Окраска мокроты азур эозином

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Предметные и покровные стекла.
2. Чашки Петри.
3. Зубоврачебные шпатель и игла.
4. Черная и белая бумага.
5. Микроскоп.
6. Газовая или спиртовая горелка.
7. Смесь Никифорова.
8. Краска Романовского.
9. Едкий натр.
10. Эозин.
11. Желтая кровяная соль.
12. Концентрированная соляная кислота.
13. Метиленовая синька.
14. Вода.
15. Спички.

Мокроту, помещенную в чашку Петри, распластывают с помощью шпателя и иглы до получения полупрозрачного слоя (шпатель и иглу захватывают правой и левой рукой в виде писчего пера); это делают очень осторожно, чтобы не разрушить имеющиеся в мокроте образования. Полупрозрачный слой мокроты изучают с целью выявления в нем линейных и округлых частиц и образований, клочков, отличающихся по цвету и консистенции. Для этого чашку Петри с мокротой располагают попеременно на белом и черном фоне. Найденные образования выделяют из основной массы (слизи, гноя, крови) режущими движениями инструментов, стараясь не повредить выделенные частицы. Полноценным приготовленный препарат будет лишь в том случае, если будут последовательно отобраны все интересующие исследователя частицы и образования. Отобранный материал помещают на предметное стекло. При этом более плотные по консистенции частицы помещают ближе к центру намечаемого препарата, а менее плотные, так же как и слизисто-гнойные, гнойно-слизистые, кровянисто окрашенные образования, — по периферии. Материал покрывают стеклом. Обычно на одном предметом стекле готовят два препарата, что обеспечивает максимальный просмотр отобранного материала. В правильно приготовленных препаратах мокрота не выходит за пределы покровного стекла.

Если мокрота вязкой или тягучей консистенции, то на покровное стекло слегка надавливают, чтобы равномернее распределить материал. Препараты, предназначенные для микроскопического исследования, изучают вначале под малым, а затем под большим увеличением микроскопа при опущенном конденсоре.

Важно уметь находить различные элементы мокроты не только при большом, но и при малом увеличении.

1. Слизь — волокнистая или сетевидная, вместе с форменными эле¬ментами (лейкоцитами, эритроцитами), сероватого цвета.

2. Эпителий — плоский, круглый (альвеолярные макрофаги), цилиндрический (мерцательный).

Плоский эпителий имеет форму полигональных бесцветных клеток с обильной цитоплазмой и одним ядром.
Эпителий цилиндрический, мерцательный (бронхов) (рис. 51, 3) представляет собой продолговатой формы клетки, один из концов которых сужен, а на другом — тупом — нередко видны реснички; ядро, круглой или овальной формы, расположено эксцентрично в широкой части клетки; цитоплазма содержит мелкую зернистость. Иногда (при бронхиальной астме) эпителий бронхов выявляется в виде железистоподобных образований, которые в свежевыделенной мокроте имеют движущиеся реснички.

Рис. 51. Клеточные элементы в мокроте и эластические волокна: лейкоциты (1), альвеолярные макрофаги (2), эпителий бронхов (3), миелин (4), эластические волокна простые (5), коралловидные (6), обызвествленные (7).

Альвеолярные макрофаги — это круглой формы клетки по размерам в несколько раз больше лейкоцитов, с выраженной зернистостью в цитоплазме, из-за которой в большинстве случаев не видно ядра. Зернистость обычно сероватого цвета. Подвергаясь, жировому перерождению, альвеолярные макрофаги становятся более темными, так как капли жира, накапливающиеся в клетке, сильнее преломляют лучи проходящего через них света.

При наличии угольного пигмента часть зернистости приобретает черный цвет. У курильщиков альвеолярные макрофаги содержат буровато-желтую зернистость. Золотисто-желтая зернистость обусловлена наличием в альвеолярных макрофагах кровяного пигмента, содержащего железо (гемосидерин). С целью обнаружения гемосидерина в мокроте используют химическую реакцию.

С препарата, в котором были обнаружены альвеолярные макрофаги с лимонно-желтой или золотисто-желтой зернистостью, снимают покровное стекло. Мокроту подсушивают на воздухе. На 8-10 минут на препарат наливают реактив (смесь равных объемов 3% раствора соляной кислоты и 5% раствора желтой кровяной соли). Через 8-10 минут реактив сливают. Препарат накрывают покровным стеклом и изучают под большим увеличением.
При наличии гемосидерина альвеолярные макрофаги окрашиваются в синий (голубой) цвет (рис. 52).

Рис. 52. Реакция на гемосидерин в мокроте. 1 — до окраски, 2 — после окраски.

3. Миелин (рис. 51, 4) — различной формы матово-серые образования, которые могут находиться в мокроте внеклеточно, а также внутри альвеолярных макрофагов.

Для отличия миелина от капелек жира используют микрореакцию: к материалу, в котором был обнаружен миелин, осторожно прибавляют одну каплю концентрированной H2SO4; при этом миелин окрашивается в оттенки от фиолетового до красного цвета.

4. Нейтрофилы . Морфологически нейтрофилы напоминают лейкоциты, встречающиеся в моче. В гнойной мокроте происходит разрушение лейкоцитов, поэтому в некоторых местах препарата находят зернистую бесструктурную массу (детрит).

5. Эозинофилы . Имеют ряд отличительных от нейтрофилов признаков. Они несколько больше их по размеру, содержат крупную зернистость, благодаря чему выглядят более темными. Их скопления при малом увеличении имеют желтоватый оттенок. Особенно много эозинофилов содержится в желтоватых рассыпчатых клочках мокроты больных бронхиальной астмой. Иногда среди эозинофилов находят кристаллы Шарко-Лейдена. Для более точного распознавания эозинофилов препарат окрашивают.

Техника окраски эозинофилов. Мокроту распределяют по предметному стеклу. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Теплое стекло помещают на 3 минуты в 0,5% спиртовой раствор эозина, а затем промывают водой и красят в течение нескольких секунд 0,5-1% водным раствором метиленовой синьки. Вновь промывают водой, высушивают и изучают под микроскопом с иммерсией. В эозинофилах выявляют красную зернистость (рис. 53). Окрасить эозинофилы можно также способом Романовского. С этой целью препарат окрашивают точно так же, как мазки крови, но только меньше времени (8-10 минут).

Рис. 53. Эозинофильные лейкоциты в мокроте (масляная иммерсия).

6. Эритроциты — неизмененные выглядят так же, как и в моче. В бурых кровянистых частицах они обычно не обнаруживаются.

7. Жирно-зернистые клетки (рис. 54, 1) — округлой формы, в несколько раз больше лейкоцитов, содержат жировые капельки, сильно преломляющие свет.

8. Клетки злокачественных новообразований (рис. 54, 2) — разных размеров, жиро- и вакуольно-перерожденные. Встречаются отдельно и в виде тесных округлых групп или стержневидных образований, луковиц и пр.

Рис. 54. 1 — жирно-зернистые клетки; 2 — железистоподобная группа из атипического эпителия при железистом раке легкого. Нативный препарат. Увеличение 300х. Микрофотография.

