придает мокроте уголь.

Консистенция: зависит от состава мокроты, жидкая — в основном от наличия серозной жидкости, клейкая — при наличии слизи, вязкая — фибрина.

Запах: свежевыделенная мокрота обычно без запаха. Неприятный запах свежевыделенной мокроты обычно появляется при абсцессе легкого, при гангрене легкого — гнилостный.

Нативные препараты готовят, выбирая материал из разных мecт мокроты, берут также для исследования все частицы, выделяющиеся окраской, формой, плотностью.

Отбор материала производят металлическими палочками, помещают его на предметное стекло и покрывают покровным. Материал не должен выходить за покровное стекло.

Лейкоциты: всегда содержатся в мокроте, количество их зависит от характера мокроты.

Эозинофилы: распознаются в нативном препарате по более темной окраске и наличию в цитоплазме четкой, одинаковой, преломляющей свет зернистости. Часто располагаются в виде больших скоплений. Эозинофилы встречаются при бронхиальной астме, других аллергических состояниях, гельминтозе, эхинококке легкого, новообразованиях, эозинофильном инфильтрате.

Эритроциты: имеют вид дисков желтого цвета. Единичные эритроциты могут встречаться в любой мокроте, в большом количестве — в мокроте, содержащей примесь крови: новообразованиях легкого, туберкулезе, инфаркте легкого.

Клетки плоского эпителия: попадают в мокроту из полости рта, носоглотки, большого диагностического значения не тлеют.

Цилиндрический мерцательный эпителий: выстилает слизистую оболочку гортани, трахеи, бронхов. В большом количестве обнаруживается при острых катарах верхних дыхательных путей, бронхитах, бронхиальной астме, новообразованиях легкого, пневмосклерозе и др.

Альвеолярные макрофаги: большие клетки различной величины, чаще круглой формы, с наличием в цитоплазме включений черно-бурого цвета. Встречаются чаще в слизистой мокроте с небольшим количеством гноя. Обнаруживаются при различных патологических процессах: пневмонии, бронхитах, профессиональных заболеваниях легких и др. Альвеолярные макрофаги, содержащие гемосидерин, старое название — «клетки сердечных пороков», имеют в цитоплазме золотисто-желтые включения. Для их выявления применяют реакцию на берлинскую лазурь. Ход реакции: кусочек мокроты помещают на предметное стекло, прибавляют 2 капли 5% раствора соляной КИОЛОТЫ и 1-2 капли 5% раствора желтой кровяной соли. Перемешивают стеклянной палочной и по-крывают покровным стеклом. Гемосидерин, лежащий внутриклеточно, окрашивается в голубой или синий цвет. Эти клетки обнаруживаются в мокроте при застойных явлениях в легких, инфарктах легкого.

Жирное перерождение клетки (липофаги, жировые шары): чаще округлые, цитоплазма их заполнена жиром. При прибавлении к препарату судана Ш капли окрашиваются в оранжевый цвет. Группы таких клеток встречаются при новообразованиях легкого, актиномикозе, туберкулезе и др.

Эластические волокна: в мокроте имеют вид извзитых блестящих волокон. Как правило располагаются на фоне лейкоцитов и детрита. Наличие их указывает на распад ткани легкого. Обнаруживаются при абсцессе, туберкулезе, новообразованиях легкого.

Коралловые волокна: Грубые ветвящиеся образования с бугристыми утолщениями вследствие отложения на волокнах жирных кислот и мыл. Их обнаруживают в мокроте при кавернозном туберкулезе.

Обызвествленные эластические волокна — грубые, пропитанные солями извести палочковидные образования. Обнаруживают при распаде петрифицированного очага, абсцессе легкого, новообразованиях, Элемента распада петрифицированнго очага носят название тетрады Эрлиха: I) обызвествленные эластические волокна; 2)аморфные соли извести; 3) кристаллы холестерина; 4) микобактерии туберкулеза.

Спирали Куршмана_- уплотнены, закрученные в спираль слизевые образования. Центральная часть резко преломляет свет и выглядит спиралью, по периферии свободно лежащая слизь образует мантию. Спирали Куршмана образуются при бронхиальной астме.

