Для микроскопического исследования мокроты прежде всего готовят неокрашенные (нативные) препараты мокроты. Полноценность исследования зависит от правильного приготов¬ления и количества просмотренных препаратов. Материал для исследования выбирают из разных мест и переносят металлической иглой на предметное стекло, затем покрывают покровным стеклом так, чтобы мокрота не выступала за его края.
Препараты должны быть тонкими, элементы в них должны располагаться однослойно. Микроскопию проводят сначала при малом увеличении микроскопа (объектив 8Х, окуляр 10Х), просмотр с малым увеличением дает представление о качестве выбранного материала, позволяет обнаружить скопление клеток, кристаллических образований, найти эластические волокна, спирали Куршмана, элементы новообразования. Дальнейшее исследование производится при большом увеличении микроскопа (объектив 40Х, окуляр 10Х).
При этом в мокроте можно обнаружить в большем или меньшем количестве лейкоциты и среди них по более темной окраске и наличию в цитоплазме обильной, четкой, преломляющей свет зернистости различить эозинофилы, наличие которых характерно для бронхиальной астмы и других аллергических состояний. Эритроциты в мокроте имеют вид желтоватых дисков. Единичные эритроциты встречаются в каждом виде мокроты, большое же их количество характерно для кровянистой мокроты и встречается при инфаркте легкого, легочных кровотечениях, застое в малом круге кровообращения.
В мокроте всегда можно обнаружить эпителий. Плоский эпителий попадает в мокроту из полости рта и носоглотки. Большое число клеток говорит о недостаточно хорошем туалете полости рта перед взятием мокроты для исследования.
Обнаружение в мокроте цилиндрического мерцательного эпителия, выстилающего слизистую оболочку гортани, трахеи и бронхов, свидетельствует о поражении соответствующих отделов. Клетки имеют удлиненную форму, расширение с одного конца, где расположено округлое ядро, и мерцательные реснички. Располагаются эти клетки группами, и в свежевыделенной мокроте можно наблюдать активное движение ресничек. При воспалительных процессах (бронхиты, пневмонии, профессиональные заболевания легких) в мокроте встречаются альвеолярные макрофаги — клетки гистиоцитарной системы. Это крупные клетки округлой формы с наличием в цитоплазме включений. Если альвеолярные макрофаги содержат гемосидерин, то их называют сидерофагами или образно «клетками сердечных пороков», так как они могут появиться при застое крови в легких, при декомпенсированных пороках сердца. С достоверностью выявить эти клетки можно реакцией обра¬зования берлинской лазури.
Бактериоскопия.
Этот этап исследования мокроты включает в себя микроскопию препаратов, окрашенных по Цилю—Нильсену, для выявления микобактерий туберкулеза и препаратов, окрашенных по Граму, для изучения микрофлоры мокроты. Иногда для выявления микобактерий туберкулеза прибегают к обогащению методом флотации. Препараты мокроты для бактериоскопического исследования, приготовленные на предметном стекле, высушивают, фиксируют над пламенем горелки и затем окрашивают.
Окраска по Цилю—Нильсену.
Реактивы:
Карболовый фуксин: 1 г основного фуксина растворяют в 10мл этилового спирта, раствор выливают в 100мл 5% раствора карболовой кислоты.
3% солянокислого спирта: 3 мл НСl и 97 мл этилового спирта
Водный 0,5% раствор метиленового синего
На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина, затем препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (3 раза). После остывания препарата сбрасывают фильтровальную бумагу и опускают его в солянокислый спирт для обесцвечивания. Обесцвечивают до полного удаления краски, промывают водой и докрашивают метиленовым синим 20—30с. Снова промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой.
Туберкулезные микобактерий окрашиваются в красный цвет, все остальные элементы мокроты и бактерии — в синий. Туберкулезные микобактерий имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке.
При окраске по Цилю—Нильсену в красный-цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. Дифференциальная диагностика туберкулезных микобактерий и кислотоупорных сапрофитов ведется бактериологическими методами исследования
При исследовании следует избегать:
приготовления толстых мазков мокроты;
фиксации плохо высушенных мазков;
недостаточной фиксации;
обугливания препарата при длительной фиксации.
Если микобактерий выделяется мало, то в обычных мазках их не находят и прибегают к методу накопления.
Метод флотации (всплывание) по Поттенджеру.
Свежевыделенную мокроту (не более 10—-15 мл) помещают в узкогорлую бутылку, приливают двойное количество 0,5% раствора едкой щелочи,-смесь энергично встряхивают 10—15 мин. Затем добавляют 1 мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 30 мл дистиллированной воды для разжижения мокроты и снова встряхивают 10— 15 мин. Доливают дистиллированную воду в таком количестве, чтобы уровень жидкости поднялся до горлышка бутылки. Оставляют на 1 — 2 ч для отстаивания. Образовавшийся верхний беловатый слой снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предварительно подогретые до 60 °С (стекла для подогревания можно положить на металлический подносик и покрыть им водяную баню). Каждую последующую каплю наносят на предыдущую подсушенную. Препарат фиксируют и красят по Цилю—Нильсену.
Наиболее достоверные результаты в обнаружении микобактерий туберкулеза дают бактериологические методы исследования. Другие бактерии, встречающиеся в мокроте, например стрептококки, стафилококки, диплобациллы, палочки Фридлендера и пр., могут быть распознаны только методом посева. Бактериоскопическое исследование препарата в этих случаях имеет только ориентировочное значение. Препараты красят метиленовым синим, фуксином или по Граму.
Окраска по Граму.
Реактивы:
Карболовый раствор генцианового фиолетового: 1 г генцианового фиолетового растворяют в 10 мл 96 % спирта,, раствор выливают в 100 мл 1 — 2 % карболовой кислоты, взбалтывают
Ра¬створ Люголя: 1 г йода, 2 г йодида калия и 300 мл дистиллированной воды; йод и йодид калия расстворяют сначала в 5—8 мл воды, а затем: приливают остальную воду
96 % спирт или сырец
10 % раствор карболового фуксина: 10 мл карболового фуксина и 90 мл дистиллированной воды
На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианового фиолетового. Красят 11/2—2 мин. Бумажку сбрасывают и заливают препарат раствором Люголя на 2 мин, а потом прополаскивают препарат в спирту до сероватого цвета. Промывают водой и окрашивают 10% раствором карболового фуксина 10—15 с. После этого препарат опять промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионным объективом.
источник
Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:
- Предметные и покровные стекла.
- Шпатели и иглы.
- Смесь Никифорова.
- Газовая или спиртовая горелка.
- Пастеровская пипетка с резиновым баллончиком.
- Водяная баня с мостиком.
- Иммерсионное масло.
- Микроскоп.
- Фильтровальная бумага.
- Пинцеты Корне.
- Бумажки Синева.
- Основной фуксин.
- 96° этиловый спирт.
- Фенол.
- Глицерин.
- Концентрированная соляная кислота.
- Метиленовая синька.
- Дистиллированная вода.
- Генцианвиолет.
- Реактив Люголя.
- Едкий натр (NaOH).
- Бензин или ксилол.
Для бактериоскопического исследования готовят обычно два препарата: один для обнаружения микобактерий туберкулеза и другой для обнаружения прочих микроорганизмов. Для первого препарата отбирают те же частицы, которые были предназначены для микроскопии, для второго — гнойные частицы. Взятый материал распределяют по предметному стеклу до получения достаточно тонкой ажурной сеточки (материал на первом стекле распределяют на 2/3 его поверхности, на втором — в центре).
Оба препарата фиксируют троекратным проведением над пламенем горелки. Первый препарат окрашивают по Цилю — Нильсену, второй — по Граму.
Для окраски препаратов по Цилю-Нильсену необходимы следующие краски и реактивы:
- Фуксин Циля: основного фуксина 1 г, глицерина 4 капли, этилового спирта 96° 10 мл, карболовой кислоты (5% раствор фенола) 5 мл, дистиллированной воды 90 мл. К фуксину, помещенному в фарфоровую ступку, прибавляют глицерин, хорошо растирают, постепенно приливают карболовую кислоту, спирт и воду. Фильтруют.