9. Эластические волокна (см. рис. 51, 5, 6, 7):

а) простые эластические волокна — блестящие, тонкие, нежные двуконтурные образования, толщина которых равномерна на всем протяжении. Встречаются скоплениями среди гнойных частиц и в мелких плотноватых клочках, в виде обрывков и единичных волокон среди казеозного распада;

б) коралловидные эластические волокна. Представляют собой простые эластические волокна, покрытые мылами. В связи с этим они лишены блеска, грубее и толще простых эластических волокон;

в) обызвествленные эластические волокна. Они грубее и толще простых эластических волокон, часто фрагментированы, некоторые из них напоминают палочковидные образования. Наиболее часто этот вид волокон располагается среди аморфной массы солей извести и капелек жира, что называют обызвествляющим жировым казеозным распадом. Обызвествляющий жировой казеозный распад, обызвествленные эластические волокна, кристаллы холестерина и микобактерии туберкулеза называют тетрадой Эрлиха.

Элементы тетрады Эрлиха легче обнаружить, если при тщательном макроскопическом исследовании мокроты отобрать беловатые рассыпчатые клочки.

В некоторых случаях для отличия коралловидных волокон от обызвествленных используют микрохимическую реакцию. К исследуемому материалу добавляют 1-2 капли 10-20% раствора NaOH; мыла, покрывающие коралловидные волокна, растворяются, и из-под их покрова освобождаются простые эластические волокна; обызвествленные эластические волокна под влиянием воздействия щелочи не изменяются. При обнаружении в нативном препарате эластических волокон препарат обязательно окрашивают по Цилю-Нильсену. В некоторых случаях прибегают к обработке мокроты с целью обнаружения простых эластических волокон.

Техника обработки мокроты с целью выявления эластических волокон . К небольшому количеству мокроты прибавляют равный объем 10% раствора щелочи; смесь нагревают до растворения, а затем разливают в две центрифужные пробирки и центрифугируют, предварительно добавив по 5-8 капель 1% спиртового раствора эозина. Из осадка готовят препарат и рассматривают под микроскопом. Эластические волокна окрашиваются в оранжево-красный цвет (рис. 55).

Рис. 55. Эластические волокна в мокроте.

10. Фибрин — имеет форму тонких волоконец, расположенных параллельными пучками пли сетевидно.

11. Кристаллы гематоидина — ромбовидные или игольчатые, красновато-оранжевого цвета.

12. Холестерин — бесцветные таблички со ступенчатообразными уступами.

13. Кристаллы Шарко-Лейдена (рис. 56) — ромбовидные, бесцветные кристаллы, напоминающие стрелку магнитного компаса.

Рис. 56. Эозинофилы, кристаллы Шарко-Лейдена, спираль Куршмана.

14. Кристаллы жирных кислот (рис. 57) — имеют вид длинных слегка изогнутых серых игольчатых образований.

15. Спираль Куршмана (см. рис. 56) — слизистое, спиралевидное закругленное образование, имеющее центральную нить и мантию. В некоторых случаях спираль имеет либо центральную нить, либо мантию. Наряду со спиралью часто в одном и том же препарате обнаруживают эозинофилы и кристаллы Шарко-Лейдена.

16. Пробка Дитриха (см. рис. 57) — беловатого или желтовато-сероватого цвета комочки творожистой копсистенции, иногда со зловонным запахом, сходные по форме с зернами чечевицы. Состоят из кристаллов жирных кислот, нейтрального жира, детрита и скоплений бактерий.

Рис. 57. Пробка Дитриха. Иглы жирных кислот; жир нейтральный; детрит. Нативный препарат. Увеличение 280х.

17. Рисовидные тельца — округлые, плотные образования. Содержат скопления коралловидных волокон, продуктов жирового распада, мыла, кристаллы холестерина и большое количество микобактерий туберкулеза.

18. Друзы актином ицетов (рис. 58) — при малом увеличении представляют собой округлые образования с резко очерченными контурами, желтоватого цвета, с аморфной серединой и с более темной окраской по краям; при большом увеличении центр друзы представляет собой скопление лучистого грибка, нити которого на периферии заканчиваются колбовидными вздутиями. При окраске по Граму нити мицелия грибка грамположительны, а колбовидные вздутия грамотрицательны.

Рис. 58. Друзы актиномицетов.

19. Элементы эхинококка (рис. 59) — хитиновая оболочка эхинококкового пузыря (в тонких местах прозрачна и имеет нежную параллельную исчерченность), крючья и сколексы эхинококка.

Рис. 59. Элементы эхинококка. 1 — пленка эхинококкового пузыря, 2 — крючья эхинококка, 3 — сколексы

источник

Достоинства:
Отсутствие противопоказаний и специального оборудования
Спонтанное выделение мокроты
Возможность многократного исследования
Наличие в материале клеток из всех отделов легкого
Высокая результативность при диагностике опухолей центральной локализации, при поражении легкого плоскоклеточным и мелкоклеточным раком
Возможность диагностики опухолей в бессимптомной стадии заболевания

Недостатки и ограничения:
Зависимость результативности от квалификации лаборанта
Большая трудоемкость приготовления препарата
Длительное исследование препарата
Низкая результативность исследовния при периферической локализации легочного поражения
Низкая результативность при диагностике доброкачественных новообразований
Отсутствие информации о локализации и распространенности поражения
Необходимость исключения локализации опухоли в соседнем органе (полости рта, глотке, гортани, пищеводе)

Суточное количество мокроты зависит от заболевания
-при остром бронхите, бронхиальной астме, начальной стадии пневмонии — 1-2 мл\сутки
-при хроническом бронхите, аденоматозе, туберкулезе легких — 25-100 мл\сутки
-при бронхоэктатической болезни, актиномикозе, некоторых глистных инвазиях — до 2 л\сутки
-при вскрытии абсцесса легкого — до 4 л

Гнилостный или гангренозный запах — характерен для гнилостного бронхита, гангрены легкого, абсцесса легкого, злокачественных новообразований легкого с некротическими процессами.

Реакция мокроты, как правило, имеет щелочной характер. Кислой она становится при разложении мокроты (длительное стояние) и от примеси желудочного сока (что помогает дифференцировать кровохарканье от кровавой рвоты).