Кристаллические образования: кристаллы Шарко-Лейдена, вытянутые блестящие ромбы, можно обнаружить в желтоватых кусочках мокроты, содержащих большое количество эозинофилов. Их образование связывают с распадом эозинофилов,

Кристаллы гематоидина: имеют форму ромбов и иголок золотистого цвета. Образуются при распаде гемоглобина при кровоизлияниях, распаде новообразований. В препарате мокроты видны обычно на фоне детирита, эластических волокон.

Кристаллы холестерина: бесцветные четырехугольники с обломанными ступенеобразным углом, обнаруживаются при распаде жирно перерожденных клеток, в полостях. Встречаются при туберкулезе, абсцессе легкого, новообразованиях.

Пробки Дитриха: мелкие желтовато-серые зернышки с неприятным запахом, содержатся в гнойной мокроте. Микроскопически представляют собой детрит, бактерии, кристаллы жирных кислот в виде игл и капелек жира. Образуются при застое мокроты в полостях при абсцессе легкого, бронхоэктазах.

Исследование на туберкулезные микобактерии: Препарат готовят из гнойных частиц мокроты, высушивают

на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Окрашивают по

Методика окрашивания: Реактивы:

2) 2% спиртовой раствор соляной кислоты,

3) водный раствор 0,5% метиленового синего.

1. На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина.

2. Препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (так 3 раза).

3. С остывшего стекла снимают фильтровальную бумагу. Обесцвечивают мазок в солянокислом спирте до полного отхождения краски.

5. Докрашивают препарат метиленовнм синим 20-30 секунд.

6. Промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. Туберкулезные микобактерии окрашиваются в красный цвет,

все остальные элементы мокроты и бактерии — в синий. Туберкулезные микобактерии имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек с утолщениями на концах или посередине.

При окраске по Цилю-Нильсону в красный цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. Дифференциальная диагностика туберкулезных микробактерий и кислотоупорных сапрофитов ведется методами посева и заражения животных.

Исследование мокроты может проводиться также методом флотации. Метод Потенжера: ход исследования:

1. Свежевыделенную мокроту (не более 10-15 мл) помещают в узкогорлую бутылку, приливают двойное количество едкой щелочи, смесь энергично встряхивают (10-15 мин).

2. Приливают I мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 100 мл дистиллированной вода для разжижения мокроты. Снова встряхивают 10-15 мин.

3. Доливают дистиллированную воду до горлышка бутылки и оставляют стоять на 10-50 мин.

4. Образовавшийся верхний слой (беловатый) снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предварительно нагретые до 60°. Каждую последующую каплю наносят на подсохшую предыдущую.

5. Препарат фиксируют и красят по Цилю-Нильсону.

Исследование на другие бактерии:

Другие бактерии, встречающиеся в мокроте, например, стрептококки, стафилококки, диплобациллы и др. могут быть распознаны только методом посева. Бактериологическое исследование препарата в этих случаях имеет только ориентировочное значение. Препараты красят метиленовым синим, фуксином или по граму. Окраска по Граму: Реактивы: I) карболовый раствор генцианвиолета,

4) 40% раствор карболового фуксина.

1. На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги, наливают раствор генцианвиолета, красят 1-2 мин.

2. Бумажку снимают и препарат заливают раствором Люголя на 2 минуты.

3. Раствор Люголя сливают и прополаскивают препарат в спирте до серого цвета.

4. Промывают водой и окрашивают 10-15 секунд раствором фуксина.