- 3% раствор солянокислого спирта: 3 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 и 97 мл 96° этилового спирта.
- 0,2 % водный раствор метиленовой синьки — 1 г метиленовой синьки растворяют в 500 мл дистиллирован- вой воды.
Техника окраски . На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги (уже и короче предметного стекла), на которую наливают в избытке фуксин Циля. Затем препарат нагревают до появления паров (достаточно троекратно медленно провести его над пламенем горелки), дают ему остыть в течение 3-5 минут, сбрасывают с помощью пинцета бумажку, промывают препарат водой и наливают на него 3% раствор солянокислого спирта для обесцвечивания на 20 секунд. После этого препарат промывают водой и вновь повторяют обесцвечивание. Материал должен быть серовато-розового цвета. Затем на препарат на 20-30 секунд наливают 1: 500 водный раствор метиленовой синьки, краску сливают, препарат промывают водой и высушивают, установив в вертикальном положении на полоску фильтровальной бумаги.
Высушенный препарат рассматривают под микроскопом с иммерсией, с поднятым конденсором.
В препарате микобактерии туберкулеза (рис. 60) красного цвета, нежные, тонкие, слегка изогнутые, иногда зернистые. Иногда обнаруживают микобактерип туберкулеза в виде так называемых осколков (в составе тетрады Эрлиха).
Рис. 60. Микобактерии туберкулеза в мокроте. 1 — окраска по Цилю-Нильсену, 2 — в люминесцентном микроскопе.
Все остальные элементы, в том числе и другие микроорганизмы, окрашены в синий цвет. С целью обнаружения мпкобактерий туберкулеза препарат тщательно исследуют, продвигая от одного продольного края к другому и поперек мазка. Во всех сомнительных случаях рекомендуют обработать препараты жавелевой водой
Результат исследования оформляют, используя следующую формулировку: «микобактерип туберкулеза не обнаружены» или «микобактерип туберкулеза обнаружены», и отмечают приблизительное их количество, например, «единичные в препарате», «единичные в поле зрения» и т. д.
В настоящее время находит все большее распространение люминесцентный способ обнаружения микобактерий туберкулеза в мокроте. Микобактерип туберкулеза имеют золотисто-желтое свечение на черном фоне препарата (рис. 60, 2).
В тех случаях, когда количество микобактерий туберкулеза в мокроте незначительно, для их обнаружения применяют метод обогащения (флотация), который состоит в следующем. В бутылку с нешироким горлышком (емкостью 250 мл) помещают 12-20 мл мокроты, добавляют равный объем 0,5% раствора КОН и встряхивают 5-10 минут. Затем приливают около 10 мл дистиллированной воды и 0,5-1 мл бензина или ксилола, взбалтывают 10-15 минут и доливают дистиллированную воду гак, чтобы горлышко бутылки было заполнено. Смесь оставляют на 1-2 часа до образования на поверхности жидкости сливкообразного слоя. На два предметных стекла, заранее расположенных на мостике над водяной баней, нагретой до 60-65°, каплями, с помощью пастеровской пипетки, 5-6 раз наносят сливкообразный слой, каждый раз после подсыхания предыдущей капли. Мазки окрашивают фуксином Циля на водяной бане (без дополнительной фиксации) в течение 10 минут, промывают водой, 3-4 минуты обесцвечивают 3% раствором солянокислого спирта, вновь обмывают водой, докрашивают 0,2% водным раствором метиленовой синьки, высушивают и исследуют под микроскопом.
Для окраски препаратов по Граму требуются следующие краски и реактивы:
- Разведенный фуксин Циля (фуксин Пфейффера): 1 часть фуксина Циля + 9 частей дистиллированной воды.
- Реактив Люголя.
- 1 % спиртовой раствор генцианвиолета — 1 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 96° этилового спирта. Этот раствор краски можно заменить бумажкой, приготовленной по методу Синева (белую фильтровальную бумажку пропитывают 1% спиртовым раствором генцианвиолета, затем высушивают и разрезают на мелкие квадратики соответственно размеру мазка).
Техника окраски . На фиксированный препарат накладывают бумажку Синева и смачивают ее водой (при отсутствии бумажки Синева ее заменяют белой фильтровальной бумажкой, на которую наносят несколько капель 1% спиртового раствора генцианвнолета). Через 1-2 минуты бумажку сбрасывают и на препарат наливают 1-2 капли реактива Люголя. Через 1-2 минуты препарат обесцвечивают 1-2 каплями 96° этилового спирта до появления бледно-серой окраски материала, смывают водой, на 10-15 секунд наносят сруксин Пфейффера, после чего вновь смывают водой и высушивают. В препаратах могут быть обнаружены (рис. 61) стафилококки, стрептококки, диплококки, палочки Пфейффера, спирохеты Плаута-Венсана, актиномицеты и другие микроорганизмы.
Рис. 61. Различные микроорганизмы в мокроте: диплококки (1), палочки Пфейффера (2), стрептококки (3), стафилококки (4), диплобациллы Фридлендера (5), симбиоз Венсана (6), мицелий актиномицет (7).
После проведенного исследования мокроту сжигают или обеззараживают. Последнее достигается следующими способами: а) автоклавированием в течение одного часа при 1,5 атм.; б) кипячением в течение одного часа в 1-2% растворе соды; в) обработкой 5% раствором лизола, карболовой кислоты или смесью, состоящей из равных объемов 5% раствора хлорамина и 5% раствора сернокислого аммония, в течение 12-24 часов. После обеззараживания посуду тщательно моют водой и высушивают.
Металлические предметы (шпатели, иглы) обеззараживают прокаливанием над огнем. Во избежание переноса микроорганизмов из одной порции мокроты в другую шпатель и иглу немедленно прокаливают после отбора соответствующих частиц.
Покровные стекла опускают в небольшую плоскую чашечку с 40% раствором серной кислоты на 12-24 часа. Затем кислоту сливают, а стекла неоднократно промывают водопроводной и дистиллированной водой. Вымытые стекла высушивают и используют для последующих исследований.
источник
Слизисто-гнойная, иногда слизисто-гнойно-кровянистая
Лейкоциты — большое количество, эритроциты, обильная флора, макрофаги.
Обильное (утренняя — «полным ртом»)
Лейкоциты — сплошь, кристаллы жирных кислот, гематоидина, холестерина, флора разнообразная, обильная.
Цилиндрический эпителий, кристаллы Шарко-Лейдена, эозинофилы.
Скудное вначале, обильное позже
Клейкая, ржавая вначале, позже слизисто-гнойная
Свёртки фибрина, изменённая кровь
Макрофаги, лейкоциты, эритроциты, кристаллы гематоидина, зёрнышки гемосидерина, пневмококки.
Обильное при прорыве абсцесса в бронх
Гнойная со зловонным запахом,
Сплошь лейкоциты, эластические волокна, кристаллы жирных кислот, гематоидина, холестерина, флора разнообразная, обильная.
Слизисто-гнойная, иногда с примесью крови
Рисовидные тельца («линзы Коха») при наличии каверн
Нахождение микобактерий туберкулёза, эластические волокна и различные кристаллы.
Обрывки ткани в обильной мокроте при распаде опухоли
БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОКРОТЫ.
Это этап исследования мокроты включает микроскопию препаратов, окрашенных по Циль-Нильсену для выявления микобактерий туберкулёза (кислотоустойчивых бактерий, КУБ), препаратов, окрашенных по Граму, для изучения микрофлоры мокроты (стрептококки, стафилококки, пневмококки). В последнем случае бактериоскопическое исследование имеет ориентировочное значение. Правильность выявлений этих бактерий всегда подтверждают посевом.
Техника приготовления окрашенных препаратов.
На край предметного стекла кладутся кусочки из мокроты, растираются другим предметным стеклом до гомогенной массы. Препарат должен занимать не более половины стекла, для удобства при приготовлении, фиксации и окраски. Затем препараты высушивают, фиксируют путём троекратного проведения над пламенем горелки и окрашивают.