Слизистая мокрота бесцветная и прозрачная, либо имеет белесоватый цвет.
Гнойная и гнойно-слизистая мокрота — серого, желтоватого, зеленоватого цвета
Кровянистая мокрота — цвет крови (при легочном кровотечении)
Ржавый цвет — типичен для крупозной пневмонии
Буроватый цвет — типичен для парагонимоза
Коричневый цвет — типичен при туберкулезе, гангрене, злокачественных новообразованиях легкого
Малиновый цвет — типичен при злокачественных новообразованиях
Грязно-зеленая или зеленовато-желтая — при желтухе

Слизистая мокрота — мокрота бесцветна, вязкая, с небольшим количеством клеточных элементов
-хроническое воспаление верхних дыхательных путей
-у курильщиков
-при астматическом приступе
-коклюш
-острый бронхит
-инфильтративный и очаговый туберкулез (иногда)
-неспецифические воспалительные процессы легких (скудное количество слизистой, с мелкими крупинками, «рвущейся» мокроты)

Слизисто-гнойная мокрота — однородная мутная и вязкая масса
-заболевания бронхов и паренхимы легких

Гнойно-слизистая мокрота — неоднородная, состоящая из слизи с включениями комочков гноя округлой формы
-заболевания верхних дыхательных путей
-рак легкого (с беловато-серыми или кровянистыми прожилками)

Гнойная мокрота — полужидкая или жидкая
-абсцесс легкого (большое количество гнойной зеленоватой мокроты с гнилостным запахом)
-вскрытие эмпиемы плевры в просвет бронха (чисто гнойная)
-фиброзно-кавернозная форма туберкулеза

Кровяная мокрота
-туберкулез легких
-актиномикоз
-гангрена легкого
-бронхоэктазы
-новообразования
-сифилис
-ранения легкого
Иногда источник кровотечения может иметь нелегочное происхождение (прорыв аневризмы аорты в просвет бронха или трахею, носовое кровотечение, язважелудка\круглая язва)

Слизисто-кровянистая мокрота
-инфаркт легкого в стадии обратного развития
-воспаление верхних дыхательных путей и носоглотки

Слизисто-гнойно-кровянистая мокрота
-туберкулез легких
-тяжелые воспалительные процессы верхних дыхательных путей с застоем
-злокачественные новообразования
-актиномикоз
-парагонимоз (дистоматоз)
-бронхоэктазы

Пенистая мокрота
-аденоматоз легких

Серозная мокрота чаще бесцветная, пенистая, жидкая, невязкая или довольно прозрачная, с большим содержанием белка
-отек легких
-туберкулез легких
-хронический бронхит

Спирали Куршмана в мокроте могут быть представлены довольно крупными (видны в чашке Петри при макроскопии) и малкими образованиями (при образованиив мелких бронхиолах).
Спирали Куршмана характерны для таких заболеваний, как:
-бронхиальная астма
-туберкулез
-злокачественные новообразования легких
-воспалительные процессы со спазмом и обструкцией бронхов

Пробки Дитриха расположены в нижнем гнойном слое трехслойной мокроты, образующейся в полостях при абсцессе легкого и бронхоэктатической болезни.

Микроскопическое исследование мокроты

Препараты окрашиваются азур-эозином
Лейкоциты могут быть как хорошо сохранившиеся, так и на разных стадиях дегенерации
Чем больше в мокрте гноя, тем больше нейтрофилов. При неспецифических воспалительных процессах нейтрофилы в густом по консистенции гное выглядят как бесцветные, мелкозернистые, четко контурированные объемные клетки, в жидкй серозной мокроте нейтрофилы — крупные клетки (в 2,5 раза крупнее эритроцитов) с хорошо определяемыми фрагментированными ядрами.

Препараты окрашиваются азур-эозином

Основные характеристики эозинофилов мокроты при заболеваниях бронхо-легочной системы
-цитоплазматические гранулы с большим количеством щелочного белка и перекисей, обладающих бактерицидной активностью
-в гранулах эозинофилов определяется кислая фосфатаза, акрилсульфатаза, коллагеназа, эластаза, глюкуронидаза, катепсинмиелопероксидаза и др. ферменты с литической активностью
-эозинофилы обладают слабой фагоцитарной активностью и обуславливают внеклеточный цитолиз, участвуя в прогельминтном иммунитете и аллергический реакциях

Присутстие эозинофилов в мокроте свидетельствует о:
-бронхиальная астма
-экзогенный аллергический альвеолит
-эозинофильная пневмония Лефлера
-гранулематоз из клеток Лангерганса
-лекарственный токсикоз
-поражение легких простейшими
-гельминтозы легких
-эозинофильный инфильтрат
-злокачественные новообразования легких

Наличие тканевых базофилов в мокроте и бронхолегочном лаваже может свидетельствовать об экзогенном алергическом альвеолите

Большое количество лимфоцитов появляется при активации иммунологической реактивности организма.
Лимфоциты в большом количестве обнаруживаются в мокроте при:
-туберкулезе легких
-саркоидозе
-экзогенном аллергическом альвеолите
-парагонимозе
-аскаридозе
-амебной пневмонии

Единичные эритроциты могут встречаться в любой мокроте.
При мокроте, окрашенной кровью, можно предположить:
-инфаркт легкого
-застой в малом круге кровообращения
-туберкулез
-парагонимоз
-злокачественные новообразования легких

Клетки цилиндрического реснитчатого эпителия обнаруживаются в мокроте при приготовлении препаратов из белесоватых тяжей и нитей, пленок на фоне слизи, представляющих собой отторгнутые при калевых толчках участки воспаленной гипертрофированной слизистой дыхательных путей.

Тельца креола — образующиеся при движении по бронхам плотные клеточные комплексы округлой или овальной формы с четкими контурами, с ресничками по краям, долго сохраняющие активную подвижность (ошибочно принимаются за простейших, либо за комплексы злокачественных клеток).

Альвеолярные макрофаги

Кониофаги фагоцитируют пыль, сажу, никотин, краску.
Включения в виде желтовато-коричневых, коричневых, черных и цветных гранул различных размеров, иногда заполняющие практически всю клеточную цитоплазму (черного цвета у шахтеров, белого цвета у мукомолов и т.д.)

Липофаги — альвеолярные макрофаги с каплями жира или ксантомные клетки из очагов жировой дегенерации легочной ткани.
Характерны для:
-хронического восплительного процесса в легких
-злокачественных новообразований легких

Содержат в цитоплазме кристаллы гемосидерина золотисто-желтого или коричневого цвета
Характерны для:
-застоя в малом круге кровообращения
-инфаркта легкого
-легочных кровотечений
-идиопатического гемосидероза легких («железное» легкое, синдром Селена-Геллерстедта)

Альвеолярный эпителий в мокроте представлен пневмоцитами 2 типа, обнаруживается при идиопатическом легочном фиброзе (синдром Хаммена-Рича, склерозирующий альвеолит, прогрессирующий интерстициальный фиброз легких) в препаратах из бронхоальвеолярного лаважа.

Появляются в мокроте в результате распада:
-туберкулез легких
-абсцесс легкого
-гангрена
-абсцедирующая пневмония
-актиномикоз
-злокачественные новообразования легких

Неизмененные эластические волокна
-находят в мокроте при выраженном распаде

Коралловидные эластические волокна
-образуются в очаге хронического воспаления, каверне при кавернозном туберклезе

Обызвествленные эластические волокна
-находят в мокроте при распаде первичного туберкулезного очага Гона, при абсцессе и гангрене легкого, злокачественных новообразованиях легких

Тетрада Эрлиха — элементы распада петрифицированного очага:
-обызвествленные эластические волокна
-обызвествленный детрит
-кристаллы холестерина
-микобактерии туберкулеза

Кристалы Шарко-Лейдена образуются в мокроте не сразу (могут образоваться спустя 24-28 часов от сбора мокроты), они характерны для таких заболеваний, как:
-бронхиальная астма (межприступный период)
-глистные инвазии
-крупозная пневмония
-бронхиты

В препаратах мокроты кристаллы гематоидина распложены на фоне детрита, эластических волокон, злокачественных клеток, в очагах некроза легочной ткани либо распада гематом.