5. МОКРОТА ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ПАТОЛОГИИ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ
Нозологическая форма	Колич. Макрос. Хар-р изучен.	Микроскопия
I
Бронхит	Скудное,за-	Цилиндрический эпи-
тем боль-	телий ,лейкоциты,иног-
шое. Слизи —	да эритроциты,много
стая или	флоры,макрофаги .
слизисто-
гнойная
Бронхопневмо-	Большое	Цилиндрический эпите-
ния	количество	лий, альвеолярный эпи-
слизистой	телий, лейкоциты,
-или слизис-	пневмококки
ТО-ГНОЙНОЙ
Крупозная	Скудное,за-	Свертки	Макрофаги, лейкоциты,
пневмония	тем обиль-	фибрина,	эритроциты, кристал-
ное к-во	изменен-	лы гематоидина,
ржавой мо-	ная	гемосидерин, пневмо-
кроты	кровь	кокки
Бронхиальная	Скудное,	Спирали	Цилиндрический эпи-
астма	слизистая	Куршмана	телий, кристаллы
Шарко-Лейдена,
эозинофилы
Бронхоэктати-	Обильное	Пробки	Лейкоциты сплошь,
ческая бо-	(утром-	Дитриха	кристаллы жирных
лезнь	полным	кислот,гематоидина,
ртом)	холестерина, обильная разнообразная флора

Приложение: посуда и оборудование: Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Смотрят с иммерсией.

2. Инструменты для отбора мокроты: металлические палочки с расплющенными концами, препаровальные иглы и др.

7. Дезинфицирующая жидкость.

Абсцесс легкого Обильное, гнойная, со зловонным запахом Обрывки ткани легкого. Сплошь лейкоциты, эластические волокна, кристаллы жирных кислот, гематоидина, хо-лестерша, разнообразная обильная флора

Различное, рисовидные тельца слизисто-гнойная, иногда с примесью крови Микобактерии туберкулёза, эластические волокна, различные кристаллы

Различное, слизисто-кровянистое Обрывки ткани. Атипические клетки.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Да какие ж вы математики, если запаролиться нормально не можете. 8392 — | 7310 — или читать все.

193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Бактериоскопическое исследование мокроты

КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ОБРАЗОВАНИЯ МОКРОТЫ

Кристаллы Шарко-Лейдена – блестящие бесцветные ромбы различной величины, напоминающие стрелки компаса. Образуются из распадающихся эозинофилов. Часто свежевыделенная мокрота не содержит кристаллов Шарко-Лейдена, они образуются в ней через 24 часа. Присутствие этих кристаллов в мокроте характерно для бронхиальной астмы, встречается также при глистных поражениях легких.

Кристаллы гематоидинаимеют вид ромбов или иголок золотисто-желтого цвета. Являются продуктом распада гемоглобина. Образуются в глубине гематом, в некротизированной ткани. В препаратах мокроты располагаются на фоне детрита, эластических волокон.

Кристаллы холестерина — бесцветные четырехугольные пластинки с обломанным углом, образуются при распаде жироперерожденных клеток, задержке мокроты в полостях. Встречаются при кавернозном туберкулезе, опухолях и абсцессах легких.

Для исследования морфологии клеточных элементов мокроты используют обычные гематологические методы окраски – по Романовскому, Паппенгейму и др. В окрашенных препаратах дифференцируются нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты, базофилы, альвеолярные макрофаги, эпителиальные клетки, клетки злокачественных опухолей.

Этот этап исследования мокроты в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети включает в себя микроскопию препаратов, окрашенных:

— по Цилю-Нильсену для выявления микобактерий туберкулеза (кислотоустойчивых микобактерий, КУМ);

— по Грамму для изучения микрофлоры мокроты (выявления стрептококков, стафилококков, пневмококков и др.). Бактериоскопическое исследование окрашенных по Грамму препаратов имеет ориентировочное значение. Правильность выявления этих бактерий должна подтверждаться бактериологическим исследованием (посевом).

Бактериоскопическое исследование мокроты необходимо проводить в соответствии с правилами, изложенными в приложении №10 к приказу Минздрава России от 21.03.2003г. №109. Сбор мокроты для анализа на кислотоустойчивые микобактерии (КУМ) изложен в общих правилах сбора мокроты.

Процедура приготовления мазков для бактериоскопического исследования начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые стекла ГОСТ 9284-75 , отмытые и обезжиренные в спирте или смеси Никифорова (96% этиловый спирт + эфир в соотношении 1:1), без царапин и сколов. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды, промывают в 1% растворе соляной кислоты, а затем в проточной воде и протирают насухо. Для обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически закрытые емкости со смесью Никифорова или с 96% этиловым спиртом не менее чем на 1 сутки. Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно протираются насухо.