Для бактериоскопического исследования готовят обычно два препарата: один для обнаружения микобактерий туберкулёза, другой – для обнаружения прочих микроорганизмов. Для первого препарат отбирают частицы, которые были предназначены для микроскопии, для второго – гнойные частицы.
Первый препарат окрашивают по методу Циль-Нильсену, а второй по Граму.
3. Водный 0,5% р-р метиленовой сини.
1. На препарат кладут квадратик фильтровальной бумаги.
2. Наливают р-р карболового фуксина Циля.
3. Препарат нагревают над пламенем горелки до 3-х кратного отхождения пара.
5. Сбрасывают бумажку и опускают препарат в солянокислый спирт для обесцвечивания.
6. Промывают препарат водой.
7. Докрашивают препарат метиленовым синим в течение 20-30 сек.
8. Промывают водой и высушивают на воздухе.
9. Микроскопируют с иммерсионной системой.
Микобактерии туберкулёза окрашиваются в красный цвет , а все остальные элементы — в синий. Микобактерии имеют вид точек, слегка изогнутых, расположенных группами или поодиночке.
Если микобактерий с мокротой выделяется мало, то в обычных мазках их не находят и прибегают к методу накопления (обогащения).
МЕТОД ОБОГАЩЕНИЯ ПО ПОТТЕНДЖЕРУ.
1. 10-15 мл свежевыделенной мокроты помещают в узкогорлую бутылку.
2. Доливают двойным объёмом 0,5% р-ра NaOH или КОН.
3. Смесь энергично встряхивают 10-15 мин.
4. Добавляют 1 мл летучего вещества (ксилола, толуола, бензола) и 100 мл воды.
5. Снова встряхивают 10-15 мин.
6. Доливают дистиллированной воды до горлышка.
7. Оставляют на один час для отстаивания.
8. Верхний беловатый слой (флотационное кольцо) снимают пипеткой по каплям и наносят на предметные стекла, подогретые на воздушной бане до 60 0 С. Каждую новую каплю наносят на высохшую предыдущую.
10. Красят по Циль-Нильсену.
МЕТОД СЕДИМЕНТАЦИИ МОКРОТЫ.
1. 1 часть мокроты смешивается с 2 частями 10% трёхзамещённого фосфорнокислого натрия ( Na 12 H 2 О).
2. Смесь ставят в термостат на 1 сутки (можно не ставить).
3. Слить надосадочную жидкость.
4. 10 мл надосадочной жидкости центрифугируют при 2000 об/мин в течение 12 мин.
5. Быстро сливают надосадочную жидкость.
6. Из осадка делают препараты, высушивают при Т 90 0 С в течение 30 мин., затем окрашивают по Цилю-Нильсену.
Метод седиментации предпочтительнее, так как при флотации по Поттенджеру образуется аэрозоль, что увеличивает риск заражения мед.персонала.
3. 1% Карболовый раствор генцианового фиолетового.
1. На фиксированный препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги.
2. Наносят несколько капель 1% карболового раствора.
3. Через 1-2 мин бумажку сбрасывают и на препарат наливают 1-2 капли реактива Люголя.
4. Через 1-2 мин препарат обесцвечивают 96 0 этиловым спиртом.
5. Препарат промываю водой и докрашивают фуксином Пфейффера 10-15 сек.
6. Промывают водой и высушивают.
7. Микроскопируют с иммерсионной системой.
Грамположительные бактерии окрашивают в фиолетовый цвет (синий), а грамотрицательные – в красный цвет.
В препаратах, окрашенных по Граму, обнаруживают пневмококки, стрептококки, стафилококки, актиномицеты и другие микроорганизмы.
ОКРАСКА МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ.
1. На приготовленный препарат наливают краску так, чтобы она покрывала всё стекло.
2. Через 2-3 мин краску смывают водой.
3. Препарат высушивают и микроскопируют.
Окраска метиленовым синим — это ориентировочное ознакомление с клеточным и бактериальным составом мокроты.
ОКРАСКА ПРЕПАРАТА ПО ЛЕЙШМАНУ
ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Основным свойством клеток злокачественной опухоли является морфологическая и биологическая анаплазия (потеря способности клетки к дифференцированию и нарушение биохимических свойств):
1. Полиморфизм размеров и формы клеток.
2. Особенности структуры ядра (неравномерное распределение хроматина в ядрах, что обуславливает неравномерность окраски этих ядер, изменение цитоплазмы).
3. Особенности цитоплазмы (дистрофические и дегенеративные изменения (включение обломков клеток или целых клеточных образований)).
источник
Клиника-Мокрота Комплект №1 ЗАО ЭКОлаб № ФСР 2008/02613 от 30.04.2008
38.05 Набор реагентов для клинического анализа мокроты:
ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА МОКРОТЫ
(«Клиника – Мокрота»)
Набор предназначен для проведения бактериоскопического и микроскопического исследования мокроты в клинико-диагностических лабораториях лечебно — профилактических учреждений.
Набор рассчитан на проведение 200 проб при определении кислотоустойчивых микобактерий (КУМ), 100 проб при обнаружении альвеолярных макрофагов с гемосидерином, 300 проб при определении клеток злокачественных новообразований.
- Характеристика набора
2.1. Принцип метода
Обнаружение кислотоустойчивых микобактерий
Метод окраски кислотоустойчивых микобактерий по Цилю-Нильсену основан на использовании нескольких специальных методических приемов:
- Окраска фуксином (с подогреванием) – при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия фенола (карболовая кислота) повышается способность красителя проникать в микробную клетку и, особенно, в структуры её клеточной стенки, состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются фуксином в красный цвет.
- Обесцвечивание. Обработка окрашенных фуксином препаратов 25 % раствором серной кислоты приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не обладающие достаточной гидрофобностью и стойкостью к разрушению в кислоте (кислотоустойчивостью). Только кислотоустойчивые микроорганизмы остаются после обесцвечивания окрашенными в малиново-красный цвет. Сапрофитные микроорганизмы, также окрашенные фуксином, обесцвечиваются.
- Контрастирующая окраска – обесцвеченные элементы мазка докрашивают метиленовым синим для придания контрастности препарату при поиске КУМ.
Обнаружения альвеолярных макрофагов с гемосидерином
Аморфные кристаллы гемосидерина (окислы железа жёлтого цвета), расположенные внутриклеточно, при внесении в нативный препарат мокроты раствора калия железистосинеродистого и раствора соляной кислоты вступают в реакцию с образованием берлинской лазури – соединения, окрашенного в голубой или сине – зеленый цвет.
Обнаружение клеток, характерных для воспалительных и злокачественных процессов в лёгких.
Метод основан на воздействии азур – эозиновых красителей типа Май – Грюнвальда и Романовского на клеточные элементы мокроты. Клетки приобретают различную окраску: ядра окрашиваются в тёмно – фиолетовый цвет; ядрышки — в голубой; цитоплазма, в зависимости от её принадлежности к той или другой клетки, принимает соответствующую окраску от розовато – сероватого, бледно – голубого до синего.
2.2. Состав набора
- Карболовый фуксин по Цилю-Нильсену — 2 флакона (по 100 мл);
- Кислота серная, 25 % объем. — 2 флакона (по 100 мл);
- Метиленовый синий, 1 % — 2 флакона (по 100 мл);
- Калий железистосинеродистый, 5 % — 1 флакон (10 мл);
- Кислота соляная, 5 % — 1 флакон (10 мл);
- Краситель эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду — 1 флакон (100 мл);
- Краситель азур-эозин по Романовскому — 1 флакон (100 мл);
- Фосфатный буфер (сухая смесь) – 1 флакон (на 2 л).
- Бумага фильтровальная размером 4,5×2,5 см — 200 полосок.