Образются при застое мокроты в полостях, в очагах дегенерации легочной ткани, при злокачественных новообразованиях, абсцессе легкого.

Хламидийная пневмония
При цитологическом исследовании мокроты в цитоплазме клеток цилиндрического эпителия либо макрофагов в вакуолях обнаруживают мелкие полиморфные включениятемно-вишневого цвета. В цитоплазме этих клеток определяются пустые вакуоли.

Пневмококковая пневмония
При крупозной пневмонии в ранней стадии заболевания мокрота вязкая, очень скудная, ржавого цвета. При микроскопии определяются эритроциты. макрофаги с гемосидерином, лейкоциты, мелкие фибриновые свертки и пневмококки. В период разрешения воспалительного процесса мокрота приобретает слизисто-гнойный характер без ржавой окраски. При молниеносной форме крупозной пневмонии у пациента возникает кровохарканье.
При очаговой пневмонии характер мокроты слизисто-гнойный.

Госпитальные пневмонии
При пневмонии, возбудителем которой является палочка Фридлендера мокрота слизисто-гнойная, иногда с примесью крови. Внутри плотных темно- или светло-розовых червеобразных образований в бесцветных полисахаридных капсулах видны короткие, прямые толстые палочки с округлыми и слегка утолщенными концами, расположенные поодиночке или парами.
Гемофильная палочка определяется в мокроте при окраске азур-эозином.

Вирусные пневмонии
В препаратах мокроты обнаруживаются гигантские многоядерные клетки цилиндрического эпителия с достаточно крупными ядрами одинаковых размеров и формы. Ядер много, они обычно накладываются друг на друга, лежат плотно, образуя фасетки. Такая микроскопическая картина может напоминать злокачественные клетки.

источник

Исследование мокроты предусматривает определение физи­ческих свойств мокроты, ее микроскопическое исследование в нативном мазке и бактериологическое исследование в окрашен­ных препаратах.

Мокроту, получаемую при откашливании утром до приема пи­щи, собирают в чистую сухую склянку. Перед исследованием боль­ной должен почистить зубы и тщательно прополоскать рот водой.

Мокроту помещают в чашку Петри, рассматривают на светлом и темном фоне, описывают ее свойства. Количество мокроты за сутки при различных патологических процессах может быть раз­лично: так например, при бронхите — скудное (5-10 мл), при абсцессе легкого, бронхоэктазах — большое количество (до 200—300 мл).

Деление на слои наблюдается в случаях опорожнения боль­ших полостей в легком, например, абсцесса легкого. В этом случае мокрота образует 3 слоя: нижний слой состоит из детри­та, гноя, верхний слой — жидкий, на поверхности его иногда имеется третий — пенистый слой. Такую мокроту называют трехслойной.

Характер: характер мокроты определяет содержание слизи, гноя, крови, серозной жидкости, фибрина. Характер ее может быть слизистый, слизисто-гиойный, слизисто-гнойно-кровянистый и т.п.

Цвет: зависит от характера мокроты, от выдыхаемых частиц, которые могут окрашивать мокроту. Так например, желтоватый, зеленоватый цвет зависит от наличия гноя, «ржавая» мокрота -от распада эритроцитов, встречается при крупозной пневмонии. Прожилки крови в мокроте или красная мокрота может быть при примеси крови (туберкулез, бронхоэктазы). Серый и черный цвет придает мокроте уголь.

Консистенция: зависит от состава мокроты, жидкая — в ос­новном от наличия серозной жидкости, клейкая — при наличии слизи, вязкая — фибрина.

Запах: свежевыделенная мокрота обычно без запаха. Непри­ятный запах свежевыделенной мокроты обычно появляется при абсцессе легкого, при гангрене легкого — гнилостный.

Нативные препараты готовят, выбирая материал из разных мecт мокроты, берут также для исследования все частицы, выде­ляющиеся окраской, формой, плотностью.

Отбор материала производят металлическими палочками, по­мещают его на предметное стекло и покрывают покровным. Мате­риал не должен выходить за покровное стекло.

Лейкоциты: всегда содержатся в мокроте, количество их зависит от характера мокроты.

Эозинофилы: распознаются в нативном препарате по более темной окраске и наличию в цитоплазме четкой, одинаковой, пре­ломляющей свет зернистости. Часто располагаются в виде больших скоплений. Эозинофилы встречаются при бронхиальной астме, других аллергических состояниях, гельминтозе, эхинококке лег­кого, новообразованиях, эозинофильном инфильтрате.

Эритроциты: имеют вид дисков желтого цвета. Единичные эритроциты могут встречаться в любой мокроте, в большом коли­честве — в мокроте, содержащей примесь крови: новообразовани­ях легкого, туберкулезе, инфаркте легкого.

Клетки плоского эпителия: попадают в мокроту из полости рта, носоглотки, большого диагностического значения не тлеют.

Цилиндрический мерцательный эпителий: выстилает слизистую оболочку гортани, трахеи, бронхов. В большом количестве обнаруживается при острых катарах верхних дыхательных путей, бронхитах, бронхиальной астме, новообразованиях легкого, пневмосклерозе и др.

Альвеолярные макрофаги: большие клетки различной величи­ны, чаще круглой формы, с наличием в цитоплазме включений черно-бурого цвета. Встречаются чаще в слизистой мокроте с небольшим количеством гноя. Обнаруживаются при различных па­тологических процессах: пневмонии, бронхитах, профессиональ­ных заболеваниях легких и др. Альвеолярные макрофаги, содер­жащие гемосидерин, старое название — «клетки сердечных поро­ков», имеют в цитоплазме золотисто-желтые включения. Для их выявления применяют реакцию на берлинскую лазурь. Ход реакции: кусочек мокроты помещают на предметное стекло, прибавляют 2 капли 5% раствора соляной КИОЛОТЫ и 1-2 капли 5% раствора желтой кровяной соли. Перемешивают стеклянной палочной и по-крывают покровным стеклом. Гемосидерин, лежащий внутриклеточно, окрашивается в голубой или синий цвет. Эти клетки обнару­живаются в мокроте при застойных явлениях в легких, инфарктах легкого.

Жирное перерождение клетки (липофаги, жировые шары): чаще округлые, цитоплазма их заполнена жиром. При прибавлении к препарату судана Ш капли окрашиваются в оранжевый цвет. Группы таких клеток встречаются при новообразованиях легкого, актиномикозе, туберкулезе и др.

Эластические волокна: в мокроте имеют вид извзитых блес­тящих волокон. Как правило располагаются на фоне лейкоцитов и детрита. Наличие их указывает на распад ткани легкого. Обнаруживаются при абсцессе, туберкулезе, новообразованиях легко­го.