Техника приготовления мазков из мокроты изложена выше.

При приготовлении мазка необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат. Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании. Через правильно приготовленный неокрашенный мазок можно читать газетный шрифт, расположенный позади стекла на расстоянии 5-10см.

Фиксация мазков.Приготовленные мазки помещают на 15-30 минут на лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, и высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу или при его отсутствии — на столе, в специально отведенном месте. Ни в коем случае не допускается фиксация сырых мазков над пламенем горелки. Стекла с высохшими мазками пинцетом или специальными щипцами берут за конец, на который нанесена маркировка, и трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания мазка в пламени не должна превышать 3-5 секунд. Затем стекла помещают на специальную подставку («рельсы») для окрашивания.

В плане охраны труда оптимальным является метод Хайна, согласно которому предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при 37°C, а затем температуру повышают до 105°C и через 10 минут шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу и гибель микобактерий, как находящихся в материале мазка, так и случайно попавших на поднос. Фиксирующая температура не должна превышать 105°С, чтобы не изменить свойства микобактерий.

Высушенные и фиксированные мазки должны сразу же окрашиваться. Нефиксированные мазки ни в коем случае не должны оставляться открытыми на ночь, так как это увеличивает опасность распространения инфекции и возможность переноса ее насекомыми. Фильтровальная бумага, которой был выстлан лоток (поднос), по окончании фиксации каждой серии мазков подлежит обязательному сжиганию или автоклавированию, а лоток обжигается спиртом. Лотки ежедневно выстилаются чистой бумагой.

Дата добавления: 2014-11-29 ; Просмотров: 2528 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

В продолжение микробиологической темы — окраска бактериальных клеток по методике Грама. Текст дублирует комментарии в видео (вдруг у кого-то сию минуту нет возможности проиграть ролик, а приобщиться к образованию хочется).

В микробиологии широко применяются различные методы окраски бактерий. Конечно, можно производить наблюдение и без этих сложных манипуляций, но тогда при микроскопировании вы почти ничего не увидите, ведь коэффициент светопреломления бактерий близок к коэффициенту светопреломления жидкости, в которой они живут. Для того, чтобы бактерии или какие-то их внутренние или внешние структуры чётко выделялись на фоне, применяют различные красители. Сегодня мы рассмотрим методику окраски по Граму, разработанную в 1884 году датским врачом Гансом Кристианом Грамом.

Исполнение методики начинается с приготовления фиксированного мазка культуры микроорганизмов. На предметное стекло наносится капля физиологического раствора, в которую микробиологической петлёй, прожжённой в пламени горелки, вносятся изучаемые бактерии. Это может быть как сиюминутный соскоб или мазок, так и заранее выращенная колония. Все этапы должны производиться в условиях асептики, желательно в зоне пламени горелки. Демонстрируемый способ выполнения методики призван лишь отразить последовательность внесения необходимых для окраски веществ и разъяснить роль каждого этапа.

Суть методики в визуальном разделении бактерий на две группы – грамположительные и грамотрицательные. Первые в итоге дифференциации выглядят под микроскопом как окрашенные в синий или фиолетовый цвет, а вторые – в розовый. Основная разница между ними в том, что грамотрицательные бактерии хуже воспринимают краситель из-за более сложного строения оболочки. В частности, у них имеется дополнительная мембрана поверх клеточной стенки, препятствующая проникновению ненужных веществ. При этом пептидогликановый слой у них тоньше, чем у грамположительных бактерий. Именно эти особенности позволяют им проявлять патогенность. В медицинской микробиологии почти не изучаются грамположительные бактерии, поскольку очень немногие из них способны вызывать болезни.

Нанесённый на стекло мазок высушивается на воздухе или высоко над пламенем горелки, чтобы не допустить закипания и денатурации белка, а затем фиксируется путём пронесения через пламя в течение короткого времени. Таким образом микроорганизмы погибают и надёжно приклеиваются к стеклу.