- Аналитические и диагностические характеристики набора
Кислотоустойчивые микобактерии (КУМ)
Пределы метода световой микроскопии при окраске мазков по Цилю-Нильсену позволяют выявить кислотоустойчивые микроорганизмы при их содержании 5000 – 10000 и более микробных клеток в 1 мл мокроты, что характерно для больных с прогрессирующими формами процесса. Больные с малыми формами заболевания без деструкции лёгочной ткани выделяют значительно меньшее количество КУМ, что может быть ниже предела обнаружения данным методом. Чувствительность метода можно повысить, увеличивая кратность обследования пациента.
Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диагноза туберкулёза.
Гемосидерин – обнаруживают в мокроте при застое в малом круге кровообращения, застойных явлениях в лёгком другой этиологии, инфаркте лёгкого, кровоизлиянии, крупозной пневмонии и др.
Клетки злокачественных новообразований и воспалительных процессов
Величина, цвет и форма ядра и клетки, нарушенное ядерно – цитоплазматическое соотношение, число ядер в клетке, наличие и величина ядрышек, а также другие критерии позволяют обнаружить злокачественные клетки. Злокачественные клетки располагаются на фоне клеточных элементов воспаления, таких как нейтрофилы, альвеолярные макрофаги, моноциты, клетки цилиндрического мерцательного эпителия, а при аллергическом процессе – эозинофилов и неклеточных элементов, таких как спирали Куршмана и кристаллы Шарко – Лейдена.
- Меры предосторожности при работе с набором.
Потенциальный риск применения набора – класс 2а.
В состав набора входит фенол, фуксин, метиленовый синий, калий железистосинеродистый, краситель эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду, краситель азур-эозин по Романовскому, кислота серная и кислота соляная. При работе с ними следует соблюдать осторожность и не допускать попадания на кожу и слизистые; при попадании
немедленно промыть пораженной место большим количеством проточной воды. При проглатывании следует выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.
Меры предосторожности – соблюдение «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемио-логических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.), и «Инструкции по унифицированным методам микроскопических исследований для выявления кислотоустойчивых микобактерий в клиникодиагностических лабораториях лечебно — профилактических учреждений» (Приказ МЗ РФ № 109 от21.03.03, Приложение № 10).
При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.
- Оборудование, материалы, реагенты:
- лотки для сушки и окраски мазков;
- спиртовая или газовая горелка для фиксации препарата и подогревания его при окрашивании карболо- вым фуксиином;
- штатив для просушивания окрашенных стёкол на воздухе в вертикальном или наклонном положении;
- штатив («рельсы») для окраски мазков на предметных стёклах;
- емкости для фиксации и окраски;
- пинцет или щипцы для взятия предметных стёкол с препаратами;
- пипетки глазные, палочки стеклянные;
- стёкла предметные;
- микроскоп;
- таймер;
- чашки Петри;
- бумага фильтровальная;
- вода дистиллированная;
- масло иммерсионное;
- перчатки резиновые или пластиковые.
- Анализируемые пробы
Мокрота и некоторые другие материалы (экссудат, мазки – отпечатки с биопсийного и операционного материала).
Для окраски по методу Циля – Нильсена срок хранения мокроты в течение 48 – 72 часов при комнатной температуре (18-25) °С.
Для окраски по Романовскому, с целью обнаружения клеток воспаления и/или новобразования, материал должен быть свежесобранным. Срок хранения не более 2 часов.
Препараты, приготовленные из исследуемого материала, могут храниться 3 — 5 дней при комнатной температуре.
- Проведение анализа
7.1. Приготовление рабочих растворов реагентов
7.1.1. Приготовление фосфатного буферного раствора, рН 6,8-7,2
К содержимому флакона с сухой смесью реактивов для приготовления фосфатного буфера добавить 20 мл дистиллированной воды, растворить при перемешивании.
Добавить полученный концентрат к 2 л дистиллированной воды, перемешать.
Для приготовления небольшого количества буферного раствора смешать полученный концентрат с дистиллированной водой в соотношении 1:100.
Концентрат фосфатного буферного раствора можно хранить при температуре (2-8) °С в течение года.
Фосфатный буферный раствор можно хранить в плотно закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение 3 месяцев, а при комнатной температуре (18-25) °С не более месяца.
7.1.2. Приготовление рабочего раствора красителя азур-эозин по Романовскому
Краситель азур-эозин по Романовскому разбавить фосфатным буферным раствором (см. п.7.1.1) в соотношении 1:10.
Рабочий раствор красителя азур-эозин по Романовскому стабилен при комнатной температуре в течение 8 часов.
7.1.3. Реагенты готовые к применению:
— карболовый фуксин по Цилю-Нильсену;
— калий железистосинеродистый, 5 %;
— краситель эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду.
Реагенты можно хранить при комнатной температуре в плотно закрытых флаконах, в защищенном от света месте в течение всего срока годности набора.
7.2. Проведение анализа
7.2.1. Обнаружение кислотоустойчивых микобактерий
7.2.1.1. Приготовление препаратов из нативной мокроты
Из разных участков образца мокроты выбрать 2-3 гнойных небольших комочка, перенести на новое (не поцарапанное) предметное стекло и с помощью уголка другого предметного стекла равномерно растереть тонким слоем бли-
же к одному или другому краю предметного стекла на площади размером приблизительно 2×2 или 1,5×2 см в виде круга или овала.
Примечание: При приготовлении препарата для микроскопического исследования необходимо добиться его правильной толщины. Слишком тонкий мазок содержит мало материала, что может привести к ложноотрицательному результату. Слишком толстый мазок трудно хорошо зафиксировать, окрасить. По окончании окраски материал, недостаточно плотно фиксированный на стекле, может быть частично или полностью смыт водой. Толстый препарат плохо просматривается при микроскопическом исследовании.
Не рекомендуется готовить препараты с помощью «растяжки» мокроты между двух предметных стекол или растирания мокроты между двух предметных стекол. Эти способы приготовления препаратов мокроты сопровождается образованием биологически опасного аэрозоля и загрязняют инфицированным материалом края предметных стёкол.
Приготовленные препараты положить на лотки, выстланные фильтровальной бумагой, и высушить при комнатной температуре в течение 15 – 30 минут.
Высушенный на воздухе препарат зафиксировать над пламенем спиртовой или газовой горелки. Для этого стекло с сухим препаратом трижды медленно провести через верхнюю треть пламени до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания препарата в пламени не должна превышать 3 – 5 секунд.
Не допускается фиксация над пламенем горелки сырых препаратов мокроты.
Предметные стёкла с зафиксированными препаратами поместить на штатив для окраски так, чтобы расстояние между ними составляло примерно 1 см.
На каждое стекло положить полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала только препарат. Это предотвращает в дальнейшем распределение краски по всему стеклу.
Налить с помощью пипетки на бумагу с избытком раствор карболового фуксина по Цилю-Нильсену.
Внести стекло с препаратом в пламя горелки и дождаться появления пара, что означает закипание на препарате мокроты карболового фуксина по Цилю-Нильсену.
Повторить эту процедуру ещё раз.
Примечание: При подогревании препарата необходимо следить за тем, чтобы фильтровальная бумага, смоченная карболовым фуксином по Цилю-Нильсену, оставалась влажной до конца третьей процедуры. При трёхкратном появлении пара над препаратом мокроты происходит стойкое прокрашивание липоидной оболочки КУМ
Подогретый мазок оставляют на 3-5 минут, чтобы краситель проник в клеточную систему микобактерий и окрасил её.
Снять с помощью пинцета фильтровальную бумагу.
Остатки краски осторожно смыть с обратной стороны предметного стекла слабой струёй холодной воды, пока не прекратится видимое отхождение фуксина.
Стекло с препаратом вновь положить на «рельсы».
Покрыть полностью всю поверхность препарата 25 % серной кислотой (обесцвечивающим раствором) на 3 минуты, т.е. полного до обесцвечивания.
Тщательно смыть серную кислоту холодной водой с обратной стороны предметного стекла.
Залить препарат 1 % раствором метиленового синего на 1-2 минуты.
Смыть метиленовую синь с препарата холодной водой с обратной стороны предметного стекла.