Коралловые волокна: Грубые ветвящиеся образования с буг­ристыми утолщениями вследствие отложения на волокнах жирных кислот и мыл. Их обнаруживают в мокроте при кавернозном тубер­кулезе.

Обызвествленные эластические волокна — грубые, пропитанные солями извести палочковидные образования. Обнаруживают при распаде петрифицированного очага, абсцессе легкого, ново­образованиях, Элемента распада петрифицированнго очага носят название тетрады Эрлиха: I) обызвествленные эластические во­локна; 2)аморфные соли извести; 3) кристаллы холестерина; 4) микобактерии туберкулеза.

Спирали Куршмана_- уплотнены, закрученные в спираль слизевые образования. Центральная часть резко преломляет свет и выглядит спиралью, по периферии свободно лежащая слизь обра­зует мантию. Спирали Куршмана образуются при бронхиальной астме.

Кристаллические образования: кристаллы Шарко-Лейдена, вы­тянутые блестящие ромбы, можно обнаружить в желтоватых кусоч­ках мокроты, содержащих большое количество эозинофилов. Их образование связывают с распадом эозинофилов,

Кристаллы гематоидина: имеют форму ромбов и иголок золо­тистого цвета. Образуются при распаде гемоглобина при крово­излияниях, распаде новообразований. В препарате мокроты видны обычно на фоне детирита, эластических волокон.

Кристаллы холестерина: бесцветные четырехугольники с обло­манными ступенеобразным углом, обнаруживаются при распаде жирно перерожденных клеток, в полостях. Встречаются при туберку­лезе, абсцессе легкого, новообразованиях.

Пробки Дитриха: мелкие желтовато-серые зернышки с непри­ятным запахом, содержатся в гнойной мокроте. Микроскопически представляют собой детрит, бактерии, кристаллы жирных кислот в виде игл и капелек жира. Образуются при застое мокроты в полостях при абсцессе легкого, бронхоэктазах.

Исследование на туберкулезные микобактерии: Препарат готовят из гнойных частиц мокроты, высушивают

на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Окрашивают по

Методика окрашивания: Реактивы:

2) 2% спиртовой раствор соляной кислоты,

3) водный раствор 0,5% метиленового синего.

1. На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина.

2. Препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (так 3 раза).

3. С остывшего стекла снимают фильтровальную бумагу. Обесцвечивают мазок в солянокислом спирте до полного отхождения краски.

5. Докрашивают препарат метиленовнм синим 20-30 секунд.

6. Промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. Туберкулезные микобактерии окрашиваются в красный цвет,

все остальные элементы мокроты и бактерии — в синий. Туберку­лезные микобактерии имеют вид тонких, слегка изогнутых пало­чек с утолщениями на концах или посередине.

При окраске по Цилю-Нильсону в красный цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. Дифференциальная диагностика туберкулезных микробактерий и кислотоупорных сапрофитов ведет­ся методами посева и заражения животных.

Исследование мокроты может проводиться также методом фло­тации. Метод Потенжера: ход исследования:

1. Свежевыделенную мокроту (не более 10-15 мл) помещают в узкогорлую бутылку, приливают двойное количество едкой ще­лочи, смесь энергично встряхивают (10-15 мин).

2. Приливают I мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 100 мл дистиллированной вода для разжижения мокроты. Снова встряхивают 10-15 мин.

3. Доливают дистиллированную воду до горлышка бутылки и оставляют стоять на 10-50 мин.

4. Образовавшийся верхний слой (беловатый) снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предвари­тельно нагретые до 60°. Каждую последующую каплю наносят на подсохшую предыдущую.

5. Препарат фиксируют и красят по Цилю-Нильсону.

Исследование на другие бактерии:

Другие бактерии, встречающиеся в мокроте, например, стрептококки, стафилококки, диплобациллы и др. могут быть распознаны только методом посева. Бактериологическое иссле­дование препарата в этих случаях имеет только ориентировоч­ное значение. Препараты красят метиленовым синим, фуксином или по граму. Окраска по Граму: Реактивы: I) карболовый раствор генцианвиолета,

4) 40% раствор карболового фуксина.

1. На фиксированный препарат кладут полоску фильтроваль­ной бумаги, наливают раствор генцианвиолета, красят 1-2 мин.

2. Бумажку снимают и препарат заливают раствором Люголя на 2 минуты.

3. Раствор Люголя сливают и прополаскивают препарат в спирте до серого цвета.

4. Промывают водой и окрашивают 10-15 секунд раствором фуксина.

Приложение: посуда и оборудование: Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Смотрят с иммерсией.

2. Инструменты для отбора мокроты: металлические палоч­ки с расплющенными концами, препаровальные иглы и др.

7. Дезинфицирующая жидкость.

Абсцесс лег­кого Обильное, гнойная, со зловонным запахом Обрывки ткани легкого. Сплошь лейкоциты, эла­стические волокна, кристаллы жирных кис­лот, гематоидина, хо-лестерша, разнообраз­ная обильная флора

Различное, рисовидные тельца слизисто-гнойная, иногда с примесью кро­ви Микобактерии тубер­кулёза, эластические волокна, различные кристаллы

Различное, слизисто-кровянистое Обрывки ткани. Атипические клетки.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Да какие ж вы математики, если запаролиться нормально не можете. 8392 — | 7310 — или читать все.

193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессивный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 110-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интенсивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в ксилоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время, от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.

Ниже описаны методики, и прописи красителей в частности гематоксилина и его приготовление для окраски срезов из книги Р. Лилли

ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ГИСТОХИМИЯ

ПРОТРАВНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ЯДЕР И ДРУГИХ СТРУКТУР

Квасцовый гематоксилин

Комплексы гематоксилина с солями алюминия обычно готовят, используя двойной сульфат аммония и алюминия или алюмо — аммониевые квасцы. Такие комплексы называются обычно квасцовым гематоксилином. Иногда вместо аммониевых используются калиевые или натриевые квасцы, причем результаты окрашивания не изменяются. Поскольку красящим началом является не сам гематоксилин, а продукт его окисления — гематеин, а соли алюминия в отличие от солей трехвалентного железа не являются окислителями, растворы квасцового гематоксилина перед использованием необходимо окислить или дать им «вызреть». Гематеин медленно образуется при пропускании пузырьков воздуха через растворы гематоксилина (для получения однородных результатов может понадобиться 3—4 недели), при выдерживании растворов в открытых сосудах в течение нескольких недель; гематеин образуется также в твердом красителе, хранящемся в открытом сосуде во влажной атмосфере. Большинство химических окислителей, таких, как перекиси, иодаты, перманганаты, перхлораты, окись ртути и соли трехвалентного железа, окисляют гематоксилин сразу, хотя некоторые из них действуют при нагревании.

Избирательность окраски ядер квасцовым гематоксилином возрастает в присутствии избытка солей алюминия или еще лучше в кислых растворах. Многие авторы предпочитают перекрашивать срезы не подкисленными растворами красителя, а затем дифференцировать их в кислоте, подкисленном спирте или других дифференцирующих агентах.