Теперь наступает время внесения красителя. Сперва происходит окраска генцианвиолетом. Это основной краситель трифенилметанового ряда: смесь пента- и гексаметилпараозанилинов с небольшим количеством декстрина и фуксина. Он используется в медицине не только как краситель, но и как антисептическое средство. Противомикробные свойства объясняются высокой проницаемостью сквозь бактериальные оболочки и воздействием на окислительно-восстановительные процессы.

Окраска длится 1-2 минуты, после чего генцианвиолет сливают и заливают образцы раствором Люголя. Это вещество, думаю, хорошо знакомо всем – им обрабатывают горло при ангине. Раствор Люголя – это соединение йода с йодидом калия, что придаёт ему хорошую водорастворимость. Соединяясь с кусочками генцианвиолета, который проник в клеточные стенки бактерий, йод образует прочное соединение сине-фиолетового цвета. Реакция тоже длится 1-2 минуты.

Теперь пришло время дифференциации, то есть разделения грамположительных и грамотрицательных бактерий. Для этого стекло с мазком несколько раз погружают в сосуд с 96%-ным этиловым спиртом до тех пор, пока стекающие капли не сравняются по цвету со спиртом в стакане. При этой процедуре сине-фиолетовый комплекс вымывается из стенок грамотрицательных бактерий, оставаясь только в стенках грамположительных.

Для того, чтобы грамотрицательные бактерии не казались бесцветными, мазок промывается водой и дополнительно окрашивается водным раствором фуксина в течение тех же магических 1-2 минут. Поскольку в стенке грамположительных бактерий уже есть краситель, они фуксином не окрашиваются. А грамотрицательные бактерии приобретают розовый цвет. Мазок окончательно промывается водой, высушивается и препарат готов к микроскопированию.

источник

Для микроскопического исследования мокроты прежде всего готовят неокрашенные (нативные) препараты мокроты. Полноценность исследования зависит от правильного приготов¬ления и количества просмотренных препаратов. Материал для исследования выбирают из разных мест и переносят металлической иглой на предметное стекло, затем покрывают покровным стеклом так, чтобы мокрота не выступала за его края.
Препараты должны быть тонкими, элементы в них должны располагаться однослойно. Микроскопию проводят сначала при малом увеличении микроскопа (объектив 8Х, окуляр 10Х), просмотр с малым увеличением дает представление о качестве выбранного материала, позволяет обнаружить скопление клеток, кристаллических образований, найти эластические волокна, спирали Куршмана, элементы новообразования. Дальнейшее исследование производится при большом увеличении микроскопа (объектив 40Х, окуляр 10Х).
При этом в мокроте можно обнаружить в большем или меньшем количестве лейкоциты и среди них по более темной окраске и наличию в цитоплазме обильной, четкой, преломляющей свет зернистости различить эозинофилы, наличие которых характерно для бронхиальной астмы и других аллергических состояний. Эритроциты в мокроте имеют вид желтоватых дисков. Единичные эритроциты встречаются в каждом виде мокроты, большое же их количество характерно для кровянистой мокроты и встречается при инфаркте легкого, легочных кровотечениях, застое в малом круге кровообращения.

В мокроте всегда можно обнаружить эпителий. Плоский эпителий попадает в мокроту из полости рта и носоглотки. Большое число клеток говорит о недостаточно хорошем туалете полости рта перед взятием мокроты для исследования.
Обнаружение в мокроте цилиндрического мерцательного эпителия, выстилающего слизистую оболочку гортани, трахеи и бронхов, свидетельствует о поражении соответствующих отделов. Клетки имеют удлиненную форму, расширение с одного конца, где расположено округлое ядро, и мерцательные реснички. Располагаются эти клетки группами, и в свежевыделенной мокроте можно наблюдать активное движение ресничек. При воспалительных процессах (бронхиты, пневмонии, профессиональные заболевания легких) в мокроте встречаются альвеолярные макрофаги — клетки гистиоцитарной системы. Это крупные клетки округлой формы с наличием в цитоплазме включений. Если альвеолярные макрофаги содержат гемосидерин, то их называют сидерофагами или образно «клетками сердечных пороков», так как они могут появиться при застое крови в легких, при декомпенсированных пороках сердца. С достоверностью выявить эти клетки можно реакцией обра¬зования берлинской лазури.