Высушить окрашенный препарат на воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.
Препарат не следует промокать фильтровальной бумагой.
Микроскопировать с иммерсионной системой.
7.2.2. Обнаружение альвеолярных макрофагов с гемосидерином
С нативного препарата мокроты, в котором обнаружены альвеолярные макрофаги желтовато-коричневого цвета с единичными крупными и многочисленными мелкими включениями в цитоплазме, подозрительные на содержание в них аморфных кристаллов гемосидерина, осторожно, под контролем малого увеличения микроскопа, снять покровное стекло. На препарат нанести каплю 5% раствора калия железистосинеродистого («жёлтой кровяной соли»), смешать с мокротой уголком покровного стекла, добавить такую же по размеру каплю 5 % соляной кислоты, вновь смешать и накрыть препарат покровным стеклом. Выдержать 10-15 мин и микроскопировать при малом увеличении.
7.2.3. Обнаружение клеточных элементов, характерных для воспалительных и злокачест-венных новообразований
Нативные препараты мокроты фиксируют фиксатором – красителем эозин-метиленовым синим по Май-Грюнвальду, а затем докрашивают рабочим раствором азур – эозин по Романовскому.
На препарат, высушенный на воздухе, налить краситель эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду так, чтобы он покрыл всё стекло (1-1,5 мл), или опустить в ёмкость с красителем эозин-метиленовым синим по Май-Грюнвальду, выдержать в течение 3-5 мин. После окончания фиксации, краситель смыть слабой струёй воды с обратной стороны предметного стекла с препаратом мокроты.
Стекло с зафиксированным препаратом мокроты вновь положить на «рельсы» налить рабочий раствор красителя азур-эозин по Романовскому (см. п. 7.1.2) 2 – 2,5 мл так, чтобы он покрыл весь мазок, или опустить в ёмкость для окраски препаратов.
Время окраски препаратов подобрать предварительно на нескольких фиксированных мазках: экссудат 7 – 10 мин, мокрота 30 – 40 мин.
По окончании окрашивания краску с препарата слить и промыть препарат водопроводной холодной водой, направляя её на обратную сторону предметного стекла. Препарат высушить на воздухе и микроскопировать с иммерсионной системой.
- Регистрация результатов
Микроскопию нативных препаратов провести при малом (объектив 8×, окуляр 10×) и большом (объектив 40×, окуляр 10×) увеличениях микроскопа.
Микроскопирование окрашенных препаратов провести с иммерсионной системой (объектив 90×, окуляр 10×).
- Учет результатов реакций
Кислотоустойчивые микобактерии (КУМ)
Оболочка КУМ окрашивается фуксином по Цилю — Нильсену в малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные элементы обесцвечиваются серной кислотой и окрашиваются метиленовым синим — в голубой.
Градация результатов микроскопического исследования при окраске по методу Циля — Нильсена:
исследования
Гемосидерин — альвеолярные макрофаги, содержащие гемосидерин (окислы железа жёлтого цвета), в результате реакции с калием железистосинеродистым в солянокислой среде окрашиваются в синий или сине-зеленый цвет.
Клетки злокачественных новообразований – морфологию этих клеток определить по руководству по цитологии (полиморфизм их размеров, нарушение ядерно — цитоплазматического соотношения в сторону увеличения ядра, изменение формы ядра, наличие в нём множественных ядрышек неправильной формы, митоз клеток).
Клетки воспаления — альвеолярные макрофаги («пылевые клетки»), макрофаги с миелином, гистиоциты, моноциты, эозинофилы, цилиндрический эпителий и др. Морфологию этих клеток и образований определить по руководству по гематологии и цитологии.
- Условия хранения и эксплуатации набора
Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при комнатной температуре (18-25) °С в защищенном от света месте в течение всего срока годности.
Рабочий раствор красителя азур-эозин по Романовскому стабилен при комнатной температуре в течение 8 часов.
Концентрат фосфатного буферного раствора можно хранить при температуре (2-8) °С в течение года.
Фосфатный буферный раствор можно хранить при температуре (2-8) °С в течение 3-х месяцев, при комнатной температуре (18-25) °С не более месяца в плотно закрытом флаконе.
Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
По вопросам, касающимся качества набора «Клиника — Мокрота», следует обращаться по адресу 142530, Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1. ЗАО «ЭКОлаб»; тел/факс (49643) 3-30-93, 3-30-85 — отдел сбыта.
Набор разрешен к производству, продаже и применению на территории Российской Федерации.
Регистрационное удостоверение № ФСР 2008/02613 от 30.04.2008
источник
Исследование мокроты предусматривает определение физических свойств мокроты, ее микроскопическое исследование в нативном мазке и бактериологическое исследование в окрашенных препаратах.
Мокроту, получаемую при откашливании утром до приема пищи, собирают в чистую сухую склянку. Перед исследованием больной должен почистить зубы и тщательно прополоскать рот водой.
Мокроту помещают в чашку Петри, рассматривают на светлом и темном фоне, описывают ее свойства. Количество мокроты за сутки при различных патологических процессах может быть различно: так например, при бронхите — скудное (5-10 мл), при абсцессе легкого, бронхоэктазах — большое количество (до 200—300 мл).
Деление на слои наблюдается в случаях опорожнения больших полостей в легком, например, абсцесса легкого. В этом случае мокрота образует 3 слоя: нижний слой состоит из детрита, гноя, верхний слой — жидкий, на поверхности его иногда имеется третий — пенистый слой. Такую мокроту называют трехслойной.
Характер: характер мокроты определяет содержание слизи, гноя, крови, серозной жидкости, фибрина. Характер ее может быть слизистый, слизисто-гиойный, слизисто-гнойно-кровянистый и т.п.
Цвет: зависит от характера мокроты, от выдыхаемых частиц, которые могут окрашивать мокроту. Так например, желтоватый, зеленоватый цвет зависит от наличия гноя, «ржавая» мокрота -от распада эритроцитов, встречается при крупозной пневмонии. Прожилки крови в мокроте или красная мокрота может быть при примеси крови (туберкулез, бронхоэктазы). Серый и черный цвет придает мокроте уголь.
Консистенция: зависит от состава мокроты, жидкая — в основном от наличия серозной жидкости, клейкая — при наличии слизи, вязкая — фибрина.
Запах: свежевыделенная мокрота обычно без запаха. Неприятный запах свежевыделенной мокроты обычно появляется при абсцессе легкого, при гангрене легкого — гнилостный.
Нативные препараты готовят, выбирая материал из разных мecт мокроты, берут также для исследования все частицы, выделяющиеся окраской, формой, плотностью.
Отбор материала производят металлическими палочками, помещают его на предметное стекло и покрывают покровным. Материал не должен выходить за покровное стекло.
Лейкоциты: всегда содержатся в мокроте, количество их зависит от характера мокроты.
Эозинофилы: распознаются в нативном препарате по более темной окраске и наличию в цитоплазме четкой, одинаковой, преломляющей свет зернистости. Часто располагаются в виде больших скоплений. Эозинофилы встречаются при бронхиальной астме, других аллергических состояниях, гельминтозе, эхинококке легкого, новообразованиях, эозинофильном инфильтрате.
Эритроциты: имеют вид дисков желтого цвета. Единичные эритроциты могут встречаться в любой мокроте, в большом количестве — в мокроте, содержащей примесь крови: новообразованиях легкого, туберкулезе, инфаркте легкого.
Клетки плоского эпителия: попадают в мокроту из полости рта, носоглотки, большого диагностического значения не тлеют.
Цилиндрический мерцательный эпителий: выстилает слизистую оболочку гортани, трахеи, бронхов. В большом количестве обнаруживается при острых катарах верхних дыхательных путей, бронхитах, бронхиальной астме, новообразованиях легкого, пневмосклерозе и др.