Квасцовый гематоксилин, приготовленный на 10%-ном водном растворе алюмо-аммониевых квасцов, имеет рН около 2,95; при добавлении 2% уксусной кислоты рН сдвигается до 2,34, при добавлении 4% — до 2,22.

Отмечено, что содержание гематеина в различных партиях поступающего в продажу гематоксилина различно, так что краситель иногда может представлять собой почти чистый гематеин. У меня имелись образцы гематоксилина, которые «вызревали» «естественным путем» за сравнительно короткий срок (8—10 дней). Обычный срок вызревания составляет 8—10 недель, хотя, по данным Шморля, период вызревания для гематоксилина Бемера составляет 8—10 дней. Иногда встречаются партии гематоксилина, которые оказываются сильно «переокисленным» при добавлении стандартных количеств иодата натрия. Я могу привести пример, когда 1 г NaIО3 окисляли 6 г гематоксилина. Это соотношение ниже, чем в прописи Майера, но выше рекомендованного.

Хорошо «вызревшие» растворы квасцового гематоксилина разбавляют дистиллированной водой до концентрации приблизительно 10 мг гематоксилина в 1 л. При «переокислении»- независимо от того, достигнуто ли оно за счет длительного выдерживания на воздухе или избыточной дозы окислителя,— раствор меняет цвет от пурпурного через красный до оранжевого или даже желто-коричневого.

Другие окислители

Для приготовления растворов гематоксилина с хорошими красящими свойствами на 1 г гематоксилина обычно берут 177 мг перманганата калия, 200 мг иодата натрия и 500 мг окиси ртути, но, как было показано недавно, количества некоторых из зтих окислителей можно уменьшить.

Рекомендуются следующие количества окислителей на 1 г гематоксилина: иодата натрия NaIO3 -40-100 мг, перманганата калия КМnО4 — 175 мг, периодата калия КI04 —50 мг, окиси ртути НgО — 100 мг. Первые три окислителя используют при пониженной температуре, для окисления окисью ртути необходимо кипячение. Дозы КМnО4 и КI04 следует уточнить.

Способ получения гематеина не оказывает влияния на красящие свойства гематоксилина. Различные растворы квасцового гематоксилина будут окрашивать по-разному в зависимости от количества красителя, использованного для их приготовления, степени его окисления или переокисления; избирательность окрашивания при прогрессивном методе зависит от рН раствора. Роль спирта, по-видимому, сводится главным образом к предохранению от плесени, роль глицерина — к повышению стабильности растворов по отношению к переокислению. Действительно, я наблюдал, как намерению

переокисленвые растворы гематоксилина при добавлении 30% глицерина восстанавливали при стоянии свою способность к окрашиванию.

В табл. 1 приведен ряд наиболее часто употребляемых прописей приготовления

квасцовых гематоксилинов из расчета на 1 л раствора. В некоторых методах рекомендуется сначала растворить гематоксилин в спирте или в воде и окислить либо на воздухе, либо добавляя окислители. По-видимому, не имеет значения, добавляются ли квасцы, глицерин, вода, уксусная кислота и другие компоненты к гематоксилину до или после его окисления; не важен и метод окисления. Спирт и глицерин могут сами окисляться химическими окислителями.

Пропись Делафильда цитируется по Майеру («Энциклопедия» Эрлиха).

Я беру 60 г квасцов, что несколько превышает количество, необходимое для получения раствора 1 : 11, который Майер считает насыщенным. Маллори советует применять 15%-ный раствор квасцов и во всех прописях использует этиловый спирт. Последняя рекомендация кажется полезной.

Как пропись Маллори, так и пропись Шморля представляют собой по существу модификацию не вполне точной прописи Бемера («Энциклопедия» Эрлиха) и цитируются по публикациям этих авторов. Пропись Майера приводится, по существу, в том виде, в каком она дается почти всеми руководствами, вышедшими после «Энциклопедии». В моей модификации в отличие от прописи Майера гемалаун содержит 0,5% гематоксилина (вместо 0,4% гематеина у Майера; «Энциклопедия» Эрлиха). Ланжерон приводит пропись более разбавленной смеси Караччи, содержащей 0,1 % гематоксилина, 0,02% иодата натрия, 20% глицерина и 5% квасцов . Пропись Апати цитируется по Ли в измененном виде: 1 %-ный гематоксилин сначала созревал в 70%-ном спирте, затем его смешивали с равными объемами глицерина и раствора, содержащего 3% уксусной кислоты и 9% квасцов.

Пропись Гарриса и смесь Эрлиха я привожу по «Энциклопедии». В воследней количество квасцов составляет 4%; это более чем достаточно для насыщения при 30°. Маллори ввел в пропись Эрлиха вызревание.

Гематоксилин Балларда

Баллард растворяет 8 г гематоксилина в 144 мл 50%-ного спирта, добавляет 16 мл ледяной уксусной кислоты и нагретый раствор 20 г алюмо — аммониевых квасцов в 250 мл воды, к нагретой до кипения смеси медленно (не допуская вспенивания) добавляет 8 г красной окиси ртути; быстро охлаждает, фильтрует и добавляет 275 мл 95%-ного спирта, 330 мл глицерина, 18 мл ледяной уксусной кислоты и 40 г алюмо-аммониевых квасцов.

Если растворам гематоксилина предоставляют созревать самопроизвольно, не используя для этого химические реактивы, то необходимо учесть, что это длительный процесс; поэтому в лаборатории следует иметь заранее приготовленные растворы гематоксилина на разных стадиях вызревания.

Я предпочитаю пользоваться растворами, содержащими глицерин, поскольку они более устойчивы, и растворами с содержанием гематоксилина 0,5% и более, так как они дают интенсивную окраску и ими можно окрасить большее число срезов. Подкисленные гематоксилины лучше использовать для обычного окрашивания ядер, но и не подкисленные гематоксилином также имеют ряд ценных свойств. Концентрация квасцов в них обычно близка к насыщению; в растворах, содержащих спирт и глицерин, она ниже, чем в водных растворах. Рекомендуется использовать алюмоаммониевые квасцы, которые представляют собой двойную сернокислую соль аммония и алюминия (NН4)2SО4*AL2(SО4)3*24Н20. Поскольку это соль сильной кислоты и довольно слабых основании, то растворы квасцовых гематоксилинов кислые: рН 2,6—2,8

источник

Клиника-Мокрота Комплект №1 ЗАО ЭКОлаб № ФСР 2008/02613 от 30.04.2008
38.05 Набор реагентов для клинического анализа мокроты:

ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА МОКРОТЫ

(«Клиника – Мокрота»)

Набор предназначен для проведения бактериоскопического и микроскопического исследования мокроты в клинико-диагностических лабораториях лечебно — профилактических учреждений.

Набор рассчитан на проведение 200 проб при определении кислотоустойчивых микобактерий (КУМ), 100 проб при обнаружении альвеолярных макрофагов с гемосидерином, 300 проб при определении клеток злокачественных новообразований.