Бактериоскопия.

Этот этап исследования мокроты включает в себя микроскопию препаратов, окрашенных по Цилю—Нильсену, для выявления микобактерий туберкулеза и препаратов, окрашенных по Граму, для изучения микрофлоры мокроты. Иногда для выявления микобактерий туберкулеза прибегают к обогащению методом флотации. Препараты мокроты для бактериоскопического исследования, приготовленные на предметном стекле, высушивают, фиксируют над пламенем горелки и затем окрашивают.

Окраска по Цилю—Нильсену.

Реактивы:
Карболовый фуксин: 1 г основного фуксина растворяют в 10мл этилового спирта, раствор выливают в 100мл 5% раствора карболовой кислоты.
3% солянокислого спирта: 3 мл НСl и 97 мл этилового спирта
Водный 0,5% раствор метиленового синего

На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина, затем препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (3 раза). После остывания препарата сбрасывают фильтровальную бумагу и опускают его в солянокислый спирт для обесцвечивания. Обесцвечивают до полного удаления краски, промывают водой и докрашивают метиленовым синим 20—30с. Снова промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой.
Туберкулезные микобактерий окрашиваются в красный цвет, все остальные элементы мокроты и бактерии — в синий. Туберкулезные микобактерий имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке.
При окраске по Цилю—Нильсену в красный-цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. Дифференциальная диагностика туберкулезных микобактерий и кислотоупорных сапрофитов ведется бактериологическими методами исследования

При исследовании следует избегать:
приготовления толстых мазков мокроты;
фиксации плохо высушенных мазков;
недостаточной фиксации;
обугливания препарата при длительной фиксации.

Если микобактерий выделяется мало, то в обычных мазках их не находят и прибегают к методу накопления.

Метод флотации (всплывание) по Поттенджеру.

Свежевыделенную мокроту (не более 10—-15 мл) помещают в узкогорлую бутылку, приливают двойное количество 0,5% раствора едкой щелочи,-смесь энергично встряхивают 10—15 мин. Затем добавляют 1 мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 30 мл дистиллированной воды для разжижения мокроты и снова встряхивают 10— 15 мин. Доливают дистиллированную воду в таком количестве, чтобы уровень жидкости поднялся до горлышка бутылки. Оставляют на 1 — 2 ч для отстаивания. Образовавшийся верхний беловатый слой снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предварительно подогретые до 60 °С (стекла для подогревания можно положить на металлический подносик и покрыть им водяную баню). Каждую последующую каплю наносят на предыдущую подсушенную. Препарат фиксируют и красят по Цилю—Нильсену.
Наиболее достоверные результаты в обнаружении микобактерий туберкулеза дают бактериологические методы исследования. Другие бактерии, встречающиеся в мокроте, например стрептококки, стафилококки, диплобациллы, палочки Фридлендера и пр., могут быть распознаны только методом посева. Бактериоскопическое исследование препарата в этих случаях имеет только ориентировочное значение. Препараты красят метиленовым синим, фуксином или по Граму.

Окраска по Граму.

Реактивы:
Карболовый раствор генцианового фиолетового: 1 г генцианового фиолетового растворяют в 10 мл 96 % спирта,, раствор выливают в 100 мл 1 — 2 % карболовой кислоты, взбалтывают
Ра¬створ Люголя: 1 г йода, 2 г йодида калия и 300 мл дистиллированной воды; йод и йодид калия расстворяют сначала в 5—8 мл воды, а затем: приливают остальную воду
96 % спирт или сырец
10 % раствор карболового фуксина: 10 мл карболового фуксина и 90 мл дистиллированной воды

На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианового фиолетового. Красят 11/2—2 мин. Бумажку сбрасывают и заливают препарат раствором Люголя на 2 мин, а потом прополаскивают препарат в спирту до сероватого цвета. Промывают водой и окрашивают 10% раствором карболового фуксина 10—15 с. После этого препарат опять промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионным объективом.

источник