Альвеолярные макрофаги: большие клетки различной величины, чаще круглой формы, с наличием в цитоплазме включений черно-бурого цвета. Встречаются чаще в слизистой мокроте с небольшим количеством гноя. Обнаруживаются при различных патологических процессах: пневмонии, бронхитах, профессиональных заболеваниях легких и др. Альвеолярные макрофаги, содержащие гемосидерин, старое название — «клетки сердечных пороков», имеют в цитоплазме золотисто-желтые включения. Для их выявления применяют реакцию на берлинскую лазурь. Ход реакции: кусочек мокроты помещают на предметное стекло, прибавляют 2 капли 5% раствора соляной КИОЛОТЫ и 1-2 капли 5% раствора желтой кровяной соли. Перемешивают стеклянной палочной и по-крывают покровным стеклом. Гемосидерин, лежащий внутриклеточно, окрашивается в голубой или синий цвет. Эти клетки обнаруживаются в мокроте при застойных явлениях в легких, инфарктах легкого.
Жирное перерождение клетки (липофаги, жировые шары): чаще округлые, цитоплазма их заполнена жиром. При прибавлении к препарату судана Ш капли окрашиваются в оранжевый цвет. Группы таких клеток встречаются при новообразованиях легкого, актиномикозе, туберкулезе и др.
Эластические волокна: в мокроте имеют вид извзитых блестящих волокон. Как правило располагаются на фоне лейкоцитов и детрита. Наличие их указывает на распад ткани легкого. Обнаруживаются при абсцессе, туберкулезе, новообразованиях легкого.
Коралловые волокна: Грубые ветвящиеся образования с бугристыми утолщениями вследствие отложения на волокнах жирных кислот и мыл. Их обнаруживают в мокроте при кавернозном туберкулезе.
Обызвествленные эластические волокна — грубые, пропитанные солями извести палочковидные образования. Обнаруживают при распаде петрифицированного очага, абсцессе легкого, новообразованиях, Элемента распада петрифицированнго очага носят название тетрады Эрлиха: I) обызвествленные эластические волокна; 2)аморфные соли извести; 3) кристаллы холестерина; 4) микобактерии туберкулеза.
Спирали Куршмана_- уплотнены, закрученные в спираль слизевые образования. Центральная часть резко преломляет свет и выглядит спиралью, по периферии свободно лежащая слизь образует мантию. Спирали Куршмана образуются при бронхиальной астме.
Кристаллические образования: кристаллы Шарко-Лейдена, вытянутые блестящие ромбы, можно обнаружить в желтоватых кусочках мокроты, содержащих большое количество эозинофилов. Их образование связывают с распадом эозинофилов,
Кристаллы гематоидина: имеют форму ромбов и иголок золотистого цвета. Образуются при распаде гемоглобина при кровоизлияниях, распаде новообразований. В препарате мокроты видны обычно на фоне детирита, эластических волокон.
Кристаллы холестерина: бесцветные четырехугольники с обломанными ступенеобразным углом, обнаруживаются при распаде жирно перерожденных клеток, в полостях. Встречаются при туберкулезе, абсцессе легкого, новообразованиях.
Пробки Дитриха: мелкие желтовато-серые зернышки с неприятным запахом, содержатся в гнойной мокроте. Микроскопически представляют собой детрит, бактерии, кристаллы жирных кислот в виде игл и капелек жира. Образуются при застое мокроты в полостях при абсцессе легкого, бронхоэктазах.
Исследование на туберкулезные микобактерии: Препарат готовят из гнойных частиц мокроты, высушивают
на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Окрашивают по
Методика окрашивания: Реактивы:
2) 2% спиртовой раствор соляной кислоты,
3) водный раствор 0,5% метиленового синего.
1. На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина.
2. Препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (так 3 раза).
3. С остывшего стекла снимают фильтровальную бумагу. Обесцвечивают мазок в солянокислом спирте до полного отхождения краски.
5. Докрашивают препарат метиленовнм синим 20-30 секунд.
6. Промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. Туберкулезные микобактерии окрашиваются в красный цвет,
все остальные элементы мокроты и бактерии — в синий. Туберкулезные микобактерии имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек с утолщениями на концах или посередине.
При окраске по Цилю-Нильсону в красный цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. Дифференциальная диагностика туберкулезных микробактерий и кислотоупорных сапрофитов ведется методами посева и заражения животных.
Исследование мокроты может проводиться также методом флотации. Метод Потенжера: ход исследования:
1. Свежевыделенную мокроту (не более 10-15 мл) помещают в узкогорлую бутылку, приливают двойное количество едкой щелочи, смесь энергично встряхивают (10-15 мин).
2. Приливают I мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 100 мл дистиллированной вода для разжижения мокроты. Снова встряхивают 10-15 мин.
3. Доливают дистиллированную воду до горлышка бутылки и оставляют стоять на 10-50 мин.
4. Образовавшийся верхний слой (беловатый) снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предварительно нагретые до 60°. Каждую последующую каплю наносят на подсохшую предыдущую.
5. Препарат фиксируют и красят по Цилю-Нильсону.
Исследование на другие бактерии:
Другие бактерии, встречающиеся в мокроте, например, стрептококки, стафилококки, диплобациллы и др. могут быть распознаны только методом посева. Бактериологическое исследование препарата в этих случаях имеет только ориентировочное значение. Препараты красят метиленовым синим, фуксином или по граму. Окраска по Граму: Реактивы: I) карболовый раствор генцианвиолета,
4) 40% раствор карболового фуксина.
1. На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги, наливают раствор генцианвиолета, красят 1-2 мин.
2. Бумажку снимают и препарат заливают раствором Люголя на 2 минуты.
3. Раствор Люголя сливают и прополаскивают препарат в спирте до серого цвета.
4. Промывают водой и окрашивают 10-15 секунд раствором фуксина.
| 5. МОКРОТА ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ПАТОЛОГИИ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ | |||
| Нозологическая форма | Колич. Макрос. Хар-р изучен. | Микроскопия | |
| I | |||
| Бронхит | Скудное,за- | Цилиндрический эпи- | |
| тем боль- | телий ,лейкоциты,иног- | ||
| шое. Слизи — | да эритроциты,много | ||
| стая или | флоры,макрофаги . | ||
| слизисто- | |||
| гнойная | |||
| Бронхопневмо- | Большое | Цилиндрический эпите- | |
| ния | количество | лий, альвеолярный эпи- | |
| слизистой | телий, лейкоциты, | ||
| -или слизис- | пневмококки | ||
| ТО-ГНОЙНОЙ | |||
| Крупозная | Скудное,за- | Свертки | Макрофаги, лейкоциты, |
| пневмония | тем обиль- | фибрина, | эритроциты, кристал- |
| ное к-во | изменен- | лы гематоидина, | |
| ржавой мо- | ная | гемосидерин, пневмо- | |
| кроты | кровь | кокки | |
| Бронхиальная | Скудное, | Спирали | Цилиндрический эпи- |
| астма | слизистая | Куршмана | телий, кристаллы |
| Шарко-Лейдена, | |||
| эозинофилы | |||
| Бронхоэктати- | Обильное | Пробки | Лейкоциты сплошь, |
| ческая бо- | (утром- | Дитриха | кристаллы жирных |
| лезнь | полным | кислот,гематоидина, | |
| ртом) | холестерина, обильная разнообразная флора |
Приложение: посуда и оборудование: Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Смотрят с иммерсией.
2. Инструменты для отбора мокроты: металлические палочки с расплющенными концами, препаровальные иглы и др.
7. Дезинфицирующая жидкость.
Абсцесс легкого Обильное, гнойная, со зловонным запахом Обрывки ткани легкого. Сплошь лейкоциты, эластические волокна, кристаллы жирных кислот, гематоидина, хо-лестерша, разнообразная обильная флора
Различное, рисовидные тельца слизисто-гнойная, иногда с примесью крови Микобактерии туберкулёза, эластические волокна, различные кристаллы
Различное, слизисто-кровянистое Обрывки ткани. Атипические клетки.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8334 — 
| 7954 — 
или читать все.
193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
Клинический анализ мокроты и бронхо-альвеолярной жидкости
Это патологическое отделяемое, выделяющееся с кашлем из органов дыхания при их заболеваниях.