1. Характеристика набора

2.1. Принцип метода

Обнаружение кислотоустойчивых микобактерий

Метод окраски кислотоустойчивых микобактерий по Цилю-Нильсену основан на использовании нескольких специальных методических приемов:

• Окраска фуксином (с подогреванием) – при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия фенола (карболовая кислота) повышается способность красителя проникать в микробную клетку и, особенно, в структуры её клеточной стенки, состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются фуксином в красный цвет.
• Обесцвечивание. Обработка окрашенных фуксином препаратов 25 % раствором серной кислоты приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не обладающие достаточной гидрофобностью и стойкостью к разрушению в кислоте (кислотоустойчивостью). Только кислотоустойчивые микроорганизмы остаются после обесцвечивания окрашенными в малиново-красный цвет. Сапрофитные микроорганизмы, также окрашенные фуксином, обесцвечиваются.
• Контрастирующая окраска – обесцвеченные элементы мазка докрашивают метиленовым синим для придания контрастности препарату при поиске КУМ.

Обнаружения альвеолярных макрофагов с гемосидерином

Аморфные кристаллы гемосидерина (окислы железа жёлтого цвета), расположенные внутриклеточно, при внесении в нативный препарат мокроты раствора калия железистосинеродистого и раствора соляной кислоты вступают в реакцию с образованием берлинской лазури – соединения, окрашенного в голубой или сине – зеленый цвет.

Обнаружение клеток, характерных для воспалительных и злокачественных процессов в лёгких.

Метод основан на воздействии азур – эозиновых красителей типа Май – Грюнвальда и Романовского на клеточные элементы мокроты. Клетки приобретают различную окраску: ядра окрашиваются в тёмно – фиолетовый цвет; ядрышки — в голубой; цитоплазма, в зависимости от её принадлежности к той или другой клетки, принимает соответствующую окраску от розовато – сероватого, бледно – голубого до синего.

2.2. Состав набора

• Карболовый фуксин по Цилю-Нильсену — 2 флакона (по 100 мл);
• Кислота серная, 25 % объем. — 2 флакона (по 100 мл);
• Метиленовый синий, 1 % — 2 флакона (по 100 мл);
• Калий железистосинеродистый, 5 % — 1 флакон (10 мл);
• Кислота соляная, 5 % — 1 флакон (10 мл);
• Краситель эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду — 1 флакон (100 мл);
• Краситель азур-эозин по Романовскому — 1 флакон (100 мл);
• Фосфатный буфер (сухая смесь) – 1 флакон (на 2 л).
• Бумага фильтровальная размером 4,5×2,5 см — 200 полосок.

1. Аналитические и диагностические характеристики набора

Кислотоустойчивые микобактерии (КУМ)

Пределы метода световой микроскопии при окраске мазков по Цилю-Нильсену позволяют выявить кислотоустойчивые микроорганизмы при их содержании 5000 – 10000 и более микробных клеток в 1 мл мокроты, что характерно для больных с прогрессирующими формами процесса. Больные с малыми формами заболевания без деструкции лёгочной ткани выделяют значительно меньшее количество КУМ, что может быть ниже предела обнаружения данным методом. Чувствительность метода можно повысить, увеличивая кратность обследования пациента.

Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диагноза туберкулёза.

Гемосидерин – обнаруживают в мокроте при застое в малом круге кровообращения, застойных явлениях в лёгком другой этиологии, инфаркте лёгкого, кровоизлиянии, крупозной пневмонии и др.

Клетки злокачественных новообразований и воспалительных процессов

Величина, цвет и форма ядра и клетки, нарушенное ядерно – цитоплазматическое соотношение, число ядер в клетке, наличие и величина ядрышек, а также другие критерии позволяют обнаружить злокачественные клетки. Злокачественные клетки располагаются на фоне клеточных элементов воспаления, таких как нейтрофилы, альвеолярные макрофаги, моноциты, клетки цилиндрического мерцательного эпителия, а при аллергическом процессе – эозинофилов и неклеточных элементов, таких как спирали Куршмана и кристаллы Шарко – Лейдена.

1. Меры предосторожности при работе с набором.

Потенциальный риск применения набора – класс 2а.

В состав набора входит фенол, фуксин, метиленовый синий, калий железистосинеродистый, краситель эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду, краситель азур-эозин по Романовскому, кислота серная и кислота соляная. При работе с ними следует соблюдать осторожность и не допускать попадания на кожу и слизистые; при попадании

немедленно промыть пораженной место большим количеством проточной воды. При проглатывании следует выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.

Меры предосторожности – соблюдение «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемио-логических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.), и «Инструкции по унифицированным методам микроскопических исследований для выявления кислотоустойчивых микобактерий в клиникодиагностических лабораториях лечебно — профилактических учреждений» (Приказ МЗ РФ № 109 от21.03.03, Приложение № 10).

При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.

1. Оборудование, материалы, реагенты:

• лотки для сушки и окраски мазков;
• спиртовая или газовая горелка для фиксации препарата и подогревания его при окрашивании карболо- вым фуксиином;
• штатив для просушивания окрашенных стёкол на воздухе в вертикальном или наклонном положении;
• штатив («рельсы») для окраски мазков на предметных стёклах;
• емкости для фиксации и окраски;
• пинцет или щипцы для взятия предметных стёкол с препаратами;
• пипетки глазные, палочки стеклянные;
• стёкла предметные;
• микроскоп;
• таймер;
• чашки Петри;
• бумага фильтровальная;
• вода дистиллированная;
• масло иммерсионное;
• перчатки резиновые или пластиковые.

1. Анализируемые пробы

Мокрота и некоторые другие материалы (экссудат, мазки – отпечатки с биопсийного и операционного материала).

Для окраски по методу Циля – Нильсена срок хранения мокроты в течение 48 – 72 часов при комнатной температуре (18-25) °С.

Для окраски по Романовскому, с целью обнаружения клеток воспаления и/или новобразования, материал должен быть свежесобранным. Срок хранения не более 2 часов.

Препараты, приготовленные из исследуемого материала, могут храниться 3 — 5 дней при комнатной температуре.

1. Проведение анализа

7.1. Приготовление рабочих растворов реагентов

7.1.1. Приготовление фосфатного буферного раствора, рН 6,8-7,2

К содержимому флакона с сухой смесью реактивов для приготовления фосфатного буфера добавить 20 мл дистиллированной воды, растворить при перемешивании.

Добавить полученный концентрат к 2 л дистиллированной воды, перемешать.

Для приготовления небольшого количества буферного раствора смешать полученный концентрат с дистиллированной водой в соотношении 1:100.

Концентрат фосфатного буферного раствора можно хранить при температуре (2-8) °С в течение года.

Фосфатный буферный раствор можно хранить в плотно закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение 3 месяцев, а при комнатной температуре (18-25) °С не более месяца.

7.1.2. Приготовление рабочего раствора красителя азур-эозин по Романовскому

Краситель азур-эозин по Романовскому разбавить фосфатным буферным раствором (см. п.7.1.1) в соотношении 1:10.

Рабочий раствор красителя азур-эозин по Романовскому стабилен при комнатной температуре в течение 8 часов.