Главные компоненты мокроты: слизь, серозная жидкость, клеточные элементы крови и дыхательных путей, фибрин, микробная флора.
Цель исследования мокроты: установить характер, локализацию, этиологию патологического процесса.
Требования к получению материала
Сбор материала: утро, после туалета полости рта. Получают мокроту путем откашливания, а не отхаркивания – в чистую сухую стеклянную широкогорлую банку или чашку Петри (в специализированных стационарах – в специальную плевательницу – градуированные стеклянные баночки с герметически закрывающимися крышками). Материал доставляют сразу, хранение нежелательно.
Особенности работы с мокротой
С мокротой работают как с заразным материалом:
v Чашки с материалом не взбалтывать во избежание образования инфицирующих аэрозолей.
v Готовить и окрашивать препараты необходимо в вытяжном шкафу.
v Все манипуляции выполнять на специальном лотке (дезинфекция каждый день огнем либо хлорамином). Столы смачивать дезраствором на 6 часов, а затем промывать теплым содовым раствором.
v По окончании работы остатки мокроты слить в специальную посуду и обеззаразить сухой хлорной известью в соотношении 1:5 в течение 1 часа.
v Микроскоп протереть 70 0 спиртом.
Клинический анализ мокроты
Ø определение физических свойств
Ø микроскопия нативного материала и окрашенных мазков
Физические свойства мокроты
Количество мокроты – определяется в мерной стеклянной посуде. Небольшое — при острых воспалительных заболеваниях бронхов и легких.
Большое (200-300 мл) — из полостей в легочной ткани.
Расслоение мокроты при стоянии (следствие разницы в относительной плотности составных частей):
на 3 слоя – пенистый, серозный, гнойный — при гнилостном бронхите, гангрене легких, бронхоэктазах.
на 2 слоя — серозный, гнойный — при абсцессе легкого: верхний – серозный.
Определяют, располагая чашку с мокротой на белом фоне.
v Слизистая и серозная бесцветная или беловато-серая.
v Гнойная- зеленовато-желтая.
v Разные оттенки красного — при появлении крови.
v Ржавая — при крупозной пневмонии, туберкулезе легких с распадом, инфаркте легкого.
Консистенцию определяют с помощью препаровальной иглы над чашкой Петри.
v Мокрота почти вся тянется за иглой — консистенция тягучая (гной).
v Тянется в виде толстой нити – вязкая (слизь, гной).
v Тянется в виде тонкой и быстроотрывающейся нити — умеренно вязкая (слизь, гной).
v Не приподнимается над чашкой – студенистая (примесь фибрина).
v полужидкая и жидкая консистенция (серозная).
v Запаха обычно не имеет. Зловонный, гнилостный при задержке в бронхах и при распаде легочной ткани.
Определяется при осмотре, зависит от соотношения различных компонентов:
Ø кровянисто-слизистая и т д.
Преобладающий субстрат ставят на первое место.
Дополнительные признаки при осмотре мокроты
v Наличие патологических примесей (кусочки ткани при распаде злокачественной опухоли, рисовидные зерна при туберкулезе)
v спирали Куршмана (плотные извитые нити — при бронхиальной астме)
v пробки Дитриха — небольшие беловато-сероватые комочки, при раздавливании издающие зловонный запах — при хроническом абсцессе, бронхоэктатической болезни. Состоят из детрита, бактерий, жирных кислот, капелек жира.
v друзы актиномицетов — желтоватые зернышки в виде крупы — при актиномикозе
Включает изучение нативных и окрашенных препаратов.
Подготовка к исследованию: Узким шпателем или иглой выбрать кусочек величиной с булавочную головку →на предметное стекло, накрыть покровным стеклом (материал не должен выходить за пределы покровного стекла).
Ø под малым увеличением (7х8) – обнаружение элементов, встречающихся в мокроте в небольшом количестве (эластические волокна, спирали Куршмана и т.д.)
Ø под большим (7х40) — детальное исследование мазка. При необходимости окрашивания покровное стекло сдвигают, отмечают на предметном интересующее место, затем препарат высушивают и окрашивают.
N.B! Необходимо исследовать все частицы, отличающиеся от фона мокроты.
Элементы нативного препарата мокроты
v волокнистые образования
v кристаллические образования
Клеточные элементы нативного препарата мокроты
v Плоский эпителий – из полости рта. Единичный встречается всегда. Большое количество — примесь слюны. Диагностического значения не имеет.
v Цилиндрический мерцательный эпителий — эпителий слизистой оболочки бронхов и трахеи — в больших количествах при бронхиальной астме и остром бронхите.
Клеточные элементы нативного препарата мокроты (продолжение)
Лейкоциты —встречаются в любой мокроте. В слизистой мокроте — едининичные, а в гнойной -сплошь покрывают поле зрения.
Эритроциты — единичные в любой мокроте, в большом количестве в кровянистой мокроте при застое, инфаркте легких.
Альвеолярные макрофаги — при бронхитах, пневмониях и профессиональных заболеваниях легких (пылевые клетки — кониофаги), застойных явлениях в легких (сидерофаги – Мф, содержащие гемосидерин, определяют реакцией на берлинскую лазурь). пороках сердца.
Опухолевые клетки попадают в мокроту при распаде опухоли в бронхах.
Волокнистые образования в нативном препарате мокроты
Эластические волокна – элементы соединительной ткани. Следствие деструкции ткани. Имеют вид извитых, блестящих, тонких волокон. Обнаруживаются при туберкулезе, абсцессе, гангрене, новообразованиях.
Обызвествленные эластические волокна – грубые, толстые, пропитанные солями палочковидные образования — при распаде петрифицированного туберкулезного очага.
Спирали Куршмана –образуются при спастическом состоянии бронхов и наличии в них слизи. Во время кашлевого толчка вязкая слизь выбрасывается в просвет более крупного бронха, закручиваясь спиралью. Появляются при БА, бронхитах, иногда при опухолях легкого, сдавливающих бронхи.
Кристаллические образования в нативном препарате мокроты
Кристаллы Шарко-Лейдена – образуются из распадающихся эозинофилов. Для выявления необходимо выдерживание мокроты в течение 24 часов. Встречаются при БА (и на высоте приступа и в межприступном периоде)., при глистных поражениях легких.
Кристаллы гематоидина – продукт распада гемоглобина. Образуются в глубине гематом и обширных кровоизлияний, в некротизированной ткани.
Кристаллы холестерина – образуются при распаде жироперерожденных клеток, при задержке мокроты в полостях — при туберкулезе, новообразованиях, абсцессе.
Тетрада Эрлиха – обызвествленный детрит, обызвествленные эластические волокна, кристаллы холестерина, микобактерии туберкулеза – при распаде обызвествленного первичного туберкулезного очага.
Окрашенные препараты мокроты
Приготовление: При необходимости окрашивания покровное стекло после микроскопии нативного препарата сдвигают, отмечают на предметном стекле интересующее место, затем препарат высушивают, окрашивают по Романовскому или Папенгейму.
Окрашенные препараты мокроты (продолжение)
Элементы окрашенных препаратов:
Нейтрофилы составляют основную массу лейкоцитов в окрашенном мазке. Могут быть дегенеративные — в гнойной мокроте.
Эозинофилы отдельные или скоплениями, сособенно при БА.
Гистиоциты встречаются постоянно в различных количествах.
Эпителиоидные клетки — клетки туберкулезной гранулемы — при туберкулезе, саркоидозе.
Клетки Пирогова-Ланхганса – гигантские многоядерные клетки, входят в состав туберкулезной гранулемы. В мокроте встречаются редко.
Плоский эпителий, эпителий бронхов, реснитчатые клетки, бокаловидные клетки – единичные.
Бактериоскопическое исследование мокроты
Ø микроскопия препаратов, окрашенных по Циль-Нильсену — для выявления микобактерий туберкулеза
Ø микроскопия препаратов, окрашенных по Граму — для изучения микрофлоры мокроты (стрептококки, стафилококки и т.д.).
Исследование мокроты на микобактерии туберкулеза
1-через 1-2 часа после сна (под наблюдением медицинского работника).
2 – в тот же день через несколько часов после взятия первой пробы.
Необходимое количество материала — 3-5 мл мокроты, мокроту откашливать из глубоких отделов легких!
Исследование мокроты на микобактерии туберкулеза (продолжение)
Подготовка препаратов: Выбрать плотные гнойные частицы мокроты из 4-6 разных мест, распределить по предметному стеклу тонким слоем (или растереть комочки между двумя предметными стеклами). Высушить на воздухе 15-30 мин, фиксировать над пламенем спиртовки.
Основные ошибки – слишком толстые препараты, плохая фиксация, фиксация плохо высушенных мазков, слишком длительная фиксация (обугливание мазков).
Окраска по Циль-Нильсену и микроскопия
Методика окрашивания (инструкция МЗ РБ): на мазки – фильтровальная бумага, сверху карболовый фуксин Циля → медленно нагреть над пламенем спиртовки до появления пара (но не закипания!) → выдержать 5 мин при комнатной температруе→ удалить фильтровальную бумагу → ополоснуть стекло под проточной водой до полного удаления краски → обработать 25% раствором серной кислоты до полного отхождения краски → смыть → фиксировать 96 0 этиловым спиртом 5 мин → промыть водой → докрасить 0,3% водным раствором метиленового синего 60 сек →промыть, высушить, микроскопировать.
Окраска по Циль-Нильсену и микроскопия (продолжение)
Микроскопия: Просмотр не менее 100 полей зрения под иммерсией. Если не обнаружены – еще 100 полей. В сомнительных случаях – весь мазок. Микробактерии окрашиваются в красный цвет (тонкие, слегка изогнутые палочки), остальные элементы мокроты и бактерии – в синий. Подсчитывают количество на 100 полей.
Выражение результата бактериоскопии
1-9 на 100 полей – указать число
После просмотра мазки обрабатывают толуолом или ксилолом для удаления иммерсионного масла. Мазки с обнаруженными микобактериями туберкулеза хранят в течение года.
Исследование мокроты методом флотации
Метод накопления (флотации) – метод Поттенджера — применяется при подозрении на туберкулезный процесс в легких после трехкратного отрицательного исследования мокроты на микобактерии туберкулеза обычным способом.
Методика — мокроту обрабатывают ксилолом или бензолом, встряхивают → возбудитель в связи с гидрофобностью всплывает с пеной →из пены готовят мазок и окрашивают по Цилю-Нильсену.
Микроскопия препаратов мокроты, окрашенных по Грамму
Используется для выявления другой бактериальной флоры в мазке. Грамположительные бактерии (стрептококки, стафилококки, пневмококки, дифтерийные палочки и др.) – фиолетового цвета.
Грам-отрицательные (диплобациллы Фридлендера — пневмобациллы, палочки брюшного тифа, катаральные микрококки и т.д.) – красного цвета.
Стрептококки (в виде цепочек), стафилококки (грозди винограда) – при гнойных заболеваниях легких. Пневмобациллы – при пневмониях и других легочных заболеваниях. Пневмококки – возбудители крупозного воспаления легких. Исследование по Граму имеет ориентировочное значение – далее следует делать посев.
Мокрота при различных заболеваниях
Слизисто-гнойная или гнойно-слизистая. Небольшое количество лейкоцитов, единичные эритроциты. В значительном количестве клетки эпителия бронхов. При хроническом – с дегенеративными изменениями.
Мокрота скудная, слизистая, вязкая, бесцветная. Много эозинофилов, единичные эритроциты, клетки эпителия бронхов, разное количество лейкоцитов, кристаллы Шарко-Лейдена, спирали Куршмана.
Мокрота при различных заболеваниях (продолжение)
Мокроты много (при прорыве в бронх), при стоянии расслаивается на 2 слоя. Микроскопия – лейкоциты, эритроциты, фибрин, эластические волокна (признак деструкции ткани легкого), кристаллы гематоидина, микробная флора.
Мокроты много с гнилостным запахом, расслаивается на 3 слоя. Микроскопия – много лейкоцитов в стадии распада, эластические волокна, кристаллы гематоидина.
Мокроты много по утрам (переход из лежачего положения), чаще гнойного характера, иногда с гнилостным запахом. Небольшое количество лейкоцитов, единичные эритроциты, пробки Дитриха. Эластических волокон не содержит.
Мокрота при различных заболеваниях (продолжение)
v в начальной стадии: мокроты мало – слизистая, вязкая с примесью отдельных гнойных комочков. Лейкоцитов и альвеолярного эпителия мало. Микобактерий может на быть.
v в поздней стадии – обызвествленные эластические волокна, признаки казеозного распада (крошковатые белые массы), кристаллы холестерина, микобактерии.
Наиболее часто плоскоклеточный (45-60%), недифференцированный (20-40%), аденокарцинома (9-12%). В мокроте – клеточные элементы рака со слизью, гноем, кровью, комплексы атипичных клеток с признаками злокачественности.
Общеклиническое исследование бронхиального и бронхоальвеолярного смыва
Бронхиальный смыв: с помощью фибробронхоскопа вводят в просвет бронха 50 мл изотонического раствора хлористого натрия с последующей аспирацией. Бронхоаьвеолярный смыв: с помощью фибробронхоскопа катетер продвигают на 6-7 см внутрь сегментарного бронха, дробно вводя 4 порции по 50 мл изотонического раствора хлористого натрия с последующей аспирацией. Эти смешанные порции – бронхоальвеолярный смыв.
Состав бронхиального смыва в норме
| Клетки | Содержание, % |
| Бронхиальный эпителий | 5 — 20 |
| Цилиндрический эпителий | 4 – 15 |
| Плоский эпителий | 1 — 5 |
| Макрофаги | 64 — 68 |
| Нейтрофилы | 5 — 11 |
| Лимфоциты | 2 — 4 |
| Тучные клетки | 0 – 0,5 |
| Эозинофилы | 0 – 0,5 |
Состав бронхоальвеолярного смыва в норме
| Клетки | Содержание % | Клетки | Содержание % |
| Общее кол-во клеток, шт. | 10 — 15 | Эозинофилы | |
| Макрофаги | 84 — 99 | Эритроциты | |
| Лимфоциты | 1 — 14 | Недифференцированные лимфоциты | |
| Полиморфно-ядерные | 0,1 — 4 | Дифференцированные лимфоциты: Т-клетки: — хелперы — супрессоры | |
| Реснитчатые | 1 — 5 | ||
| В — клетки | 5 — 10 |
Клинико-диагностическое значение исследования БС и БАС
Показания: оценка уровня и характера воспаления в трахеобронхиальном дереве. Клинические возможности: Установление характера и оценка динамики эндобронхита
| Тип эндобронхита | Цитоз (Ц), •10 9 /л | Альвео-лярные макро-фаги, % | Нейтрофи-лы (НЛ), % | Лимфо-циты, % | Микро-флора, % |
| Нет эндобронхита | 0,3 | 88,1 | 5,6 | 5,1 | |
| Катаральный | 1,9 | 32,2 | 48,0 | 20,6 | |
| Катарально-гнойный | 2,5 | 2,4 | 82,5 | 15,6 | |
| Гнойный | 23,6 | 3,1 | 94,2 | 2,5 |
Оценка динамики альвеолита
Дифференциальная диагностика неспецифической легочной патологии
| Клетки | норма | БА | ЭП | ГП | С | ИФА | ХБ |
| Макрофаги | |||||||
| Лимфоциты | |||||||
| Нейтрофилы | 0,5 | ||||||
| Эозинофилы | 0,5 |
Условные обозначения: БА – бронхиальная астма; ЭП – эозинофильная пневмония; ГП – гиперчувствительный пневмонит; С – саркоидоз; ИФА – идиопатический фиброзирующий альвеолит; ХБ – хронический бронхит
Дата добавления: 2014-01-11 ; Просмотров: 3527 ; Нарушение авторских прав? ;
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет
источник