7.1.3. Реагенты готовые к применению:

— карболовый фуксин по Цилю-Нильсену;

— калий железистосинеродистый, 5 %;

— краситель эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду.

Реагенты можно хранить при комнатной температуре в плотно закрытых флаконах, в защищенном от света месте в течение всего срока годности набора.

7.2. Проведение анализа

7.2.1. Обнаружение кислотоустойчивых микобактерий

7.2.1.1. Приготовление препаратов из нативной мокроты

Из разных участков образца мокроты выбрать 2-3 гнойных небольших комочка, перенести на новое (не поцарапанное) предметное стекло и с помощью уголка другого предметного стекла равномерно растереть тонким слоем бли-

же к одному или другому краю предметного стекла на площади размером приблизительно 2×2 или 1,5×2 см в виде круга или овала.

Примечание: При приготовлении препарата для микроскопического исследования необходимо добиться его правильной толщины. Слишком тонкий мазок содержит мало материала, что может привести к ложноотрицательному результату. Слишком толстый мазок трудно хорошо зафиксировать, окрасить. По окончании окраски материал, недостаточно плотно фиксированный на стекле, может быть частично или полностью смыт водой. Толстый препарат плохо просматривается при микроскопическом исследовании.

Не рекомендуется готовить препараты с помощью «растяжки» мокроты между двух предметных стекол или растирания мокроты между двух предметных стекол. Эти способы приготовления препаратов мокроты сопровождается образованием биологически опасного аэрозоля и загрязняют инфицированным материалом края предметных стёкол.

Приготовленные препараты положить на лотки, выстланные фильтровальной бумагой, и высушить при комнатной температуре в течение 15 – 30 минут.

Высушенный на воздухе препарат зафиксировать над пламенем спиртовой или газовой горелки. Для этого стекло с сухим препаратом трижды медленно провести через верхнюю треть пламени до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания препарата в пламени не должна превышать 3 – 5 секунд.

Не допускается фиксация над пламенем горелки сырых препаратов мокроты.

Предметные стёкла с зафиксированными препаратами поместить на штатив для окраски так, чтобы расстояние между ними составляло примерно 1 см.

На каждое стекло положить полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала только препарат. Это предотвращает в дальнейшем распределение краски по всему стеклу.

Налить с помощью пипетки на бумагу с избытком раствор карболового фуксина по Цилю-Нильсену.

Внести стекло с препаратом в пламя горелки и дождаться появления пара, что означает закипание на препарате мокроты карболового фуксина по Цилю-Нильсену.

Повторить эту процедуру ещё раз.

Примечание: При подогревании препарата необходимо следить за тем, чтобы фильтровальная бумага, смоченная карболовым фуксином по Цилю-Нильсену, оставалась влажной до конца третьей процедуры. При трёхкратном появлении пара над препаратом мокроты происходит стойкое прокрашивание липоидной оболочки КУМ

Подогретый мазок оставляют на 3-5 минут, чтобы краситель проник в клеточную систему микобактерий и окрасил её.

Снять с помощью пинцета фильтровальную бумагу.

Остатки краски осторожно смыть с обратной стороны предметного стекла слабой струёй холодной воды, пока не прекратится видимое отхождение фуксина.

Стекло с препаратом вновь положить на «рельсы».

Покрыть полностью всю поверхность препарата 25 % серной кислотой (обесцвечивающим раствором) на 3 минуты, т.е. полного до обесцвечивания.

Тщательно смыть серную кислоту холодной водой с обратной стороны предметного стекла.

Залить препарат 1 % раствором метиленового синего на 1-2 минуты.

Смыть метиленовую синь с препарата холодной водой с обратной стороны предметного стекла.

Высушить окрашенный препарат на воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

Препарат не следует промокать фильтровальной бумагой.

Микроскопировать с иммерсионной системой.

7.2.2. Обнаружение альвеолярных макрофагов с гемосидерином

С нативного препарата мокроты, в котором обнаружены альвеолярные макрофаги желтовато-коричневого цвета с единичными крупными и многочисленными мелкими включениями в цитоплазме, подозрительные на содержание в них аморфных кристаллов гемосидерина, осторожно, под контролем малого увеличения микроскопа, снять покровное стекло. На препарат нанести каплю 5% раствора калия железистосинеродистого («жёлтой кровяной соли»), смешать с мокротой уголком покровного стекла, добавить такую же по размеру каплю 5 % соляной кислоты, вновь смешать и накрыть препарат покровным стеклом. Выдержать 10-15 мин и микроскопировать при малом увеличении.

7.2.3. Обнаружение клеточных элементов, характерных для воспалительных и злокачест-венных новообразований

Нативные препараты мокроты фиксируют фиксатором – красителем эозин-метиленовым синим по Май-Грюнвальду, а затем докрашивают рабочим раствором азур – эозин по Романовскому.

На препарат, высушенный на воздухе, налить краситель эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду так, чтобы он покрыл всё стекло (1-1,5 мл), или опустить в ёмкость с красителем эозин-метиленовым синим по Май-Грюнвальду, выдержать в течение 3-5 мин. После окончания фиксации, краситель смыть слабой струёй воды с обратной стороны предметного стекла с препаратом мокроты.

Стекло с зафиксированным препаратом мокроты вновь положить на «рельсы» налить рабочий раствор красителя азур-эозин по Романовскому (см. п. 7.1.2) 2 – 2,5 мл так, чтобы он покрыл весь мазок, или опустить в ёмкость для окраски препаратов.

Время окраски препаратов подобрать предварительно на нескольких фиксированных мазках: экссудат 7 – 10 мин, мокрота 30 – 40 мин.

По окончании окрашивания краску с препарата слить и промыть препарат водопроводной холодной водой, направляя её на обратную сторону предметного стекла. Препарат высушить на воздухе и микроскопировать с иммерсионной системой.

1. Регистрация результатов

Микроскопию нативных препаратов провести при малом (объектив 8×, окуляр 10×) и большом (объектив 40×, окуляр 10×) увеличениях микроскопа.

Микроскопирование окрашенных препаратов провести с иммерсионной системой (объектив 90×, окуляр 10×).

1. Учет результатов реакций

Кислотоустойчивые микобактерии (КУМ)

Оболочка КУМ окрашивается фуксином по Цилю — Нильсену в малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные элементы обесцвечиваются серной кислотой и окрашиваются метиленовым синим — в голубой.

Градация результатов микроскопического исследования при окраске по методу Циля — Нильсена:

исследования

Число полей зрения (п/з), обязательных для просмотра Интерпретация результата исследования КУМ — не обнаружены 300 Отрицательный КУМ — 1 — 2 300 Результат не оценивается, рекомендуется повторить исследование КУМ — 1 — 9 100 Положительный, указывают точное число КУМ КУМ — 10 — 90 100 Положительный — 1+ — единичные КУМ в поле зрения КУМ — 1 — 10 в 1 п/з 50 Положительный — 2+ — умеренное количество КУМ Более 10 КУМ в 1 п/з 20 Положительный — 3+ — значительное количество КУМ